HPLC analýza dexamethasonu v topických přípravcích (Rigorózní práce)

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové HPLC analýza dexamethasonu v topických přípravcích (Rigorózní práce) Mgr.

2 Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Rigorózní práce vznikla za podpory projektu SVV

3 Děkuji Doc. RNDr. Jaroslavu Sochorovi, CSc. za cenné rady, připomínky a metodické vedení práce. 3

4 Obsah: 1. ÚVOD TEORETICKÁ ČÁST Chromatografické metody HPLC - vysokoúčinná kapalinová chromatografie Instrumentace Techniky kolonové kapalinové chromatografie Chromatografické parametry Termodynamika a kinetika separace Kvalitativní a kvantitativní vyhodnocování chromatogramů Programované a multidimenzionální techniky v kapalinové chromatografii Validace analytických metod Dexamethason HPLC analýza dexamethasonu v léčivých přípravcích (rešerše v odborné literatuře) CÍL PRÁCE PRAKTICKÉ PROVEDENÍ Použité přístroje, chromatografický materiál, chemikálie a léčivé látky HPLC podmínky hodnocení dexamethasonu Izolační postup VÝSLEDKY A DISKUZE Chromatografické podmínky Rozlišení Faktor symetrie píku Izolační postup Kalibrační křivka v masťovém základu L Sestrojení kalibrační křivky Ověření kalibrační křivky Kvantifikace dexamethasonu v topickém přípravku Kalibrační křivka standardu Sestrojení kalibrační křivky Kvantifikace dexamethasonu v topickém přípravku Validace vypracované metody izolace dexamethasonu z masťového základu Přesnost

5 5.5.2 Správnost Selektivita Linearita Detekční limit (LOD) a kvantitativní limit (LOQ) Robustnost Test způsobilosti ZÁVĚR LITERATURA ABSTRAKT ABSTRACT

6 1. ÚVOD 6

7 Kontrola léčiv plní jednu ze základních funkcí farmacie - zajišťuje jakost, bezpečnost a účinnost léčiv. Důležitost této funkce plyne, z hlediska pacienta, ze zaručení bezvadné kvality jimi používaných léčiv, ale také, z hlediska dnešního dravého farmaceutického trhu, z neustále se zvyšujících nároků při výzkumu, vývoji a výrobě léčiv. Na jakémkoliv stupni vývoje, v průběhu výroby, stejně jako v období, kdy je produkt již na trhu, je analýza kvality použitých surovin i hotových léčiv naprostým základem. Je nutno určit a zhodnotit bezpečnost, identitu, sílu, kvalitu, čistotu a stabilitu farmaceutických produktů. Kontrola léčiv zasahuje prakticky do všech oblastí farmacie - od výzkumu (kde se v dnešní době klade důraz na kontrolně- analytické hodnocení, stabilitní studie a na vývoj metodik pro hodnocení léčiv) a vývoje nových účinných látek přes analytické studie související s vývojem nejrůznějších lékových forem až po analytické monitorování léčiv a metabolitů v lidském organismu, které je v současné době jedním z nejprogresivnějších trendů v oblasti analýzy léčiv. S velkými výhodami se ve všech oblastech analýzy léčiv využívá vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Možnost současného určení totožnosti, obsahu i přítomnosti nečistot z jediného chromatografického záznamu, jak u účinných látek, léčivých přípravků, tak i u jejich složitých směsí, jako jsou masti, činí z HPLC rozsáhle využívanou a široce aplikovanou chromatografickou metodu analýzy. 7

8 2. TEORETICKÁ ČÁST 8

9 2.1 Chromatografické metody Jedná se o metody separační, které umožňují analýzu látek i jejich směsí. Jednotlivé složky jsou hodnoceny jak z kvalitativního tak z kvantitativniho hlediska. [1] Po zavedení vysokoúčinných kolon a s rozvojem chromatografické instrumentace se stala HPLC jednou z klíčových moderních analytických metod. V současné době se rozvoj chromatografických metod odehrává zejména v oblasti vysokoúčinné kapalinové chromatografie a plynové chromatografie. [2] Chromatografie využívá dělení analyzovaných látek mezi dvěma fázemi, z nichž jedna je stacionární (sorbent) a druhá mobilní. V průběhu chromatografického procesu dochází k postupnému, mnohokrát opakovanému vytváření rovnovážných stavů dělenýeh látek mezi stacionární a mobilní fází, která separované látky unáší. Při styku fází stacionární a mobilní s dělenými látkami dochází k vzájemným interakcím; k separaci dochází na základě různé afinity dělených látek ke stacionární a mobilní fázi. [1] Druhy interakcí: [3] a) hydrofobní interakce (van der Waalsovy síly) b) interakce dipól-dipól c) vodíková vazba d) elektrostatická interakce Obrázek č. 1.: Druhy interakcí Při průchodu separované složky kolonou přejde každá její molekula mnohokrát z mobilní fáze do fáze stacionární a zpět. Doba, po kterou separovaná látka setrvá v koloně, závisí na intenzitě interakcí. Čím intenzivnější jsou interakce ve stacionární fázi, tím větší je hodnota 9

10 elučního času. Látky lze chromatograficky dělit, liší-li se alespoň v některé fyzikálně chemické veličině, jež určuje míru jejich interakce ve stacionární a v mobilní fázi. [2] Chromatografické metody jsou členěny podle různých hledisek (např.: dle podstaty separačního procesu, dle uspořádání, dle charakteru mobilní fáze, apod.) Obrázek č. 2.: Schéma separace dělení [2] Různé analyty podléhají různé distribuci (rozdělování) mezi mobilní a stacionární fází. Rozdílné analyty jsou rozdílně zadržovány a rozdílně zpožďovány (retardovány). [1] 2.2 HPLC - vysokoúčinná kapalinová chromatografie Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC = High Performance Liquid Chromatography) je jednou z nejvýznamnějších moderních analytických metod. Umožňuje dělení, identifikaci a stanovení velkého počtu organických i anorganických látek. K dělení látek je možné využít všechny vratné dvoufázové separační mechanismy. Kapalinovou chromatografii lze provádět v uzavřeném (sloupcová chromatografie, HPLC) nebo v otevřeném (tenkovrstvá, papírová chromatografie) systému. [2] Hlavními přednostmi HPLC jsou kvalitativní a zároveň kvantitativní hodnocení separovaných složek, rychlost analýzy, citlivost stanovení, minimální množství vzorku, možnost automatizace. Pro své přednosti je HPLC s oblibou používána ve všech moderních lékopisech. [1] Využití HPLC: 1) Kontrolně- analytická oblast léčiv (totožnost, obsah, přítomnost nečistot) 2) Oblast stability léčiv (kvalitativní i kvantitativní hodnocení rozkladných 10

11 produktů; kvantitativní hodnocení postupného úbytku sledovaného léčiva) 3) Analýza přírodních léčiv v rostlinném materiálu 4) Oblast monitorování léčiv a jejich metabolitů v tělních tekutinách (krevní plazma, sérum, moč). [4] Instrumentace Přístroj se skládá z čerpacího systému, dávkovacího zařízení, chromatografické kolony, detektoru a počítače na kontrolování systému a na zpracování dat. Mobilní fáze je do systému přiváděna z jednoho nebo více zásobníků a protéká obvykle konstantní rychlostí kolonou a poté detektorem. [4] Z těchto komponentů mohou být sestaveny různé typy HPLC, od jednoduchých po mnohostranně automatické systémy. [5] Schéma kapalinového chromatografu Obrázek č.3.: Schéma HPLC sestavy [2] Kapalinový chromatograf se obvykle skládá z následujících částí: 1. zásobníky mobilní fáze 2. zařízení pro programování gradientu 3. směšovací zařízení 4. odplyňovací zařízení 5. vysokotlaké čerpadlo 6. tlumič tlakových pulsů 7. dávkovací zařízení 11

12 8. předkolona 9. kolona 10. detektor 11. jímač frakcí 12. vyhodnocovací zařízení, počítač [2] Vysokotlaká čerpadla 1) Pneumatická čerpadla Zdrojem energie je stlačený plyn. Plyn je zaveden přímo nad hladinu kapaliny nebo je od ní oddělen pomocí pístu. Při kontaktu plynu s kapalinou se plyn částečně v kapalině rozpouští. Výhodnější je oddělit plyn od kapaliny prostřednictvím pístu či membrány. Čerpadla jsou obvykle bezpulsní, velmi jednoduchá a levná. Přesnost kvantitativního vyhodnocení chromatogramu není obvykle vysoká. [2] 2) Velkoobjemová pístová čerpadla (lineární) Tlak na píst je vyvoláván mechanicky použitím elektromotoru. Pracovní objem čerpadel je 100 až 500 ml. Hlavní výhodou je konstantní průtok a nepulsující tlak; vysoká stabilita základní linie detektoru. Cena čerpadel je velmi vysoká z důvodu přesného opracování jednotlivých dílů. Stabilní průtok se ustavuje pomalu - za 15 až 60 minut. Čerpadlo se musí po několika hodinách práce plnit mobilní fází. Použitá mobilní fáze musí být odvzdušněna. Čerpadlo je vhodné pro práci s vysokými tlaky. [2] 3) Reciproční čerpadla s malým objemem činné části (dvojčinná) Charakteristickým znakem je zde pulsní tok mobilní fáze. Čerpaná kapalina je vytlačována pístem nebo membránou. Hlava čerpadla je opatřena dvěma ventily - sacím a výtlačným [2] Obrázek č. 4.: Reciproční HPLC čerpadlo [2] 12

13 Tlumení tlakových pulsů Nutné při použití recipročních čerpadel s malým vnitřním objemem. Možnost zařazení dalšího čerpadla pracujícího v opačné fázi. Možnost použití více čerpacích hlav s koordinovaným sáním a výtlakem. Často se používají čerpadla s programovaným pohybem pístu. Někdy se používají tlumiče pulsů (pružné trubice). Zbytkové pulsy na základní linii lze softwarově filtrovat a oddělovat. [2] Dávkovací zařízení Nejčastěji se v HPLC dnes používá injekční ventil s vyměnitelnou smyčkou, lze takto dávkovat velmi přesně daný objem vzorku a dosahuje se vysoké reprodukovatelnosti nástřiku. [3] Dávkovací ventil se skládá z pevného pouzdra s otočným jádrem. Smyčka je naplněna vzorkem pomocí mikrostříkačky. Při nepřerušeném průtoku mobilní fáze je otočením jádra dávkovací smyčka (mikrostříkačka naplněna vzorkem) zařazena do průtoku, přičemž proudící mobilní fáze vytlačí vzorek do kolony. [6] Autosamplery HPLC [7] Autosampler, neboli automatický dávkovač, je zařízení spojené se zásobníkem vzorku, do kterého se umísťují septem nebo zátkou uzavřené vialky (mikronádobky). Autosamplery se liší konstrukčním spojením injekční stříkačky dávkovače se zásobníkem vzorku, kdy je fixní buď injekční stříkačka nebo zásobník. V případě, že jsou fixní obě části autosampleru, je vialka dopravena roboticky pod jehlu injekční stříkačky dávkovače. Tok mobilní fáze kolonou by neměl být při dávkování přerušen, této podmínce více vyhovuje konstrukční spojení s fixním zásobníkem. Po každém dávkování je nutný k zamezení kontaminace vzorků (crossover, cross contamination) vnitřní i vnější oplach jehly. Kolony Pro analytické účely jsou nejčastěji dlouhé cm o vnitřním průměru 3-5 mm, většinou jsou vyrobeny z nerezové oceli či skla. [3] Chromatografickou kolonu volíme podle požadavků na analýzu a podle použité techniky. Vedle analytických kolon se setkáváme se speciálními kolonami preparačními o velkém průměru a délce. Podmínky analýzy je nutné volit kompromisně s ohledem na dobu 13

14 analýzy, požadované rozlišení a zatížení chromatografické kolony. Je-li požadováno vysoké rozlišení, doba analýzy se prodlouží, kolonu nelze zatěžovat dávkováním velkého objemu vzorku. Je-li nutné provést analýzu v co nejkratší době, bude dosaženo horšího rozlišení, kolonu nelze zatěžovat dávkováním velkého objemu vzorku. Je-li potřebné analyzovat velké objemy vzorků, doba analýzy se prodlouží a rozlišení bude dosahovat nižších hodnot. [2] Náplně chromatografických kolon (sorbenty, sorbenty s chemicky vázanou fází) Kolony jsou naplněny vhodnými sorbenty (o průměru zrn 3, 5 nebo 10 µm) [3]. Dle navázaných radikálů na hydroxylové skupiny silikagelových zrnek se rozlišují nepolární chemicky vázané fáze (tzv. reverzní fáze), uhlovodíkové řetězce obsahující 18 (popř. 8) uhlíkových atomů vázané k silikagelovým zrnkům. Kolona s octadecylovou náplní je často nazvývána ODS kolonou (ODS= octadecyl silica). [5] Dále se rozlišují středně polární fáze, kde navázaným radikálem je tříuhlíkatý řetězec zakončený skupinami NH 2 -CN aj. Jako polární sorbent se používá silikagel a oxid hlinitý, i když v daleko menší míře. [1] Sorbenty na bázi ZrO 2 jsou v poslední době hojně užívány. Předkolony a postkolony Předkolony se často používají k ochraně kolony při analýzách biologických materiálů. [2] Guard kolony, vložené mezi dávkovačem a kolonou a naplněné stejnou či podobnou stacionární fází jako kolona, zachycují složky ze vzorku s vysokou afinitou ke stacionární fázi (např. bílkoviny). [5] Předkolony a postkolony mohou být využity k derivatizaci analytu před vlastní kolonou, anebo za kolonou [2] Spojovací součásti Nejlepší je přímé napojení (žádné spojovací součásti). S rostoucím objemem spojovacích součástí se výrazně zvyšuje rozmývání zón analytů. Spojení dávkovače s kolonou a kolony s detektorem lze uskutečnit pomocí kapilár. [2] Detektory v HPLC Detektory v HPLC jsou obecně složitější a rozmanitější než detektory v GC. Detektor musí být kompatibilní s viskózními systémy s malými difúzními koeficienty. Detektor musí poskytovat odezvu dostatečně rychle. Detektor může být univerzální (reaguje na vlastnosti systému jako celku, např. refraktometrický) nebo selektivní (reaguje na určitou selektivní 14

15 vlastnost analytu, např. fluorescenční). Detektor může být destruktivní (AAS, AES) nebo nedestruktivní (UV/VIS). Detektory lze vhodně kombinovat (vícenásobná detekce). Detektor může pracovat ve více doménách (detektor s diodovým polem). Detektor by měl mít co nejmenší vnitřní objem. Druhy detektorů: - UV/VIS spektrometrický detektor- nejoblíbenější, nejčastěji používaný, selektivní - Spektrometrický detektor s diodovým polem- z křemíkové destičky s množstvím fotodiod; slouží zejména k posouzení čistoty; poskytuje trojrozměrný záznam - Fluorescenční detektor- použitelný pouze pro látky přímo fluoreskující nebo fluoreskující po derivatizaci. - MS (Mass Spectrometry) detektor- HPLC separace se provádí za vysokých tlaků, MS měření v hlubokém vakuu. - Amperometrický detektor- založena na měření limitních proudů - Coulometrický detektor- V HPLC často využívaný elektrochemický detektor [2] - Konduktometrický detektor- uplatnění nachází při analýzách v průběhu zpracování vody - Potenciometrický detektor / detektor ISFET (ion-selective field effect transistor) - Refraktometrický detektor- založen na měření indexu lomu Počítač Počítač se stal nepostradatelnou součástí HPLC. Zpracovává a vyhodnocuje data (např. kompletní vyhodnocení záznamu chromatogramu, výpočet koncentrace analytů z uložených dat ploch či výšek píků; etc.). Slouží též k řízení průběhu činností (kontroluje a monitoruje různé parametry jako je složení mobilní fáze, tlak, průtoková rychlost, teplota kolony a detektoru, dávkování vzorků, výběr detektoru etc.). Získávají se plně automatické systémy poskytující lepší analytický výkon a jednoduchou obsluhu. [5] 15

16 2.2.2 Techniky kolonové kapalinové chromatografie [2] Sloupcová kapalinová chromatografie V současné době se již v analytických laboratořích neuplatňuje. Původní chromatografické kolony měly průměr 1 až 5 cm a délku 20 až 150 cm. Průtok mobilní fáze byl u původních uspořádání zajišťován hydrostatickým tlakem. S vývojem kapalinové chromatografie se zmenšovala velikost částic náplně kolon. Dnes se většina analýz v oblasti kapalinové chromatografie provádí v režimu HPLC. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Vysoce instrumentálně pokročilá technika kapalinové chromatografie. Vysoké účinnosti separačního procesu je dosaženo použitím kolon plněných stacionární fází o malé a dobře definované velikosti částic anebo kolon monolitických. Kolony pro HPLC se vyznačují vysokou hustotou a homogenitou náplně. Pro dosažení dostatečného průtoku je potřeba aplikovat tlak jednotek až desítek MPa. 1. adsorpční kapalinová chromatografie Interakce analytů se stacionární fází je založena na procesu adsorpce. Distribuční konstanta zde závisí na celé řadě proměnných (objem monomolekulární vrstvy rozpouštědla, aktivita adsorbentu, eluční síla rozpouštědla). Je žádoucí, aby docházelo pouze k fyzikální adsorpci, nikoliv k chemické interakci. Snažíme se pracovat v lineární části adsorpční izotermy. Pracujeme-li v nelineární části adsorpční izotermy, získáme chvostující píky. Mezi nejběžnější adsorbenty patří silikagel či alumina. Silikagel má slabě kyselé vlastnosti (lze jej použít při ph = 2 až 8). Alumina je vhodná pro analýzu silně bazických látek. Uplatnění nacházejí také uhlíkaté organické sorbenty. Jako mobilní fáze se často používá nepolární uhlovodík + polární modifikátor. Voda má schopnost potlačovat adsorpci. Adsorpční kapalinová chromatografie je zvláště vhodná pro analýzy strukturních izomerů (například fenolů). Adsorpční chromatografie nemůže být prováděna s gradientovou elucí. 2. chromatografie na chemicky vázaných fázích Dnes zahrnuje asi 80 % všech aplikací HPLC. Na nosič (obvykle silikagel) jsou vázány různé funkční skupiny. Nejběžnější jsou dnes chemicky vázané fáze siloxanového typu (připravované reakcí silikagelu s chlorsilany). Nevýhodou použití silikagelu jako nosiče je 16

17 omezení v hodnotách ph, pracovat lze pouze při ph v rozmezí 2 až 8, při jiném ph se může odtrhávat navázaná fáze. Příkladem chemicky vázaných skupin jsou: C4, C8, C18, CN-, fenyl, chirální látka. Nezreagované OH skupiny silikagelu je nutné deaktivovat, aby nepůsobily jako sorbent. Podle druhu navázané funkční skupiny lze analyzovat rozličné soluty. Chirální chemicky vázané fáze například umožňují analýzu opticky aktivních izomerů. Přesný popis procesu separace na chemicky vázaných fázích je velmi obtížný. Základem separace je solvofobní (hydrofobní) efekt a síly namířené proti němu. Pro průběh separačního děje jsou významné interakce analytu s mobilní a stacionární fází a rozdělování analytu mezi mobilní a stacionární fázi. Chromatografie na obrácených fázích Použité stacionární fáze mají nepolární charakter. Velmi často se dnes používá chemicky vázaná fáze C18 (oktadecylsiloxanová). Na C18 vázané fázi lze analyzovat látky nepolární i látky iontové. Jako mobilní fáze se používá voda s přídavkem polárních organických rozpouštědel (alkoholy, acetonitril, dioxan, tetrahydrofuran, aceton). Eluční síla mobilní fáze roste s její klesající polaritou. Chromatografie na obrácených fázích je vhodná pro dělení látek v homologických řadách. Použití obrácených fází v HPLC dnes převládá. Chromatografie iontových párů Analýza látek iontové povahy se zde provádí na chemicky vázaných fázích, často na C18 stacionární fázi. Mobilní fáze vždy obsahuje iontově párové činidlo s opačným nábojem, než je náboj analyzovaných iontů. Pro analýzu aniontů lze jako iontově párové činidlo použít tetraalkylamoniové sole. Pro analýzu kationtů může sloužit jako iontově párové činidlo dodecylsíran sodný a nebo sodné soli alkylsulfonových kyselin. Vzniklý iontový pár se chová jako organická molekula a přechází z vodné mobilní fáze do fáze stacionární. 3. iontově výměnná chromatografie (IEC) Technika vhodná pro dělení látek iontové povahy založená na elektrostatické interakci. Analyt v průběhu separace difunduje směrem k měniči iontů, následovně difunduje měničem, kde dojde k vlastní iontové výměně. O rychlosti děje a o účinnosti separace rozhoduje rychlost procesu difúze. Vhodnou volbou iontoměniče lze měnit parametry a možnosti separace. V iontově výměnné chromatografii se běžně využívají různé druhy katexů a 17

18 anexů. Parametry separace jsou závislé na velikosti a náboji iontů, na iontové síle mobilní fáze, na stupni solvatace, na stupni zesíťování a botnání ionexu. Afinita k ionexu roste s rostoucím nábojem iontu. Při stejném náboji iontů se zvyšuje afinita k ionexu s rostoucím atomovým číslem. Při stejném náboji a podobné velikosti iontů se přednostně zachytí na iontoměniči ionty přítomné v největší koncentraci. Velké organické ionty mají velkou afinitu k iontoměniči. Při vysokých teplotách a koncentracích jsou rozdíly v afinitě k iontoměniči malé. Volba mobilní fáze je v IEC empirická (obvykle mm pufry). Metoda IEC je vhodná pro analýzu silných elektrolytů (látek iontové povahy). Zvláště významná je možnost analýzy aniontů ve vzorcích vod. Zajímavá je rovněž možnost analýzy sacharidů po převedení na iontovou formu reakcí s kyselinou boritou. Při analýze metodou IEC lze s úspěchem používat gradientové eluce. 4. vylučovací - gelová permeační chromatografie Založena na nerovnovážném ději - na sítovém efektu. Separace je závislá na velikosti a tvaru částic analyzované látky a stacionární fáze. Mobilní fáze pouze unáší analyty kolonou, separačního procesu se přímo neúčastní. Velké molekuly (makromolekuly) nepronikají do pórů gelu a eluují jako první. Malé molekuly pronikají do pórů gelu, jejich pohyb kolonou se zpomaluje. Experimenty lze provádět v režimu HPLC i klasické sloupcové chromatografie. Vylučovací limit = velikost částic, které již nebudou pronikat do pórů a nebudou separovány na vylučovací koloně. Pomocí vylučovací chromatografie lze určovat molekulové hmotnosti. Většinou se jako gel používají organické polymery (kopolymer styren + divinylbenzen). Vhodné je též použití porézních, rigidních skel a silikagelu. Agarosové a dextranové gely se nehodí pro HPLC, neboť nevydrží vysoké tlaky. Mobilní fáze musí rozpouštět analyty, nesmí reagovat se soluty ani se stacionární fází, musí smáčet povrch stacionární fáze a být kompatibilní s detektorem (např.: voda a vodné roztoky pufrů). Vylučovací chromatografie je vhodná pro analýzy makromolekulárních látek (např.: analýza proteinů a peptidů). Zajímavou aplikací je analýza alergenů (včelí, vosí, psí, kočičí, travní). 18

19 Obrázek 5: Mechanismus separace látek gelovou permeační chromatografií [2] 5. bioafinitní chromatografie Experimenty lze provádět v režimu HPLC i klasické sloupcové chromatografie. Založena na specifické interakci mezi biologicky aktivními látkami a protilátkami (např.: protilátka antigen, enzym substrát). Bioafinitní chromatografii lze použít k separaci, izolaci a k čistění složek vzorku. Stacionární fáze se nejprve musí navázat na vhodný inertní nosič. Ligand (stacionární fáze) musí mít velikou afinitu pro stanovovanou látku. Při analýze dochází k interakci mezi soluty a ligandem vázaným na inertním nosiči. Vazbu mezi ligandem a analytem lze následně rozrušit změnou experimentálních podmínek a použitím deformujícího pufru Chromatografické parametry RETENČNÍ DATA Retenční čas a retenční objem Měření retence v eluční chromatografii může být vyjádřeno retenčním časem (t R ) přímo definovaným polohou vrcholu píku na chromatogramu. Retenční (elučni) čas je 19

20 doba, která uplyne od nástříku vzorku do dosažení maxima eluční křivky a eluční objem je proteklý objem mobilní fáze za tuto dobu. [8] Z retenčního času může být vypočítán retenční objem (V R ) podle vzorce: [4] VR = t R. v t R - retenční čas; v- průtoková rychlost mobilní fáze. Hmotnostní distribuční poměr Známý jako kapacitní faktor k nebo retenční faktor k Hmotnostní distribuční poměr (D m ) je definován jako: [4] D m = množství rozpuštene látky ve stacionárni fázi množství rozpuštene látky v mobi lní fázi D m = K C V V S M K C - rovnovážný distribuční koeficient (známý jako distribuční konstanta); V S - objem stacionární fáze; V M - objem mobilní fáze. Hmotnostní distribuční poměr složky může být určen z chromatogramu s použitím vzorce: [4] D m t = R t t M M t R - retenční čas (nebo objem) nebo vzdálenost podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího dané složce; t M - mrtvý čas (nebo objem) nebo vzdálenost podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího nezadržované složce. 20

21 Distribuční koeficient Eluční charakteristika látky na určité koloně ve vylučovací chromatografii může být dána distribučním koeficientem (K 0 ), který se vypočítá ze vzorce: [4] K 0 t = t R t t t M M t R - retenční čas (nebo objem) nebo vzdálenost podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího dané složce; t M - mrtvý čas (nebo objem) nebo vzdálenost podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího nezadržované složce; t t - retenční čas (nebo objem) nebo vzdálenost podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího složce, která může volně pronikat do všech pórů stacionární fáze. CHROMATOGRAFICKÁ DATA Záznam odezvy chromatografického detektoru na čase se nazývá chromatogram. Zóny separovaných látek procházející detektorem jsou zaznamenávány jako koncentrační profily (chromatografické píky). V ideálním případě je chromatografický pík symetrický a má Gaussovský tvar [2] 21

22 [3] Obrázek č.6.: Tvary píků Pík může být definován plochou píku (A) nebo výškou píku (h) a šířkou píku v poloviční výšce (w h ) nebo výškou píku (h) a šířkou píku mezi body inflexe (w i ). Pro gaussovské píky platí vzorec: [4] W = 1, 18 h w i Faktor symetrie Faktor symetrie píku (A s ) (nebo faktor chvostování píku) se vypočítá ze vzorce: [4] w A s = 2d 0,05 W 0,05 - šířka píku v jedné dvacetině jeho výšky; d- vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině jeho výšky. Hodnota faktoru symetrie 1,0 značí úplnou (ideální) symetrii píku. [4] Účinnost separačního procesu Účinnost chromatografické kolony klesá s rostoucí rychlostí rozmývání zón separovaných analytů. [2] Účinnost kolony charakterizuje, jak moc se zóny separovaných látek na koloně rozšiřují. [3] K porovnání účinností kolon různých délek se používá údaj o počtu teoretických pater na jednotku délky kolony nebo údaj o výšce teoretického patra H. [2] 22

23 Kinetiku procesu rozmývání zón (mírou účinnosti chromatografické kolony) popisují následující teorie: - teorie chromatografického patra (Martin a Synge, 1941) - van Deemterova dynamická teorie (van Deemter, 1956) [2] 1) Teorie chromatografického patra Vychází z hypotetického předpokladu, že kolona může být rozdělena na sled elementárních jednotek pater. [2] Teoretické patro je pomyslná část kolony, ve které dochází k ustavení rovnováhy mezi mobilní a stacionární fází. Délka této části kolony se nazývá výškový ekvivalent teoretického patra H. [9] V rámci jednoho patra se uskuteční kompletní elementární separační krok. Tato teorie (odvozená z diskontinuálních procesů vícestupňové extrakce a kolonové destilace) nemůže být přijata bez výhrad. Pro praxi však přináší výhodné vyjadřování účinnosti chromatografických kolon počtem teoretických pater a výškou teoretického patra. [2] a) počet teoretických pater dané kolony Za předpokladu Gaussovského symetrického píku lze počet teoretických pater vyjádřit: [2] n = t 2 R,i / σ 2 i [2] [3] n - počet teoretických pater kolony t R,j - retenční čas látky j; nebo vzdálenost (nebo objem) podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmici spuštěné z vrcholu píku odpovídajícího dané složce σ i - pološířka příslušného chromatografického píku v inflexním bodě w j - šířka píku při základně w 1/2j - šířka píku v polovině výšky Údaj o počtu teoretických pater musí být vždy doprovázen informací o délce kolony a o použité testovací látce. [2] Hodnoty t R a w h musí být vyjádřeny ve stejných jednotkách (času, 23

24 objemu nebo vzdálenosti). Zdánlivý počet teoretických pater se mění se stanovovanou složkou, kolonou a retenčním časem. [4] b) výškový ekvivalent teoretického patra (porovnávání účinností kolon různých délek) L délka kolony Obrázek č.7.: Určení účinnosti kolony na základě chromatografických údajů [3] Kolona je tím účinnější, čím více má teoretických pater a čím menší má výškový ekvivalent teoretického patra. 2) Dynamická van Deemterova teorie Umožňuje popsat, které procesy přispívají k rozmytí zón separovaných látek. [2] 24

25 Obrázek č. 8.: Příčiny rozšiřování (rozmývání) zón (čtyři nezávislé aditivní procesy): [3] 1. Vířivá difúze v mobilní fázi (Hv) 2. Podélná molekulární difúze v mobilní fázi (Hp) 3. Odpor proti přenosu hmoty ve stacionární fázi (Hs) 4. Odpor proti přenosu hmoty v mobilní fázi (Hm) [3] Tato interpretace dobře vystihuje podmínky plynové chromatografie s použitím náplňových kolon. [2] Výšku teoretického patra lze vyjádřit jako součet dílčích příspěvků: H = H v + H p + H s + H m H = A + B / u + (C s + C m ) u H = A + B / u + C u [3] H - výška teoretického patra H v - příspěvek vířivé difúze k výšce teoretického patra H p - příspěvek molekulární difúze k výšce teoretického patra H s - příspěvek odporu proti přenosu hmoty ve stacionární fázi k výšce teoretického patra H m - příspěvek odporu proti přenosu hmoty v mobilní fázi k výšce teoretického patra A - konstanta vířivé difúze B - konstanta podélné molekulární difúze C M - konstanta závislá na difúzním koeficientu analytu v mobilní fázi C S - konstanta závislá na difúzním koeficientu analytu ve stacionární fázi u - průtoková rychlost mobilní fáze 25

26 Obrázek č. 9.: Závislost výškového ekvivalentu teoretického patra (H) na lineární průtokové rychlosti mobilní fáze (u) [2] ; v jejím minimu najdeme optimální lineární rychlost; závislosti, které získáváme z experimentálně určených počtů teoretických pater pro různé lin. rychlosti mobilní fáze, jsou plošší; pracuje se s takovou rychlostí mobilní fáze, při které je separace dostatečně účinná a ještě dosti rychlá- volí se rychlost poněkud vyšší než odpovídá přesně minimu křivky bez výrazné ztráty na účinnosti separace. [9] ; a) Vířivá difúze v mobilní fázi Souvisí s nehomogenitou stacionární fáze. Mobilní fáze proudí v širších kanálcích rychleji než v kanálcích užších. Molekuly procházející různými kanálky postupují různou rychlostí (různé molekuly musí urazit různé vzdálenosti [3] ). Příspěvek vířivé difúze k rozmytí zón je závislý pouze na rozměrech částic a pravidelnosti uspořádání náplně kolony (nezávisí na u). U náplňových kolon není možné člen A van Deemterovy rovnice eliminovat, naopak u kapilárních kolon tento člen odpadá. b) Molekulová difúze v mobilní fázi Molekuly látky difundují z místa s vyšší koncentrací do místa s koncentrací nižší. Molekuly se takto pohybují ve směru toku mobilní fáze i proti toku mobilní fáze. Molekulová difúze je popsána podle Fickových zákonů. Molekulová difúze se uplatňuje zejména při malých průtokových rychlostech. 26

27 Příspěvek je velký v plynové chromatografii při malém průtoku nosného plynu, naopak při hodnotách průtoku mobilní fáze běžných v kapalinové chromatografii je zanedbatelný. [2] c) Odpor proti přenosu hmoty v mobilní a ve stacionární fázi Rychlost převodu hmoty mezi fázemi je určována především difúzí analytu ve stacionární nebo stagnantní mobilní fázi v pórech nosiče [2] (rychlostní profil mobilní fáze uvnitř kanálku je parabolický [3] ). Rychlost převodu hmoty je rovněž závislá na tvaru a velikosti zrn náplně a na tloušťce vrstvy stacionární fáze [2] (různé molekuly difundují různě hluboko do stacionární fáze [3] ). SEPARAČNÍ DATA Rozlišení Hlavním cílem chromatografických metod je dosáhnout dobrého rozdělení analyzovaných látek v přijatelném čase. [8] Rozlišení charakterizuje míru relativní separace popř. míru vzájemného překrývání dvou sousedních píků. [3] Ani v koloně, která má vysoký počet teoretických pater, nemusí dojít k dokonalé separaci dvou složek. K vyjádření účinnosti, s jakou se od sebe separují dvě složky 1 a 2, se používá veličina rozlišeni R 1,2. Čím je rozlišení větší, tím jsou dvě složky lépe separovány. Při hodnotě rozlišení 1 nastává separace z 95%, při rozlišení 1,5 již z 99%. [9] Rozlišení větší než 1,5 odpovídá rozdělení píků na základní linii. Pro píky, které se vzájemně značně liší svými výškami, nemusí být výše uvedený vzorec vhodný. [4] Rozlišení (R s ) mezi píky dvou složek, které mají podobnou výšku, může být vypočteno ze vzorce: [4] 1,18 ( t t ) R s = w h1 R2 + w h2 R1 kde t R2 > t R1 t R1 a t R2 - retenční časy nebo vzdálenosti podél základní linie od bodu nástřiku ke kolmicím spuštěným z vrcholů dvou sousedních píků; w h1 a w h2 - šířky píků v poloviční výšce. [4] Míru rozlišení lze určit na základě údajů odečtených z chromatogramu (t R,2 ; t R,1 ; w h1 ; w h2 ) 27

28 Obrázek č. 10.: Určení míry rozlišení na základě chromatografických údajů [3] [3] [3] Obrázek č. 11.: Míra překrývání Obrázek č. 12.: Míra překrývání Vztah mezi rozlišením a selektivitou, kapacitou a účinností je dán rovnicí: [2] R 1,2 = F sel. F kap. F úč / 4 1. Faktor selektivity: F sel = (r 1,2 1) / r 1,2 Selektivita systému je určena volbou stacionární a mobilní fáze. Mírou selektivity je relativní retence r 1,2 (r 1,2 = V R,1 / V R,2 = k 1 / k 2 ). Selektivitní faktor je faktor termodynamický a lze jej vyjádřit pomocí separačního faktoru α. Rozlišení je přímo úměrné výrazu (1 α) a blíží se 0, když α se blíží 1. Rozlišení lze ovlivnit změnou mobilní a stacionární fáze a změnou rychlosti průtoku mobilní fáze. [2] 2. Faktor kapacity: F kap = k 1 / (k 1 + 1) Rozlišení roste se vzrůstající hodnotou kapacitního poměru. Kapacitní poměr je možné ovlivnit množstvím stacionární fáze v koloně, změnou stacionární nebo mobilní fáze a změnou teploty. [2] 28

29 3. Faktor účinnosti: F úč = n 1/2 Kinetický faktor související s počtem teoretických pater kolony. Faktor účinnosti lze ovlivnit délkou kolony, rychlostí průtoku mobilní fáze, velikostí částeček stacionární fáze a teplotou. [2] Poměr výšky píku k sedlu Jestliže není zcela oddělena nečistota od analyzované látky, lze použít jako kritérium způsobilosti systému ve zkouškách na příbuzné látky poměr výšky píku k sedlu (p/v): [4] p / v = H H p v H p - výška píku nečistoty nad extrapolovanou základní linií; H v - výška nejnižšího bodu křivky oddělující píky nečistoty a analyzované látky (sedlo) nad extrapolovanou základní linií Termodynamika a kinetika separace [3] Termodynamika separace se zabývá vlivy, které ovlivňují -velikost interakce mezi sorbentem a analytem -zadržování (retenci) a zpožďování (retardaci) analytů -rychlost migrace analytů kolonou -rozdíl v retenčních časech analytů -dělení analytů od sebe navzájem Kinetika separace se zabývá vlivy, které ovlivňují rozšiřování (rozmývání) zón analytů během postupu kolonou a šířky píků v chromatogramu. Zóny dělených látek (analytů) se během postupu kolonou rozšiřují. Zóně analytu v chromatogramu odpovídá pík neboli eluční křivka, která charakterizuje koncentrační profil analytu v zóně. 29

30 Obrázek č. 13.: Zóny dělených látek (analytů) se během postupu kolonou rozšiřují. Zóně analytu v chromatogramu odpovídá pík neboli eluční křivka, která charakterizuje koncentrační profil analytu v zóně. Termodynamika a kinetika separace spolu úzce souvisí a obě dvě určují, jak moc se sousední píky v chromatogramu překrývají; tj. jak dokonale nebo nedokonale jsou zóny sousedních analytů vzájemně odděleny; ovlivňují rozlišení sousedních píků v chromatogramu. Obrázek č. 14.: Vliv termodynamiky a kinetiky separace na rozlišení sousedních píků v chromatogramu 30

31 2.2.5 Kvalitativní a kvantitativní vyhodnocování chromatogramů [3] a) kvalitativní analýza K charakterizaci analytů lze použít absolutní vyjádření retence pomocí kapacitních faktorů (je však závislé na experimentálních podmínkách) Výhodnější je relativní vyjádření retenčních hodnot, kdy se redukovaný retenční čas (objem) vztahuje na hodnotu relativního retenčního času (objemu) standardu. Standard se svou chemickou povahou a chromatografickým chováním musí co nejvíce podobat analyzovaným látkám. Oblíbeným způsobem vyjadřování retenčních dat je vyjadřování pomocí Kovatsových retenčních indexů [2] Při identifikaci látek, pro které není k dispozici standard nebo údaje z literatury, se využívá závislosti retenčních dat v homologických řadách, selektivních detektorů nebo identifikace na základě skupinových reakcí. [10] b) kvantitativní analýza Obsah látky ve vzorku se určuje vždy relativně s použitím standardů. 1. metoda vnějšího standardu spočívá ve dvou krocích: 1. nejprve se na kolonu nastříkne roztok analyzovaného vzorku a zaregistruje se chromatografický záznam, 2. následně se provede nástřik roztoku vnějšího standardu (nejčastěji standard sledované látky) a opět se registruje jeho chromatogram. Koncentrace stanovované látky se pak vypočítá z úměry plochy (výšky) píku analyzované látky a plochy (výšky) píku vnějšího standardu, jehož koncentraci známe.. [10] 2. metoda vnitřní normalizace Základní podmínkou je, aby všechny složky analyzované směsi byly eluovány. Detektor musí poskytovat lineární, stejně velkou odezvu pro stejné koncentrace všech analyzovaných látek. Procentuální složení směsi se pak určí ze změřených ploch všech elučních křivek (analytických signálů, píků). Metoda je velmi jednoduchá, je však problematická, pokud jsou odezvy detektoru pro různé analyty odlišné. [2] 3. metoda absolutní kalibrace Metoda je založena na dávkování známých množství vzorku a standardu za stejných experimentálních podmínek. Vyhodnocení se provádí podle kalibrační křivky nebo přímým 31

32 srovnáním ploch získaných analytických signálů (píků). Musím znát alespoň dva nástřiky do kolony (vzorek + standard). [2] 4. metoda vnitřního standardu Ke známému objemu roztoku vzorku se přidá definovaný objem roztoku vhodného vnitřního standardu a po promíchání se provede analýza. Koncentrace stanovovaných látek se vypočítá z poměru plochy (výšky) píku stanovované složky a plochy (výšky) píku vnitřního standardu. Metoda vnitřního standardu je méně časově náročná a hlavně přesnější z toho důvodu, že není zatížena chybou dvojího nástřiku. Výběr vhodného vnitřního staudardu však klade nároky na odbornou erudikaci hodnotící osoby a to zvláště při analýze vícesložkových směsí. Vnitřní standard by měl být eluován v blízkosti píků vyhodnocovaných látek, být chemicky inertní k těmto látkám a také by měl mít podobný charakter a koncentraci. [10] 5. metoda standardního přídavku Metoda je založena na přídavku definovaného množství stanovované látky ke vzorku. Provádějí se dvě analýzy, první s původním vzorkem, druhá se vzorkem po přidání daného množství stanovované látky. Zvětšení plochy píku je přímo úměrné přidanému množství analytu. [2] Programované a multidimenzionální techniky v kapalinové chromatografii [2] Základní dimenzí v chromatografii je pohyb směrem z injektoru do detektoru. U jednodimenzionálních separací nikdy nemáme jistotu, že získané signály odpovídají jediné detegované látce. Každý nový pohled na separační systém poskytuje nové informace a přispívá ke snížení zbytkové nejistoty. Gradientová eluce je rovněž multidimenzionální technikou. 1) Eluce s programovaným průtokem mobilní fáze Zkrácení analýzy je přímo úměrné zvýšení průtoku mobilní fáze. Přímo úměrně zvýšení průtoku mobilní fáze roste i pracovní tlak. Při programování průtoku je důležité, aby člen C van Deemterovy rovnice byl co nejmenší a nedocházelo ke zmenšení účinnosti dělení. 2) Eluce s programovanou teplotou Zvýšení teploty se projeví zmenšenou sorpcí analytů a urychlením eluce. K řízení teploty slouží programované termostaty. Programování teploty se provádí u chromatografie na chemicky vázaných fázích a u chromatografie na měničích iontů. Možnosti použití některých detektorů při programování teploty jsou omezené. 32

33 3) Programování stacionární fáze Jedná se zejména o techniku přepínání kolon. Používá se několik kolon spojených vedle sebe nebo za sebou. K dělení slouží eluent o konstantním složení, ale určité skupiny látek se mohou dělit na různých kolonách nebo na různých kombinacích kolon. Při zapojení dvou stejných kolon o počtu n teoretických pater za sebou získáme 2 1/2.n teoretických pater (účinnost je úměrná druhé odmocnině z délky kolony). Při zapojení dvou odlišných chromatografických kolon (RP, IEC) o počtu n teoretických pater má výsledná separační soustava n 2 teoretických pater. 4) Gradientová eluce Nejúčinnější a nejpoužívanější technika programování podmínek v HPLC. Složení mobilní fáze se mění s časem. Koncentrační gradient lze charakterizovat pomocí tří parametrů: počáteční koncentrace účinné eluční složky v mobilní fázi, strmosti gradientu a tvaru gradientu. Nejčastěji se používá gradient lineární, někdy též gradient exponenciální či logaritmický. Při analýze na chemicky vázaných nepolárních fázích se zpravidla používá gradient methanolu nebo acetonitrilu ve vodě. V iontově výměnné chromatografii se využívá obvykle gradientů iontové síly a ph. 33

34 2.3 Validace analytických metod Smyslem validace je demonstrovat, že vypracovaná metoda je pro daný účel vhodná. Je to proces, při kterém se zjišťují nejdůležitější charakteristiky metody, určují podmínky, za kterých je zkušební postup použitelný, a procesem kterým se zajišťuje stejná spolehlivost při opakovaném použití v jedné nebo i v různých laboratořích. Provádí se při vývoji nové metody, v případě změny metody, při přenesení metody do jiné laboratoře, nebo při průkazu rovnocennosti dvou metod. Zpracuje se validační protokol dle zjištěných hodnot validačních parametrů a musí obsahovat též patřičnou dokumentaci (např. chromatogramy). [11] Podle zamýšleného použití a účelu analytické metody monitorování kvality léčiv se ověřují následující parametry, které pro analytickou metodu splňují nezbytné požadavky. Správnost (accuracy) Správnou hodnotu lze zjistit nejčastěji přípravou modelového vzorku ze všech složek přípravku a přesně přidaného standardu (analýza nejméně šesti vzorků), nebo se analyzuje přípravek se známým přídavkem standardu (nejsou- li k dispozici všechny složky přípravku). Vyjadřuje se jako shoda správné a získané hodnoty (těsnost mezi získaným výsledkem a správnou hodnotou) nebo jako výtěžnost, udávaný v procentech [11] : nalezená hodnota vyteznost ( recovery) = 100 správná hodnota Správnost kombinuje přesnost a pravdivost, tj. vlivy náhodných a systematických faktorů. Za předpokladu, že výsledky použité metody vykazují nulovou nebo malou chybu, správnost se rovná přesnosti. [12] Přesnost (precision) Přesnost je míra shody mezi jednotlivými výsledky metody opakovaně získanými s jedním homogenním vzorkem. Obvykle se tento vzorek analyzuje šestkrát kompletním postupem včetně přípravy vzorku a přesnost se pak vyjádří jako relativní směrodatná odchylka (RSD) těchto šesti stanovení. [11] RSD = 100 x směr. odchylka / průměr 34

35 Závisí na rozdělení náhodných chyb a nemá vztah ke skutečné hodnotě. [12] Podle podmínek opakování se rozlišují tři úrovně přesnosti: - Opakovatelnost (repeatability) metoda se opakuje stejným způsobem jedním pracovníkem se stejnými činidly na tomtéž přístroji. [11] Je vlastností metody, ne výsledku; [12] - Mezilehlá přesnost (intermediate precision) - metoda se provádí s různými činidly, analytiky i přístroji, v různých dnech, ale v jedné laboratoři a se stejným zhomogenizovaným vzorkem; - Reprodukovatelnost (reproducibility) - provedení je stejné jako u mezilehlé přesnosti, ale probíhá v různých laboratořích. [11] Selektivita (selectivity), specificita (specificity) Selektivita metody je vlastnost změřit správně a specificky danou látku v přítomnosti jiných látek, jež lze očekávat. To mohou být další účinné látky u složených přípravků, pomocné látky, nečistoty z výroby, rozkladné produkty, zbytková rozpouštědla. [11] Selektivita se mění s obsahem, (množstvím, koncentrací) analytu a někdy i v závislosti na nastavení parametru metody (souvislost s robustností). [13] Tento parametr se doloží výsledky analýzy standardu, a dále např. vzorků bez analyzované látky obsahujících všechny složky přípravku, rozkladné produkty, nečistoty. [11] Mírou selektivity je známý, kvantitativním způsobem vyjádřený vliv matrice. [13] Specificita je schopnost měřicího postupu stanovovat pouze tu měřenou veličinu, která má být stanovena. [13] Specifičnost metody udává rozsah měření, do kterého může být jednotlivý analyt (skupina analytů, složka) stanoven v komplexní směsi, aniž by došlo k interferenci s ostatními složkami ve směsi (je oproštěn od vlivu matrice). O metodě, která je naprosto selektivní (limitně) pro analyt nebo skupinu analytů, říkáme, že je specifická. [12] Detekční limit (LOD) a kvantitativní limit (LOQ) LOD Mez detekce je nejnižší detekovatelná koncentrace látky, nestanovované kvantitativně (nejmenším množstvím analytu ve vzorku, které může být detekováno). Vyjadřuje citlivost metody a u neinstrumentálních metod se hledá experimentálně. [11] Mez detekce závisí na poměru signál/šum. [12] U instrumentálních metod se může určit jako koncentrace 35

36 analyzované látky s poměrem signálu k šumu s hodnotou 3. [11] Šum je limitující faktor citlivosti detektoru, kdy výška jednoznačně detekovatelného píku musí být dvojnásobek šumu základní linie. [15] Nalezený detekční limit se ověří analýzou příslušné koncentrace vzorku. [11] Ke kvalitativnímu určení se obvykle pokládá výška píku (mez detekce) trojnásobku šumu. [15] LOD = 3 S K n b [14] 1 (plocha píku/ výška píku) / (plocha píku/ koncentrace analytu) směrodatná odchylka šumu Směrodatná odchylka šumu se odhaduje při měření slepého vzorku ze záznamu šumu v okolí retenčního času stanovované látky. Středem šumu se vede nulová linie a od ní se změří největší kladná (r + ) a záporná (r - ) amplituda šumu. Směrodatná odchylka S n se určí: [14] s n = (r + - r - ) / 5 LOQ Mez stanovitelnosti je nejnižší koncentrace látky, stanovitelná s přijatelnou přesností a správností. Stejně jako mez detekce vyjadřuje citlivost metody. [11] Zjišťuje se za použití vhodného vzorku, obvykle to bývá nejnižší bod kalibrační křivky. [12] Často se vyjadřuje jako koncentrace s poměrem signálu k šumu s hodnotou 10. Za limitující relativní směrodatnou odchylku se považuje 10 %, proto je možné kvantitativní limit vyjádřit jako koncentraci, při jejíž analýze se dosáhne této relativní směrodatné odchylky. Obvykle to bývá trojnásobek detekčního limitu. [11] Ke kvantitativnímu stanovení musí být výška píku desetinásobek šumu. [15] LOQ = 10 s K n b [14] 1 (plocha píku/ výška píku) / (plocha píku/ koncentrace analytu) směrodatná odchylka šumu Linearita (linearity) Je to rozsah hodnot obsahu, množství či koncentrací, ve kterém je analytický signál lineární funkcí hodnot obsahu, množství či koncentrace. [13] Vyjadřuje tedy schopnost metody 36

37 poskytnout přímo úměrné výsledky zkoušky. Je zjišťována analýzou vzorků (lze pracovat i s roztoky standardů) s koncentracemi analytu, které pokrývají deklarovaný rozsah metody (v sériích 3-5 replikátů [13] ). Obvykle se stanovuje minimálně pět různých koncentrací v rozmezí % deklarovaného obsahu. Pokud je metoda lineární, lze s výhodou určit směmici z jednoho kalibračního bodu. Pokud není, je třeba výsledky vyhodnocovat z celé kalibrační křivky. [11] Rozsah (range) Je to koncentrační hranice, v kterých může být metoda používána. Obvykle se odvozuje z linearity metody. Je to oblast v níž metoda poskytuje použitelné výsledky. [12] Dolním limitem může být například detekční limit a horní může být určen maximální odezvou, při jejímž překročení už přístroj nepracuje přesně. [11] Robustnost (robustness) Robustnost (metody, postupu) je experimentálně zjišťována pomocí záměrného vnášení malých změn do metody a zkoumání jejich důsledků (poskytuje indikaci o jeho spolehlivosti během obvyklého používání). [12] Zjišťují se podmínky, které mohou ovlivnit výsledky. Vyjadřuje tedy míru vlivu proměnných podmínek na výsledky analýzy. Například u HPLC metod se sleduje: složení mobilní fáze, ph vodné složky mobilní fáze, teplota na koloně, rychlost průtoku, stabilita analyzovaných vzorků, rozdíl mezi kolonami různých šarží případně i výrobců... [11] Robustnost je obvykle zjišťována laboratoří, která metodu zavádí, před tím, než metodu budou používat ostatní laboratoře. [12] Test způsobilosti (system suitability test) Při každém novém použití metody se neopakuje celá validace, ale jsou definována určitá kriteria, která musí být splněna a která se obecně nazývají testem způsobilosti analytického systému. Při splnění požadavků testu způsobilosti se předpokládá, že dříve provedená validace platí. [11] Faktory, které mohou ovlivnit chromatografické chování, zahrnují složení mobilní fáze, její iontovou sílu, teplotu a zdánlivé ph, průtokovou rychlost, délku kolony, teplotu a tlak, charakteristiku stacionární fáze, včetně porozity, velikosti a typu částic, specifického povrchu a u nosičů používaných v chromatografii s obrácenými fázemi rozsah chemické modifikace (odstranění povrchových silanolových skupin, obsah vázaného uhlíku atd.). Jednotlivé části 37

38 použitého zařízení musí být kvalifikovány a musí být schopny dosáhnout přesnosti požadované pro provedení zkoušky nebo stanovení obsahu. [4] Při kvantitativní analýze se hodnotí opakovatelnost odezvy při opakovaném určitém počtu nástřiků měřeného roztoku. Opakovatelnost se vyjadřuje jako relativní směrodatná odchylka (RSD) uvedená v procentech: 100 ( yi y) RSD% = y n 1 2 yi - jednotlivé hodnoty vyjádřené jako plocha píku, výška píku nebo poměr ploch u metody vnitřního standardu, y - průměr jednotlivých hodnot, n - počet jednotlivých hodnot; Test způsobilosti analytického systému (relativní retenční čas, rozlišení, symetrie píku a opakovatelnost u kvantifikace) je nedílnou součástí analytické metody a slouží k ověření účinnosti chromatografického systému. [4] 2.4 Dexamethason C 22 H 29 FO 5 M r 392,47 CAS Je to 9-fluor-11β,17,21-trihydroxy-16α-methylpregna-1,4-dien-3,20-dion. Počítáno na vysušenou látku, obsahuje 97,0 % až 103,0 % sloučeniny C 22 H 29 FO [4] 5 38

39 Vlastnosti Bílý nebo téměř bílý krystalický prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, mírně rozpustný v ethanolu, těžce rozpustný v dichlormethanu. Taje při asi 255 C, za rozkladu. [4] Charakteristika Dexamethason je fluorovaný syntetický kortikosteroid s velmi dlouhou dobou účinku a silným protizánětlivým působením. Jeho mineralokortikoidní aktivita je s výjimkou vysokého dávkování zanedbatelná. Ve srovnání s prednisonem méně ovlivňuje krevní tlak, oproti triamcinolonu má silnější psychotropní působení včetně stimulace chuti k jídlu a váhového přírůstku. Terapeuticky se využívá především jeho účinků antiflogistických, antifibroplastických, antiedematózních, antialergických, imunosupresivních a antiproliferativních. Vzhledem k jeho slabé mineralokortikoidní aktivitě je obzvláště vhodný u stavů, kde hrozí retence solí a tekutin. Patří k nejúčinnějším kortikosteroidům pro použití v oftalmologii. [16] Indikace Zánětlivá gastrointestinální onemocnění; mozkový edém vyvolaný mozkovým tumorem; horská nemoc; imunoalterační a některá zánětlivá onemocnění v neurologii; diagnostický test adrenokortikální funkce a k diferenciální diagnóze depresivních psychiatrických stavů; některé nezánětlivé respirační poruchy; některá ledvinová onemocnění; infekce provázené závažnou zánětlivou reakcí léčené vhodnou chemoterapií, např. TBC, meningitis, Herxheimerova reakce; některá onemocnění pojivové tkáně, revmatická onemocnění a kolagenózy; těžké formy alergických reakcí; zánětlivá onemocnění oka; závažná kožní onemocnění; hematologická onemocnění; maligní onemocnění jako doplněk léčby cytostatiky; terapie kongenitální hyperplazie kůry nadledvin v dospělosti a u mladistvých u forem, které nevyžadují substituci mineralokortikoidů; stavy po orgánových transplantacích. [16] Nežádoucí účinky Metabolické (hyperlipidemie, hypokalemická alkalóza, indukce disproporční obezity); endokrinní (útlum růstu u dětí, sekundární amenorea, pokles potence a libida u mužů, útlum osy hypotalamus-hypofýza-nadledvinová kůra); potlačení imunitních reakcí; snížení 39