CANDIDA ANTIGENS. Candida albicans antigens Candida albicans positive control serum SÉRODIAGNOSTIKA ASPERGILÓZY IMUNOPRECIPITAČNÍ REAKCÍ

Transkript

1 CANDIDA ANTIGENS Candida albicans antigens Candida albicans positive control serum SÉRODIAGNOSTIKA ASPERGILÓZY IMUNOPRECIPITAČNÍ REAKCÍ

2 1- KLINICKÝ VÝZNAM Společnost Bio-Rad vyrábí různé antigeny Candida albicans pro sérodiagnostiku kandidózy imunoprecipitací. Diagnóza kandidózy průkazem protilátek specifických pro kvasinky v séru pacientů je zpravidla jednodušší vzhledem k četnosti kandidových infekcí s negativními krevními kulturami. V případě pozitivních krevních kultur umožňuje imunologická diagnostika ověřit, zda není izolovaná Candida výsledkem kontaminace. 2- PRINCIP Antigeny společnosti Bio-Rad lze použít v různých imunoprecipitačních reakcích. Doporučovány jsou zejména tyto dvě techniky: IMUNOLELEKTROFORÉZA (IEP) PROTISMĚRNÁ ELEKTROFORÉZA (ES) 3- BALENÍ Candida albicans antigens, kód lahvičky s lyofilizovanými antigeny, které se rozpouštějí v 1 ml sterilní destilované vody (přibližně 10 reakcí). - Candida albicans metabolický antigen - Candida albicans somatický antigen Candida albicans positive control serum, kód lahvička s lyofilizovaným králičím sérem proti Candida albicans, které se rozpouští v 1 ml sterilní destilované vody. 4- SLOŽENÍ Antigeny (dva typy): Metabolický antigen, získaný filtrací kultur po 10 dnech inkubace při 30 C. Somatický nebo celulární antigen získaný z mladých mycelárních kultur (3 dny, beze spor), které se drtí a promíchávají při 30 C. 5- UCHOVÁVÁNÍ Reagencie v lyofilizované formě skladované na suchém místě při teplotě 2-8 C jsou stabilní až do data exspirace, uvedeného na soupravě. Po rozpuštění: reagencie mohou být skladovány několik měsíců při -20 C v rozdělených alikvotech. Vyhněte se opakovanému zamražování a rozmražování reagencií.

3 6- VZORKY 1. Testy se mohou provádět pouze se vzorky séra ze suchých zkumavek. 2. Dodržujte následující doporučení pro přípravu, uchovávání a zacházení se vzorky séra: - Při odběru vzorků séra dodržujte všechna běžná bezpečnostní opatření. - Před centrifugací nechte vzorky krve úplně srazit. - Udržujte zkumavky neustále uzavřené. - Po centrifugaci oddělte sérum a uchovávejte jej v důkladně uzavřené zkumavce. - Pokud budou vzorky vyšetřeny do 24 hodin, mohou být uchovávány při teplotě +2-8 C. - Jestliže nebude vyšetření provedeno do 24 hodin nebo pro účely přepravy uchovávejte vzorky zamražené při teplotě minimálně -20 C. - Přednostně rozmrazujte vzorky pouze jednou. Zamražené vzorky je nutné po rozmražení před testováním důkladně promíchat. 3. Interference s vysokými hladinami albuminu, bilirubinu a hemoglobinu nebyla testována. 4. Vzorky nezahřívejte. 7- PRACOVNÍ POSTUP A) POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY Barbital sodný Kyselina chlorovodíková Destilovaná voda Barbital Glycin 0,05 M Tris pufr ph 7,0 Agaróza B) IMUNOELEKTROFORÉZA (fotografie 1) Imunoelektroforéza (Grabar) může být prováděna na mikroskopických podložních sklíčkách. Připravte gel purifikovaného 1% agaru nebo agarózy s barbitalovým pufrem o ph 8,2 (přidejte merthiolát v ředění 1:10 000). Do gelu vyřízněte žlábek o délce 60 mm a šířce 2 mm a dva otvory o průměru 2 mm po každé straně žlábku ve vzdálenosti 4 mm (viz diagram). Naneste 20 µl neředěného antigenu do dvou postranních otvorů.

4 Po dobu 90 minut aplikujte na konce sklíčka potenciál 5 V/cm. Do středního žlábku naneste sérum a nechte jej difundovat pro dobu 48 hodin ve vlhké atmosféře při teplotě okolí (18-30 C). Třetí den ponořte sklíčka na 24 hodin do promývacího roztoku. Vyhodnocení proveďte čtvrtý den. K vyhodnocení zvláště jemných linií precipitační reakce může být zapotřebí barvivo Coomassie Blue. C) PROTISMĚRNÁ ELEKTROFORÉZA (obr. 1) Protisměrná elektroforéza (Bussard) může být prováděna na agarózovém gelu nebo na acetátu celulózy. Jedná se o jednoduchou metodu, která je velmi citlivá a rychlá a je vhodná k vyšetření velkého počtu sér. Při použití agarózového gelu a mikroskopických podložních sklíček se vyříznou otvory podle uvedeného schématu: antigeny se nanášejí na straně katody (-), séra na straně anody (+). Otvory o průměru 2 mm se oddělují mezerou o šířce 6 mm. Naplňte otvory pro antigen čistým roztokem ředěným v poměru 1:2 a 1:4. Do otvorů pro sérum naneste 20 µl séra. Aplikujte potenciál 5 V/cm na dobu 90 minut. Reakce se zpravidla odečítá bezprostředně po migraci. Jestliže je nutno použít Coomassie blue, je nutné provést nejdříve dva po sobě jdoucí cykly promývání: ve fyziologickém séru (přes noc) a poté v destilované vodě (24 hodin), následovně sušení. Doporučuje se paralelně testovat pozitivní kontrolu pomocí stejného postupu jako pro testování antigenů. D) PŘÍPRAVA REAGENCIÍ 1) PUFRY - VERONALOVÝ PUFR ph 8,2 Barbital sodný 15,85 g HCl 1N 23 ml H2O ad ml - BARBITAL SODNÝ BARBITAL TRIS GLYCINE (BBNa TG) ph 8,8 A. Barbital sodný 65 g Barbital 10,35 g H2O q.s.p ml B. Glycin 281 g Tris 226 g H2O ad ml Po smísení stejných objemů roztoků A a B získáme pufr o ph 8,8 a osmolaritě 0,08.

5 2) 1% AGARÓZA (HMOTNOST/OBJEM) Agaróza H2O Přiveďte k varu a po ochlazení (přibližně na 60 C) Přidejte: Barbitalový pufr ph 8,2 nebo Pufr BBNa TG ph 8,8 (naředěný na 50 % destilovanou vodou) E) SOUHRNNÁ TABULKA 10 g 500 ml 500 ml 500 ml Imunoelektroforéza Elektrosyneréza Fotografie 1 Pufry Napětí Trvání Barviva Agaróza 1 %/ 5 V/cm 90 min veronalový pufr ph 8,2 Coomassie Blue Agaróza 1 %/ 25 V/cm 60 min BBNa-TG pufr, ph = 8,8 Agaróza 1 %/ veronalový pufr ph 8,2 5 V/cm 90 min 1 a 2: Antigeny S: Sérum pacienta Obr. 1 Sr: kontrolní sérum Agaróza 1 %/ BBNa-TG pufr, ph = 8,8 10 V/cm 60 min Coomassie Blue 8- INTERPRETACE Přítomnost specifických precipitačních linií při použití imunoprecipitační metody pro stanovení antigenu Candida albicans indikuje kandidovou infekci. Vzhledem k větší rychlosti se elektrosyneréza upřednostňuje před elektroforézou jako screeningová metoda. Séra shledaná jako pozitivní pomocí této techniky však musí být ověřena pomocí imunoelektroforézy. Precipitační linie se stávají viditelné po prvních 24 hodinách, avšak definitivní odečet se provádí po 4. dni. K zobrazení jemnějších detailů se používá barvivo Coomassie Blue. Nejčastěji se vyskytující linie indikují enzymatickou aktivitu. Tyto linie mohou být detekovány speciální reakcí (Biguet et al.), ale nemusí být identifikovány při rutinní diagnóze. Jediná precipitační linie je postačujícím ukazatelem pro infekci Candida albicans. Počet precipitačních linií se zvyšuje se šířením nemoci na různé orgánové skupiny, v případě septikémie následované trvalou hypertermií po dobu déle než 10 dnů, endokarditidy a při chronické mukokutánní granulomatózní kandidóze.

6 9- ÚČINNOST/KONTROLA KVALITY A) ANTIGENY CANDIDA ALBICANS Účinnost antigenů Candida albicans je kontrolována pomocí pozitivního kontrolního séra (králičí sérum obsahující protilátky proti Candida albicans, získané imunizací zvířat standardním somatickým nebo metabolickým antigenem). Imunoelektroforéza (ph = 8,2) Vzhled precipitační linie somatický Ag metabolický Ag C. albicans Ag / pozitivní kontrolní sérum anti-c. albicans + 3 až 6 linií + 2 až 4 linie C. albicans Ag / pozitivní kontrolní sérum anti-aspergillus - - B) POZITIVNÍ KONTROLNÍ SÉRUM Imunoelektroforéza (ph = 8,2) Vzhled precipitační linie somatický Ag metabolický Ag Pozitivní kontrolní sérum anti-c. albicans / C. albicans Ag + 3 až 6 linií + 2 až 4 linie Pozitivní kontrolní sérum anti-c. albicans / Aspergillus Ag KONTROLA KVALITY PROVÁDĚNÁ VÝROBCEM Všechny vyráběné reagencie jsou připravovány podle našeho systému jakosti, počínaje převzetím surovin až po finální komercionalizaci výrobku. Každá šarže je podrobena kontrole kvality a je propouštěna na trh pouze tehdy, pokud odpovídá stanoveným kritériím. Dokumentace týkající se výroby a kontroly každé jednotlivé šarže je uchovávána u firmy Bio-Rad. 11- OMEZENÍ TESTU Při diagnostice kandidózy je nutné posoudit všechny klinické radiologické a biologické (mikrobiologické, histologické a sérologické) aspekty; každé z těchto hodnocení je nutné provádět samostatně a interpretovat s opatrností.

7 12- RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. DROUHET E. et B. DUPONT : Infections mycosiques et parasitaires au cours des traitements immunosuppresseurs. PATHOL. BIOL. (1976) 24, DROUHET E. : Antigènes des Candida-Application à l'étude de l'immunité humorale et du diagnostic immunologique. REV. FRANC. ALLERGOL. (1976) 16, n 5, (33 réf.). 3. DROUHET E. ; Systemic Candidosis and its immunology. MYKOSEN (1978) Suppl 1, (16 réf.). 4. FRISK A. : Serological aspects of candidosis. CURRENT THERAP. RESEARCH. (1977) 22, n 1, (12 réf.). 5. HARDING S.A.; SANDFORD G.R.; MERZ W.G.: Three serologic tests for candidiasis. AM.J.CLIN.PATHOL. (1976) 65, n 6, pp (24 réf.). 6. SEGRETAIN G.; DROUHET E.; MARIAT F.: Diagnostic de laboratoire en mycologie médicale. (1979-4e edition). MALOINE Edit. PARIS, 150 pages. 16

8 - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) - EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) - CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) IVD - For in vitro diagnostic use - Catalogue number - Pour diagnostic in vitro REF - Référence catalogue - Para diagnóstico in vitro - Número de catálogo - In vitro-diagnostikum - Bestellnummer - Per uso diagnostico in vitro - Numero di catalogo - Para uso em diagnóstico in vitro - Número de catálogo - In vitro diagnostik - Katalognummer - In vitro diagnose - Katalognummer - Manufacturer EC REP - Authorised Representative - Fabricant - Représentant agréé - Fabricante - Representante autorizado - Hersteller - Bevollmächtigter - Produttore - Distributore autorizzato - Fabricante - Representante Autorizado - Tillverkad av - Auktoriserad representant - Fremstillet af - Autoriseret repræsentant LOT - Batch code - Expiry date YYYY/MM/DD - Code du lot - Date de peremption AAAA/MM/JJ - Código de lote - Estable hasta AAAA/MM/DD - Chargen-Bezeichnung - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT - Codice del lotto - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG - Código do lote - Data de expiração AAAA/MM/DD - Batch nr. - Utgångsdatum År/Månad/Dag - Batchkoden - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD - Storage temperature limitation - Consult Instruction for use - Limites de températures de stockage - Consulter le mode d'emploi - Temperatura limite - Consulte la instrucción para el uso - Lagerungstemperatur - Siehe Gebrauchsanweisung - Limiti di temperatura di conservazione - Consultare le istruzioni per uso - Limites de temperatura de armazenamento - Consulte o folheto informativo - Temperaturbegränsning - Se instruktionsanvisning vid användning - Temperaturbegrænsning - Se instruktion før brug 65

9 The other languages which are required in conformity to the European Directive can be obtained from your local Bio-Rad agent. Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponibles auprès de votre représentant Bio-Rad local. Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la Directiva Europea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad. Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVD Direktive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-Rad Niederlassung. Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europee possono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad. As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a Directiva Europeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próxima de si. Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från din lokala Bio-Rad-representant. De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås ved henvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /2003 Fax.: +33 (0) code: