Buněčné markery sepse Karin Malíčková Klinická imunologie a alergologie laboratoř Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK a VFN Praha
Sepse přehnaná zánětlivá a poškozující odpověď imunitního systému imunoparalýza cytokinová bouře syndrom kompenzatorní protizánětlivé odpovědi (CARS, compensatory antiinflammatory response syndrome) 2
Laboratorní markery dysfunkce imunitních mechanizmů u systémového zánětu co potřebujeme v klinické praxi? zánět? etiologie? tíže stavu, predikce dalšího vývoje, prognóza rozhodování o terapii ale také rychlost stanovení, jednoznačná interpretace výsledků, cena
Neutrofily efektorové buňky přirozené imunity fyziologicky tvoří 50 70 % cirkulujících leukocytů 4
Neutrofily - sepse mikrobiální produkty, cytokiny a chemokiny negativně ovlivňují chemotaxi (změny struktury cytoskeletu neutrofilů, inhibice interakcí neutrofil - endotel, internalizace povrchových chemokinových receptů CXCR2) dysfukční tvorba fagolysozomů (ph) intracelulární oxidativní vzplanutí: neřízené uvolňování ROS 5
CD64 na neutrofilech vysokoafinitní receptor pro Fc část molekuly IgG (FcγRI) velmi nízká exprese za fyziologických okolností jeho exprese se zvyšuje působením prozánětlivých cytokinů (IFN, G-CSF), čímž se zajišťuje efektivnější fagocytóza patogenních mikroorganizmů do 48 hodin po odstranění noxy exprese molekuly opět klesá a do týdne se vrací k normálu 6
CD64 na neutrofilech exprese není ovlivněna imunosupresivní léčbou, přítomností systémové autoimunity, hematologickou malignitou, neutropenií atd. schopnost reagovat na infekci zvýšením exprese CD64 na neutrofilech mají i novorozenci vč. předčasně narozených, též HIV pozitivní jedinci 7
CD64 na neutrofilech Wang X, Li ZY, Zeng L, Zhang AQ, Pan W, Gu W, Jiang JX. Neutrophil CD64 expression as a diagnostic marker for sepsis in adult patients: a meta-analysis. Crit Care. 2015;19:245 8 klinických studií, n = 1986 pacientů senzitivita pro dg. sepse v pediatrické i dospělé populaci >90 % (CRP ~ 80 %) 8
CD64 na neutrofilech Davis BH. Improved diagnostic approaches to infection/sepsis detection. Expert Rev Mol Diagn. 2005 Mar;5(2):193-207 senzitivita pro dg. sepse 90,5 % specificita (sepse vs SIRS) 96,6 % pozitivní prediktivní hodnota pro dg. sepse 95 % negativní prediktivní hodnota pro dg. sepse 92,9 % 9
CD64 na neutrofilech Hoffmann JJ. Neutrophil CD64: a diagnostic marker for infection and sepsis. Clin Chem Lab Med. 2009;47(8):903-16. Je-li exprese CD64 na neutrofilech během prvních 24 hodin hospitalizace nízká, lze ukončit protimikrobiální léčbu ještě před obdržením výsledků mikrobiologických vyšetření Vyšetření exprese CD64 na neutrofilech nenahrazuje vyšetření počtu leukocytů/neutrofilů, ale poskytuje kvalitativně jinou informaci. 10
CD64 na neutrofilech snadný a rychlý způsob detekce (výsledek během pár desítek minut, většinou do hodiny) exprese molekuly je v EDTA vzorku krve velmi dlouho stabilní (> 24 hodin při pokojové teplotě) průtoková cytometrie standardní metodika (QuantiBRITE) finance 1 povrchový znak detekovaný průtokovou cytometrií = 349 bodů 11
CD64 na neutrofilech stanovuje se průměrný počet molekul exprimovaných neutrofilním granulocytem normální hodnoty nepřesahují 2000 mol/bb v podmínkách febrilní infekce se exprese CD64 na neutrofilech zvyšuje >10x 12
Monocyty cirkulující monocyty = zásobárna makrofágů pro potřeby všech tkání v krvi setrvávají jen několik hodin, poté vstupují do tkání a mění se ve tkáňové makrofágy syntetizují, skladují a uvolňují řadu zánětlivých mediátorů (IL-1, IL-10, IL-10, TNFa, růstové faktory) jsou antigen-prezentujícími buňkami 13
Monocyty u septických pacientů snížená tvorba prozánětlivých mediátorů snížená kapacita k prezentaci antigenů zejména z důvodu poklesu exprese HLA molekul II.třídy 14
Exprese HLA-Dr na monocytech snížená exprese HLA-Dr na monocytech = marker imunosuprese/imunoparalýzy prediktor sepse u pacientů po rozsáhlých traumatech, operacích, popáleninách prediktor zvýšeného rizika vzniku nozokomiální infekce míra poklesu koreluje s tíží klinického stavu fatální prognóza sepse bývá spojena buď s dlouhodobým nebo opětovným poklesem exprese HLA-Dr na monocytech 15
Exprese HLA-Dr na monocytech Drewry AM, Ablordeppey EA, Murray ET, Beiter ER, Walton AH, Hall MW, Hotchkiss RS. Comparison of monocyte human leukocyte antigen-dr expression and stimulated tumor necrosis factor alpha production as outcome predictors in severe sepsis: a prospective observational study. Crit Care. 2016;20(1):334. den 1-2 den 3-4 16
Exprese HLA-Dr na monocytech Vysoké nároky na preanalytickou fázi vyšetření: protisrážlivé činidlo transport do laboratoře na ledu zpracovat nejdéle do 4 hodin od odběru 17
TREM-1 na neutrofilech a monocytech Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 1 (TREM-1) po vazbě ligandů (nejspíše různých produktů bakterií a kvasinek) na TREM-1 dochází k diferenciaci dendritických buněk z monocytů zvyšuje se exprese povrchových molekul nutných k prezentaci antigenu zvyšuje se sekrece IL-1, TNFa a dalších prozánětlivých působků v myeloidních buňkách tím jsou Th1 lymfocyty jsou stimulovány k tvorbě Th1 spektra prozánětlivých cytokinů 18
TREM-1 na neutrofilech a monocytech zvýšená exprese TREM-1 = excesivní zánět v experimentálních myších modelech vedla blokáda membránových TREM-1 k redukci mortality na sepsi (mortality rate 94 % 24 %, Buochon, A et al., J. Exp. Med. 2001, 194:1111) 19
TREM-1 na neutrofilech a monocytech humánní medicína - výzkumný potenciál Marioli A, et al. Early changes of the kinetics of monocyte TREM 1 reflect final outcome in human sepsis. BMC Immunol. 2014;15:585 n = 75 20
Solubilní TREM-1 (strem) vzniká nejspíše proteolytickým odštěpením od membránově vázané molekuly TREM-1 soutěží s membránovým TREM-1 o ligandy a tlumí tak zánětlivé kaskády spouštěné aktivací TREM-1 zatím rozporuplné výsledky studií o významu strem jako biomarkeru infekčního zánětu 21
Solubilní TREM-1 (strem) Jiyong J, Tiancha H, Wei C, Huahao S. Diagnostic value of the soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in bacterial infection: a meta-analysis. Intensive Care Med. 2009;35(4):587 95. meta-analýza 13 klinických studií n = 980 pacientů senzitivita 82% (95% CI 68-90) specificita 86% (95% CI 77-91) although strem-1 may prove a useful adjunct for a correct sepsis diagnosis, further validation studies are necessary before strem-1 may be utilized clinically 22
Regulační T lymfocyty (Treg) populace CD4+CD25+Foxp3+ pomocných T lymfocytů (cca 5 %) regulace imunitní odpovědi - imunologická tolerance, potlačování periferní autoreaktivity zánět modulují imunitní odpověď třemi mechanismy: přímou cytotoxicitou inhibují tvorbu prozánětlivých cytokinů v CD8+ T-lymfocytech přímou sekrecí imunomodulačních cytokinů TGF β a IL-10 23
Regulační T lymfocyty (Treg) a sepse absolutní i relativní počty Treg při sepsi stoupají jde o CD4+ CD25+ FoxP3+CD45RO+CD69- buňky, tj. přirozené Treg pocházející z thymu (nikoliv indukované ze zralých T lymfocytů) vzestup počtu Treg je nápadný hned po nástupu sepse, trvale vysoké hodnoty jsou typické pro pacienty se špatnou prognózou 24
Regulační T lymfocyty (Treg) a sepse Chen K, Zhou QX, Shan HW, Li WF, Lin ZF. Prognostic value of CD4(+)CD25(+) Tregs as a valuable biomarker for patients with sepsis in ICU. World J Emerg Med. 2015;6(1):40-3. 25
Regulační T lymfocyty (Treg) standardizovaná metodika EDTA nebo heparin stabilita povrchových znaků existence metodik i bez nutnosti intracelulárního značení rychlost, cena 26
Detekce intracelulární tvorby cytokinů charakterizace různých subpopulací leukocytů, které lze rozlišit na základě rozdílné produkce cytokinů určení stupně aktivace/suprese buněk vyšetřujeme-li solubilní cytokiny, nemáme informaci o tom, odkud pocházejí, a jejich pikogramové plazmatické koncentrace mohou být obtížně hodnotitelné 27
Detekce intracelulární tvorby cytokinů stimulace aktivace značení povrchových molekul (fenotypizace) fixace lyzace permeabilizace značení intracelulárních cytokinů analýza průtokovým cytometrem 28
Detekce intracelulární tvorby cytokinů Brunialti MK, et al. Increased percentages of T helper cells producing IL-17 and monocytes expressing markers of alternative activation in patients with sepsis. PLoS One. 2012;7(5):e37393 n= 100 CTRL n = 32 29
Závěr sepse není nemoc, ale syndrom zatímco někteří septičtí pacienti vykazují známky excesivní zánětlivé reakce, jiní pacient jsou imunoparalyzováni potřeba jednoduchých a specifických parametrů aktuálního zánětlivého stavu septických pacientů laboratorní magic bullet ovšem zatím neexistuje 30