Marcela Vlková Jana Nechvátalová FN u sv. Anny v Brně LF MU Brno
Leukocytární subpopulace CD45 CD45
Lymfocytární subpopulace Fenotypizace základní subpopulace T a B lymfocytů a NK buněk subpopulace základních populací vývojové a aktivační markery Sledování regulačních buněk Funkční testy: proliferace např. CSFE, produkce cytokinů, cytotoxicita,..
Bazofily Bazotest
Monocyty CD14 CD45 Funkční testy: Stanovení exprese HLA DR Fagocytární testy Produkce cytokinů Exprese aktivačních molekul
Změny exprese HLA DR na monocytech u septických pacientů CD14 HLA DR FITC CD14 HLA DR PerCP Cy5.5 HLA DR FITC
Eozinofily FS CD16,56 CD45 CD45
Neutrofily Jméno neutrofil pochází z histologických nebo cytologických preparátů, při barvení hematoxylinem nebo eosinem Basofily tmavě modré Eosinofily jasně červené Neutrofily neutrálně růžové Charakteristické svými výraznými jádry, které jsou segmentovány do 2 5 laloků
Vývoj neutrofilů Nature Clinical Practice Rheumatology (2006) 2, 500 510
Cytologie neutrofilů Zralé neutrofily měří v průměru v nátěru 12 15 m Jsou charakteristické výraznými jádry, které jsou segmentovány do 2 5 laloků Méně zralé neutrofily nazýváme tyčkami mají nesegmentované jádra tvarované právě do tvaru tyček Ranější formy neutrofilů metamyelocytymůžeme také nalézt v periferní krvi
Vývoj netrofilů
Neutrofily Vysoký počet neutrofilů a jejich krátký život může být výsledkem evolučního vývoje Buňky rychlého nasazení Minimalizace množení parazitů Neutrofilní antimikrobiální produkty poškozují okolní tkáně Neutrofily bývají často fagocytovány makrofágy po digesci patogenů
Neutrofily stanovení v PK CD45 a CD16 FS CD16,56 CD45 CD45
Neutrofily FS CD16,56 FS CD16,56 CD45 CD45 CD45 CD45
Vývojová stádia neutrofilů v PK CD16,56 CD16,56 CD45 CD45
Subpopulace neutrofilů? Absence monoklonální protilátky? CD16,56 CD16,56 CD16,56 FS FS FS CD45 CD45 CD45
Absence monoklonální protilátky? NE!!! FS CD16 CD16 CD45 CD3
Maturované x nematurované neutrofily CD16,56 FS CD45
Další fenotypizace ukázala CD45 CD3 CD16 CD15 FS FS CD16,56 CD19 CD16 CD16,56 CD19 CD16 CD45 CD3 CD16 CD15
CD16 je nízkoafinitní receptor pro Fc IgG. Vyskytuje se ve dvou izoformách: FC RIIIA (NK buňky, DC, monocyty, makrofágy) a Fc RIIIB (na neutrofilech a eozinofilech). FC RIIIA (CD16a) existuje ve třech polymorfizmech: Fc RIIIa 48L/H/R Fc RIIIa 158V/F Fc RIIIa 66H/L Fc RIIIB (CD16b) 2 alelické formy NA1 a NA2 Různé alelické varianty CD16 vedou k: rozdílné aktivitě ADCC snížení léčebné odezvy (léčba rituximabem) ovlivnění účinnosti fagocytózy bakterií opsonizovaných IgG ochotněji s homozygotní variantou NA1 než NA2) popsán i deficit CD16 další Fc receptory pro IgG (CD32 a CD64) zřejmě kompenzují ztrátu CD16 (Wagner C. et al., Eur J Clin Invest. 2004)
Exprese CD16b na neutrofilech 100 135x10 3 vazebných míst (při použití klonu 3G8) Intenzita exprese CD16b na neutrofilech: při manipulaci in vitro (hustotní gradientová centrifugace) u pacientů podstupujících hemodialýzu u těhotných žen u novorozenců u pacientů léčených G CSF u pacientů během sepse během apoptózy neutrofilů
Ne všechny klony monoklonálních protilátek CD16 se chovají stejně. A proto Jana dále bádá, a příště Vám řekne víc
Děkuji Spolupracovníkům: Janě Nechvátalové Zitě Chovancové Jiřímu Litzmanovi
Neutrofily stimulace nebo suprese? Pieter H.C. Leifelder, Front Immunol, 2015
Subpopulace neutrofilů Janesh Pillay, J Clin Invest, 2012
Neutrofily změny po separaci Periferní krev Granulocyty 1hodina po separaci a inkubaci Inkubace PBMC + granulocytů 24 hod. Inkubace PBMC + granulo 24 hod. + stim.anti CD3, CD28 CD62L CD16 PD L1 CD16
Monocyty změny po separaci a inkubaci Periferní krev Čerstvě izol. PBMC Inkubace PBMC 24 hod. Inkubace PBMC 24 hod. + stimulace anti CD3, CD28 CD16 PD 1 CD62L PD L1
Low density granulocytes Jitka Y. Sagiv, Cell Reports, 2015
Low Density Neutrophiles LDN v PBMC pacienta s CVID Čerstvě izol. PBMC Inkubace PBMC 24 hod. Inkubace PBMC 24 hod. + stimulace anti CD3, CD28 CD62L CD16 PD L1 CD15 CD16
Fenotypizace LDN Carmelo Carmon Rivera, Seminar Immunophatol, 2013