PASTOREX STAPH-PLUS 1 x x Latexový aglutinační test pro identifikaci Staphylococcus aureus

Transkript

1 PASTOREX STAPH-PLUS 1 x x Latexový aglutinační test pro identifikaci Staphylococcus aureus /01 1- POUŽITÍ PASTOREX STAPH-PLUS je rychlý aglutinační test pro souběžnou detekci afinity k fibrinogenu (clumping faktor), proteinu A a kapsulárních polysacharidů Staphylococcus aureus. 2- SOUHRN A VYSVĚTLENÍ Staphylococcus aureus je jedním z nejčastěji se vyskytujících patogenů v klinických vzorcích. Rychlé rozlišení mezi tímto druhem a jinými, méně virulentními stafylokoky má velký význam pro vhodnou léčbu pacientů. Test detekce tvorby volné koagulázy umožňuje identifikovat Staphylococcus aureus. (11, 12). Uvedený test však trvá 4 až 24 hodin, používaná plazma může navíc vykazovat rozdíly mezi jednotlivými šaržemi, které mohou ovlivnit výslednou reakci (16). Byly vyvinuty aglutinační testy umožňující rychlejší a spolehlivější detekci Staphylococcus aureus (3). Při těchto aglutinačních testech se používá latex senzibilizovaný fibrinogenem a IgG k detekci clumping faktoru, proteinu A a biochemických markerů S. aureus. Bylo však pozorováno, že některé kmeny Staphylococcus aureus (zejména rezistentní k methicilinu) neaglutinují těmito aglutinačními testy (15). Studie těchto kmenů prokázala, že všechny obsahují kapsulární polysacharid (4). Je tedy pravděpodobné, že polysacharidové pouzdro, které obaluje za určitých podmínek všechny stafylokoky, (přímé vzorky, izoláty z kultur a bakteriální klony) maskuje protein A a clumping faktor, a tím brání v aglutinaci latexových částic senzibilizovaných pouze fibrinogenem a IgG. 3- PRINCIP PASTOREX STAPH-PLUS byl navržen k souběžné detekci následujících tří komponent: 1) fibrinogen afinitního faktoru, označovaného také jako vázaná koaguláza popř. "clumping factor"; 2) proteinu A, který vykazuje afinitu k Fc fragmentu gamma imunoglobulínu (IgG); 3) kapsulárních polysacharidů Staphylococcus aureus. Reagencie obsahuje latexové částice senzibilizované fibrinogenem a IgG a specifickou monoklonální protilátkou (patent Pasteurova Institutu) proti kapsulárním polysacharidům Staphylococcus aureus (1, 5, 6, 8, 10). Kombinace fibrinogenu, IgG a anti-kapsulárních monoklonálních protilátek ve stejné reagencii umožňuje rozpoznat silně i slabě opouzdřené kmeny Staphylococcus aureus. U silně opouzdřených kmenů dochází k aglutinaci bakterií protilátkami proti kapsulárním polysacharidům. Bakterie kmenů, které ztratily polysacharidové pouzdro, jsou aglutinovány fibrinogenem a IgG. Izoláty z kultur Staphylococcus aureus se smíchají s latexovou reagencií na podložním sklíčku. Po důkladném promíchání se sklíčka vyhodnotí vizuálně na přítomnost aglutinace, která indikuje přítomnost Staphylococcus aureus. 4- SLOŽENÍ 1. PASTOREX STAPH-PLUS, souprava obsahující 50 testů, kód Latexový test: 1 kapací lahvička obsahující 1 ml červeného latexu senzibilizovaného roztokem bovinniho albuminu, fibrinogenem, IgG a monoklonálními protilátkami proti kapsulárním polysacharidům Staphylococcus aureus. Konzervační prostředek: <1.5 % ProClin 300. Negativní kontrola: 1 kapací lahvička s 1 ml reagencie pro negativní kontrolu obsahující červený latex senzibilizovaný roztokem bovinního albuminu. Konzervační prostředek: <1.5 % ProClin aglutinačních kartiček na jedno použití 150 tyčinek 2. PASTOREX STAPH-PLUS, souprava obsahující 5 x 50 testů, kód Latexový test: testovací reagencie, 5 kapacích lahviček (1 ml). Negativní kontrola: reagencie pro negativní kontrolu, 5 kapacích lahviček (1 ml). 4 x 16 aglutinačních kartiček na jedno použití 3 x 100 tyčinek 1

2 5- UCHOVÁVÁNÍ Po otevření jsou všechny reagencie stabilní až do data exspirace uvedeného na štítku, pokud jsou uchovávány při +2-8 C a v nepřítomnosti mikrobiální kontaminace. Lahvičku s latexovou reagencií uchovávejte dnem vzhůru. LATEXOVÁ REAGENCIE NESMÍ BÝT ZAMRAŽENA. 6- POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY Klička pro odběr bakteriálních kolonií. Dezinfekční tank nebo autoklávovatelná nádoba pro likvidaci použitých kartiček. 7- METODICKÁ UPOZORNĚNÍ Souprava Pastorex Staph-Plus je určena pouze pro ověření kultivačních testů a nemá se používat pro přímé klinické vzorky. Kvalita výsledků závisí na dodržování zásad správné laboratorní praxe. Všechny reagencie a vzorky je třeba používat při laboratorní teplotě mezi 18 a 30 C. Nedotýkejte se reakčního povrchu aglutinačních kartiček. Před použitím důkladně protřepejte lahvičky latexu. Otřete špičku kapací lahvičky, aby bylo možné získat kapky o standardní velikosti. Aby jste nanesli kapky, držte lahvičku s reagencií ve svislé poloze. Pomocí plastových míchacích tyčinek, které jsou součástí soupravy, promíchejte latexovou reagencii a bakteriální kolonie. Nepoužívejte dřevěné tyčinky. Pro každou reakci použijte novou tyčinku. Vyhoďte všechny použité jednorázové materiály do autoklávovatelné nádoby na odpad nebo do nádoby s dezinfekčním roztokem. OCHRANA ZDRAVÍ A BEZPEČNOSTNÍ POKYNY Dodržujte vždy aktuálně platné techniky a pokyny týkající se ochrany proti mikrobiologickým rizikům. Varování: Reagencie obsahují ProClin 300 < 1.5%. Doporučení týkající nebezpečí a upozornění v souvislosti s některými komponenty v této testovací sadě najdete na piktogramech uvedených na štítcích a v pokynech na konci návodu k použití. Bezpečnostní list je k dispozici na adrese 8- PRACOVNÍ POSTUP 1) PŘÍPRAVA VZORKU Vzorky používané s touto soupravou mají být čisté a čerstvé. Jako izolační média se doporučují: Agarová Média Trypto-casein-sójový agar Columbia agar + beraní krev Columbia agar Krevní agar Slaný mannitolový agar Média Baird-Parker s přísadami MRSASelect Vyšetřete kultivované organismy barvením podle Grama a katalázovým testem. Kolonie testované pomocí reagencie PASTOREX STAPH-PLUS by měly být grampozitivní, kataláza-pozitivní koky. 2) AGLUTINAČNÍ REAKCE Důkladně promíchejte latexovou reagencii protřepáním. V případě nutnosti promíchejte na vortexu. Naneste kapku latexové reagencie testu do jednoho z kroužků na aglutinační kartě. Do dalšího kroužku naneste jednu kapku latexové negativní kontroly. Pomocí kličky nebo plastové tyčinky odeberte 1 až 3 grampozitivní, kataláza-pozitivní kolonie a emulgujte je v kapce latexu po dobu 10 sekund. Opakujte krok 4 pro latexovou negativní kontrolu. Homogenizujte opatrným otáčením karty. Výsledky je nutné odečíst do 30 sekund poté, co zahájíte otáčení karty. Vyhodnoťte výsledky podle níže uvedených kritérií a vyhoďte kartu do nádoby s dezinfekčním prostředkem. Nepoužívejte kartu opakovaně. 9- INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Pozitivní reakce Pozitivní reakce se projevuje tvorbou agregátů s reagenciemi testu, které se stávají viditelnými pouhým okem pod normálním osvětlením do 30 sekund od doby, kdy začnete otáčet kartou. Agregáty latexových částic mohou mít různou velikost s více či méně zakaleným, růžovým pozadím. Pomalá a slabá aglutinace může znamenat nespecifickou aglutinaci. 2

3 Negativní reakce Při negativní reakci suspenze netvoří agregáty a zachovává si svůj mléčný vzhled. Neinterpretovatelné výsledky Neinterpretovatelné výsledky odpovídají aglutinaci suspenze latexovou negativní kontrolou. V takovém případě proveďte identifikaci pomocí jiné metody, například testováním na přítomnost volné koagulázy nebo tepelně stabilní DNázy. 10- KONTROLA KVALITY TESTU Zkontrolujte latexovou reagencii při každém použití ověřením nepřítomnosti aglutinace po nanesení latexu na kartu. Latex je třeba pravidelně testovat pomocí dříve identifikovaných kmenů Staphylococcus aureus a Staphylococcus epidermidis. Latexová reagencie musí vykázat přítomnost aglutinace se Staphylococcus aureus a nepřítomnost aglutinace se Staphylococcus epidermidis. Latexová negativní kontrola musí vykázat nepřítomnost aglutinace s oběma výše uvedenými organismy. 11- KONTROLA KVALITY PROVÁDĚNÁ VÝROBCEM Všechny vyráběné a komercionalizované reagencie jsou kontrolovány kompletním systémem kontroly kvality začínajícím od přijetí surovin až po komercionalizaci produktu. Každá šarže je podrobena kontrole kvality a je uvolněna na trh pouze tehdy, jestliže odpovídá stanoveným akceptačním kriteriím. Dokumentace týkající se výroby a kontroly každé jednotlivé šarže je uchovávána u výrobce. 12- ÚČINNOST Účinnost testu PASTOREX STAPH-PLUS byla hodnocena v několika různých laboratořích (2, 13, 14). Celkem bylo pomocí dané soupravy testováno 440 kmenů S. aureus a 138 stafylokokových kmenů jiných než S. aureus. Identifikace kultury byla provedena pomocí Gramova barvení, testu katalázové aktivity a koagulázového testu ve zkumavce. Odlišné výsledky byly následovně testovány biochemickou analýzou a komercionalizovaným alternativním testem pro rychlou detekci. Kmeny S. aureus byly rovněž vyšetřeny na citlivost k methicilinu. Výsledky testování citlivosti u kmenů S. aureus rezistentních k methicilinu (MRSA) a u methicillin-citlivých kmenů S. aureus (MSSA), a dále celkové výsledky pro všechny kmeny Staphylococcus aureus jsou uvedeny v tabulce 1. Výsledky testování specificity u stafylokokových kmenů jiných než S. aureus jsou uvedeny v tabulce 2. Tabulka 1 Účinnost testu Pastorex STAPH-PLUS pro izoláty MRSA a MSSA MRSA MSSA S. aureus celkem * z testu byl vyřazen jeden neinterpretovatelný výsledek Celkem Pozitivní Negativní Relativní citlivost 217 * % % 439 * % S. aureus rezistentní k methicilinu Jak je uvedeno v tabulce 1, bylo pomocí soupravy PASTOREX STAPH-PLUS správně identifikováno 217 z 217 dobře definovaných izolátů MRSA Citlivost testu PASTOREX STAPH-PLUS pro MRSA byla stanovena jako 100%, s vyloučením jednoho neinterpretovatelného výsledku, který představuje 0,4 % všech analyzovaných kmenů. S. aureus citlivý na methicilin Všech 222 kultivovaných kmenů MSSA dalo pozitivní výsledek při testování soupravou PASTOREX STAPH-PLUS, jak je znázorněno v tabulce 1. Citlivost při použití této populace MSSA byla 100%. Ostatní stafylokoky Tabulka 2 Účinnost testu Pastorex STAPH-PLUS pro jiné stafylokokové kmeny Celkem Pozitivní Negativní Relativní Specifičnost Ostatní stafylokokové kmeny % 3

4 Pomocí soupravy PASTOREX STAPH-PLUS bylo rovněž analyzováno 138 stafylokokových izolátů jiných než S. aureus, včetně S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, S. schleiferi, S. lugdunensis, a jiných druhů. Negativní výsledek byl získán pro 137 ze 138 izolátů, jak je znázorněno v tabulce 2. Sporný výsledek byl identifikován jako S. lugdunensis a byl pozitivní i při použití alternativního rychlého testu. 13- OMEZENÍ TESTU Bylo popsáno, že druhy Staphylococcus lugdunensis a Staphylococcus schleiferi jsou vybaveny fibrinogen afinitním faktorem (7,9) a mohou reagovat pozitivně v testu pro detekci clumping faktoru, v závislosti na daném kmenu a izolačním médiu. Vzhledem k tomu, že některé kmeny stafylokoků, zejména Staphylococcus saprophyticus, způsobují nespecifickou agregaci latexových částic, doporučuje se, aby se kontrolní latex, který tvoří součást soupravy, použil s každým testovaným organismem. Druhy Staphylococcus intermedius a Staphylococcus hyicus, které jsou nalézány u patologických stavů u zvířat, avšak u lidí jsou izolovány jen vzácně, mohou dávat pozitivní reakci při klasických koagulázových testech a teoreticky tak mohou reagovat i s testem k detekci fibrinogen afinitního faktoru. Nesmí být opomíjena ani možnost zkřížených reakcí. Určité streptokoky jsou vybaveny proteinem, který vykazuje afinitu k Fc fragmentům imunoglobulinů a mohou tak reagovat s latexovými částicemi. Nespecifické reakce při použití latexových metod byly popsány i pro některé další druhy, např. Escherichia coli a Candida albicans (17). Proto se doporučuje provést před vlastním latexovým testem Gramovo barvení a katalázový test u vyšetřovaných kolonií. K falešně negativní reakci může dojít, pokud izolovaný kmen Staphylococcus aureus neprodukuje fibrinogen afinitní faktor (clumping faktor), protein A nebo kapsulární polysacharidy, proti nimž byly vytvořeny monoklonální protilátky. K falešně negativním výsledkům může dojít i při použití nedostatečně velkého inokula. 14- LITERATURA 1. Boutonnier A., Nato F., Bouvet A., Lebrun L., Audurier A., Mazie J.C., and Fournier J.M. Direct testing of blood cultures for detection of the serotype 5 and 8 capsular polysaccharides of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol : Davies S. Detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus: the evaluation of rapid agglutination methods, Br. J. Biomed. Sci., 1997, 54: Esserts I., and Radebold K. Rapid and reliable identification of Staphylococcus aureus by a latex agglutination test. J. Clin. Microbiol Fournier J.M., Boutonnier A., and Bouvet A. Staphylococcus aureus strains which are not identified by rapid agglutination methods are of capsular serotype 5. J. Clin. Microbiol : Fournier J.M., Bouvet A., Boutonnier A., Audurier A., Goldstein F., Pierre J., Bure A., Lebrun L., and Hochkeppel H.K. Predominance of capsular polysaccharide type 5 among oxacillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol : Fournier J.M., Hannon K., Moreau M., Karakawa W.W., and Vann W.F. Isolation of type 5 capsular polysaccharide from Staphylococcus aureus. Ann. Inst. Pasteur/Microbiol : Freney J., Brun Y., Bes M., Meugnier H., Grimont F., Grimont P.A.D., Nervi C., and Fleurette J. Staphylococcus lugdunensis sp. No. and Staphylococcus schleifer sp. Nov., two species form human clinical specimen. J. Clin. Microbiol : Hochkeppel H.K., Braun D.G., Vischer W., Imm A., Sutter S., Staeubli U., Guggenheim R., Kaplan E.L., Boutonnier A., and Fournier J.M. Serotyping and electron microscopy studies of Staphylococcus aureus clinical isolates with monoclonal antibodies to capsular polysaccharide types 5 and 8. J. Clin. Microbiol : Jean Pierre H., Darbas H., Jean-Roussenq A., and Boyer G. Pathogenicity in T cases of Staphylococcus schleiferi, a recently described species. 10. Karakawa W.W., Fournier J.M., Vann W.F., Arbeit R., Schneerson, R.S. and Robbins. J.B. Method for the serological typing of the capsular polysaccharides of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol., 1985, 22: Kloos W.E. and Lambe D.W. (1991). Staphylococcus Manual of Clinical Microbiology, 5th Ed. Edited by Balows A., Hausler W.J., Herrmann K.L., Isenberg H.D., and Shadomy J.J. American Society for Microbiology, Washington, D.C., Pages Kloos W.E., and Scleifer K.H. Staphylococcus Bergeyís manual of systematic bacteriology. 1986, vol. 2, Luijendijk AD., Alex van Belkum, Verbrugh H., and Kluytmans J. Comparison of Five Tests for Identification of Staphylococcus aureus from Clinical Samples. J. Clin. Microbiol., 1996, 34: Neher C., Allerberger F., Prodinger W. Dierich M.P., Evaluation of commercially available agglutination tests for methicillinresistant. 8 th ECCMID Congress, Lausanne, Ruane P.J., Morgan M.A., Citron D.M., and Mulligan M.E. Failure of rapid agglutination methods to detect oxacillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol : Selepack S.T., and Witebsky F.G. Inoculum size and lot-to-lot variation as significant variables in the tube coagulase test for Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol., 1985, 22: Kronvall G. A Surface Component in Group A, C, and G Streptococci with Non-Immune Reactivity for Immunoglobulin G. J. Immunology., 1973, vol.11,

5 5

6 6

7 Distributed in the USA by Bio-Rad Laboratories Diagnostics Group th Avenue N.E. Redmond, WA For Customer Orders Call : BIORAD For Technical Service Call : BIORAD ( ) Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /01 Fax : +33 (0)