UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE 2. LÉKA SKÁ FAKULTA Ústav klinické biochemie a patobiochemie FN v Motole Tereza Ku erová Stanovení adrenalinu a noradrenalinu v plazm metodou HPLC Bakalá ská práce Praha 2012

2 Autor práce: Tereza Ku erová Vedoucí práce: Ing. Eva Klapková, Ph.D. Oponent práce: Ing. Karel Kota ka, Ph.D. Datum obhajoby:

3 Bibliografický záznam KU EROVÁ, Tereza. Stanovení adrenalinu a noradrenalinu v plazm metodou HPLC. Praha: Univerzita Karlova, 2. léka ská fakulta, 2012, s. 69. Vedoucí bakalá ské práce Ing. Eva Klapková, Ph.D. Anotace Cílem této bakalá ské práce bylo provést validaci metody na stanovení adrenalinu a noradrenalinu v plazm pomocí vysokoú inné kapalinové chromatografie s elektrochemickou (coulometrickou) detekcí. Metodu bylo pot eba nejprve optimalizovat pro coulometrickou detekci, nebo byl pou íván kit firmy Bio-Rad, který byl ur en pro stanovení s amperometrickou detekcí. Principem této metody je chromatografická separace látek s následnou oxidací stanovovaných analyt p i pr chodu analytickou celou s coulometrickou detekcí. Sou ástí analytického postupu je extrakce adrenalinu a noradrenalinu na pevné fázi. V rámci této práce byla provedena optimalizace metody pro stanovení adrenalinu a noradrenalinu s coulometrickou detekcí. Na jednotlivých analytických celách bylo zvoleno následující nastavení potenciál : na cele 1 byl nastaven potenciál 350 mv s rozsahem 100 na, na cele 2 byl nastaven potenciál 0 mv s rozsahem 50 na na a na guard cele 0 mv s rozsahem 50 na. Dále byla chromatografická metoda pln validována (p esnost, správnost, mez detekce, robustnost). Na záv r bylo provedeno mezilaboratorní porovnání výsledk 42 pacientských vzork s výsledky nam enými v nemocnici ternberk. Klí ová slova adrenalin, noradrenalin, feochromocytom, HPLC

4 Annotation The target of this bacalary work was to validate the metod for determination of adrenaline and noradrenaline in plasma by high performance liquid chromatography with electrochemical (coulometric) detection. The metod was first necessary to optimize for the coulometric detection because it was used the Bio-Rad kit, which was designed to determine with amperometric detection. The principle of this metod is the chromatographic separation of substances with subsequent oxidation of the determined analyte passes through the analytic cell with coulometric detection. The part of the analytical procedure is the solid phase extraction. The part of this work was the optimization of the metod for the coulometric detector. For the analysis were selected following potentials: channel mv with range 100 na, channel 2-0 mv with range 50 na, guard channel 0 mv with range 50 na. Furthermore, the chromatographic metod was fully validated (accuracy, precision, limit of detection, robustness). In the conclusion was made interlaboratory comparison of results of 42 patients samples with those obtained in the hospital ternberk. Keywords adrenaline, noradrenaline, phaeochromocytoma, HPLC

5 Prohlá ení Prohla uji, e jsem bakalá skou práci zpracovala samostatn pod vedením Ing. Evy Klapkové, Ph.D., uvedla v echny pou ité literární a odborné zdroje a dodr ovala zásady v decké etiky. Dále prohla uji, e stejná práce nebyla pou ita pro získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze Tereza Ku erová

6 Pod kování Cht la bych pod kovat své kolitelce Ing. Ev Klapkové, Ph.D. za trp livost, odborné vedení a dal í hodnotné rady, které mi p i vedení mé práce poskytla. Dále bych ráda pod kovala úsekové laborantce Vendulce Havránkové za pomoc a podporu.

7 Obsah ÚVOD TEORETICKÁ ÁST KATECHOLAMINY Biosyntéza katecholamin Skladování katecholamin Metabolismus katecholamin Adrenalin Noradrenalin FEOCHROMOCYTOM (FEO) Výskyt Klinický obraz Genetika Maligní feochromocytom Diagnostika Dieta a interference Odb r materiálu Lé ba METODY STANOVENÍ KATECHOLAMIN A JEJICH METABOLIT Fotometrické metody Fluorometrické metody Radioimunoanalýza Enzymoimunoanalýza Chromatografické metody CÍLE EXPERIMENTÁLNÍ ÁST P ÍSTROJE, MATERIÁL, CHEMIKÁLIE P ístroje Dopl kový materiál Kit na stanovení plazmatických katecholamin pomocí HPLC (Bio-Rad) P íprava reagencií EXTRAKCE KATECHOLAMIN CHROMATOGRAFICKÁ ANALÝZA VÝSLEDKY A DISKUZE OPTIMALIZACE PODMÍNEK PRO COULOMETRICKOU DETEKCI VALIDACE METODY Kalibrace Opakovatelnost Reprodukovatelnost Správnost Mez detekce Výt nost Robustnost STANOVENÍ ADRENALINU A NORADRENALINU U PACIENTSKÝCH VZORK ZÁV R SEZNAM LITERATURY... 64

8 SEZNAM POU ITÝCH ZKRATEK A adrenalin NA noradrenalin MN metanefrin NMN normetanefrin VMA kyselina vanilmandlová HVA kyselina homovanilová MHPG 3-metoxy-4-hydroxyfenylglykol DHPG 3,4-dihydroxyfenylglykol DHMA 3,4-dihydroxymandlová kyselina L-DOPA dihydroxyfenylalanin TH tyrozinhydroxyláza AADC L - dekarboxyláza aromatických kyselin DBH dopamin- -hydroxyláza PNMT fenyletanolamin-n-metyltransferáza COMT katechol-o-metyltransferáza MAO monoaminooxidáza CNS centrální nervový systém HPLC vysokoú inná kapalinová chromatografie HPLC-ECD HPLC s elektrochemickou detekcí HPLC-FLD HPLC s fluorescen ní detekcí AV atrioventrikulární uzel FEO feochromocytom MEN 2A mnoho etná endokrinní neoplazie typ 2A MEN 2B mnoho etná endokrinní neoplazie typ 2B NF1 neurofibromatóza typu I VHL von Hippel-Lindau syndrom SDH sukcinátdehydrogenáza NIH National Institute of Health CT výpo etní tomografie MR magnetická rezonance PET pozitronová emisní tomografie MIBG scintigrafie s metajodbenzylguanidinem 18 F-FDG 18 F-fluorodeoxyglukóza

9 EDTA kyselina etylendiamintetraoctová K 3 EDTA draselná s l kyseliny etylendiamintetraoctové HCl kyselina chlorovodíková BKK blokátor kalciového kanálu EDA etylendiamin THI trihydroxyindol SPE extrakce na pevné fázi TMB tetrametyl-benzidin HMBA 4-hydroxy-3-metoxybenzylamoniumchlorid EHPEA 3-etoxy-4-hydroxyfenyletanolamin FNMN 6-fluoronormetanefrin R2 reagent 2 R3 reagent 3 I.S. vnit ní standard CV varia ní koeficient SD-výb r sm rodatná odchylka-výb rová LOD mez detekce

10 ÚVOD Katecholaminy adrenalin, noradrenalin a dopamin - jsou biogenní monoaminy tvo ené v chromafinních bu kách d en nadledvin (p evá n adrenalin) a centrálním nervovém systému (p evá n dopamin a noradrenalin). Tyto hormony hrají nezastupitelnou roli ve stresových situacích, mimo jiné ovliv ují i na i náladu, spánek a procesy, je vy adují pozornost. Fyziologické hodnoty adrenalinu v plazm jsou 84 pg/ml, noradrenalinu 420 pg/ml a dopaminu 94 pg/ml (12, s. 2; 22, s. 1). U n kterých onemocn ní, jako jsou feochromocytom, paragangliom a neuroblastom dochází k nadprodukci katecholamin, jejich nadbytek m e mít fatální d sledky. Feochromocytomy jsou obecn nádory vycházející z chromafinních bun k (nej ast ji d en nadledvin). Pokud jsou lokalizovány extraadrenáln, nazývají se bu extraadrenální feochromocytomy, nebo také paragangliomy. Nej ast j ím p íznakem je trvalá nebo záchvatovitá hypertenze, kterou trpí asi % pacient s feochromocytomem. Tyto nádory se vyskytují pom rn vzácn, a pokud jsou v as rozpoznány a správn lé eny, má pacient velkou anci na plné vylé ení. Nerozpoznané i patn lé ené feochromocytomy tém v dy kon í fatáln. Vzhledem k tomu, e a 50 % feochromocytom z stává nerozpoznáno, jsou velmi podstatné pokroky v biochemické diagnostice, které umo ují d ív j í diagnostiku nádoru. Zárove sou asné pokroky v lokalizaci nádoru (pozitronová emisní tomografie s pou itím 18 F- fluorodeoxyglukózy), chirurgických technikách (nadledviny et ící laparoskopická chirurgie) a v porozum ní patofyziologii a genetice nádoru (nov objevené mutace genu TMEM127) vedou ke zm nám ve strategii a mo nostech lé by (7, s ). Biochemický pr kaz nadprodukce katecholamin a jejich metabolit je klí ový pro diagnostiku feochromocytomu, p i em stanovení katecholamin v plazm je velmi podstatné pro zp esn ní výsledk, které nesv d í jednozna n pro feochromocytom a správné za azení pacienta bu do skupiny zdravé populace, nebo do skupiny pacient s feochromocytomem.

11 1 TEORETICKÁ ÁST 1.1 KATECHOLAMINY Katecholaminy (dopamin, noradrenalin a adrenalin) pat í mezi látky obsahující ve své struktu e katecholové jádro a etylaminovou skupinu, která je p ipojena na uhlíku 1. Jsou to biogenní monoaminy. Prekurzorem pro syntézu katecholamin je aminokyselina tyrozin. Nejvýznamn j í metabolity katecholamin jsou metanefrin, normetanefrin, kyselina vanilmandlová a kyselina homovanilová. Katecholaminy jsou v mozku produkovány jen malým po tem neuron, které jsou sdru eny do specifických jader. Jako neurotransmitery je vyu ívá asi neuron, co je v ak jen 0,0005 % z celkového po tu neuron. V krátkodobých stresových reakcích má nezastupitelnou roli hlavn adrenalin (jako to stresový hormon). Ten je tvo en p evá n v d eni nadledvin. Noradrenalin, produkovaný hlavn v centrálním nervovém systému (CNS), ovliv uje spánek, náladu a procesy vy adující pozornost. Dopaminergních neuron se v CNS vyskytuje asi a , co je v t ina neuron, je vyu ívají katecholaminy. Tyto neurony jsou lokalizovány do ty hlavních jader, nacházejících se hlavn v mesencefalu. Dopaminergní neurony vytvá í t i hlavní projek ní dráhy, které ovliv ují kontrolu motoriky, kognitivní a behaviorální procesy. (22, s. 1) Biosyntéza katecholamin Katecholaminy se syntetizují p evá n ve d eni nadledvin, dopaminergních a noradrenergních neuronech, dále pak i v periferních bu kách gastrointestinálního traktu a ledvin. Aminokyselinový prekurzor, ze kterého se katecholaminy syntetizují, je tyrozin. Ten je do t la p ijímán bu potravou nebo vzniká v játrech hydroxylací fenylalaninu. Na pozici 3 je L-tyrozin hydroxylován cytosolovým enzymem tyrozinhydroxylázou (TH) na dihydroxyfenylalanin (L-DOPA). Tyrozinhydroxyláza vy aduje ke své funkci jako kofaktor eleznaté ionty (Fe 2+ ), molekulární kyslík a tetrahydrobiopterin (donor vodíku). V dopaminergních neuronech pokra uje syntéza dekarboxylázou aromatických kyselin (AADC = L-aromatic acid decarboxylase) a tím zde i kon í. AADC p em uje L-DOPA na dopamin. AADC se nachází v cytoplazm a ke své správné funkci 11

12 pot ebuje pyridoxalfosfát (derivát vitaminu B 6 ) (22, s. 2; 23, s. 22). Dále se dopamin z cytoplazmy p esune do vezikulárních zásobních granul. Dopamin je v dopaminergních neuronech centrálního nervového systému (CNS) kone ným produktem. Slou í zde jako p ena e nervového vzruchu (1, s. 38). V noradrenergních neuronech pak pokra uje syntetická dráha dál, a to konverzí dopaminu na noradrenalin (NA). Tato konverze probíhá pomocí dopamin- hydroxylázy (DBH). Tento enzym vy aduje jako kofaktory m naté ionty (Cu 2+ ) a kyselinu askorbovou (vitamin C) (22, s. 2; 23, s. 22). Enzym DBH se vyskytuje pouze v t ch bu kách, které syntetizují noradrenalin a adrenalin (1, s. 39). Syntéza noradrenalinu na adrenalin pokra uje dále ve d eni nadledvin a noradrenergních neuronech. Je zprost edkována enzymem fenyletanolamin-nmetyltransferázou (PNMT). Kofaktorem PNMT a donorem metylové skupiny je zde S- adenosyl-l-methionin. Vytvo ený adrenalin je dále p esunut do chromafinních granul, kde je uchováván a do svého uvoln ní (1, s. 39). Obrázek. 1: Syntetická dráha katecholamin (p evzato z 23, s. 21) 12

13 1.1.2 Skladování katecholamin Pomocí vezikulárních monoaminových transportér jsou katecholaminy p esouvány do vezikulárních zásobních granul. Zásoby katecholamin ve vezikulách se nacházejí ve velmi dynamickém stavu vzhledem k okolní cytoplazm. Dochází k neustálým pasivním únik m do cytoplazmy, ty jsou vyrovnávány aktivním transportem zp t do zásobních granul. Uvnit granul je kyselé prost edí, krom katecholamin se tam nachází i ATP a peptidy (nejznám j í jsou chromograniny). Dosud byly popsány dva druhy chromafinních bun k, které obsahují morfologicky rozdílné vezikuly. Ty mohou p ednostn skladovat adrenalin nebo noradrenalin (1, s. 40) Metabolismus katecholamin Inaktivace katecholamin probíhá pomocí n kolika po sob následujících krok. Zahrnuje kroky vychytávání a metabolismu. Vychytávání katecholamin je zprost edkováno transportéry. Ty se d lí do dvou skupin (transportéry lokalizované v neuronech a transportéry s extraneuronální lokalizací). Pro odstran ní katecholamin z krevního ob hu a ukon ení í ení signálu je podstatný extraneuronální transportér. Naopak základním mechanismem pro rychlé ukon ení sympatoneuronálního p enosu je neuronální noradrenalinový transportér. Noradrenalin uvoln ný ze sympatického nervového systému je odstra ován p edev ím (asi z 90 %) neuronálním vychytáváním zp t do nerv. Adrenalin uvol ovaný p ímo z d en nadledvin rovnou do ob hu je vychytáván p edev ím pomocí extraneuronálního monokinového transportéru (asi z 90 %). Ten se nachází hlavn v játrech. Díky t mto vysoce aktivním proces m jsou katecholaminy z krevního ob hu vychytávány velmi rychle. Jejich polo as v krevním e i ti je ni í ne dv minuty (1, s. 41). Katecholaminy jsou metabolizovány p evá n ve stejných bu kách, ve kterých se aminy tvo í. Velký podíl probíhá nezávisle na uvol ování A a NA z vezikulárních vá k a jen malý podíl tvo í metabolismus cirkulujících katecholamin (27, s. 332). Katecholaminy jsou metabolizovány n kolika cestami. T chto cest se ú astní mno ství enzym a výsledkem je velký po et metabolit. P ednostn je A i NA deaminován na 3,4-dihydroxyfenylglykol (DHPG). Dal í mo ností, která ov em není up ednost ována, 13

14 je deaminace na 3,4-dihydroxymandlovou kyselinu (DHMA). DHPG je posléze o- metylován katechol-o-metyltransferázou (COMT) na 3-metoxy-4-hydroxyfenylglykol (MHPG). Jiná významná cesta metabolismu katecholamin je o-metylace zprost edkovaná katechol-o-metyltransferázou (COMT). COMT pro svou správnou funkci pot ebuje donor metylové skupiny a tím pro ni je S-adenosylmethionin. Adrenalin (A) se metabolizuje na metanefrin (MN), noradrenalin (NA) na normetanefrin (NMN) a dopamin na metoxytyramin. o-metylací dochází k tvorb volných metanefrin. Ty se dále metabolizují enzymem monoaminooxidázou (MAO) na MHPG (hlavní cesta) nebo p ímo na kyselinu vanilmandlovou (VMA) (vedlej í cesta). MHPG vzniklý z metanefrin a DHPG m e být bu dále konjugován nebo je metabolizován na kyselinu vanilmandlovou (VMA) postupným p sobením dvou enzym (alkoholdehydrogenázy a aldehyddehydrogenázy). V gastrointestinálním traktu dochází ke konjugaci MHPG s glukuronidem nebo sulfátem. Více ne 97 % mo ových metanefrin p edstavují práv tyto konjugované metanefriny. Konjugované metanefriny a normetanefriny jsou z cirkulace uvol ovány pom rn pomalu. Jejich clearance je závislá na o i ovací funkci ledvin. Koncentrace volných metanefrin není ovlivn na renálními funkcemi. Kone né produkty metabolismu adrenalinu a noradrenalinu jsou VMA a konjugované MHPG, kde to kone ným produktem metabolismu dopaminu je kyselina homovanilová (HVA) a její konjugáty (1, s ; 8, s. 202; 22, s. 7). Obrázek. 2: Metabolická dráha katecholamin (p evzato z 24, s. 137). 14

15 1.1.4 Adrenalin Adrenalin je hormon produkovaný zejména d ení nadledvin. Je uvol ován p ímo do krve a p sobí na bu ky vzdálené od místa, kde je produkován. Adrenalin funguje jako neurotransmiter, kdy je organismus vystaven nebezpe í nebo stresu, a to jak stresu psychickému, tak i fyzickému. Mezi dal í ú inky tohoto hormonu adíme zvý ení krevního tlaku, zrychlení srde ního tepu nebo uvol ování glukózy z jater. Dlouhodobý nadbytek adrenalinu m e mít za následek kardiovaskulární potí e, problémy s vyu itím glukózy i akumulaci abnormálních bun k v t le. Jeho nadbytek je také spojován s psychickými obtí emi, jako je nap íklad úzkost. Déle trvající nedostatek m e mít za následek trávicí potí e nebo také psychické problémy (nap íklad únavu i deprese) (1, s. 48; 23, s. 19). Syntéza a metabolismus adrenalinu byly ji zmín ny v kapitolách a Obrázek. 3: Strukturní vzorec adrenalinu ( Noradrenalin Noradrenalin je produkován p evá n postgangliovými sympatickými nervy, které inervují krevní cévy, srdce i jiné tkán. P sobí jako nervový p ena e v tkáních blízkých míst m jeho produkce (1, s. 48). Mezi ú inky noradrenalinu se adí zvý ení krevního tlaku, roz í ení zornic, roz í ení dýchacích cest v plicích a zú ení prakticky v ech cév (23, s. 19). V centrálním nervovém systému zprost edkovává funkce, které ovliv ují náladu, spánek, procesy vy adující pozornost a jiné. Je zde produkován v noradrenergních neuronech, které se nacházejí v locus coeruleus na spodin tvrté komory mozkové. V periferním nervovém systému je uvol ován z nadledvin, jater a mezenteriálních orgán. P sobí jako mediátor postgangliových neuron sympatiku (22, s. 1). 15

16 Dlouhodobý nadbytek noradrenalinu m e zp sobit zvý ení krevního tlaku, hypertyreózu nebo záchvaty paniky. Dlouhodobý nedostatek m e vést k poruchám kognitivních funkcí, poruchám chování, hypotyreóze i defekt m imunitního systému (23, s. 19). Syntéza a metabolismus adrenalinu byly ji zmín ny v kapitolách a Obrázek. 4: Strukturní vzorec noradrenalinu ( Uvol ování katecholamin m e probíhat dv ma zp soby. M e být bu generalizované a difuzní v celém organismu, nebo lokalizované v ur itých tkáních a orgánech. Katecholaminy zvy ují krevní tlak, kontraktilitu myokardu a urychlují vedení atrioventrikulárním (AV) uzlem a zárove zrychlují srde ní tep. Zp sobují sta ení prakticky v ech cév. Na druhou stranu zp sobují také relaxaci tracheálních a bronchiálních sval a mohou ovliv ovat bronchiální sekreci. Katecholaminy p sobí také na renin-angiotensin-aldosteronový systém, zp sobují relaxaci lu níku a zvy ují agregabilitu trombocyt (1, s ). LÁTKA KONCENCTRACE KONCENTRACE V PLAZM V MO I Adrenalin < 84 pg/ml < 27 µg/den Noradrenalin < 420 pg/ml < 97 µg/den Dopamin < 94 pg/ml < 500 µg/den Metanefrin < 90 pg/ml < 320 µg/den Normetanefrin < 200 pg/ml < 390 µg/den VMA - 1,9-9,8 mg/den Tabulka. 1: Referen ní rozmezí katecholamin a jejich metabolit (p evzato z 12, s. 2, dopln no z 44) 16

17 1.2 FEOCHROMOCYTOM (FEO) Feochromocytomy pat í do skupiny neuroendokrinních nádor, do které dále adíme i paragangliom a neuroblastom. Feochromocytomy jsou nádory, je produkují, ukládají a metabolizují katecholaminy, nemusejí je ov em v dy také vylu ovat. Jsou pom rn vzácné. Pokud v ak nejsou v as odhaleny a správn lé eny, bývají tém v dy fatální. Jestli e se správn diagnostikují a zahájí se v asná terapie je ance na vylé ení a 90 % (8). U feochromocytom jsou katecholaminy produkovány d ení nadledvin, konkrétn chromafinními bu kami. Extraadrenáln ulo ené feochromocytomy se nazývají té paragangliomy. Funk ní paragangliomy vycházejí z chromafinních bun k sympatického i (mén asto) parasympatického nervového systému. Paragangliomy pocházející z chromafinních bun k sympatického nervového systému se vyskytují nej ast ji v oblasti hrudníku, b icha a pánve. Paragangliomy pocházející z chromafinních bun k parasympatického nervového systému se vyskytují v oblasti hlavy a krku a bývají a z 95 % n mé (sekre n neaktivní). Feochromocytomy jsou nádory a z 90 % hormonáln aktivní a dochází u nich k nadprodukci adrenalinu, v t inou s noradrenalinem, mén asto samostatn. Kde to paragangliomy jsou hormonáln aktivní maximáln z 50 % a produkují p evá n noradrenalin n kdy v kombinaci s dopaminem. V t í riziko maligní transformace mají pragangliomy ne feochromocytomy (2, s. 343; 4, s. 249; 8, s. 201; 15, s. 260). Produkce katecholamin nádorem je proces dosti variabilní, av ak jejich metabolismus je tém konstantní a není závislý na mno ství vyprodukovaných katecholamin. Normální bu ky d en nadledvin, stejn tak jako bu ky nádorové, obsahují enzym katechol-o-metyltransferázu (COMT). Ta metabolizuje noradrenalin na normetanefrin, adrenalin na metanefrin a dopamin na metoxytyramin (4, s. 249) Výskyt Feochromocytomy se vyskytují nej ast ji mezi 40. a 50. rokem ivota. Jejich výskyt v ak není vylou en u d tí ani stra ích osob (6, s. 36). ast ji postihují eny ne mu e. Vyskytují se u v ech ras, ale v erno ské populaci mén (1, s. 7). Pro feochromocytom platilo pravidlo 10 %, co znamená, e v 10 % jsou maligní (dnes ji %), cca 10 % je extraadrenální (dnes spí e %), a z 10 % jsou familiární 17

18 a 10 % jsou bilaterální formy. R zné studie v poslední dob ukázaly, e se feochromocytom m e vyskytovat spolu s n kterými genetickými syndromy a jeho familiární výskyt je tedy a 24 %, ale n kte í auto i uvádí i vy í procento výskytu (6, s. 36; 7, s. 133; 20, s. 201). Celkov se feochromocytom vyskytuje vzácn. Bývá diagnostikován u 0,05 0,1 % pacient s trvalou hypertenzí. ast ji je nacházen u náhodn zji t ných tumor nadledvin tzv. incidentalom, kde se m e prokázat ve 4 5 % p ípad (4, s. 249) Klinický obraz P íznaky doprovázející p ítomnost feochromocytomu bývají z velké ásti zp sobeny nadbytkem katecholamin produkovaných nádorem. Jen málo jich m e být zp sobeno nap íklad útlakem okolních struktur nádorem nebo zvý enou produkcí jiných látek (2, s. 343). Tyto p íznaky jsou nespecifické a jsou spole né pro více jiných onemocn ní, z tohoto d vodu se feochromocytomu ob as íká chameleon. Kv li velké variabilit p íznak je n kdy nejv t í problém p i diagnostice na feochromocytom v bec pomyslet. Proto a 50 % výskytu onemocn ní m e z stat klinicky nerozpoznáno. Klinické projevy se u pacienta mohou vyskytovat trvale i jen epizodicky ve form tzv. atak, záchvat. Záchvaty zp sobené feochromocytomem mohou trvat od n kolika sekund po n kolik hodin, nej ast ji se v ak setkáváme s délkou v ádu n kolika minut. Zárove se mohou vyskytovat vícekrát za den nebo jen velmi ojedin le nap íklad po n kolika m sících. V takovém p ípad je velmi obtí né dát si je do souvislosti a pomyslet na mo nou p ítomnost feochromocytomu (3, s. 1). Zvý ené hladiny katecholamin jsou spojovány s klasickou triádou záchvatovitých p íznak, mezi n pat í pocení, palpitace a bolest hlavy (20, s. 201). Trvalá nebo paroxysmální hypertenze bývá tím nej ast j ím projevem. Trpí jí více ne 90 % pacient. Vyskytuje se hlavn u nádor, které produkují noradrenalin. V ur itých p ípadech se m e u pacient vyskytnout i hypotenze, tém v dy u tumor produkujících p evá n adrenalin. Dal ím typickým p íznakem m e být i zblednutí b hem záchvatu. D sledkem náhlého zvý ení hladin katecholamin m e být t ká a letální arytmie, infarkt myokardu, hypertenzní krize nebo cévní mozková p íhoda. Projevem dlouhodobého nadbytku katecholamin m e být vznik kardiomyopatie (3, s. 1 2; 18, s. 330). 18

19 Mezi metabolické projevy se adí hlavn poruchy metabolismu glukózy, které mohou vyústit a v diabetes mellitus závislý na inzulinu. Typicky se té vyskytuje katecholaminy indukovaný úbytek hmotnosti. Ten je ov em lépe prokazatelný a po úsp né operaci, kdy v t ina pacient p ibere i n kolik kilogram (4, s. 251). Podez ení na p ítomnost feochromocytomu by m ly té vzbudit symptomy, které jsou zp sobeny zvý ením krevního tlaku p i diagnostických zákrocích, jako je nap íklad anestezie, endoskopie, podání kontrastní látky p i CT (ne v ak p i podání nových CT kontrastních látek, které ji nezp sobují zvý ené vyplavování katecholamin ) (7, s. 133). N mé feochromocytomy neprodukují katecholaminy v dostate né mí e na to, aby mohly zp sobit klinické projevy. Zárove nízká hladina katecholamin v plazm pacienta zp sobuje negativní výsledek b n pou ívaných biochemických test (8, s. 201) Genetika Feochromocytomy a paragangliomy se vyskytují ve velké v t in sporadicky. Podle posledních studií v ak familiární formy mohou tvo it %. Vyskytují se jako sou ást n kolika genetických syndrom. Pat í sem: mnoho etná endokrinní neoplazie typ 2 (MEN 2A nebo MEN 2B) neurofibromatóza typ I (NF1) von Hippel v-lindau v syndrom (VHL) familiární paragangliomatóza spojená s mutacemi gen sukcinátdehydrogenázy Tyto geny se obecn d dí autozomáln dominantním zp sobem (7, s. 133). Nové studie popisují i dal í genetické mutace nap. TMEM 127, které by mohly mít vliv na vznik familiárního feochromocytomu. Gen TMEM 127 poprvé popsal Qin et al. v roce Jde o tumor-supresorový gen asociovaný s q raménkem 2. chromozomu (2q11) (26, s. 229). Zárode né mutace tohoto genu jsou spojeny se ztrátou divoké alely. Burnichon et al. uvád jí souvislosti s bilaterálním familiárním feochromocytomem (21, s ). Yao et al. provedli studii s 990 pacienty, kde r zné mutace genu TMEM127 prokázali pouze u pacient s feochromocytomem, nikoli s paragangliomem (25, s. 2618). 19

20 Mnoho etná endokrinní neoplazie (MEN) Neboli Sipple v syndrom se v populaci vyskytuje zhruba u jednoho jedince na , nej ast ji kolem ty icátého roku ivota, ale není vylou en ani u d tí ve v ku kolem deseti let. Tvo í ho medulární karcinom títné lázy, feochromocytom a primární hyperparatyreóza. Mnohem více se vyskytuje feochromocytom, v 70 % je bilaterální, paragangliom pouze vzácn. Feochromocytomy u tohoto syndromu metastazují málokdy (zhruba v 5 % p ípad ). Pacienti bývají normotenzní i jinak asymptomati tí (p íznaky se vyskytují v 50 %), proto se nedoporu uje profylaktická adrenektomie. MEN 2A tvo í více ne 80 % v ech p ípad MEN 2. U MEN 2A i MEN 2B dochází k mutaci v RET protoonkogenu, který se nachází na q raménku 10. chromozomu v pruhu 11.2 (10q11.2) (7, s , 16, s. 10). Tento gen kóduje receptor pro tyrozinkinázu, RET protein. U MEN 2A dochází k mutaci postihující tyrozinkinázovou ligand vázající doménu, u MEN 2B je mutací posti eno katalytické místo tyrozinkinázy. Aktivací RET onkogenu dochází k hyperplazii cílových bun k in vivo. Vznik nádoru je pak indukován následujícími sekundárními zm nami, nap íklad ztrátou tumor-supresorového genu na p raménku 1. chromozomu. Gen RET obsahuje 21 exon, z nich 6 exon jsou takzvané exony s horkými místy. Pat í sem exony 10, 11, 12, 13, 14 a 15. V t chto exonech se u 97 % pacient s MEN 2 proká e mutace (1, s ). Feochromocytom spojený se syndromem MEN 2 má adrenergní fenotyp, co znamená, e produkuje hlavn adrenalin, který je metabolizován na metanefrin. Z tohoto d vodu je diagnostika FEO u vý e zmín ného syndromu zalo ena na pr kazu vysokých koncentrací metanefrinu nebo adrenalinu v plazm i mo i. Genetický screening mutací v RET protoonkogenu by m l být dostupný pro ka dého pacienta, kde má léka podez ení na p ítomnost familiárního typu feochromocytomu (pokud je p ítomen bilaterální FEO, v rodin se ji vyskytl FEO i medulární karcinom títné lázy) (7, s. 137). Neurofibromatóza typu I (NF1) Neurofibromatóza má dva typy, FEO se vyskytuje pouze u 1. typu NF, kde nacházíme neurofibromy periferních nerv. NF1 je známa té pod názvem von Recklinghausenova nemoc. Jde o autozomáln dominantn d di nou chorobu s úplnou 20

21 penetrancí, která se vyskytuje v populaci u jednoho jedince na 3-4 tisíce. Pro tento syndrom je typická p ítomnost café-au-lait skvrn (k diagnóze je t eba alespo p ti skvrn), neurofibrom, gliom optiku, pih v axille a dal ích nález. Celkem 84 % FEO u syndromu NF1 je jednostranných. Zárove je v t ina t chto nádor benigních. (1, s. 31; 16, s. 9; 17, s. 405). NF1 je v populaci nej ast ji se vyskytující genetické onemocn ní, u n ho m e docházet ke vzniku feochromocytom. Av ak FEO vzniká pouze u malé ásti pacient s tímto syndromem, jedná se o mén ne 1 % p ípad. Proto z celkového po tu pacient s FEO má jen 5 % feochromocytom na podklad syndromu NF1 (7, s. 139). U syndromu NF1 je mutovaný velký tumor-supresorový gen NF1 obsahující 51 exon (7, s. 139), který se nachází na q raménku 17. chromozomu v pruhu 11.2 (17q11.2). Tímto genem je kódován protein neurofibromin, který je homologní s aktivujícím proteinem ras/gtpázou (GAP) (9, s. 127). Mutací dochází k inaktivaci NF1 genu a jeho proteinu, ím se aktivuje Ras a následuje bun ná proliferace (1, s. 31). U pacient s NF1 se obecn nedoporu uje rutinní screening feochromocytomu, nebo záchyt je velmi malý. Provedení screeningu je na míst, pokud pacient s NF1 trpí hypertenzí i jinými p íznaky FEO, pak by se na n j nem lo zapomínat. FEO u syndromu NF1 produkuje noradrenalin a adrenalin, a tak je jeho diagnostika zalo ena na p ítomnosti zvý ených koncentrací noradrenalinu, adrenalinu, ale i normetanefrinu a metanefrinu v plazm i mo i (1, s 32). Von Hippel v-lindau v syndrom (VHL) Eugen Hippel popsal v roce 1895 p ípad pacienta, u kterého se vyskytl sítnicový angiom. O 31 let pozd ji, v roce 1926, pozoroval Arvin Lindau sou asný výskyt angiom sítnice a centrálního nervového systému. Za dal í rok pak jejich asociaci s cystami ledvin a pankreatu. Melmon a Rosen poprvé zavedli pojem von Hippel v- Lindau v syndrom (1, s. 29). V populaci se vyskytuje u 2 3 na narozených d tí. VHL se rozvíjí ve stejné mí e u obou pohlaví i v r zných etnických skupinách. Pr m rný v k p i stanovení diagnózy je 20 let (17, s. 404). V rámci tohoto syndromu feochromocytom vznikne p ibli n u 7 18 % pacient (19, s. 522). V jednotlivých rodinách se výskyt FEO m e velmi zásadn li it. Von Hippelova-Lindauova choroba bývá nej ast j í p í inou 21

22 familiární formy feochromocytomu (9, s. 126). M eme ji rozd lit na dva typy. FEO není sou ástí syndromu VHL 1. typu, a proto se jím nebudeme zabývat. VHL 2. typu se dále d lí na podtypy 2A, 2B a 2C. VHL 2A je typ s nízkým rizikem pro vznik feochromocytomu, kde to VHL 2B má vysoké riziko pro vznik feochromocytomu. VHL 2C tvo í pouze feochromocytom (1, s. 30; 19, s. 521). FEO je lokalizován hlavn v nadledvin, jen velmi z ídka se nachází extraadrenáln. Zhruba 50 % jsou bilaterální formy FEO. Riziko metastáz je ni í ne 5 % (16, s. 10). Von Hippelova-Lindauova choroba vzniká na podklad mutací na p raménku 3. chromozomu (3p25/26). VHL pat í mezi tumor-supresorové geny. A u 23 % pacient, u nich byla zji t na mutace VHL genu, nebyla prokázána pozitivní rodinná anamnéza, a tudí se jedná o mutace de novo. Zárove a 9 % pacient se zdánliv sporadickým feochromocytomem nese VHL mutaci (1, s. 29). Feochromocytomy v rámci VHL syndromu produkují noradrenalin (noradrenergní fenotyp). U pacient s VHL chorobou je vhodné za ít screening feochromocytomu ji od p ti let v ku (7, s. 138). Familiární feochromocytomy spojené s mutací gen pro sukcinátdehydrogenázu Teprve nedávno bylo prokázáno, e na vzniku feochromocytomu a paragangliomu mají podíl i zárode né mutace genu pro enzym sukcinátdehydrogenázu (SDH). Geny, které kódují sukcinátdehydrogenázu, jsou ty i. Gen SDHA je umíst n na q raménku 15. chromozomu v pruhu 15 (5q15). Tento gen kóduje flavoprotein. Gen SDHB gen paragangliomu 4, je umíst n na q raménku 1. chromozomu v pruhu 35 (1q35). Produktem tohoto genu je protein, který obsahuje elezo a síru. Gen SDHC gen paragangliomu 3, je umíst n na q raménku 1. chromozomu v pruhu 23 (1q23). Tímto genem je kódována velká podjednotka cytochromu b. Gen SDHD gen paragangliomu 1, je umíst n na q raménku 11. chromozomu v pruhu 23 (11q23). Tímto genem je kódována malá podjednotka cytochromu b. K vnit ní membrán mitochondrií je zakotven flavoprotein (kódován SDHA) a protein obsahující elezo a síru (kódován SDHB). Geny sukcinátdehydrogenázy jsou známé jako geny kódující mitochondriální komplex II. Na mitochondriální komplex II je vázán 22

23 Krebs v cyklus a elektronový transportní et zec (oxidativní fosforylace). Oxidace sukcinátu na fumarát (sukcinátdehydrogenázou) je specificky katalyzována mitochondriálním komplexem II. P ená í elektrony uvoln né p i oxidaci na ubichinon (koenzym Q) za pomoci elezo-sírových shluk SDHB a flavinadenindinukleotidu (1, s. 32). Koenzym Q umo uje cytochromu b p enos elektron na dal í komplexy v mitochondriích. Výsledkem toho je efektivní syntéza ATP. patná funkce komplexu II má za následek zhor enou funkci mitochondrií a vznik hypoxie s aktivací hypoxických cest. Zárove se aktivuje i glykolýza, která napomáhá k syntéze pot ebného ATP. Bohu el je asto nedostate ná. V d sledku toho dochází k celkové hypoxii a acidóze. Co nádorovým bu kám umo uje p e ívání. Zárove m e docházet i k inhibici apoptózy. V d sledku mutace v SDHA genu vzniká feochromocytom i paragangliom jen z ídka. Na podklad mutace v SDHB genu dochází p evá n k rozvoji paragangliomu, feochromocytomu mén. Tyto nádory bývají mnoho etné, recidivující, agresivní a metastazují. Skoro v dy produkují noradrenalin. asto se m eme setkat i se spole nou produkcí noradrenalinu a dopaminu. Biochemicky n mé nádory vznikají nej ast ji práv v d sledku mutace SDHB genu. Zhruba % pacient s metastatickým feochromocytomem nese mutaci v tomto genu. Mutace gen SDHC se mohou vyskytnout u feochromocytomu i paragangliomu, ale celkov se vyskytují vzácn. Mutace v genu SDHD vedou nej ast ji ke vzniku paragangliomu v oblasti hlavy a krku, ale nacházíme je i u paragangliom v dutin b i ní (7, s. 140). Tento gen je exprimován jen díky p enosu otcovské alely (paternální p enos) (maternální imprinting) (1, s. 33) Maligní feochromocytom Feochromocytomy se vyskytují z v t í ásti jako benigní nádory. Maligní formy p edstavují zhruba %. Více bývají maligní paragangliomy, zde se m e jednat a o 36 %. N kdy i více v závislosti na genetickém pozadí nádoru (4, s. 249). Zhruba kolem 50 % pacient s maligním FEO p e ívá pr m rn 5 let. I zde je velká variabilita v závislosti na genetickém pozadí nádoru. Hor í prognózu mají nosi i mutace v SDHB 23

24 genu (2, s. 346). U d tí se maligní formy feochromocytom vyskytují mén asto, mají v ak tendence agresivn j ího vývoje. Maligní feochromocytomy jsou v t inou v t í s v t ím obsahem nekrotické tkán. Bývají tvo eny bu kami men ími ne benigní adrenální FEO. Rozli it maligní feochromocytom od benigního jen pomocí histopatologického popisu je velmi obtí né (9, s. 122). Proto je stále jediným kritériem pro ur ení malignity nádoru p ítomnost chromafinních bun k ve tkáních, kde se normáln nevyskytují (20, s. 203). Typické oblasti, kam feochromocytomy metastazují, jsou lymfatické uzliny, kosti (a 70 %), játra a plíce. Klinický obraz se u pacient s maligním FEO m e významn li it. S velmi pomalým postupováním nemoci se setkáváme p edev ím u pacient s izolovanými kostními metastázemi. Tito pacienti mohou p e ívat a 20 let. Naopak je tomu u pacient s metastázemi do parenchymatózních orgán. V t chto p ípadech nemoc progreduje velmi rychle a pacient umírá b hem n kolika m síc (6, s. 38; 18, s. 335) Diagnostika V dne ní dob se diagnostika feochromocytom provádí pouze biochemickými testy. Ty spo ívají v pr kazu nadprodukce katecholamin a jejich metabolit v plazm i mo i pacienta. Zobrazovací metody slou í k lokalizaci nádoru, který je ji biochemicky potvrzen (3, s. 2) Biochemický pr kaz Vzhledem k tomu, e se katecholaminy nemusejí uvol ovat z bu ky konstantn nebo v dostate né mí e ( asto se uvol ují v takzvaných atakách, epizodách), není jejich stanovení nejvhodn j í pro screening feochromocytom (4, s. 251). Katecholaminy jsou v chromafinních bu kách neustále metabolizovány enzymem katechol-ometyltransferázou na metanefriny, a to nezávisle na uvoln ných katecholaminech. Tato metabolická dráha je pro feochromocytom specifická (6, s. 37). Metanefriny se stanovují ve frakcionované podob (zvlá je stanovený normetanefrin a metanefrin). Senzitivn j í metodou je stanovení frakcionovaných metanefrin ne stanovení mate ských katecholamin. Metanefriny m eme stanovit jak v plazm, tak i v mo i. 24

25 Mo ové metanefriny se stanovují po dekonjugaci a p edstavují sulfokonjugáty produkované sulfotransferázou 1A3. To je enzym lokalizovaný v trávicím traktu. Plazmatické metanefriny se stanovují ve volné form. Co vysv tluje pro má stanovení plazmatických metanefrin vy í diagnostickou specificitu ne stanovení mo ových metanefrin (2, s. 344). V ur itých p ípadech stanovujeme pro dopln ní informací i koncentrace dopaminu nebo jeho metabolitu metoxytyraminu. M e to vypovídat o maligním potenciálu tumoru. Zhruba % p edstavují nádory sekre n n mé, co znamená, e neprodukují dostate né mno ství katecholamin na to, aby vedly k pozitivit testu. Velká v t ina t chto nádor v ak katecholaminy metabolizuje a tedy produkuje metanefriny. Jedná se asto o nádory, které jsou maligní a vznikají na základ mutace v genu SDHB. Z ídka se m eme setkat i s FEO, které neprodukují ani metanefriny. U tohoto druhu FEO nám m e pomoci stanovení chromograninu A. Plazmatická neuronspecifická enoláza m e být pozitivní u maligních nádor. Pro tyto nádory platí, e u nich nelze histochemicky detekovat enzym tyrozinhydroxylázu (TH). Mají poru enou tvorbu katecholamin (4, s. 251). D le ité pro vlastní rozhodnutí o p ítomnosti i nep ítomnosti FEO je vzít v úvahu vlastní zvý ení stanovovaných analyt. Jen mírné zvý ení nemusí znamenat p ítomnost nádoru. Výrazné zvý ení hladin (3,5 a 4 násobné) naopak 100 % potvrzuje pravd podobnost feochromocytomu. Zále í také, za jakých okolností byly výsledky získány, jeliko stanovení m e být naru eno n kterými léky, zp sobem odb ru pacienta, p ípadn m e dojít ke komplikacím p i sb ru mo i atd. (2, s. 345; 5, s. 736). V p ípad, kdy se zvý ené hladiny nam ených analyt nalézají v takzvané edé zón (hodnoty mezi horní hranicí referen ního rozmezí a jejím ty násobkem), je doporu eno pou ít dal í test. V dne ní dob se pou ívá clonidinový supresní test (7, s. 149). Clonidin inhibuje uvol ování noradrenalinu pouze ze sympatických nerv nikoli v ak z feochromocytomu. Pacientovi se podá peroráln 0, 3 mg clonidinu. Po 2 3 hodinách se odebere vzorek krve a stanovují se hodnoty noradrenalinu i normetanefrinu a hodnotí se pokles nam ených hodnot p ed a po podání clonidinu (9, s. 137). Pokud dojde ke sní ení pod horní hranici referen ního rozmezí nebo alespo o 40 % je p ítomnost nádoru velmi nepravd podobná. Zatímco absence sní ení m ených 25

26 parametr sv d í s vysokou pravd podobností o p ítomnosti nádoru. P i stanovení normetanefrinu je senzitivita testu 96 % u noradrenalinu 67 % (7, s. 150). Senzitivita (%) Specificita (%) Plazma Hereditární Sporadický Hereditární Sporadický Volné nefriny Katecholaminy Mo Konjugované nefriny Katecholaminy Kyselina vanilmandlová Tabulka. 2: Senzitivita a specificita test (p evzato z 13, s. 7) Diagnostický algoritmus p i podez ení na feochromocytom Tento algoritmus vychází z doporu ení NIH (National Institutes of Healt) a je pou íván nap íklad na Odd lení laboratorní medicíny nemocnice ternberk. 1. krok screeningové vy et ení Pacientovi omezujeme pouze betalytika, není nutný dietní re im pouze 12 hodinové la n ní p ed odb rem. Stanovení volných nefrin metanefrin, normetanefrin v plazm metodou HPLC s elektrochemickou detekcí (HPLC-ECD). Výsledky: Ob hodnoty negativní (metanefriny do 61 ng/l, normetanefriny do 112 ng/l). Tyto hodnoty nesv d í pro feochromocytom, pacient je nadále sledován. Výsledky se nacházejí v edé zón (metanefrin do 236 ng/l, normetanefrin do 400 ng/l) provádíme dal í testy 2. krok. Hodnoty jsou pozitivní (metanefrin nad 236 ng/l, normetanefrin nad 400 ng/l). Tyto hodnoty sv d í pro p ítomnost feochromocytomu a pokra ujeme 3. krokem lokalizací. 2. krok výsledky nejsou jasné nacházejí se v edé zón. 26

27 Stanovujeme volné nefriny v plazm (MN, NMN), katecholaminy v plazm (A, NA) metodou HPLC-ECD, provádíme výpo et indexu MN/A (normal do 4,2), NMN/NA (normal do 0,52) a clonidinový test (3 hod. po podání 0,3 mg clonidinu by m l NMN poklesnout na normální hodnoty nebo o 50 %, absence poklesu sv d í pro feochromocytom) (10, s. 1). Pokud se výsledky nacházejí v edé zón, je pro zp esn ní interpretace výsledk doporu ován p epo et na v k dle uvedeného vzorce: ( -4,188-0,07. v k) + (4,516. koncentrace matenefrinu) + (3,129. koncentrace normetanefrinu) V k pacienta se udává v letech, koncentrace MN a NMN se udává v nmol.l -1. Hodnota cut-off je pro tuto rovnici stanovena -1,48. Senzitivita pro tento výpo et je udávána 91 % a specificita 97 %. P epo et pomocí tohoto vzorce by mohl sní it zastoupení fale n pozitivních výsledk a ke 3 % (12, s. 2). Výsledky: Pokud jsou hodnoty nefrin, katecholamin, clonidinového testu a indexu (MN/A, NMN/NA) v norm, není feochromocytom potvrzen a pacient se nadále sleduje. Hodnoty nad rámec referen ních mezí sv d í pro feochromocytom a následuje 3. krok lokalizace. 3. krok lokalizace ji biochemicky potvrzeného feochromocytomu. CT (výpo etní tomografie) nadledvin s podáním kontrastní látky, MR (magnetická rezonance) pro extraadrenální umíst ní, scinti MIBG (scintigrafie s metajodbenzylguanidinem), PET (pozitronová emisní tomografie) (10, s. 1). 27

28 Obrázek. 5: Diagnostický algoritmus pro feochromocytom (p evzato z 10, s. 2) Lokalizace tumoru K lokalizaci tumoru se p istupuje a po definitivním potvrzení pomocí biochemických test. Vy et ení d líme na anatomické zobrazovací metody a funk ní zobrazovací metody. Mezi anatomické zobrazovací metody se adí CT a MR. Tato vy et ení se provád jí jako první a jedno z nich tedy podstupuje ka dý pacient s biochemicky potvrzeným feochromocytomem (7, s. 155). CT i MR (s podáním gadolinia) jsou stejn vhodné pro vy et ení v oblasti nadledvin. Mají p ibli n 95 % senzitivitu, ale jen 70 % specificitu. Pro vy et ení paragangliom (extraadrenální lokalizace) je u diagnosticky p esn j í MR (a 90 % senzitivita). Tu volíme p ednostn u d tí, t hotných en, v p ípad renální nedostate nosti i u pacient trpících alergií na kontrastní látku (podávanou p i CT). Podání neiontové kontrastní látky (iohexolu) nejspí e neovliv uje plazmatické hladiny katecholamin, a proto je bezpe né. Pacient p i podání takovéto kontrastní látky nemusí být p ed vy et ením p ipravován alfa-blokátory (2, s. 345; 14, s. 431; 18, s. 331). Funk ní zobrazovací metody jsou velmi specifické a adí se mezi n PET i MIBG scintigrafie. Funk ní zobrazovací vy et ení se ji neprovádí u v ech pacient. 28

29 N kte í auto i (nap. Pacák et al.) uvádí, e funk ní zobrazovací metody není t eba provád t u pacient s nádorem, který je v t í jak 5 cm (v takovýchto p ípadech je v dy doporu ováno chirurgické odstran ní) nebo v p ípad, e nádor produkuje adrenalin (jeliko výskyt t chto nádor je tém v dy adrenální, a tak se za dosta ující pova uje biochemický pr kaz a pozitivní CT nebo MR) (7, s. 155). Zatímco auto i Zelinka, trauch nebo Widimský doporu ují provád t funk ní zobrazovací vy et ení u nádor v t ích ne 5 cm, kv li pot eb vylou it maligní nebo multilokulární formu FEO (podez ení na maligní i multilokulární formu mají v echny tumory, je produkují noradrenalin a tumory produkující adrenalin v t í ne 5 cm) (2, s. 345; 4, s. 252; 14, s. 431). Funk ní zobrazovací vy et ení indikujeme v p ípadech, kdy jsme pomocí CT a MR neobjevili primární p í inu zvý ené koncentrace katecholamin nebo pokud si nejsme jisti, e se jedná opravdu o feochromocytom. Je vhodné ho pou ít i tehdy, pokud máme podez ení, e by se mohlo jednat o maligní i mnoho etný feochromocytom (6, s. 37). Pokud máme podez ení, e se jedná o maligní i mnoho etnou formu feochromocytomu nebo pokud se jedná o paragangliom (feochromocytom lokalizován extraadrenáln ) je na míst pou ít spí e vy et ení s 131 I-MIBG ne 123 I-MIBG, i kdy 123 I-MIBG má lep í technickou kvalitu. Jeliko n které látky (nap. labetalol, kalciové blokátory nebo tricyklická antidepresiva) mohou ovliv ovat vy et ení s 123 I-MIBG. Dal í optimální metodou pro posouzení p ítomnosti maligního feochromocytomu a paragangliomu je také metoda s pou itím fluorodeoxyglukózou-pet/ct ( 18 F-FDG-PET/CT), obsahující dvoufázové zobrazení multidetektorovou výpo etní tomografií. P ínosnost této metody je ve srovnání s CT ni í, jeliko je více ne p tkrát dra í (15, s. 265). Oktreotidový scan zna ený 111 In i PET s 18 F-fluorodeoxyglukózou ( 18 F-FDG) by m la být vy et ení vyhrazená hlavn pro p ípady, kdy 123 I-MIBG bylo negativní. Vzhledem k tomu, e tyto dva testy mají pro FEO ni í specificitu, nejsou doporu ovány jako základní vy et ení. U metastatické formy FEO má v t í diagnostickou výt nost vy et ení PET zna ený 18 F-fluorodopaminem ne 123 I-MIBG, ale 18 F-fluorodopamin stále není b n dostupný pro klinické pou ití (14, s. 431). 18 F- 29

30 1.2.6 Dieta a interference P ed stanovením katecholamin a jejich metabolit je nutné dodr et p ísnou dietu a vysadit ur ité léky, které by mohly ovliv ovat výsledky nebo samotnou analýzu (viz ní e). Výjimkou je stanovení volných metanefrin v plazm. Pro toto stanovení je nutné vysadit pouze kofein (i káva bez kofeinu) a z lé iv pouze betablokátory a tricyklická antidepresiva (13, s. 8). Dietní úprava t i dny p ed odb rem pacient musí vynechat tyto potraviny: erná káva, silný aj, alkohol, kakao, okoláda, sýr, o echy, raj ata, banány, grapefruity, pomeran e, vanilka, pokrmy obsahující vanilin. Sedm dní p ed odb rem musejí být pacientovi vysazeny ur ité léky. P íklady lék, které z analytického hlediska znemo ují nebo zkreslují výsledky analýzy: Léky zvy ující výsledky: labetalol, tetracyklin, erytromycin, chinidin, chloral hydrát, chlorptomazin, acetaminofen, benzodiazepiny, triamteren, sotalol, kyselina nalidixová, dietní fenoly Léky sni ující výsledky: clofibrát, disulfiram, propranolol, metylglucamin Sedm dní p ed odb rem musejí být pacientovi vysazeny léky, které mohou výsledky analýzy ovlivnit z farmakologického hlediska. Léky zvy ující výsledky: krátce ú inkující vasodilatátory, metyldopa, inhibitory MAO, levodopa, exogenní katecholaminy, krátkodob p sobící inhibitory sympatiku (alfa-blokátory, betablokátory ovliv ují metanefriny) Léky sni ující výsledky: fenfluramin, mandelamin, metyrozin, etanol, inhibitory MAO (sni ují VMA) metyldopa (sni uje VMA), inhibitory sympatiku (ovliv ující katecholaminy) (12, s. 3) Odb r materiálu Krev: Odb r krve se provádí v ranních hodinách a nala no. Alespo 15 minut p ed vlastním odb rem se le ícímu pacientovi zavede kanyla. asový interval je nutné dodr et, jinak by stresem z odb ru krve mohlo dojít k zvý ení hladin m ených analyt. Po uplynutí 15 minut se propláchne kanyla fyziologickým roztokem i heparinem. První 30

31 odebraná krev se sbírá do tzv. odpadní zkumavky, ím se zbavíme heparinu, pop. fyziologického roztoku, kterým jsme kanylu vyplachovali. Poté se provádí vlastní odb r krve pro stanovení. Odebírá se do zkumavek o objemu 5 ml. Jako antikoagula ní roztok m e být pou it heparin nebo EDTA. Je vhodné pou ívat zkumavky, které byly p ed odb rem p edchlazeny. Ihned po odb ru je nutné vlo it zkumavky do ledové t í t a co nejd íve transportovat do laborato e. Krev by se m la od plazmy odd lit nejpozd ji do 2 hodin. Vzorky se centrifugují p i cca 4 C. Plazma se odpipetuje do plastových zkumavek a zamrazí. Vzorky uchováváme p i cca -80 C (11, s. 1; 28). Mo : Sb r mo i detekuje se mno ství katecholamin i jejich metabolit, vylou ených do mo i za 24 hodin. Pro 24 hodinový sb r mo i je velmi d le ité, aby byl proveden spolehliv. Pak má v t í informa ní hodnotu ne analýza náhodn odebraných vzork. Mo se sbírá do isté, vypláchnuté nádoby, která se b hem sb ru musí uchovávat na chladném, dob e zastín ném míst. První porce mo i se do nádoby nesbírá, ale vymo í se do toalety. Tím za íná jednodenní období sb ru. D le ité je pacienta upozornit, e musí sbírat mo p ed ka dou stolicí. Po ukon ení sb ru je nutné p esn zm it objem mo i, nejlépe odm rným válcem. Hrubé odhady jsou nep ípustné. Do laborato e pak odesíláme bu celý objem 24 hodinového sb ru, nebo jen 40 a 50 ml (po d kladném promíchání). Pokud neposíláme celý objem, je nutné uvést informaci o celkovém objemu za 24 hodin. P ed sb rem se musí mo okyselit pomocí kyseliny chlorovodíkové (HCl). Pou íváme 25 % roztok HCl. 40 ml se nalije p ed za átkem sb ru do sb rné nádoby. U d tí nebo pacient trpících oligurií dáváme na 100 ml mo i kapek ed né HCl nebo koncentrované kyseliny octové. V slab kyselé mo i a chladu jsou volné katecholaminy stabilní minimáln 24 hodin (12, s. 2) Lé ba Ideálním e ením je chirurgické odstran ní feochromocytomu. Neodstran ný nádor by pacientovi mohl zp sobit smrtelnou hypertenzní krizi. K správnému odstran ní nádoru je zapot ebí anesteziologa i chirurga, kte í ji mají zku enosti s tímto 31

32 typem nádoru. Vzhledem k tomu, e p i manipulaci s nádorem m e dojít k výrazným zm nám koncentrace katecholamin, na n je pot eba ihned zareagovat. Metodou první volby je v posledních deseti letech laparoskopické odstran ní feochromocytomu. I pacienti s nádory v t ími ne 9 cm i s mnoho etnými nádory se v dne ní dob operují laparoskopicky. V sou asné dob je opera ní mortalita men í ne 1 %, pokud je dodr ena správná p edopera ní farmakologická p íprava a operaci provád jí zku ení léka i. P edopera ní medikamentózní p íprava je nutná k udr ení stabilního krevního tlaku pacienta, nebo p i manipulaci s feochromocytomem m e dojít k uvoln ní vysokých hladin katecholamin, hypertenzní krizi i tachyarytmii (7, s. 156). Akutní odstran ní feochromocytomu bez ádné farmakologické p edopera ní p ípravy má vysokou úmrtnost. Medikamentózní p íprava je zalo ena na podávání blokátor alfa 1 -receptor (nap. doxazosin, terazosin, prazosin). S podáváním alfa-blokátor (a potencionáln i beta-blokátor ) by se m lo za ít 10 a 14 dní p ed operací. Dávky lék by se m ly postupn zvy ovat podle individuální tolerance pacienta. Nekompetitivní antagonista alfa-receptor je fenoxybenzamin, ten by m l být brán jako základní lék, u nás ov em bohu el není k dispozici. Proto se jako náhrada pou ívají selektivní blokátory alfareceptor, co jsou v ak jen kompetitivní antagonisté (nap. doxazosin, terazosin). Ty nemusejí pacientovi zprost edkovat plnou ochranu alfa-receptor p ed vysokými hladinami adrenalinu a noradrenalinu uvoln nými p i operaci. Výhodou t chto lék je, e na rozdíl do fenoxybenzaminu nezp sobují výrazn j í reflexní tachykardie, a proto nemusejí být v dy indikovány beta-blokátory. Podávat v rámci p edopera ní lé by kombinovaný alfa a beta-blokátor labetalol, není úpln vhodné, jeliko p eva uje blokáda beta-receptor. Beta-blokátory se podávají a potom, co nastoupí efekt alfa-blokátor (nejmén 24 hodin po jejich podání). Pomocí t chto lék se kontroluje arytmie a tachykardie. Pouze samostatné podání beta-blokátor se u feochromocytomu nedoporu uje, jeliko by mohlo dojít k plicnímu edému (4, s ; 6, s. 37; 14, s. 432). Dále je mo né indikovat i blokátory kalciových kanál (BKK), které zabra ují vyplavování intracelulárního kalcia zprost edkovaného katecholaminy. Mohou se podávat spole n s alfa-blokátory nebo samostatn (hlavn u normotenzních pacient ). Samostatné podání BKK je mén vhodné, proto e sice nevede k ortostatické hypotenzi, ale nezabra uje vzestupu krevního tlaku. 32

33 Hypertenzní pi ky b hem chirurgického výkonu se mohou kontrolovat pomocí izosorbiddinitrátu, nitroprusidu sodného i krátkodob p sobících blokátor kalciových kanál. Esmolol, co je krátkodob p sobící beta-blokátor, je vhodný pro kontrolu tachyarytmie. Zvý eným p ísunem soli a tekutin m eme sní it riziko poopera ní hypotenze. Po chirurgickém odstran ní je d le ité ud lat kontrolní biochemické testy, které zjistí, zda operace vedla k normalizaci hladin stanovovaných analyt. Vyhlídky pacient po operaci jsou velmi dobré, u n kterých m e být p ítomna hypertenze i po odstran ní nádoru, ale ji nebývá tak záva ná. Je doporu eno pacienty i nadále sledovat v ur itých asových intervalech, nebo by mohlo dojít k recidiv feochromocytomu (a v 17 % p ípad ). Extraadrenální i familiární formy FEO recidivují ast ji ne jiné (14, s. 432). Pro maligní formy FEO zatím nebyla nalezena jednozna n úsp ná lé ba. Jednou z mo ností je chirurgické e ení. Nádorová tká se m e odstra ovat opakovan, v etn metastáz. Pomocí alfa-blokátor se pak kontroluje krevní tlak a symptomy. Dal í mo ností je podávání terapeutických dávek 131 I-MIBG. Tato varianta by m la být na prvním míst hlavn u pacient, kte í mají pozitivní scintigrafii s MIBG. Podle n kterých studií mohou prodlou it p e ívaní vysoké dávky 131 I-MIBG. Poslední mo ností je také chemoterapie pomocí cyklofosfamidu, vinkristinu a dakarbazinu. Poslední dv zmi ované mo nosti pacientovi zhor ují kvalitu ivota a zárove jen málo jich vede ke kompletní remisi (4, s. 253; 6, s. 38; 14, s. 432). 1.3 Metody stanovení katecholamin a jejich metabolit Fotometrické metody Fotometrické stanovení metabolit katecholamin bylo popsáno autory Pisano et al. ji v roce Principem metody je konverze stanovovaných látek na vanilin, který je poté stanoven fotometricky p i 360 nm. Výsledky jsou ovlivnitelné stravou (nap. okoládou, kofeinem, banány, potravinami obsahujícími vanilku, citrusovými plody) a léky (nap. aspirin, antihypertenziva, tricyklická antidepresiva). Metody jsou zdlouhavé a vy adují pe livou kontrolu reak ních podmínek, jsou ji zastaralé a v klinických 33

34 laborato ích se pou ívají jen ojedin le, d íve se v ak vyu ívaly pro screening FEO (28, s. 1585, 1588). Stanovení metanefrin Po kyselé hydrolýze jsou nekonjugované metanefriny adsorbovány na kolonky s katexem a poté vymývány hydroxidem amonným. Opakovanou oxidací jsou p evedeny na vanilin. Výsledná sm s je stanovena fotometricky p i 360 nm. Tato metoda nerozli uje MN od NMN (33, s ). Stanovení VMA VMA a dal í fenolové kyseliny se extrahují z mo i okyselené etylacetátem do vodného roztoku uhli itanu draselného. VMA se oxiduje na vanilin. Vanilin je pak selektivn odd len od kyseliny fenolové (kontaminace) extrakcí do toluenu a zp t do uhli itanu. Koncentrace vanilinu je stanovena spektrofotometricky p i 360 nm (36, s ). Spektrofotometrické stanovení pou ívali ve své práci nap. i Sies et al., kte í stanovovali VMA v mo i u 249 pacient (122 mu a 127 en) s podez ením na neuroblastom. Z 249 pacient bylo 20 potvrzených p ípad neuroblastomu (31, s. 300) Fluorescen ní metody Fluorescen ní metody jsou citliv j í a specifi t j í ne Pisanovy fotometrické metody, p esto se v dne ní dob v klinických laborato ích pou ívají jen velmi omezen. V t ina fluorescen ních postup pro stanovení adrenalinu a noradrenalinu je zalo ena na vzniku derivát t chto amin, které vyza ují charakteristickou fluorescenci. Nejroz í en j í byly metody, kde vznikaly THI (trihydroxyindol) deriváty nebo EDA (etylendiamin) deriváty. V metod THI jsou katecholaminy oxidovány na odpovídající adrenochromy, které se v alkalickém ph p eskupí na THI deriváty nazývané adrenolutiny. Koncentrace katecholamin se stanoví pomocí dvojité oxidace p i ph 3 a 6 nebo m ením fluorescence p i r zných vlnových délkách. V EDA metodách se katecholaminy nejd íve oxidují na adrenochromy, které pak reagují s 1 (adrenalin) nebo 2 (noradrenalin) moly EDA. Tyto produkty mají r zné emisní spektra, co umo uje sou asné m ení obou hormon bez p edchozího odd lení. Tato metoda nebyla tak roz í ena jako metoda THI. 34

35 Fluorescen ní metody vy adují nejprve p edúpravu vzorku pomocí SPE extrakce s kolonkami pln nými katexem nebo oxidem hlinitým p ípadn oba postupy zárove. Tyto metody jsou ovlivnitelné léky (ampicilin, labetalol, metyldopa, sulfonamidy, vitamin B komplex) nebo nápoji, které obsahují kofein (káva, aj) (28, s , 1585). Tuto metodu ve své práci pou ívali nap. Jacobs et al. nebo Oka et al. Metoda THI je dostate n citlivá pro stanovení katecholamin v mo i. Na za átku je nutné upravit ph mo i na 6,5. Vzorek se poté p e istí p es kolonku napln nou Bio-Rex 70 (slabý iontom ni ) a katexem. Po eluci katecholamin kyselinou boritou se adrenalin a noradrenalin oxidují kyano elezitanem za p ítomnosti zine natých iont na odpovídající adrenochromy. Ty se v zásaditém ph m ní na adrenolutiny, co jsou THI deriváty katecholamin, které emitují charakteristickou fluorescenci. P ídavek kyseliny askorbové zp sobí rozklad p ebyte ného oxida ního inidla a zabrání dal í oxidaci derivát. Fluorescence se m í p i 495 nm, excita ní vlnová délka je 405 nm. Diferenciace a kvantifikace adrenalinu a noradrenalinu se nedoporu uje. Metoda THI se pou ívala ke stanovení kombinované koncentrace t chto katecholamin. (29, s ; 30, s. 646) Radioimunoanalýza Princip této techniky je zalo ený na pou ití enzymu katechol-o-metyltransferázy (COMT), která p evádí radioaktivní metylovou skupinu z tritiem zna eného S- adenosylmethioninu na katecholaminy p ítomné ve vzorku. Tím se vytvo í odpovídající ozna ené metylované deriváty katecholamin. Jinou variantou radioaktivních metod pro stanovení koncentrace noradrenalinu je pou ití enzymu fenyletanolamin-n-metyltransferázy, který p evede radioaktivní metylovou skupinu S-adenosylmethioninu na aminovou slo ku v molekule noradrenalinu (28, s. 1577). Peuler et al. popisují analýzu, která je zalo ena na p evodu adrenalinu, noradrenalinu a dopaminu ve vzorku (plazma nebo mozkomí ní mok) na jejich odpovídající tritiem zna ené metoxy deriváty. K tomu se vyu ívají COMT v p ítomnosti tritiem zna eného S-adenosylmethioninu. Duplicitní inkuba ní sm s obsahuje druhou pom rovou ást vzorku a jako vnit ní standard známé mno ství 35

36 adrenalinu, noradrenalinu a dopaminu. Tato sm s je stanovována paraleln se vzorkem. Po vzniku o-metylovaných derivát jsou produkty rozpu t ny v organických rozpou t dlech a odd leny tenkovrstevnou chromatografií na základ polarity postranních et zc. Jednotlivé látky jsou pak se krábány a vymývány. P ímým m ením radioaktivity frakce tritiem zna eného 3-metoxytyraminu se m e stanovit koncentrace dopaminu. Separované frakce tritiem zna eného normetanefrinu a tritiem zna eného metanefrinu jsou dále opakovanou oxidací p evedeny na tritiem zna ený vanilin. Jeho mno ství je p ímo úm rné mno ství adrenalinu nebo noradrenalinu ve vzorku. Koncentrace jednotlivých analyt ve vzorku je stanovena pomocí vnit ního standardu obsa eného v duplicitním vzorku (32, s ) Enzymoimunoanalýza Manz et al. ve své studii popisují enzymoimunoanalýzu (EIA) pro stanovení metanefrinu a normetanefrinu. P ed vlastní imunoanalýzou je nutná precipitace protein kyselinou. Následuje derivatizace L-metanefrin na N-acyl-L-metanefriny. N-acyl-L-M (N-acyl-Lmetanefrin) a N-acyl-L-NM (N-acyl-L-normetanefrin) jsou vázány na povrchu mikrotitra ní desti ky. N-acyl-L-M a N-acyl-L-NM ze vzorku a z pevné fáze vázané na mikrotitra ní desti ce sout í o známý po et králi ích protilátek (anti-n-acyl-m nebo anti-n-acyl-nm). Nenavázané antigeny a volné komplexy antigen-protilátka jsou odstran ny promytím. Protilátky navázané na p íslu né pevné fázi jsou detekovány pomocí kozí protilátky (anti-králi í IgG) a substrátu TMB (tetrametyl-benzidin). Reakce je sledována p i 450 nm. Intenzita signálu je nep ímo úm rná koncentraci analytu ve vzorku (34, s. 583) Chromatografické metody Vysokoú inná kapalinová chromatografie (HPLC) je dnes nejroz í en j í metodou v klinických laborato ích pro stanovení katecholamin a jejich metabolit v plazm i v mo i. U tohoto stanovení je nutná p edúprava vzorku, v t ina postup pou ívá extrakci na pevné fázi. Nejb n ji se pou ívají kationtov vým nné extrak ní 36

37 kolonky, oxid hlinitý nebo gely s kyselinou boritou. Ke kvantifikaci katecholamin se nejb n ji pou ívá elektrochemická detekce pomocí amperometrického i coulometrického detektoru. Detek ní limity jsou obdobné jako u radioenzymatických metod. Lze vyu ít i fluorescen ní detekci, ale je nutné pou ít zesilova e signálu. HPLC metody jsou mnohem specifi t j í ne radioenzymatické metody a výsledky získané kapalinovou chromatografií jsou podstatn ni í. Pou ití HPLC metod je univerzální a pomocí úpravy vzorku lze eliminovat mo né p í iny interference. Rosano et al. mimo jiné popisují HPLC metodu pro stanovení plazmatických katecholamin. Volné katecholaminy jsou z plazmy nejprve rychle adsorbovány do oxidu hlinitého p i ph 8,6. Následují kroky promývání oxidu hlinitého vodou. Po promytí jsou katecholaminy eluovány malým objemem kyseliny chloristé. Takto p ipravené vzorky jsou pou ity pro HPLC analýzu. Jako stacionární fáze je pou ita katexová kolona pln ná silikagelem. Jako mobilní fáze byla pou ita sm s vodných a organických pufr o ph 6,5. K amperometrické detekci slou ila jako referen ní elektroda Ag/AgCl a jako pracovní uhlíková elektroda. Katecholaminy procházející celami detektoru podstoupily rychlou elektronovou oxidaci za konstantního potenciálu na o-chinon. Za konstantní teploty a pr toku je tato oxidace p ímoúm rná koncentraci analytu. Pro výpo et koncentrace vzorku byl pou it vnit ní standard (dihydroxybenzylamine) (28, s ). Lenders et al. popsali v roce 1993 HPLC metodu s elektrochemickou detekcí pro stanovení plazmatických koncentrací metanefrinu a normetanefrinu. Pro svou práci pou ili 32 zdravých pacient a 23 pacient s FEO. Metanefriny byly z plazmy adsorbovány na pevnou fázi a následn eluovány amoniakálním metanolem. Sm s byla vysu ena a poté rozpu t na v mobilní fázi. Pevná fáze (katex) byla nejprve aktivována 15 ml sm si amoniaku v metanolu (10 ed ný amoniakální metanol) a dále 2 ml roztoku hydroxidu sodného v metanolu (10 g/l). Poté byla promyta 2 ml deionizované vody. Na extrak ní kolonku byl nanesen 1 ml plazmy, 4 ml deionizované vody a 1 ng ka dého vnit ního standardu (HMBA, EHPEA a FNMN). Rychlost pr toku byla 2 ml/min. Kolonka byla postupn promývána 5 ml sm si kyseliny octové (10 mmol/l) a metanolu v pom ru 9 : 1, 5 ml fosfore nanu amonného ph 8 (10 mmol/l) a 5 ml deionizované vody. Metanefriny byly z kolonky eluovány 2 ml amoniakálního metanolu. Eluát byl odpa en centrifugací za sní eného tlaku a poté rozpu t n ve 150 µl mobilní fáze, z toho 140 µl bylo dávkováno na kolonu (38, 97-98). 37

38 Tuto metodu ve své práci pozd ji pou ívalo mnoho autor, nap.: Vránková et al., Eisenhofer et al. nebo Huynh et al. Auto i Ulrychová et al. ve své práci stanovovali metanefriny v plazm a mo i metodou HPLC s elektrochemickou detekcí. Metanefriny byly izolovány extrakcí na pevné fázi, pou ívali SPE kolonky Oasis MCX. Nápl nejprve aktivovali 1,25 ml metanolu a následn promyli 1,25 ml deionizované vody. Poté byl dávkován 1 ml vzorku (plazma nebo 100 krát ed ná mo ) a 50 µl vnit ního standardu HMBA (4- hydroxy-3-metoxybenzylamoniumchlorid, Merk). Kolonka byla proplachována 1,25 ml destilované vody, 1,25 ml 0,1 mol/l HCl a 1,25 ml metanolu. Metanefriny byly eluovány 1,25 ml 5 % roztoku hydroxidu amonného v metanolu. Poté byl vzorek odpa en a následn rozpu t n ve 100 µl mobilní fáze. Jako mobilní fáze byla pou ita sm s 1 mol/l NaH 2 PO 4 (dihydrogenfosfore nan sodný), 0,34 mmol/l 1-oktansulfonátu sodného, 0,13 mmol/l EDTA (kyselina etylendiamintetraoctová) a 75 ml/l acetonitrilu. Koncentrovanou kyselinou fosfore nou bylo ph upraveno na 2,9 a 3,1 (42, s. 219). Hanai et al. popisují jednoduchou a rychlou HPLC metodu s elektrochemickou (amperometrickou) detekcí pro stanovení metabolit katecholamin (VMA, HVA) v mo i. Pro svou práci pou ili vzorky mo i od 6-12 m sí ních d tí. Matky t chto d tí vkládaly do plen filtra ní papír, který posléze posílaly do laborato e. Papír byl v laborato i vysu en a uchováván v lednici. Pás filtra ního papíru byl vlo en do sklen né zkumavky a 10 minut míchán na vortexu s 1,5 ml vinanového pufru (50 mmol/l, ph 3,6). Poté byl vzorek centrifugován 10 minut p i 2000 g. 100 µl supernatantu bylo p epipetováno do jamek mikrotitra ních desti ek. Pro nást ik do HPLC systému bylo pou ito 20 µl. Jako mobilní fáze slou ila sm s 70 ml acetonitrilu a 500 ml vinanového pufru (50 mmol/l, ph 3,6) (39, s ). Goldstein et al. upravili metodu, kterou ji d íve zavedl Hjemdahl et al. Na extrak ní kolonky s 10 mg oxidu hlinitého, které jsou promyty kyselinou a 50 µl 5 mmol/l disi i itanu sodného, je napipetován 1 ml plazmy. Dále se p idá 50 µl vnit ního standardu (10 µl/l -metyldopamin) a 400 µl tris pufru (1 mol/l tris, 20 g/l EDTA, ph upraveno HCl na 8,6). Sm s se 15 minut d kladn prot epává, a pak se centrifuguje. Supernatant se odstraní. Oxid hlinitý se dvakrát promyje vodou. Eluce katecholamin se provádí 100 µl sm si (0,1 mol/l kyseliny chloristé a 0,1 mmol/l disi i itanu sodného). K analýze je pou it celý objem eluátu (40, s. 508). Bauersfeld et al. ve své práci porovnávají metodu HPLC s amperometrickou detekcí a radioenzymatickou metodu pro stanovení katecholamin. Princip HPLC 38

39 metody, kterou provád jí je zalo en na SPE extrakci. Katecholaminy jsou adsorbovány na oxid hlinitý p i vysokém ph. Pak následuje selektivní eluce sm sí kyseliny borité a kyseliny octové. Kvantifikace katecholamin je provedena HPLC s amperometrickou detekcí. Provádí se enzymatické t pení kyseliny mo ové, aby se zabránilo ru ení s noradrenalinem, jeliko kyselina mo ová je detekována v p ední ásti chromatogramu, stejn jako noradrenalin (41, s. 186). Vránková et al. ve své práci stanovovali volné plazmatické metanfriny metodou HPLC s elektrochemickou detekcí (HPLC-ECD) a výsledky srovnávali se stanovením volných mo ových metanefrin metodou HPLC s fluorescen ní detekcí (HPLC-FLD). Pracovali s 21 pacienty s potvrzeným FEO a 21 pacienty bez FEO a sledovali správné za azení výsledk. Podle 42 m ených vzork zjistili 100 % senzitivitu i specificitu pro stanovení metanefrin v plazm metodou HPLC-ECD. M ení mo ových katecholamin metodou HPLC-FLD m lo 100 % senzitivitu ale jen 77 % specificitu (37, s. 254). Eisenhofer et al. ve své práci porovnávají stanovení plazmatických hladin metanefrinu, normetanefrinu a metoxytyraminu pro rozli ení r zných d di ných forem FEO. Pou ili celkem 173 pacient s feochromocytomem, z toho 38 s mnoho etnou endokrinní neoplazií typu 2 (MEN2), 10 s neurofibromatózou typu 1 (NF1), 66 s von Hippel-Lindau (VHL) syndromem a 59 s mutací SDHB nebo SDHD. Plazmatické koncentrace volného metanefrinu, normetanefrinu a metoxytyraminu byly kvantifikovány kapalinovou chromatografií s elektrochemickou detekcí, kterou popsal Lendersen et al. (43, s. 411, 413). 39

40 2 CÍLE 1. Optimalizovat podmínky analýzy pro coulometrickou detekci p i HPLC stanovení adrenalinu a noradrenalinu v plazm pomocí kitu firmy Bio-Rad ur eného pro amperometrickou detekci. 2. Validace metody p i pou ití coulometrické detekce. 3. Mezilaboratorní porovnání výsledk adrenalinu a noradrenalinu u pacientských vzork. 40

41 3 EXPERIMENTÁLNÍ ÁST 3.1 P ístroje, materiál, chemikálie P ístroje - analytické váhy AB (Metler - Toledo) - centrifuga (Megafuge 1.0 R, Heraeus sepatech) - Vortex (Velp scientifica) - T epa ka (LT 2) - HPLC sestava Agilent Technologies 1200 (Agilent Technologies, USA) o Degasser (Agilent Technologies) o Izokratická pumpa (Agilent Technologies) o Termostat kolony (Agilent Technologies) o Autosampler (Agilent Technologies) o Coulochemický detektor (Coulochem III, Esa) o PC a vyhodnocovací software Chem 32 (Agilent Technologies) Obrázek. 6: HPLC sestava Agilent

42 3.1.2 Dopl kový materiál - automatické pipety (Biohit) - mikrozkumavky - sklen né zkumavky (10 ml) - sklen né zkumavky zábrusové (10 ml) - odm rné ba ky - kádinky - falkonky - vá enky - vialky - inserty Kit na stanovení plazmatických katecholamin pomocí HPLC (Bio-Rad) - mobilní fáze - výrobce neudává slo ení mobilní fáze - reagent 1 - Tris pufr - reagent 2 - elu ní reagencie - reagent 3 - disi i itan sodný Na 2 S 2 O 5 - vnit ní standard - kalibra ní standard lyofilizovaný - extrak ní kolonky s oxidem hlinitým - elu ní vialky - návod P íprava reagencií P íprava reagentu 2 (R2) Reagent 2 je nutné p ed pou itím na edit HPLC vodou na pracovní koncentraci. ed ní bylo provedeno v pom ru 1 ml zásobního reagentu 2 a 19 ml HPLC vody. Na ed ný R2 je stabilní a 2 týdny, pokud se uchovává p i 2-8 C (46, s. 6). 42

43 P íprava reagentu 3 (R3) disi i itan sodný Byly p ipraveny dv koncentrace R3-0,1 % a 10 %. 0,1 % R3 byl pou it pro ed ní kontrolních a kalibra ních roztok. 0,025 g R3 bylo navá eno na analytických váhách, kvantitativn se p evedlo do odm rné ba ky (25 ml) a doplnilo HPLC vodou. 0,1 % R3 musí být pou it maximáln do 8 hodin. 10 % R3 byl pou it ke konzervaci vzork plazmy (zabra uje degradaci katecholamin ). Na analytických váhách se navá il 1 g R3, kvantitativn se p evedl do odm rné ba ky (10 ml) a doplnil HPLC vodou. 10 % R3 je stabilní 5 dní, pokud je uchováván p i 2-8 C (46, s. 7). P íprava vnit ního standardu (I.S.) Pracovní roztok vnit ního standardu byl p ipravován ze zásobního roztoku I.S. a pracovního roztoku R2 ve dvou krocích. 1. krok Do mikrozkumavky se napipetuje 10 µl zásobního roztoku I.S. a 400 µl pracovního R2. D kladn se promíchá. 2. krok Do sklen né zkumavky se zábrusem je odpipetováno 200 µl sm si z kroku 1, k tomu se p idá 5 ml pracovního R2. D kladn promíchat. Pracovní roztok I.S. byl rozd len do alikvót po 1 ml a skladován p i cca -70 C. Výrobcem udávaná stabilita pracovního roztoku je 1 m síc p i skladování v teplotách < -20 C (46, s. 6). P íprava kontrolních roztok Pro na i práci jsme pou ili kontrolní materiál od firmy Bio-Rad Lyphochek Endocrine controls. Rozmezí koncentrací kontrolního materiálu pro ni í hladinu bylo ng/l pro noradrenalin a ng/l pro adrenalin. Rozmezí koncentrací pro vy í hladinu bylo ng/l pro noradrenalin a ng/l pro adrenalin (viz tab. 3). Lyofilizované kontrolní vzorky byly rozpu t ny ka dý v 10 ml 0,1 % R3. Vzhledem k tomu, e rekonstituovaný kontrolní materiál je stabilní v 2-8 C jen 72 hodin, byly p ipraveny alikvóty po 1,1 ml, které byly skladovány p i cca -70 C. Stabilita vzorku je 1 m síc p i skladování v teplotách < -20 C (46, s. 8). 43

44 Kontrolní vzorek Noradrenalin (ng/l) Adrenalin (ng/l) nízká hladina vysoká hladina Tabulka. 3: Rozmezí kontrol P íprava kalibra ních roztok Kalibra ní roztok byl p ipraven z lyofilizovaného standardu, dodávaného firmou Bio-Rad jako sou ást kitu pro HPLC analýzu plazmatických katecholamin. Kalibra ní standard byl rozpu t n v 10 ml 0,1 % R3. P i skladování p i 2-8 C je stabilní t i dny. Stabilita p i skladování v teplotách < -20 C je 1 m síc (46, s. 7). Rekonstituovaný kalibra ní vzorek m l koncentraci 488 ng/l pro noradrenalin a 570 ng/l pro adrenalin. Ze zásobního roztoku bylo v dubletu p ipraveno 5 roztok o r zných koncentracích. Koncentrace noradrenalinu byly 30,5; 61; 122; 244 a 488 ng/l. Koncentrace adrenalinu byly 35,63; 71,25; 142,5; 285 a 570 ng/l. ed ní bylo provedeno do celkového objemu 4 ml podle tabulky. 4. výsledná koncentrace adrenalinu (ng/l) výsledná koncentrace noradrenalinu (ng/l) zásobní kalibra ní roztok (ml) 0,1 % Na 2 S 2 O 5 (ml) 35,63 30,5 0,25 3,75 71, ,5 3,5 142, Tabulka. 4: P íprava kalibra ních roztok 44

45 Konzervace vzorku Jeliko katecholaminy podléhají oxidaci, je nutné vzorky plazmy stabilizovat p idáním konzervantu. Pokud jsou vzorky extrahovány v krátké dob po odb ru (maximáln do 5 hodin), není nutné antioxidant p idávat. Ke vzork m plné krve bylo p idáno 50 µl 10 % Na 2 S 2 O 5. Poté byly vzorky centrifugovány 5 minut p i 3500 ot/min (rpm) a 4 C. Do plastové zkumavky bylo odpipetováno alespo 2,5 ml plazmy, která byla dále skladována p i cca -70 C (46, s. 6). 3.2 Extrakce katecholamin Na extrak ní kolonku bylo napipetováno 500 µl reagentu 1, 100 µl pracovního roztoku vnit ního standardu a 1 ml vzorku plazmy nebo kontroly. Kolonka se pevn uzav ela a nechala se 5 minut t epat na t epa ce. Poté byl spodek kolonky uvoln n, kolonka se vlo ila do sklen né zkumavky a byla centrifugována 2 min p i 1200 rpm. Odpad byl vylit a spodek kolonky byl op t uzav en. Následn byla kolonka promyta 1 ml HPLC vody. Kolonka se d kladn prot epala a centrifugovala 1 min p i 1200 rpm. Odpad byl vylit a krok promývání se opakoval s centrifugací 2 min p i 1200 rpm. Po tomto kroku musí být kolonka viditeln suchá, pokud tomu tak nebylo, centrifugace se opakovala. Na spodní ást kolonky byla nasazena elu ní vialka. Do suché kolonky bylo napipetováno 120 µl pracovního roztoku reagentu 2. Kolonka byla 30 s vortexována a poté centrifugována 2 min p i 1200 rpm. Vyextrahované katecholaminy byly p epipetovány do insert umíst ných v HPLC vialkách. K HPLC analýze bylo pou ito 50 µl eluátu. 3.3 Chromatografická analýza Chromatografická analýza probíhala p i pr toku mobilní fáze 0,7 ml/min a tlaku cca 150 kpa. Termostat kolony byl temperován na 35 C. Termostat autosampleru byl chlazen na 6 C. Nást ik vzorku na kolonu byl 50 µl. Katecholaminy byly detekovány elektrochemickým (coulometrickým) detektorem p i následném nastavení cel: na cele 1 byl nastaven potenciál 350 mv s rozsahem 100 na, cela 2 m la potenciál 0 mv s rozsahem 50 na a na guard cele byl nastaven potenciál také 0 mv s rozsahem 50 na. 45

46 Noradrenalin byl detekován p ibli n ve 4. minut, adrenalin p ibli n v 6. minut a reten ní as vnit ního standardu byl cca 9,5 minuty. Analýza jednoho vzorku trvala 19 minut. Noradrenalin Adrenalin Vnit ní standard Obrázek. 7: Chromatogram 4 VÝSLEDKY A DISKUSE 4.1 Optimalizace podmínek pro coulometrickou detekci Kit firmy Bio-Rad, který jsme v na í práci pou ili, byl vyroben pro amperometrickou detekci. Na ím úkolem bylo najít vhodné nastavení potenciál cel pro coulometrickou detekci. Byl p ipraven pracovní roztok test mixu dodávaného firmou Bio-Rad. P íprava test mixu - 50 µl zásobního roztoku bylo na ed no 2 ml pracovního roztoku reagentu 2. Po promíchání bylo z této sm si odpipetováno 100 µl, ke kterým bylo p idáno 5 ml pracovního roztoku reagentu 2. 46

47 K chromatografické analýze byl pou it pracovní roztok test mixu. Analýza probíhala za stejných podmínek, které jsou popsány v bod 3.3. Postupn byl m n n potenciál na cele 1, a to od 100 mv do 500 mv a na cele 2 se st ídal potenciál -100 mv a 0 mv. Tímto m ením jsme do li k záv r m, e zm ny potenciál na cele 2 nemají význam pro analýzu, a tak byl vybrán potenciál 0 mv, který byl dále pou íván. Zm ny potenciál na cele 1 jsou uvedené v grafu na obrázku. 8 pro adrenalin a na obrázku. 9 pro noradrenalin. Na ose x jsou vyneseny jednotlivé potenciály a na ose y je znázorn na odezva - plocha píku. Pro dal í analýzy bylo zvoleno nastavení potenciálu na 1. cele 350 mv. Obrázek. 8: Optimalizace potenciálu adrenalin Obrázek. 9: Optimalizace potenciálu noradrenalin 47

48 4.2 Validace metody Kalibrace Byla p ipravena 5 bodová kalibrace adrenalinu a noradrenalinu. Jednotlivé kalibra ní roztoky byly p ipraveny v dubletu s koncentracemi adrenalinu 35,63; 71,25; 142,5; 285 a 570 ng/l, koncentrace noradrenalinu byly 30,5; 61; 122; 244 a 488 ng/l. Kalibra ní k ivka byla v celém rozsahu lineární. Pro výpo et jednotlivých koncentrací adrenalinu byla pou ita rovnice regrese y = 0, x + 0, , kde y je plocha píku a x je koncentrace stanovovaného analytu. Pro výpo et koncentrací noradrenalinu byla pou ita rovnice regrese y = 0, x + 0, Hodnota regresního koeficientu (R 2 ) pro adrenalin je 0,99978 a pro noradrenalin 0, Hodnota regresního koeficientu nám udává míru rozptylu bod kolem regresní p ímky. Kalibra ní k ivky jsou uvedeny na obrázcích. 10 pro adrenalin a. 11 pro noradrenalin. Obrázek. 10: Kalibra ní k ivka adrenalinu 48