Laboratoře oboru (N352014) 1. ročník MSP technologie potravin, letní semestr, 2016/ Distribuce velikosti částic a koloidní stabilita

Transkript

1 Cíl práce Seznámení s metodami hodnocení velikosti částic a stability potravinářských koloidních systémů. Posouzení vlivu ph na koloidní a emulgačních vlastnosti syrovátkových bílkovin. Úkol Připravte 1250 g 1% (hm.) roztoku koncentrátu syrovátkových bílkovin (WPC) a v podílu 250 ml upravte ph na zadanou hodnotu (podle pokynů 6,0; 5,0; 4,0 nebo 3,5). V posledním podíle, ponechte přirozené ph bez úpravy (tzn. cca ph 6,5). Složení roztoku upravte podle individuálního zadání. V jednotlivých vzorcích stanovte pomocí přístroje Zetasizer Nano (Malvern, UK) distribuci velikosti částic metodou dynamického rozptylu světla a zetapotenciál metodou Doplerovy laserové elektroforézy Pomocí emulgačního míchadla a homogenizátoru připravte 5% emulze rostlinného oleje v připravených roztocích WPC. V jednotlivých vzorcích stanovte: o distribuci velikosti tukových kuliček metodou laserové difrakce pomocí přístroje Mastersizer o sedimentační stabilitu pomocí přístroje LUMisizer proveďte kontrolu stability roztoků syrovátkových bílkovin a emulzí při 2000 ot/min stabilitu emulzí stanovte integrační metodou a výsledek extrapolujte pro tíhové zrychlení za předpokladu lineární závislosti Zhodnoťte vliv kyselosti roztoku WPC na velikost částic roztoku bílkovin, jejich zetapotenciál, velikost částic připravené emulze a na její sedimentační stabilitu. V protokolu uveďte: přípravu roztoku syrovátkových bílkovin, hodnotu ph po úpravě podmínky stanovení velikosti částic a zetapotenciálu syrovátkových bílkovin Grafy distribuce velikosti částic a zetapotenciálu roztoku syrovátkových bílkovin Tabulku stanovených hodnot velikosti částic a zetapotenciálu, uvést průměrnou hodnotu a směrodatnou odchylku. podmínky přípravy emulze Podmínky stanovení distribuce velikosti částic emulzí Grafy frekvenčních a kumulativních křivek distribuce velikosti částic emulzí. Tabulku stanovených hodnot parametrů distribuce velikosti částic emulzí (d(0.1); d(0.5); d(0.9); D [3,2], relativní šířka distribuce Y). Uvést průměrnou hodnotu a směrodatnou odchylku. Grafy průběhu sedimentace emulzí v odstředivém poli. Graf průběhu sedimentace roztoků syrovátkových bílkovin (kontrola stability při nejvyšším odstředivém zrychlení). Tabulku stanovených hodnot rychlosti změny transmitance emulzí při sedimentaci v odstředivém poli Porovnání vypočtené rychlosti transmitance při tíhovém zrychlení. Porovnejte hodnoty roztoku syrovátkových bílkovin po úpravě ph s hodnotami původního roztoku. 1

2 Měření distribuce velikosti částic metodou dynamického rozptylu světla na přístroji Zetasizer Nano Zetasizer Nano: Příručka pro uživatele. Str , Malvern, UK Co je dynamický rozptyl světla? Přístroje řady Zetasizer Nano provádějí měření velikosti částic s použitím procesu nazývaného dynamický rozptyl světla (Dynamic Light Scattering (DLS)) (také známý jako PCS - Photon Correlation Spectroscopy - Fotonová korelační spektroskopie), měří rychlost Brownova pohybu a pomocí Einstein- Stokesova vztahu ji převádí na velikost částic. Rychlost Brownova pohybu měří osvětlením částic laserem a analyzováním fluktuací intenzity rozptýleného světla. Fluktuace intenzity rozptylu Je-li malá částice osvětlená zdrojem světla, jako je laser, částice bude rozptylovat světlo ve všech směrech. Bude-li blízko u částice fotodetektor, bude osvětlený rozptýleným světlem. Nyní uvažujme nahrazení jednotlivé částice tisíci nehybných částic. Obrazovka detektoru by nyní ukazovala obraz skvrn, jak je ukázáno po straně. Obraz skvrn se bude skládat z oblastí jasného světla a tmavých oblastí, kde se žádné světlo nedetekuje. Co způsobuje tyto jasné a tmavé oblasti? Schéma dole ukazuje šířené vlny ze světla rozptýleného částicemi. Jasné oblasti světla jsou tam, kde světlo rozptýlené částicemi dorazí na obrazovku se stejnou fází a konstruktivně interferuje za vytvoření jasné skvrny. Tmavé oblasti jsou tam, kde jsou fázové přídavky vzájemně destruktivní a navzájem se zruší. Rozptýlené světlo dopadající na detektor Ve výše uvedeném příkladu jsme řekli, že se částice nepohybují. V této situaci bude obraz skvrn také neměnný - ve smyslu polohy skvrny i velikosti skvrny. Prakticky částice suspendované v kapalině nikdy nejsou nehybné. Částice se neustále pohybují kvůli Brownovu pohybu. Brownův pohyb je pohyb částic důsledkem náhodných srážek s molekulami kapaliny, které částici obklopují. Důležitým rysem Brownova pohybu pro DLS je to, že se malé částice pohybují rychleji a velké částice se pohybují pomaleji. Vztah mezi velikostí částice a její rychlostí v důsledku Brownova pohybu je definovaný ve Stokes-Einsteinově rovnici. Hydrodynamický průměr částice d(h): k Boltzmanova konstanta (J/K); viskozita prostředí (Pa.s);T teplota (K); D difusní koeficient (m 2.s -1 ) Protože částice jsou neustále v pohybu, bude se zdát, že se obraz skvrny také pohybuje. Jak se částice pohybují kolem, konstruktivní a destruktivní fázový přírůstek rozptýleného světla způsobí, že jasné a tmavé oblasti přibývají a ubývají na intenzitě - nebo řečeno jinak, zdá se, že intenzita fluktuuje. Systém Zetasizer Nano měří rychlost fluktuace intenzity a pak ji používá pro vypočítání velikosti částic. 2

3 Interpretování dat fluktuace intenzity rozptylu Pro měření fluktuace intenzity rozptylu světla se používá tzv. digitální korelátor, který měří stupeň podobnosti mezi dvěma signály v závislosti na čase. Kdybychom porovnávali intenzitu signálu určité části skvrny v jednom časovém bodě (řekněme v čase = t) s intenzitou signálu o velmi krátkou dobu později (t + t), viděli bychom, že tyto dva signály jsou si velmi podobné - neboli silně korelují. Kdybychom pak srovnali původní signál o trochu dále dopředu v čase (t + 2t), stále bude relativně dobré srovnání mezi těmito dvěma signály, ale nebude tak dobré, jako v t + t. Korelace se proto s časem zmenšuje. U DLS pracujeme s velmi malými časovými měřítky. U typického vzorku trvá časový úsek, za který se korelace sníží na nulu, řádově 1 až deset milisekund. Časová interval (t) potřebný pro stanovení časové závislosti korelace bude v řádu nanosekund nebo mikrosekund! Typická korelační funkce proti času je ukázaná na níže uvedeném obrázku. Použití korelační funkce Jak se korelační funkce vztahuje k velikosti částic? Dříve jsme se zmínili, že rychlost částic, které se pohybují Brownovým pohybem, souvisí s velikostí částic (Stokes- Einsteinova rovnice). Velké částice se pohybují pomalu, zatímco menší částice se pohybují rychle. Jaký účinek to bude mít na tvar skvrny? Jestliže se měří velké částice, pak, protože se pohybují pomalu, intenzita skvrny bude také fluktuovat pomalu. A podobně, jestliže se měří malé částice, pak, protože se pohybují rychle, intenzita skvrny bude také fluktuovat rychle. Graf dole ukazuje korelační funkci pro velké a malé částice. Jak je možné vidět, rychlost rozkladu pro korelační funkci souvisí s velikostí částic, protože rychlost rozkladu je mnohem rychlejší pro malé částice, než je pro velké částice. Poté, co se změří korelační funkce, tato informace se pak může použít pro vypočítání distribuce velikosti. Software Zetasizer používá algoritmy pro získání rychlostí rozkladu pro řadu tříd velikostí, aby vytvořil distribuci velikosti. Typický graf distribuce velikosti je ukázaný níže. 3

4 Osa X ukazuje distribuci tříd velikostí, zatímco osa Y ukazuje relativní intenzitu rozptýleného světla. Toto je proto známé jako distribuce intenzity. Ačkoli základní distribuce velikosti generovaná DLS je distribuce intenzity, může se převést, s použitím teorie Mie, na distribuci objemu. Tato distribuce objemu se může také dále převést na distribuci počtu. Ať tak nebo onak, distribuce počtu má omezené použití, protože malé chyby ve shromažďování dat pro korelační funkci povedou k obrovským chybám v distribuci počtu. Distribuce intenzity, objemu a počtu Jaký je rozdíl mezi distribucí intenzity, objemu a počtu? Velmi jednoduchý způsob, jak popsat rozdíl, je představit si vzorek, který obsahuje jen dvě velikosti částic (5 nm a 50 nm), ale s rovnajícím se počtem každé velikosti částice. První graf dole ukazuje výsledek jako distribuci počtu. Jak se očekávalo, obě maxima mají stejnou velikost (1:1), protože tam je stejný počet částic. Druhý graf ukazuje výsledek jako distribuci objemu. Plocha maxima pro 50 nm částice je 1000-krát větší, než maxima pro 5 nm (poměr 1:1000 ). To je proto, že objem 50 nm částice je 1000-krát větší, než 5 nm částice (objem koule se rovná 4/3 r 3 ). Třetí graf ukazuje výsledek jako distribuci intenzity. Plocha maxima pro 50 nm částice je nyní krát větší, než maximum pro 5 nm (poměr 1: ). Je to proto, že velké částice rozptylují mnohem více světla, než malé částice, intenzita rozptylu částice je úměrná šesté mocnině jejího průměru (z Rayleighovy aproximace). Stojí za to zopakovat, že základní distribuce získaná z měření DLS je intenzita - všechny další distribuce jsou generované z ní. 4

5 Činnost Zetasizeru Nano - měření velikosti Typický systém DLS se skládá ze šesti hlavních komponent. Především se používá laser (1) pro zajištění zdroje světla pro osvětlení částic vzorku uvnitř cely (2). Většina laserových paprsků prochází přímo skrz vzorek, ale některé jsou rozptýlené částicemi ve vzorku. Detektor (3) se používá pro měření intenzity rozptýleného světla. Jak částice rozptylují světlo ve všech směrech, je (teoreticky) možné umístit detektor do libovolné polohy a stále bude detekovat rozptyl. U přístrojů řady Zetasizer Nano, v závislosti na specifickém modelu, bude poloha detektor buď v úhlu 173 nebo 90. Intenzita rozptýleného světla musí být pro detektor uvnitř určitého rozsahu, aby ji mohl úspěšně změřit. Je-li detekováno příliš mnoho světla, dojde k přetížení detektoru. Aby se tato překážka překonala, používá se pro snížení intenzity laseru "zeslabovač" (attenuator, tlumič) (4), a tudíž se sníží i intenzita rozptylu na hodnoty, které dokáže detektor zaznamenat. U vzorků, které mnoho světla nerozptylují, jako velmi malé částice nebo vzorky o nízké koncentraci, se množství rozptýleného světla musí zvýšit. V takové situaci zeslabovač propustí více světla laseru do vzorku. U vzorků, které rozptylují více světla, jako velké částice nebo vzorky o vyšší koncentraci, se množství rozptýleného světla musí zmenšit. Toho se dosáhne použitím zeslabovače pro snížení množství světla laseru, které prochází do vzorku. Zetasizer během posloupnosti měření automaticky stanoví příslušnou polohu zeslabovače. Signál intenzity rozptylu pro detektor projde na desku digitálního zpracování signálu, nazvanou korelátor (correlator) (5). Korelátor srovnává intenzitu rozptylu v po sobě jdoucích časových intervalech, aby odvodil rychlost, kterou se intenzita mění. Tato informace korelátoru pak přejde do počítače (6), kde speciální software Zetasizeru bude analyzovat data a odvodí informace o velikosti. Detekční optika detekce zpětného rozptylu Zetasizer Nano Z, S a Z měří informace o rozptylu blízko 180. To je známé jako detekce zpětného rozptylu. Má tyto výhody: dopadající paprsek nemusí procházet celým vzorkem. Protože světlo prochází kratší optickou dráhou vzorku, pak se může měřit vyšší koncentrace vzorku. 5

6 zmenšuje jev známý jako mnohonásobný rozptyl, kde rozptýlené světlo z jedné částice je samo rozptýlené jinými částicemi to opět umožňuje měření vyšší koncentrace. Kontaminující látky (jako např. částice prachu), jsou obvyklé velké ve srovnání s velikostí částic vzorku. Velké částice převážně rozptylují ve směru dopředu. Proto se měřením zpětného rozptylu efekt prachu značně sníží. Konkrétní podmínky měření a nastavení přístroje upřesní pedagogický dozor. 6

7 Měření zetapotenciálu částic na přístroji Zetasizer Nano Zetasizer Nano: Příručka pro uživatele. Str , Malvern, UK Co je potenciál zeta? Přístroje řady Zetasizer Nano vypočítávají potenciál zeta stanovením elektroforetické pohyblivosti a potom použitím Henryovy rovnice. Elektroforetická pohyblivost se získá provedením elektroforézy vzorku a změřením rychlosti částic s použitím Laserové dopplerovy velocimetrie (Laser Doppler Velocimetry - LDV). Tyto techniky jsou popsané v následujících částech. Potenciál zeta a elektrická dvojvrstva Vznik síťového náboje na povrchu částic ovlivňuje distribuci iontů v okolní meziplošné oblasti, což má za následek zvýšenou koncentraci opačných iontů (iontů s opačným nábojem, než má částice) těsně u povrchu. Tudíž kolem každé částice existuje elektrická dvojvrstva. Vrstva kapaliny obklopující částici existuje jako dvě části; vnitřní oblast, nazývaná Sternova vrstva, kde jsou ionty silně vázané, a vnější, difúzní oblast, kde jsou ionty méně pevně připojené. Uvnitř difúzní vrstvy existuje teoretická hranice, uvnitř které ionty a částice tvoří stabilní jednotku. Když se částice pohybuje (např. kvůli gravitaci), ionty uvnitř hranice se pohybují s ní, ale všechny ionty za hranicí s částicí neputují. Tato hranice se nazývá povrch hydrodynamického smyku, nebo rovina skluzu. Potenciál, který existuje na této hranici, je známý jako potenciál zeta. Velikost potenciálu zeta naznačuje potenciální stabilitu koloidního systému. Koloidní systém vzniká tehdy, když jedno ze tří skupenství: plynné, kapalné a pevné, jsou jemně dispergované v jednom ze skupenství. Pro tuto techniku se zajímáme o dvě skupenství: pevná látka dispergovaná v kapalině, a kapalina dispergovaná v kapalině, tj. emulze. Jestliže všechny částice v suspenzi mají velký záporný nebo kladný potenciál zeta, pak budou inklinovat k odpuzování se navzájem, a neexistuje žádná tendence k tomu, aby flokulovaly (vločkovaly). Jestliže však částice mají nízké hodnoty potenciálu zeta, pak neexistuje žádná síla k tomu, aby zabránila částicím se shlukovat a flokulovat. Obecná dělicí čára mezi stabilní a nestabilní suspenzí se zpravidla bere buď při +30 mv nebo -30 mv. Částice s potenciálem zeta kladnějším než +30 mv, nebo zápornějším než -30 mv se normálně považují za stabilní. Nejdůležitější faktor, který ovlivňuje potenciál zeta je ph. Hodnota potenciálu zeta sama o sobě bez uvedení ph, je prakticky číslo nemající žádný smysl. 7

8 Představte si částici v suspenzi se záporným potenciálem zeta. Jestliže se k této suspenzi přidá více alkálie, pak částice budou inklinovat k tomu, aby získaly zápornější náboj. Jestliže se pak k této suspenzi přidává kyselina, dosáhne se bod, kde se záporný náboj neutralizuje. Jakékoliv další přidávání kyseliny může způsobit vytváření kladného náboje. Proto křivka potenciálu zeta proti ph bude kladná při nízkém ph, a nižší nebo záporná při vysokém ph. Bod, kde vynesení prochází nulovým potenciálem zeta, se nazývá izoelektrický bod a z praktických důvodů je velmi důležitý. Normálně je to bod, kde je koloidní systém nejméně stabilní. Typické vynesení potenciálu zeta proti ph je ukázané dole. Elektrokinetické efekty Důležitým důsledkem existence elektrických nábojů na povrchu částic je, že budou pod vlivem aplikovaného elektrického pole vykazovat určité efekty. Tyto efekty jsou souhrnně definované jako elektrokinetické efekty. Existují čtyři rozdílné efekty, závisející na způsobu, jakým se pohyb indukuje. Jsou to: Elektroforéza: Pohyb nabité částice ve vztahu ke kapalině, ve které je suspendovaná, pod vlivem aplikovaného elektrického pole. Elektroosmóza: Pohyb kapaliny ve vztahu ke stacionárnímu nabitému povrchu, pod vlivem elektrického pole. Potenciál proudění: Elektrické pole, generované, když je kapalina přinucená proudit kolem stacionárního nabitého povrchu. Sedimentační potenciál: Elektrické pole, generované, když se nabité částice pohybují ve vztahu ke stacionární kapalině. Elektroforéza Když je na elektrolyt aplikované elektrické pole, nabité částice suspendované v elektrolytu jsou přitahované směrem k elektrodě s opačným nábojem. Viskózní síly, působící na částice, mají sklon bránit tomuto pohybu. Když se dosáhne rovnováha mezi těmito dvěma protichůdnými silami, částice se pohybují s konstantní rychlostí. Rychlost částice je závislá na následujících faktorech: Síla elektrického pole nebo gradient napětí. Dielektrická konstanta média. Viskozita média. Potenciál zeta. Rychlost částice v elektrickém poli se obvykle označuje jako její elektroforetická pohyblivost. S touto znalostí můžeme získat potenciál zeta částice aplikováním Henryovy rovnice. 8

9 Henryova rovnice je: z : Potenciál zeta; U E : Elektroforetická pohyblivost : Dielektrická konstanta. : Viskozita f(ka) : Henryova funkce. Elektroforetická stanovení potenciálu zeta se nejčastěji provádějí ve vodném prostředí a při nepříliš velké koncentraci elektrolytu. f(ka) je v tomto případě 1,5, a nazývá se Smoluchowskiho aproximace. Proto výpočet potenciálu zeta z pohyblivosti je přímočarý pro systémy, které vyhovují Smoluchowského modelu, tj. částice větší než 0,2 mikrometru, dispergované v elektrolytu obsahujícím více než 10-3 molární sůl. Měření elektroforetické pohyblivosti Je to právě elektroforetická pohyblivost, kterou měříme přímo, s konverzí na potenciál zeta, odvozenou z teoretických úvah. Jak se elektroforetická pohyblivost měří? Základem klasického mikroelektroforetického systému je cela s elektrodami na každém konci, na které je aplikovaný potenciál. Částice se pohybují směrem k elektrodě s opačným nábojem, jejich rychlost se měří a vyjádří se v jednotkách intenzity pole jako jejich pohyblivost. Technika používaná pro měření této rychlost je laserová dopplerova velocimetrie (Laser Doppler Velocimetry). Laserová dopplerova velocimetrie Laserová dopplerova velocimetrie (Laser Doppler Velocimetry (LDV)) je technika známá v inženýrství pro studium proudění tekutin v široké škále situací, od nadzvukových toků kolem lopatek turbín v proudových motorech, po rychlosti mízy stoupající ve stvolu rostlin. V obou těchto příkladech je to ve skutečnosti rychlost drobounkých částic v proudu kapaliny, pohybujících se rychlostí kapaliny, kterou měříme. Proto je LDV využívána i pro měření rychlosti částic pohybujících se v kapalině při elektroforéze. Přijímající optika je zaostřovaná tak, aby přenášela rozptyl částic v kyvetě. Světlo rozptýlené v úhlu 17 se kombinuje s referenčním paprskem. To vyvolá kolísající signál intenzity, kde poměr fluktuace je úměrný rychlosti částic. Pro vytáhnutí charakteristických frekvencí v rozptýleném světle se používá digitální procesor signálu. 9

10 Provoz Zetasizeru Nano - měření potenciálu zeta Podobně jako typický systém DLS, popsaný v kapitole Teorie měření velikosti, systém pro měření potenciálu zeta zahrnuje šest hlavních komponent. Především se jako světelný zdroj používá laser pro osvětlení částic ve vzorku; pro měření potenciálu zeta je tento zdroj světla rozdělený, aby poskytoval dopadající a referenční paprsek. Referenční paprsek je také "modulovaný", aby se zajistil nezbytný dopplerův efekt. Laserový paprsek prochází středem kyvety se vzorkem, a detekuje se rozptyl v úhlu 17. Při vložení kyvety do držáčku kyvety umožňují vývody kyvety, aby systém rozpoznal typ instalované kyvety pro měření potenciálu zeta, a konfiguruje se software, aby použil správnou posloupnost měření. Když se na kyvetu aplikuje elektrické pole, všechny částice pohybující se v měřeném objemu způsobí, že detekovaná intenzita světla kolísá s frekvencí úměrnou rychlosti částic. Detektor odešle tuto informaci na digitální procesor signálu. Tato informace pak přejde do počítače, kde software Zetasizer Nano vytvoří frekvenční spektrum, ze kterého se vypočítá elektroforetická pohyblivost, a tudíž i potenciál zeta. Intenzita rozptýleného světla v kyvetě musí být uvnitř specifického rozsahu, aby detektor ji úspěšně změřil. Je-li detekováno příliš mnoho světla, pak se detektor stane přetížený. Aby se toto překonalo, pro snížení intenzity laseru a tím i snížení intenzity rozptylu se používá "zeslabovač" (attenuator). Pro vzorky, které nerozptylují mnoho světla, jako velmi malé částice, nebo vzorky o nízké koncentraci, se musí množství rozptýleného světla zvýšit. Zeslabovač automaticky poskytne více světla, které prochází do vzorku. Pro vzorky, které rozptylují více světla, jako velké částice nebo vzorky o vyšší koncentraci, se musí množství rozptýleného světla snížit. Zeslabovač automaticky sníží množství světla, které prochází do vzorku. Pro korekci jakýchkoliv rozdílů mezi tloušťkou stěny kyvety a lomem světla dispergovadla je v dráze rozptylovaného paprsku nainstalovaná kompenzační optika, aby udržovala seřízení rozptylovaného paprsku. 10

11 Měření distribuce velikosti částic metodou laserové difrakce na přístroji Mastersizer 2000 Laserová difrakce je jednou ze základních technik měření velikosti částic založenou na optických vlastnostech disperzí. Při měření prochází laserový paprsek přes kyvetu, ve které proudí měřený vzorek rozptýlený ve vhodném médiu, nejčastěji vodě. Vlivem přítomných částic dochází k ohybu (difrakci) laserového paprsku pod úhlem, jež je nepřímo úměrný jejich velikosti. S klesající velikostí částice, vzrůstá difrakční ohybový úhel logaritmicky, zatímco intenzita záření klesá v závislosti na objemu částice. Velké částice tedy způsobují ohyb laserového paprsku pod malým úhlem a paprsek dopadající na detektor má velkou intenzitu, zatímco malé částice způsobují difrakci laserového paprsku pod velkým úhlem, ale paprsek dopadající na detektor má nízkou intenzitu. Naměřený průběh difrakce laserového paprsku je následně použit k výpočtu distribuce velikosti částic. Výpočet vychází z Mievovy teorie pro jejíž aplikaci je nutná znalost indexu lomu měřeného materiálu a média a absorpční koeficient měřeného materiálu. Vnitřní uspořádání přístroje a princip měření je nastíněn na následujícím obrázku. Vlastní přístroj pro měření velikosti částic metodou laserové difrakce se skládá z optické jednotky, disperzní jednotky (Hydro G) a počítače s ovládacím softwarem. Nezbytnou součástí optické jednotky je měřící cela, zdroj modrého a červeného (He-Ne laser) světla a detektorové pole. Přístroj je schopen, díky použití dvou různých zdrojů záření, měřit velikost částic v rozsahu 0, m. Účelem disperzní jednotky je příprava vzorku a jeho čerpání přes měřící celu. Disperzní jednotka Hydro G umožňuje přípravu vzorků mokrou cestou, tedy rozptýlením měřeného materiálu ve vhodném médiu, kterým bývá nejčastěji voda, ale může jím být i rostlinný olej, alkoholy, uhlovodíky... Dokonalému rozptýlení vzorku napomáhá možnost volby rychlosti míchání média v nádržce, rychlosti proudění média přes měřící celu a v neposlední řadě i volba intenzity ultrazvuku, jež umožňuje rozbít případné aglomeráty částic. Koncentrace měřeného materiálu v použitém médiu je z důvodu zabránění vícenásobnému rozptylu světla nízká a reálně se pohybuje v rozmezí 0,01-0,001 % obj. Mastersizer 2000 ve spojení s jednotkou na přípravu vzorku Hydro G umožňuje měřit distribuci velikosti částic u širokého spektra materiálů počínaje mléčnými a obecně potravinářskými emulzemi, přes léčiva a pomocné práškové hmoty v potravinářství a konče oxidy kovů a cementem. Na následujícím obrázku je uveden příklad reálně naměřené distribuce velikosti částic bělící hlinky. První křivka tvořící pík (frekvenční křivka, distribuční) charakterizuje distribuci velikosti částic vztaženou na objem částic, druhá (kumulativní) křivka udává procentické zastoupení částic ve vzorku o velikosti menší než je velikost zvolená. 11

12 Rámcový postup práce při měření distribuce velikosti částic: 1. uvedení přístroje do chodu, stabilizace laserového paprsku 2. propláchnutí disperzní jednotky a měřící cely médiem, jež bude použito při dalším měření 3. nastavení parametrů měření dle povahy měřeného materiálu zadání indexu lomu měřeného materiálu a média příprava vzorku nastavení rychlosti míchání a čerpání přes měřící celu, odstranění vzduchových bublinek ultrazvukem nastavení způsobu měření (doba měření, počet cyklů, prodleva mezi cykly...), čištění po ukončení měření (počet proplachovacích cyklů, použití ultrazvuku...) a metody výpočtu distribuce velikosti částic a charakteristických parametrů 4. vlastní měření zahrnující dávkování vzorku (reprezentativní odběr) do dosažení požadované hodnoty rozptylu laserového paprsku ( obscuration ) dokonalé rozptýlení v médiu a měření následované naprogramovaným čištěním 5. zobrazení a vyhodnocení výsledků Výstupem vlastního měření je grafické vyjádření distribuce velikosti částic (frekvenční či kumulativní křivka, histogram), doplněné o tabelované hodnoty a několik vypočtených parametrů charakterizující naměřenou velikost částic ve vzorku. K charakteristickým parametrům patří: - D(v;0,5) medián: udává velikost, při které je 50%obj. částic menších a 50 %obj. větších. Jde vlastně o medián dělící plochu frekvenční křivky na dvě stejné části - D(v;0,1); D(v;0,9) udává velikost pod níž se nachází 10 resp. 90 %obj. částic a charakterizuje tak okraje distribuce - D [4,3]; D[3,2] - průměr částice vztažený k objemu, resp. velikosti povrchu částice 4 3 ni d i ni d i D 4,3 D 3 3,2 2 n d n d - Šířka distribuce velikosti částic d (0,9) d (0,1) Y d (0,5) i i i i 12

13 Stanovení sedimentační stability emulze na přístroji LUMisizer Jednou z hlavních příčin koloidní nestability emulzí je separace fází podle měrných hmotností, obecně označovaná jako usazování neboli sedimentace. Jedná se o proces, při kterém dochází vlivem působení hmotnostní (objemové) síly vyvolané gravitačním zrychlením k oddělení dispergovaných částic od disperzního prostředí. Směr usazování závisí na rozdílu hustot: částice s vyšší hustotou než disperzní prostředí se pohybují ve směru gravitačního zrychlení, částice s nižší hustotou proti němu. Proto v případě emulze tuku ve vodě hovoříme o vyvstávání tuku. Rychlost pohybu částice (vu) při pomalém usazování (Reynoldsovo kriterium usazování Reu < 0,2), které je obvyklé pro malé částice, vyjadřuje Stokesův vztah, který má pro kulové částice tvar: v u g d 2 p p 18 kde g gravitační zrychlení, dp průměr částice, p hustota dispergované kapaliny, k hustota disperzního prostředí, viskozita disperzního prostředí. Jelikož je usazování v gravitačním poli obvykle relativně pomalé, je vhodné pro účely hodnocení sedimentační stability proces separace fází urychlit nahrazením gravitačního zrychlení zrychlením odstředivým: a = r 2 (m. s -2 ) kde r je vzdálenost od osy rotace (m), úhlová rychlost (rad s -1 ). Často je praktické odstředivé zrychlení vyjadřovat jako relativní násobek tíhového zrychlení: ag = r 2 / 9,81 Ze závislosti rychlosti usazování na odstředivém zrychlení (otáček odstředivky) lze pak extrapolací odhadnout rychlost separace fází při skladování v normálním gravitačním poli. Za předpokladu platnosti Stokesova zákona (tzn. lineární závislosti) pak k tomuto odhadu dostačuje pouze jeden údaj o rychlosti sedimentace při působení zvoleného odstředivého zrychlení. V řadě případů je ovšem tato závislost nelineární: k Spolehlivější je proto provést několik měření při různých rychlostech otáčení a získanou závislost na odstředivém zrychlení vyjádřit pomocí mocninového vztahu: vu (a) = K. a n kde a je relativní odstředivé zrychlení (násobek gravitačního zrychlení), K vyjadřuje rychlost sedimentace při zrychlení 1 g a index n charakter závislosti (podle Stokesova zákona n = 1, n > 1 znamená zrychlení sedimentaci např. v důsledku agregace částic, n < 1 zpomalení sedimentace naopak při rozpadu agregátů). Vztah ovšem nevyhovuje 4. druhu závislosti (systém vykazuje mez toku). 13

14 Popis zařízení LUMisizer je temperovaná odstředivka, která umožňuje fotometrické sledování změn koncentrace dispergovaných látek ve vzorku vyvolaných působením odstředivé síly volitelné v rozmezí g. Vzorky jsou umístěny ve 12 kyvetách, ve kterých je ve zvoleném intervalu ( s) sledován profil transmitance NIR záření (870 nm; délka detektoru - tj. výška sledované vrstvy vzorku 25 mm; detektor je tvořen lineární řadou 2048 čidel, tzn. rozlišení pozice 14 m). Sedimentace dispergovaných částic se projeví jednak vyčeřením části vzorku, tzn. zvýšením transmitance, a jednak tvorbou sedimentu, tzn. snížením transmitance. Veškeré ovládání přístroje je pomocí software SEPview. Na přístroji jsou pouze tlačítka na otevření krytu odstředivky (zeleně podsvícené), nouzové zastavení rotoru (červeně podsvícené) a na přepínání veličin zobrazených na displeji (otáčky, teplota, doba měření). Postup měření Zapnutí přístroje (hlavního vypínač na zadní straně), řídícího software SEPview a otevření zvolené databáze výsledků: Zadání nového měření: Příkazem New Measurement se otevře dialogové okno pro definici parametrů nového měření postupně se zadává: o Název a popis (poznámky) o Metoda o Vzorky 14

15 Při zadávání názvu měření je možné vybrat z nabídky název některého předchozího měření, a příkazem clone vytvořit jeho kopii. Tím nové měření přejímá automaticky i metodu a definici vzorků, které pak stačí pouze upravit. Metoda je definována: rychlostí otáčení, teplotou, intervalem ve kterém budou jednotlivé transmitanční profily měřeny a počtem stanovených profilů (a tím celkovou dobou měření). Měření lze rozdělit do několika cyklů s různými podmínkami. Maximální počet profilů je 256. Pro vyjádření sedimentační stability v gravitačním poli je potřeba provést měření opakovaně s novým vzorkem při různých konstantních otáčkách. Použijte následující programy měření: cyklus počet profilů interval (s) rychlost (ot/min) světelný faktor* teplota ( C) x doporučené rychlosti 2000 ot/min odpovídá na dně kyvety násobek tíhového zrychlení 581 g Při zadání tabulky se definuje: počet vzorků (2 12), název vzorků a druh kyvety, ve které je vzorek umístěn. Nejběžnější jsou polykarbonátové kyvety s obdélníkovým průřezem o tloušťce 2 mm (délka optické dráhy) označené kódem 2. Pro poloprůhledné vzorky je možné použít kyvety s delší optickou drahou např. polyamidové o tloušťce 10 mm označené kódem 7. Ke každému vzorku lze dále přiřadit poznámku. Temperace přístroje zašroubovat bezpečnostní kryt rotoru, odstředivku uzavřít a spustit příkazem run. Zobrazí se dialogové okno, na kterém je možné sledovat dosažení zadané teploty (obvykle cca 10 minut) Měření pokračuje po zadání příkazu Perform measurements, kdy se objeví informační okno s pokyny pro umístění vzorků: 15

16 Vložení vzorků: kyveta se naplní injekční stříkačkou po rysku dobře promíchaným vzorkem bez bublin vzduchu a kyveta se uzavře zátkou a vloží na zadanou pozici do rotoru (nutné dodržovat rovnoměrné vyvážení rotoru): Po vložení všech vzorků se zašroubuje bezpečnostní kryt rotoru, uzavře se víko odtředivky a příkazem start se spustí měření. V průběhu měření se zobrazují stanovené profily transmitance - závislost transmitance na vzdálenosti od středu rotace (každý vzorek má svůj list viz záložka ve spodní části okna). Detektor sleduje oblast od 103 do 130 mm od hladiny vzorku ke dnu kyvety. Časová závislost je znázorněna barvou křivky profily na začátku měření červenou barvou, profily na konci měření barvou zelenou: meniskus dno kyvety 16

17 Vyhodnocení stanovení sedimentační stability: A. Integrační metoda vyjadřuje závislost střední integrální hodnoty transmitance celého vzorku na době působení odstředivého zrychlení. Vyjadřuje rychlost vyjasněné (vyčeření) vzorku. V transmitančním profilu se pomocí polohovacího zařízení nejprve vyznačí rozhraní vzorku (modré svislé přímky - hladina vzorku a dno kyvety): Příkazem Integration se na záložce Integration zobrazí závislost střední integrální hodnoty transmitance na době měření. Sedimentační stabilitu pak vyjadřuje směrnice této závislosti v počáteční, pokud možno lineární fázi separace. Oblast pro výpočet směrnice se zadá buď tahem myši, nebo nastavením intervalu hodnot pomocí zadávacího boxu (poklepáním myší na krajní hodnoty os): 17

18 Příkazem regression se pak provede výpočet parametrů lineární závislosti ve zvoleném časovém úseku. Výsledky lineární regrese a statistické údaje jsou zobrazeny ve spodní části v tabulce. Pro porovnání sedimentační stability se používá hodnota směrnice (slope, %/h), která vyjadřuje rychlost vyčeření vzorku v důsledku sedimentace. B. Metoda stanovení rychlosti rozhraní vyjadřuje závislost pozice zvolené hodnoty transmitance určující rozhraní mezi disperzí a vyčeřenou fází na době působení odstředivého zrychlení. Tato metoda je vhodná pouze pro vzorky se zřetelnou separací fází. V transmitančním profilu se pomocí polohovacího zařízení nejprve vyznačí oblast kyvety, ve které bude pohyb rozhraní sledován a (modré svislé přímky) a hodnota transmitance, která bude rozhraní určovat (threshold - vodorovná modrá přímka, šipka určuje směr pohybu částic): 18

19 Příkazem Integration se na záložce Front tracing zobrazí závislost pozice fázového rozhraní na době měření. Sedimentační stabilitu pak vyjadřuje směrnice této závislosti v počáteční, pokud možno lineární fázi separace. Oblast pro výpočet směrnice se zadá podobně jako u integrační metody. Příkazem regression se pak provede výpočet parametrů lineární závislosti ve zvoleném časovém úseku. Výsledky lineární regrese a statistické údaje jsou opět zobrazeny ve spodní části v tabulce. Pro porovnání sedimentační stability se používá hodnota směrnice (slope, m/s, resp. m/h). Literatura 1. Kadlec a kol.: Procesy potravinářských a biotechnologických výrob, VŠCHT Praha Zetasizer Nano: Příručka pro uživatele. Str , , Malvern, UK 19