Stanovení ethanolu pomocí head-space plynové chromatografie metodou vnitřního standardu

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Stanovení ethanolu pomocí head-space plynové chromatografie metodou vnitřního standardu Rigorózní práce Hradec Králové 2010 Mgr. Eva Kratochvílová

2 Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Tato rigorózní práce vznikla za podpory grantu SVV V Hradci Králové dne: podpis

3 Na tomto místě bych ráda poděkovala PharmDr. Radimovi Kučerovi, Ph.D. za odborné vedení, cenné rady a pomoc při vypracování této rigorózní práce.

4 OBSAH 1.ÚVOD TEORETICKÁ ČÁST Úvod k plynové chromatografii Plynový chromatograf Dávkovací zařízení Stacionární fáze Mobilní fáze Detektory Úvod ke HS-GC Základní teorie HS-GC analýzy Analýza kapalných vzorků Manipulace se vzorkem Kvantifikace metody Metoda vnitřní normalizace Metoda vnitřního standardu Metoda vnějšího standardu Metoda standardního přídavku Validace analytické metody Validační parametry Zpracování literární rešerše CÍL PRÁCE EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Použité chemikálie, přístroje, programové vybavení, pomůcky VÝSLEDKY A DISKUZE Výběr teplotních podmínek Doba temperování Teplota stříkačky Metoda vnějšího standardu Metoda vnitřního standardu Výběr vnitřního standardu Vliv matrice na stanovení obsahu ethanolu Metoda standardního přídavku Validace metody vnitřního standardu Linearita Opakovatelnost Mezilehlá přesnost Správnost LOD, LOQ Selektivita Stabilita vzorku Stanovení obsahu ethanolu ZÁVĚR... 64

5 7. ABSTRAKT ABSTRACT LITERATURA... 70

6 1.ÚVOD 1

7 Chromatografie je jednou z nejrozšířenějších analytických metod umožňující účinnou separaci látek nutnou pro identifikaci a kvantifikaci složek sledovaného vzorku. K rozdělení látek dochází na základě jejich různé pohyblivosti v systému dvou fází stacionární (zakotvené) a mobilní (pohyblivé). Různé látky se liší ve svých adsorpčních vlastnostech, v hodnotách rozdělovacích koeficientů, ve svých rozměrech či ve svých nábojích 1. Chromatografie nemusí být striktně využívána jen k analytickým separacím, může být použita k přípravě čistých substancí, k studii kinetiky reakcí, k určení fyzikálně-chemických konstant. Ve farmacii se chromatografie využívá např. k analýze nových produktů, monitoringu metabolitů v biologických systémech, stanovení zbytkových rozpouštědel v léčivých a pomocných látkách, stanovení obsahu léčiv a pomocných látek, k ověření totožnosti látek 2. Head-space plynová chromatografie (dále jen HS-GC) je technika používaná pro koncentraci a analýzu těkavých organických látek. Tato relativně jednoduchá technika je rozšířená v analýze ethanolu v krvi a zbytkových rozpouštědel ve farmaceutických produktech. Vzorek v HS-GC analýze se obvykle skládá ze směsi těkavých a netěkavých složek. Podstatné je buď kvalitativní složení těkavé části vzorku, nebo koncentrace přítomných těkavých látek. Obvykle jsou přítomny ve vialce dvě fáze (plyn-pevná látka, nebo plyn-kapalina) a je analyzována alikvotní část plynné fáze. Výhodou této situace je, že netěkavé složky vzorku, které nejsou podstatné, nevstupují do plynového chromatografu. Toto je určitá výhoda HS-GC před běžnou GC 3. 2

8 2. TEORETICKÁ ČÁST 3

9 2.1. Úvod k plynové chromatografii Principem této separační metody je rovnovážná distribuce složek mezi dvě fáze: plynnou-mobilní a kapalnou nebo tuhou-stacionární. Složky jsou separovány v plynné fázi. Plynová chromatografie (dále jen GC) je vhodná především pro organické látky s teplotou varu asi do 400 ºC. Podmínkou je, aby se látky při vypařování nerozkládaly. GC je vhodná i pro analýzu anorganických sloučenin, ale pouze těch, které jsou těkavé. V některých případech lze analyzovat i látky netěkavé, když tyto látky převedeme na těkavější deriváty derivatizace 4. Příkladem derivatizace může být alkylace- náhrada vodíku alkylem ve sloučeninách s kyselým vodíkem ( karboxylové kyseliny, fenoly) za použití diazomethanu nebo např. chloridu boritého v methanolu. Dalším typem derivatizace je silylace, kdy je nahrazen vodík ve sloučeninách silylovou skupinou ( derivatizačním činidlem může být např. trimethylsilylimidazol, trimethylchlorsilan, atd.) Plynový chromatograf Přístroj se skládá z dávkovacího zařízení, chromatografické kolony umístěné v termostatu, detektoru a systému pro zpracování dat. Nosný plyn protéká přes dávkovací zařízení do kolony a do detektoru kontrolovanou rychlostí nebo při kontrolovaném tlaku Dávkovací zařízení Přímé nástřiky roztoků jsou obvyklým způsobem dávkování. Nástřik může být prováděn buď přímo na začátek kolony za použití stříkačky, nebo dávkovací smyčky, nebo do vstřikovací komůrky, která může být opatřena děličem toku. Nástřiky plynné fáze mohou být prováděny pomocí statických nebo dynamických head-space dávkovacích systémů. 4

10 Dynamické head-space dávkovací systémy pro adsorpci a desorpci obsahují probublávací zařízení, pomocí kterého jsou těkavé látky uvolňovány z roztoku a vyplavovány do absorpční kolonky udržované na nízké teplotě. Zadržené látky jsou pak desorbovány do mobilní fáze rychlým zahřáním absorpční kolonky. Statické head-space dávkovací systémy obsahují termostatovanou komůrku, do které se vkládají uzavřené nádobky, obsahující pevné nebo kapalné vzorky na předem stanovenou dobu, potřebnou k ustavení rovnováhy těkavých složek vzorku mezi pevnou nebo kapalnou fází a plynnou fází. Po dosažení této rovnováhy je předem určené množství plynné fáze z lahvičky dávkováno do plynového chromatografu Stacionární fáze V plynové chromatografii jsou používány dva základní typy kolon: náplňové a kapilární. Náplňové kolony Klasické náplňové kolony jsou trubice naplněné adsorbentem (GSC) nebo stacionární fází na inertním nosiči (GLC) pokrytou kapalnou fází. Jsou vyrobeny z oceli, skla, atd. Příklady náplní adsorbentů jsou silikagel, grafitizované saze, oxid hlinitý. Nosiče kapalné fáze pro rozdělovací chromatografii bývají na bázi křemeliny (oxid křemičitý) 7. Délka kolony se volí podle toho, jaký problém je třeba řešit, a zpravidla je v rozmezí 30 až 400 cm. Vnitřní průměr analytických kolon je 2 až 4 mm. Na preparativní účely se používají větší průměry. Mikronáplňové kolony se nejčastěji zhotovují ze skla. Délka kolon je zpravidla větší než u klasických náplňových kolon. Vnitřní průměr je asi 1 mm 8. 5

11 Kapilární kolony jsou otevřené kapiláry, kde funkci nosiče zastávají vnitřní stěny kapiláry, které jsou pokryty kapalnou stacionární fází. Kapilární kolony se zhotovují z ocele nebo taveného křemene, jehož povrch je potažen vrstvičkou polyamidu. Tato vrstvička odstraňuje křehkost křemene a kolony jsou pružné 4. Výhody kapilárních kolon: vysoké rozlišení, nižší čas analýzy, analýza malých objemů vzorků a často vyšší citlivost 9. Podle způsobu uložení stacionární fáze v kapilární koloně se rozlišují tři typy kapilárních kolon a to WCOT, SCOT a PLOT. Stacionární fáze v plynové chromatografii zadržují jednotlivé složky v závislosti na jejich distribučních konstantách. Stacionární fázi volíme podle charakteru vzorku a podle rozsahu teplot varu. Obecně platí, že zvolená stacionární fáze má být podobného typu jako analyzovaný vzorek. Používané fáze jsou na bázi polysiloxanů. Kromě toho se používají ještě další dvě fáze: skvalan (isoalkan C 30 H 62 ) jako fáze s nejmenší polaritou a Carbowax 20M (polyethylenglykol se střední molekulovou hmotností 20000) jako silně polární stacionární fáze 4. Příklady používaných stacionárních fází v GC kolonách jsou uvedeny na obr. č.1. Obr.č. 1: Příklady používaných stacionárních fází v GC kolonách 10 6

12 Mobilní fáze V GC se jako mobilní fáze používá inertní plyn, který by se měl svým chováním blížit plynu ideálnímu. Nejčastěji používanými nosnými plyny jsou dusík, helium, vodík. Volba nosného plynu může záležet i na použitém detektoru ( vodík- FID, dusík-ecd, atd.) 11. Nosný plyn má důležitý vliv na separaci, které chceme dosáhnout. Ze tří nejčastěji používaných plynů nabízí vodík 2 výhody- optimální lineární rychlost průtoku je vyšší než u helia a dusíku, umožní tedy kratší dobu separace, a vyšší průtoková rychlost má menší vliv na citlivost kolony než u helia a dusíku 12. Hlavním kritériem výběru nosného plynu jsou požadavky měřícího systému. Zatímco optimální výběr nosného plynu z hlediska separačního procesu je určen potlačením difúzních dějů, je kritérium měřícího systému určeno podmínkou nejvyšší citlivosti měření 13. 7

13 Detektory Detektory jsou zařízení, jejichž úkolem je detegovat v nosném plynu složky, které opouštějí chromatografickou kolonu. Od detektoru se vyžaduje rychlá odezva, velká citlivost a stabilita základního (nulového) signálu. Podle dějů, které probíhají při detekci, je možno detektory rozdělit na nedestrukční a destrukční. V nedestrukčních látka prochází detektorem bez toho, aby se chemicky změnila Tepelně vodivostní detektor (TCD) Podstatnou částí je tenké odporové vlákno umístěné uvnitř kovového bloku. Vláknem prochází konstantní elektrický proud a zahřívá je na určitou teplotu. Jestliže detektorem prochází čistý nosný plyn, je také teplota konstantní. Pokud projde eluovaná složka, změní se teplota vlákna a tím i elektrický odpor detektoru. Tepelně vodivostní detektor je univerzální, dává odezvu na všechny látky 4. Je málo citlivý (10-6 až 10-7 g/ml 14 ) a používá se hlavně pro analýzy neuhlovodíkových plynů Plamenově ionizační detektor (FID) FID je nejpoužívanějším detektorem v plynové chromatografii. K ionizaci molekul vymývaných z kolony dochází v plazmě kyslíkovodíkového plamene, který hoří mezi dvěma elektrodami. V čistém kyslíkovodíkovém plameni je jen velmi málo iontů (asi 10 7 iontů v 1 cm 3 ). Obsah iontů však velmi vzrůstá již za přítomnosti stopových množství uhlovodíků. Tepelnou energií, která se uvolňuje při hoření, se štěpí chemické vazby organických látek za vzniku radikálů, které reagují s vodíkem v redukční zóně plamene za vzniku radikálů CH. V oxidační zóně plamene se tyto radikály oxidují za vzniku iontů CHO+ a elektronů. FID není citlivý na sloučeniny, které termickým štěpením neposkytují radikály CH. Jeho odezva závisí tedy na počtu uhlíkových atomů v molekule. 8

14 Heteroatomy v molekulách organických látek se uplatňují specifickými interakcemi, které zpravidla snižují odezvu detekce 8. Citlivost detektoru se pohybuje až do hodnoty g/ml Termoionizační detektor (TID) Principem detekce je měření koncentrace iontů alkalického kovu v efektivním prostoru detektoru. Koncentrace iontů je úměrná proudu, který prochází mezi polarizovanými elektrodami Detektor elektronového záchytu (ECD) Principem detekce je zachycování elektronů elektronegativními atomy, funkčními skupinami nebo molekulami. Jestliže se zachycování elektronů realizuje v elektrickém poli, změní se v něm přenos náboje a zvýší se pravděpodobnost rekombinace iontů, což se projeví poklesem ionizačního proudu Hmotnostní spektrometr (MS) MS je velice citlivý detektor vhodný pro identifikaci analyzovaných složek směsi. Organické molekuly jsou v MS detektoru ionizovány a fragmentovány a výsledné MS spektrum obsahuje informace o intenzitě jednotlivých iontů. MS je detektorem univerzálním. Kombinace GC-MS patří dnes k nejprogresivnějším technikám 11. 9

15 2.3. Úvod ke HS-GC HS-GC je technika používaná pro koncentraci a analýzu těkavých organických látek. Tato relativně jednoduchá technika je rozšířená v analýze ethanolu v krvi a zbytkových rozpouštědel ve farmaceutických produktech. Vzorkem bývá nejčastěji krev, plasty a kosmetika, které obsahují vysokomolekulární netěkavé látky, které se nedostávají do GC systému a výsledkem je tedy jednoduché analytické provedení 3. Vzorek v HS-GC analýze se obvykle skládá ze směsi těkavých a netěkavých složek. Podstatné je buď kvalitativní složení těkavé části vzorku, nebo koncentrace přítomných těkavých látek. Obvykle jsou přítomny ve vialce dvě fáze (plyn-pevná látka, nebo plyn-kapalina) a je analyzována alikvotní část plynné fáze. Výhodou této situace je, že netěkavé složky vzorku, které nejsou podstatné, nevstupují do plynového chromatografu. Toto je určitá výhoda HS-GC před běžnou GC. Analyzované vzorky jsou obvykle kapaliny nebo pevné látky, je možno i rozpustit pevnou látku a analyzovat roztok. Lze analyzovat i plynné vzorky, buď sbíráním plynného vzorku ve vialce, nebo úplným vypařením malého objemu vzorku ve vialce Základní teorie HS-GC analýzy Typy HS analýzy: Statická HS-GC analýza: Vzorek je umístěn do vialky, ze které je po dosažení rovnováhy mezi plynnou (headspace) a kapalnou/pevnou fází přenesen do plynového chromatografu. Dynamická HS-GC analýza: Oproti statické HS-GC zde není dosaženo rovnováhy, plynná fáze je kontinuálně odváděna z vialky. Těkavé analyty jsou poté zadržovány v kolonce naplněné vhodným sorbetem, která má nižší teplotu, než je teplota desorpce 10

16 analytů. Následným zahřáním kolonky se analyzované složky uvolní a jsou přeneseny do plynového chromatografu 9, 16. Statická HS-GC analýza Tento typ analýzy je používán tam, kde není kompletní extrakce analytu nezbytná 9. Vzorek je umístěn do vialky- viz obr.č. 2. V HS se vialce nachází 2 fáze: kondenzovaná fáze a fáze plynná, které se označují S a G. Pokud systém obsahuje těkavé složky, které jsou rozpustné v kondenzované fázi, tak budou distribuovány mezi obě fáze podle termodynamické rovnováhy. Systém představovaný takovou vialkou lze charakterizovat následujícími parametry 2 : Obr.č. 2 : Fáze v HS vialce 3 V v celkový objem vialky V s objem vzorku V g objem plynné fáze V v =V s +V g 11

17 Relativní objemy těchto 2 fází ve vialce jsou charakterizovány fázovým poměrem β: β =V g /V s Předpokládá se, že V s po ustavení rovnováhy je stejný jako objem původního vzorku V o Původní množství analytu ve vzorku W o a původní koncentrace C o se rovná: C o =W o /V s Po ustavení rovnováhy se příslušné množství analytu mezi dvěma fázemi W s a W g a koncentracemi C s a C g rovná: C s =W s /V s C g =W g /V g Distribuce analytu mezi dvě fáze po rozdělení je vyjádřena termodynamicky řízeným rozdělovacím koeficientem K C K = C s g Rozdělovací koeficient je základním parametrem, který vyjadřuje hmotnostní distribuci mezi dvěmi fázemi 2. Optimalizace citlivosti a kvantifikace pro kapalné vzorky Mezi faktory, které ovlivňují citlivost a kvantifikaci patří objem vialky a vzorku, teplota, tlak a přítomnost matrice. Hlavními faktory ovlivňující HS analýzu jsou fázový poměr β rozdělovací koeficient K. A Cg = Co K +β A plocha píku analyzované látky C g koncentrace analytu v plynné fázi Co původní koncentrace analytu v kapalném vzorku 12

18 Rozdělovací koeficient je závislý na rozpustnosti analytu v kondenzované fázi: složky s vysokou rozpustností mají vysokou koncentraci v kondenzované fázi oproti fázi plynné (C s >>C g ), proto hodnota K může být velmi vysoká, tedy pokud chceme zvýšit citlivost stanovení, je třeba fázový poměr snížit. Rozdělovací koeficient látky může být změněn teplotou. Mezi K a T platí: B' log K = C' T T teplota B,C specifické konstanty analytu Pro polární látky s dobrou rozpustností ve vodě a vysokou hodnotou rozdělovacího koeficientu jsou velmi významné i malé změny teploty, na rozdíl od nepolárních látek s nízkým rozdělovacím koeficientem. Na druhou stranu v případě nízké rozpustnosti bude hodnota C s blízká hodnotě C g, hodnota K bude nízká, tzn. že změny K nepovedou k výraznému zvýšení citlivosti stanovení. Vliv teploty na HS citlivost je ilustrován na obr.č.3 9. Obr.č. 3 9 : Vliv teploty na HS citlivost jako funkce rozdělovacího koeficientu K pro vodný roztok, pro který β=3,46. (1)ethanol, (2)methyl(ethyl)keton, (3)toluen, (4)n-hexan, (5)tetrachlorethylen. 13

19 -vliv objemu vzorku Objem vzorku má minimální efekt na plochu píku u polárních vzorků (vysoký rozdělovací koeficient) v matrici mísitelné s vodou. Naopak pro méně polární analyty je rozdíl v objemu vzorku znatelný. Ke vzorku může být přidána sůl, aby se zvýšila extrakční výtěžnost- viz obr.č. 4. Obr.č. 4 9 : Vlivy změny fázového poměru pro vodný roztok cyklohexanu [1] (0,002 obj.%) a 1,4-dioxanu [2] (0,1 obj.%) v 22,3 ml vialce. a- 1 ml roztoku (β=21,3) b- 5 ml roztoku (β=3,46) c- 5 ml roztoku (β=3,46), ke kterému byly přidány 2 gramy chloridu sodného 14

20 - vliv matrice na HS citlivost Intermolekulární interakce mezi rozpouštědlem a rozpuštěnou látkou popisuje aktivitní koeficient γ. Výměnou matrice můžeme modifikovat aktivitní koeficient a tedy i citlivost HS. Rozdělovací koeficient je nepřímo úměrný tlaku a aktivitnímu koeficientu analytu: K 1 o p i γi o p i tlak γ i aktivitní koeficient Hodnota rozdělovacího koeficientu může být snížena rostoucí hodnotou aktivitního koeficientu. Nízká hodnota K vede k nižší rozpustnosti analytu v matrici a tím k rostoucí koncentraci v HS a vyšší citlivosti. V případě vodných roztoků polárních látek může být použit přídavek solí do roztoku. Přídavkem soli vzrůstá objem kapalného vzorku a tím klesá β. Praktické zkušenosti dokazují, že vliv matrice můžeme považovat za zanedbatelný, pokud je její obsah ve vzorku menší než 1% 2. 15

21 2.5. Analýza kapalných vzorků V případě kapalných vzorků s nízkou viskozitou je čas ekvilibrace kratší, obvykle ovšem závisí na objemu vzorku. Čas ekvilibrace kapalných vzorků může být urychlen zvýšením ekvilibrační teploty. Pro praktické použití se výrazné zvýšení ekvilibrační teploty používá zřídka, vliv na ekvilibrační čas není příliš významný. Lepším způsobem je průběžné promíchávání vzorku ve vialce v průběhu ekvilibračního procesu. HS-GC systémy bývají obvykle vybaveny protřepávacím zařízením. Frekvence protřepávání závisí na viskozitě a objemu vzorku. Protřepávání je efektivní u nepolárních analytů ve vodných roztocích. Čas potřebný pro ustavení rovnováhy závisí na difúzi těkavých složek vzorku z a do vlastního vzorku. V případě, že máme neznámý vzorek, je provedena série měření, kdy je postupně měněn čas termostatování, přičemž ostatní podmínky měření zůstávají beze změny. Čas potřebný pro ustavení rovnováhy je čas až do konstantní plochy píku. Ekvilibrační čas je nejkratší čas, po který musí být vzorek termostatován. Při dalším prodloužení termostatování se analytické výsledky nemění. Čas ustavení rovnováhy je závislý i na objemu vzorku ve vialce, se vzrůstajícím objemem roste i čas. Na jednu stranu je možno preferovat malé objemy, na stranu druhou je třeba použít větší objemy kvůli velikosti plochy píku, malé koncentraci vzorku, rozdělovacímu koeficientu Manipulace se vzorkem Pro přenos vzorku z vialky do plynového chromatografu je používáno několik způsobů: a / plynotěsná injekční stříkačka Tento systém (viz. obr.č.5) je jedním z nejběžnějších pro přenos vzorku, který nevyžaduje složité vybavení. Pracuje s termostatováním vzorku v inkubačním prostoru vyhřátém na požadovanou teplotu a pro daný čas, 16

22 během kterého dojde k ustavení rovnováhy vzorku. Poté je alikvotní část z headspace vialky pomocí stříkačky a nastříknuta do GC. Obr. č Přenos vzorku plynotěsnou injekční stříkačkou Ustavení rovnováhy Vzhledem k tomu, že je vzorek přenášen z vyhřívaného prostoru, musí být taktéž vyhřívaná i stříkačka, aby v ní nedošlo ke kondenzaci vzorku. Nevýhodou této metody je nižší reprodukovatelnost měření, kvůli možnosti ztráty části vzorku během přenosu z vialky do injekčního portu. Tento jev je způsoben rozdílem mezi tlakem ve vialce a tlakem atmosférickým. b/ tlakově vyvážený systém Pomocí tohoto systému (viz. obr.č. 6) je dosahováno vysokého stupně opakovatelnosti měření. Používá vstřikování přímo z vialky do proudu nosného plynu bez dalších pohyblivých částí kromě ventilu a jehly. Stejně jako ostatní systémy používá inkubační prostor pro vialku se vzorkem k dosažení rovnováhy -Step 1. Poté je jehla vsunuta do vialky a dochází k tlakování nosným plynem. Až je vialka natlakovaná a je dosaženo rovnováhy, dojde k sepnutí ventilu po přesně daný čas a vzorek je přenesen na kolonu. 17

23 Obr. č Tlakově vyvážený systém c/ systém tlakové smyčky Na rozdíl od předchozího systému je zde použito přesně známé množství vzorku. Technika (viz. obr.č.7) využívá 6 ventilů, a již dříve popsané termostatování a tlakování vialky. Po natlakování vialky je ventil otočen a smyčka je naplněna vzorkem. Po naplnění smyčky je ventil znovu otočen, tím dojde k přesměrování toku nosného plynu a vzorek je veden na kolonu. Výhodou této metody je dobrá reprodukovatelnost, objemy vzorků jsou vždy stejné. Nevýhodou mohou být tzv. náhodné píky, které způsobuje vzájemná kontaminace vzorků z předchozích měření 3. Obr. č Systém tlakové smyčky 18

24 2.7. Kvantifikace metody Ačkoliv lze HS-GC použít i ke kvalitativní analýze, její hlavní využití je pro kvantifikaci těkavých látek přítomných v kapalných, plynných nebo pevných vzorcích, která je provedena analýzou alikvotní části vzorku. Hlavní metody používané v GC lze využít i v HS-GC, patří mezi ně metoda vnitřní normalizace a metoda vnitřního a vnějšího standardu. Dalšími metodami pro HS-GC je metoda standardního přídavku a metoda vícenásobné head-space extrakce Metoda vnitřní normalizace Hlavním cílem head-space analýzy je určení množství (koncentraci) těkavých složek vzorku, který také obsahuje netěkavé, nebo málo těkavé složky, označované jako matrice. Tudíž vnitřní normalizace-kde je určováno celkové složení vzorku, nemá význam, kromě dvou případů: pokud nás zajímá pouze složení plynné fáze, nebo když jsou všechny těkavé látky kompletně vypařeny do plynné fáze ve vialce 2. Obsah jedné nebo více složek zkoušené látky v procentech se vypočítá z plochy píku nebo píků jako procento celkové plochy všech píků, s výjimkou píků rozpouštědel nebo jakýchkoliv přidaných činidel a píků, jejichž plocha je pod limitem zanedbatelnosti 6. V mnoha případech ovšem stejná koncentrace rozdílných analytů dává rozdílné plochy píku, koncentrace je tedy proporcionální k ploše píku C i =f i *A i Kalibrační faktor f i je různý pro jednotlivé složky vzorku, je specifický pro každou látku 2. Výhodou této metody je, že výsledky nezávisí na přesnosti objemu při nástřiku vzorku

25 Metoda vnitřního standardu Ke zkoušenému roztoku a porovnávacímu roztoku se přidají stejná množství látky, kterou lze separovat od zkoušené látky (vnitřní standard). Vnitřní standard nesmí reagovat se zkoušenou látkou, musí být stálý a nesmí obsahovat nečistoty s retenčním časem podobným retenčnímu času zkoušené látky. Koncentrace zkoušené látky se stanoví porovnáním poměru ploch píků nebo výšek píků stanovované látky a vnitřního standardu pro zkoušený roztok a odpovídajícího poměru pro porovnávací roztok Výhodou této metody je, že není potřeba přesně znát dávkované množství do chromatografu, ale pouze relativní odezvu detektoru 8. Ci= C st A fi A i st C i..koncentrace látky i C st..koncentrace standardu f i..kalibrační faktor A i..plocha píku látky i A st..plocha píku standardu Kalibrační faktor lze vypočítat 2 : W fi= W W i..hmotnost látky i W st..hmotnost standardu i st A A st i Metoda vnějšího standardu Tato metoda spočívá ve dvou krocích (dvojím dávkování). V prvním kroku se na kolonu nastříkne roztok analyzovaného vzorku a po registraci chromatografického záznamu se v druhém kroku nastříkne roztok vnějšího standardu a opět se registruje jeho chromatogram. 20

26 Koncentrace stanovovaných složek směsi se pak vypočítá z poměru ploch (výšek) píků jednotlivých stanovovaných látek a plochy píku vnějšího standardu 17. Pokud je plocha píku a koncentrace proporcionální, lze množství analytu vypočítat z těchto dvou ploch píků. Výhodou této metody může být velké množství píků na chromatografickém záznamu, kde by se těžko hledalo místo pro eluci standardu Metoda standardního přídavku Jednorázový přídavek V této metodě je nejprve provedena analýza původního vzorku a poté vzorku, ke kterému je přidáno známé množství analytu, přičemž obě měření jsou prováděna za identických podmínek. Stanovení je založeno na identické matrici a proto není potřeba počítat s kalibračními faktory, plocha píku a množství analytu jsou proporcionální. Wo Wo+ Wa = Ao A( o + a) W o původní množství látky A o plocha píku původního množství látky W a přidané množství látky A (o+a) plocha píku po přídavku Vícenásobný přídavek K analyzovanému vzorku je postupně přidáváno vzrůstající množství analytu a výsledky jsou hodnoceny pomocí lineární regrese 2. Do grafu se vynesou střední hodnoty naměřených dat proti přidaným množstvím stanovované látky. Extrapoluje se přímka spojující body na grafu, až protne osu koncentrací. Vzdálenost mezi tímto bodem s průsečíkem os představuje koncentraci stanovované látky ve zkoušeném vzorku 6. 21

27 2.8. Validace analytické metody Validace je proces, při němž se určuje vhodnost použití daného analytického systému pro získání relevantních dat 18. Typy analytických metod pro validaci: - identifikační zkoušky - kvantitativní zkoušky na obsažené nečistoty - limitní zkoušky na obsah nečistot - kvantitativní zkoušky účinných látek ve vzorku léčivé látky nebo léčivého přípravku nebo dalších vybraných složek v léčivém přípravku Validační parametry SPRÁVNOST (ACCURACY) Vyjadřuje shodu mezi získaným výsledkem a správnou hodnotou. Správnou hodnotu lze zjistit buď jinou nezávislou metodou s ověřenou správností, nebo se připraví modelový vzorek ze všech složek přípravku a přesně přidaného standardu. Nejsou-li k dispozici všechny složky přípravku, analyzuje se přípravek se známým přídavkem standardu. Správnost se obvykle zjistí analýzou nejméně šesti vzorků a vyjádří se jako rozdíl správné a získané hodnoty nebo jako výtěžnost (recovery): nalezená hodnota recovery= správná hodnota PŘESNOST (PRECISION) Přesnost analytického měření vyjadřuje míru shody jednotlivých výsledků získaných ze série měření téhož vzorku za přesně daných podmínek. Přesnost může být posuzována ve 3 úrovních: opakovatelnost, mezilehlá přesnost a reprodukovatelnost

28 Obvykle se tento vzorek nezávisle šestkrát analyzuje kompletním postupem včetně přípravy vzorku. Přesnost se vyjádří pomocí SD a RSD 17. Výpočet SD a RSD 9 : 2 ( x x1) ( x xn) SD= n x= x1+ x 2 + x n x n SD RSD= 100 x Podle podmínek opakování se rozlišují tři úrovně přesnosti: - opakovatelnost (repeatability) - metoda se opakuje stejným způsobem jedním pracovníkem se stejnými činidly na tomtéž přístroji - mezilehlá přesnost (intermediate precision) - metoda se provádí s různými činidly, analytiky i přístroji, v různý den, ale v jedné laboratoři a se stejným homogenizovaným vzorkem - reprodukovatelnost (reproducibility) - provedení je stejné jako u mezilehlé přesnosti s tím rozdílem, že probíhá v různých laboratořích 17. SELEKTIVITA (SPECIFITY) Selektivita je schopnost jednoznačně stanovit látku v přítomnosti ostatních složek vzorku, jejichž výskyt může být předpokládán 20. To mohou být další účinné látky u složených přípravků, pomocné látky, nečistoty z výroby, rozkladné produkty, zbytková rozpouštědla. Tento parametr se doloží výsledky analýzy standardu, a dále např. vzorků bez analyzované látky obsahujících všechny složky přípravku, rozkladné produkty, nečistoty 17. LIMIT DETEKCE (LIMIT OF DETECTION, LOD) Limit detekce jednotlivé analytické metody je nejmenší množství látky ve vzorku, které může být detekováno

29 Vyjadřuje citlivost metody. U instrumentálních metod se může určit jako koncentrace analyzované látky s poměrem signálu k šumu s hodnotou LIMIT KVANTIFIKACE (LIMIT OF QUANTIFICATION, LOQ) Je též parametrem citlivosti metody. Je to nejnižší koncentrace látky, stanovitelná s přijatelnou přesností a správností. Za limitující relativní směrodatnou odchylku se považuje 10%, proto je možné LOQ vyjádřit jako koncentraci, při jejíž analýze se dosáhne této RSD. Často se vyjadřuje jako koncentrace s poměrem signálu k šumu s hodnotou LINEARITA (LINEARITY) Linearita je chápána jako přímková závislost mezi dvěma náhodnými proměnnými, tj. odezvou instrumentace (analytickým signálem) a koncentrací analytu. Těsnost vzájemné závislosti dvou náhodných proměnných charakterizuje korelační koeficient (r). Při lineární závislosti nabývá hodnoty +1 a čím více se blíží jedné, tím je závislost obou proměnných těsnější 21. ROZSAH (RANGE) Tento parametr se obvykle odvozuje z linearity metody a rozumí se jím koncentrační hranice, v kterých může být metoda používána. Dolním limitem může být např. LOD a horní může být určen maximální odezvou, při jejímž překročení už přístroj nepracuje přesně 17. ROBUSTNOST (ROBUSTNESS) Robustnost analytické metody je míra její kapacity k tomu, aby zůstala neovlivněna při malých, ale úmyslných změnách parametrů metody a udává její spolehlivost během běžného užívání 20. Vyjadřuje míru vlivu proměnných podmínek na výsledky analýzy. Sbírají se poznatky z vývoje metody a cílem je upozornit na podmínky, které mohou ovlivnit výsledky

30 2.9. Zpracování literární rešerše Z dostupných literárních zdrojů byla zpracována literární rešerše se zaměřením na používané metody a chromatografické podmínky v oblasti head-space plynové chromatografie. Shrnutí výsledků je zpracováno v tab.č.1, která zahrnuje vždy konkrétní podmínky pro danou metodu, příp. další specifikaci, pokud v článku bylo uvedeno. 25

31 Tab. č. 1 Shrnutí výsledků literární rešerše kolona matrice HS podmínky chromatografické podmínky RTX- BAC1, RTX-BAC2 krev, plazma-stabilita ethanolu během skladování matrice HS teplota: 70 C čas ekvilibrace: 20 min teplota na koloně: RTX-BAC1: 45 C RTX-BAC2: 40 C detektor: FID LOD= 0,010 g/kg, LOQ=0,04 g/kg kvantifikace za použití vnitřního standardu: 1-propanol pro BAC1, terc-butanol pro BAC2 22 DB-ALC1 želatinové kapslestanovení reziduálního ethanolu HS-teplota: 100 C čas ekvilibrace: 20 min teplotní gradient teplota na koloně čas 35 C 15 min 25 C/min 200 C 5,4 min LOQ= 5µg/ml detektor: FID využití organických nemísitelných rozpouštědel pro kvantifikaci: dekan, dodekan, heptan nosný plyn: helium 23 RTX-BAC2 krev-post mortemstanovení ethanolu HS-teplota: 60 C čas ekvilibrace 30 min teplotní gradient teplota na koloně čas 80 C 5 min 15 C/min 120 C 1,5 min detektor: FID nosný plyn: helium LOD= 10 mg/l LOQ= 200 mg/l kvantifikace za použití vnitřního standardu: t-butanol, ethyl methyl keton nosný plyn: helium 24 26

32 RTX-BAC2 Stabilwax Carbowax krev- stanovení ethanolu moč- stanovení ethanolu krev,moč- stanovení ethanolu HS-teplota: 55 C čas ekvilibrace: 15 min úprava vzorku centrifugací, poté přímý nástřik supernatantu na kolonu HS teplota: 80 C čas ekvilibrace: 10 min teplotní gradient teplota na koloně čas -60 C 1 min 10 C/min 40 C 10 min 20 C/min 240 C detektor: FID kvantifikace metodou vnitřního standardu: 2-methylpropan-1-ol LOD= 0,01 µg/ml nosný plyn: helium 25 teplotní gradient teplota na koloně čas 80 C 5 min 15 C/min 120 C 1,5 min detektor: FID kvantifikace metodou vnitřního standardu: acetonitril LOQ= 0,25 mg/l nosný plyn: helium 26 teplotní gradient teplota na koloně čas 40 C 4 min 15 C/min 220 C kvantifikace metodou vnitřního standardu: isobutanol detektor: FID LOD= 0,5 mg/l nosný plyn: helium 27 27

33 DB-1 DB-WAX skleněná kolona s náplní Separon SDA Carbowax hydrofilní iontové kapaliny- stanovení reziduálního ethanolu proteinová matricestanovení ethanolu vodné roztoků alkoholů-využití headspace pro singledrop mikroextrakci krev post mortemstanovení ethanolu HS teplota: 63 C čas ekvilibrace: 30 min HS teplota: 60 C čas ekvilibrace: 10 min HS teplota: 60 C čas ekvilibrace: 10 min HS teplota: 45 C čas ekvilibrace: 15 min teplotní gradient teplota na koloně čas 40 C 5 min 15 C/min 115 C 5 min detektor: FID nosný plyn: helium 28 teplotní gradient teplota na koloně čas 40 C 8 min 15 C/min 180 C 3 min kvantifikace metodou vnitřního standardu: propanol detektor: FID nosný plyn: helium 29 teplotní gradient teplota na koloně čas 150 C 26 min 20 C/min 190 C 8 min kvantifikace metodou vnitřního standardu: butan-2-on detektor: FID 30 isotermální analýza při 100 C detektor: FID kvantifikace metodou vnitřního standardu: t-butanol LOD=0,005 g/l; LOQ=0,01 g/l 31 28

34 CP-select 624 CB léčivé přípravky-vodné roztoky- stanovení reziduálních rozpouštědel DB-ALC1 biologické tekutinystanovení ethanolu DB-624 krev- stanovení ethanolu RTX-624 tablety (rozpuštěny ve vodě)- stanovení reziduálního ethanolu HS teplota: 60 C čas ekvilibrace: 20 min HS teplota: 70 C čas ekvilibrace: 10 min HS teplota: 60 C čas ekvilibrace: 30 min HS teplota: 80 C čas ekvilibrace: 50 min teplotní gradient teplota na koloně čas 40 C 3 min 3 C/min 100 C 8 min 20 C/min 250 C 5 min kvantifikace metodou standardního přídavku detektor: FID nosný plyn: helium C po dobu 5 minut kvantifikace metodou vnitřního standardu: n-propanol LOD= 0,02 mg/dl, LOQ= 0,2 mg/dl detektor: MS nosný plyn: helium C po dobu 10 minut detektory: FID, MS LOQ= 17 mg/dl, LOD=5 mg/dl nosný plyn: dusík 34 teplotní gradient teplota na koloně čas 50 C 30 C/min 200 C 5 min detektor: FID kvantifikace metodou standardního přídavku nosný plyn: helium 35 29

35 3. CÍL PRÁCE 30

36 Cílem této rigorózní práce bylo: - zpracovat rešerši z publikovaných článků na téma stanovení ethanolu pomocí head-space plynové chromatografie - na základě získaných výsledků testovat optimální podmínky pro kvantifikaci ethanolu pomocí HS-GC - validace metody 31

37 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 32

38 4.1.Použité chemikálie, přístroje, programové vybavení, pomůcky Chemikálie - 1-propanol, Sigma Aldrich, Německo - 2-propanol, Penta, ČR - Ethanol (99,89%), Merck KGaA, Německo - Methanol, Merck KGaA, Německo - Aceton, Penta, ČR - Přípravek č Voda- neionizovaná pomocí systému Milli-Q systému, Millipore (Bedford, MA, USA) Přístroje -plynový chromatograf GC-2010, Shimadzu, Japonsko -PC s chromatografickým softwarem GC solution Ver SU7, Shimadzu, Japonsko - Autosampler AOC-5000, Shimadzu, Japonsko - Analytické digitální váhy Sartorius A200S, ČR Chromatografický materiál: - kolona- Rtx- 624, 30 m x 0,32 µm x 1,8 µm film thickness, Restek, USA Pomůcky: - laboratorní sklo - automatik pipety, Eppendorf Research, Fischer, ČR 33

39 Chromatografické podmínky-tab.č. 2-3 Tab. č. 2- Metoda Standardy HS podmínky teplota temperování doba temperování 60 C 20 min GC podmínky teplota na koloně čas 40 C 6 min. Tab. č. 3 Metoda Final HS podmínky teplota temperování doba temperování 60 C 20 min GC podmínky teplotní gradient teplota na koloně čas 40 C 6 min. 50 C/min 235 C 20 min. Pro všechny analýzy byl odebíraný objem vzorku do HS vialky 1 ml. Na kolonu bylo nastřikováno 250 µl. 34

40 4.2. Příprava pracovních roztoků Příprava roztoku pro výběr teplotních podmínek Zásobní roztok ethanolu o koncentraci 0,4 mg/ml byl připraven přesným navážením 100 mg ethanolu do 10 ml odměrné baňky a doplněním po rysku vodou. Dále byl odebrán 1 ml tohoto roztoku do 25 ml odměrné baňky a doplněním po rysku vodou Metoda vnějšího standardu Zásobní roztok byl připraven přesným navážením 100 mg ethanolu do 10 ml odměrné baňky a doplněním po rysku vodou. Dále byl odebrán 1 ml tohoto roztoku do 25 ml odměrné baňky a doplněním po rysku vodou. Pro roztok s obsahem matrice bylo přidáno ještě 300 mg Přípravku 4 a 300 mg Přípravku Příprava roztoku pro výběr vnitřního standardu Zásobní roztok byl připraven přesným navážením 100 mg ethanolu, 1-propanolu a 2-propanolu do 10 ml odměrné baňky a doplněním po rysku vodou. Dále byl odebrán 1 ml tohoto roztoku do 25 ml odměrné baňky a doplněním po rysku vodou Příprava pracovních roztoků pro určení vlivu matrice na stanovení obsahu ethanolu Zásobní roztok byl připraven přesným navážením 100 mg ethanolu a 2-propanolu do 10 ml odměrné baňky a doplněním po rysku vodou. Dále byl odebrán 1 ml tohoto roztoku do 25 ml odměrné baňky a doplněním po rysku vodou. Roztok s obsahem matrice byl připraven stejným způsobem, s přídavkem 300 mg Přípravku 4 a 300 mg Přípravku 5 do 10 ml odměrné baňky. 35

41 Metoda standardního přídavku vnějším a vnitřním standardem Zásobní roztok byl připraven přesným navážením 100 mg ethanolu do 10 ml odměrné baňky a doplněním po rysku vodou. Poté bylo naváženo 60 mg Přípravku 1 do osmi 50 ml odměrných baněk a podle vzrůstající koncentrace přidáváno 0; 0,5; 0,75 a 1 ml zásobního roztoku ethanolu a doplněno po rysku vodou. Každá hladina byla připravena dvakrát. V druhé sérii byly vzorky připraveny stejným způsobem, s přídavkem 2 ml zásobního roztoku 2-propanolu (c= 10 mg/ml) Validace metody vnitřního standardu Linearita Zásobní roztok ethanolu (c=15 mg/ml) byl připraven přesným navážením 150 mg ethanolu do 10 ml odměrné baňky a doplněním vodou po rysku. Dále byl připraven zásobní roztok vnitřního standardu přesným navážením 50 mg 2-propanolu do 10 ml odměrné baňky a doplněním vodou po rysku. Jednotlivé roztoky ethanolu o koncentracích 1 mg/ml; 0,75 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,1 mg/ml; 0,05 mg/ml; 0,025 mg/ml byly připraveny postupným ředěním zásobního roztoku ethanolu (c=15 mg/ml) do 25 ml odměrné baňky (přené koncentrace roztoků ethanolu jsou uvedeny v tab.č.14), ke kterému byl vždy přidán 1 ml zásobního roztoku 2-propanolu a doplněním vodou po rysku Přesnost, opakovatelnost, mezilehlá přesnost Zásobní roztok byl připraven přesným navážením 50 mg ethanolu do 50 ml odměrné baňky, přidáním 1 ml zásobního roztoku 2-propanolu (c= 10 mg/ml) a doplněním vodou po rysku Správnost Zásobní roztok pro první sérii měření (bez matrice) byl připraven přidáním 5 ml zásobního roztoku ethanolu (c=7 mg/ml) a 1 ml zásobního roztoku 36

42 2-propanolu (c=10 mg/ml) do 50 ml odměrné baňky a doplněním vodou po rysku. Zásobní roztok pro druhou sérii měření (s matricí) byl připraven přesným navážením 50 mg Přípravku 4, 50 mg Přípravku 5, přidáním 1 ml zásobního roztoku 2-propanolu (c=10 mg/ml) a 5 ml zásobního roztoku ethanolu (c=7 mg/ml) do 50 ml odměrné baňky a doplněním vodou po rysku. Pro další měření byly ještě použity zásobní roztoky ethanolu o koncentracích 0,1 mg/ml a 1 mg/ml. Postup další přípravy byl stejný jako pro předchozí vzorky Selektivita Pro ověření selektivity byly připraveny jednotlivé vzorky ethanolu (c=0,39 mg/ml), 2-propanolu (c=0,38 mg/ml), methanolu (c=0,41 mg/ml) a acetonu (c=0,14 mg/ml). Jako rozpouštědlo byla použita voda. Roztok pro simulaci matrice byl připraven navážením 50 mg Přípravku 4 a 50 mg Přípravku 5 do 50 ml odměrné baňky a doplněn vodou Stabilita Zásobní roztok byl připraven přesným navážením 150 mg ethanolu do 10 ml odměrné baňky a doplněním po rysku vodou. Dále byl odebrán 1 ml tohoto roztoku do 50 ml odměrné baňky, přidán 1 ml zásobního roztoku 2-propanolu (c= 10 mg/ml) a doplněno po rysku vodou Stanovení obsahu ethanolu Přípravek č.1: 100 mg Přípravku č.1 do 100 ml odměrné baňky + 2 ml zásobního roztoku 2-propanolu (c= 10 mg/ml) a doplněno po rysku vodou. Přípravek č.2: 100 mg Přípravku č.2 do 50 ml odměrné baňky + 1 ml zásobního roztoku 2-propanolu (c= 10 mg/ml) a doplněno po rysku vodou. Přípravek č.3: 50 mg Přípravku č.3 do 50 ml odměrné baňky + 1 ml zásobního roztoku 2-propanolu (c= 10 mg/ml) a doplněno po rysku vodou. 37

43 Roztok standardu byl připraven přesným navážením 150 mg ethanolu do 10 ml odměrné baňky a doplněním vodou po rysku. Dále byl odebrán 1 ml tohoto roztoku do 50 ml odměrné baňky, přidán 1 ml zásobního roztoku 2-propanolu (c= 10 mg/ml) a doplněno po rysku vodou. 38

44 5.VÝSLEDKY A DISKUZE 39

45 5.1. Výběr teplotních podmínek V teoretické části práce byla zpracována literární rešerše (viz. odkazy č ) a na základě získaných výsledků byly zvoleny podmínky pro analýzu. V jednotlivých článcích rešerše byly nejčastěji používané polární stacionární fáze. Teplotní podmínky pro head space analýzu se pohybovaly nejčastěji v rozmezí C a čas ekvilibrace minut. Za počáteční teplotu na koloně byla nejčastěji volena hodnota 40 C po dobu 3-5 minut. Vzhledem k předpokládané matrici u testovaných vzorků byla vybrána kolona Rtx , u které je mírně polární stacionární fáze tvořena 6 % cyanopropylphenylu / 94 % dimethyl polysiloaxanu. Tato kolona se používá pro analýzu těkavých organických nečistot- zbytkových rozpouštědel, alkoholů a těkavých organických sloučenin 37. Prvním krokem v experimentální části bylo nalezení optimálních head-space podmínek pro vzorky obsahující ethanol. Bylo pracováno s dobou temperování vzorku, v rozmezí 5-25 minut, a s teplotou stříkačky v rozmezí C. Za hodnotu temperování bylo zvoleno 60 C. 40

46 Doba temperování Cílem bylo nalezení doby temperování vzorku, při které už bude hodnota píku konstantní. Ze získaných výsledků byla sestavena tab.č. 4 a grafobr. č. 8. Za temperanční teplotu vzorku bylo zvoleno 60 C. Tab. č. 4- Změna doby temperování Čas[min] A EtOH průměr SD RSD , , ,90 780,50 1, , , ,45 871,93 2, , , , ,68 5, , , , ,63 4, , , , ,89 3,58 Obr. č. 8- Změna doby temperování Změna doby temperování plocha píku čas [min] Z výsledků je patrné, že hodnota píku vzrůstala až do času 20 min. Tato hodnota byla proto zvolena za optimální a byla použita pro další měření. 41

47 Teplota stříkačky Při testování doby optimální temperace bylo pracováno s teplotou stříkačky 50 C. Pro vyloučení vlivu teploty stříkačky na průběh analýzy byla teplota zvýšena až na 65 C. Výsledky měření jsou shrnuty v tab.č. 5. Tab. č. 5- Vliv teploty stříkačky na průběh analýzy Teplota [ C] A EtOH průměr SD RSD , , , ,15 3, , , , ,81 19, , , ,20 890,81 2,19 Z výsledků měření, mezi které nebyla zahrnuta první hodnota pro teplotu 60 C jako odlehlá hodnota, je zřejmé, že teplota stříkačky nemá na analýzu vliv. Proto tedy byla zachována teplota 50 C pro všechna další měření Metoda vnějšího standardu Jako první byla testována metoda vnějšího standardu. V prvním měření byl analyzován roztok ethanolu -tab. č. 6, poté vzorek s obsahem matrice- tab. č. 7. Vzorky byly připraveny z jednoho zásobního roztoku (2 bez matrice, 2 s obsahem matrice). Každý vzorek byl analyzován dvakrát. Tab. č. 6- Vzorek bez obsahu matrice Vzorek A EtOH navážka /mg/ VZ_1/ ,5 99,7 VZ_1/ ,4 VZ_2/ ,6 VZ_2/ ,5 Průměr 44826,5 SD 1841,59 RSD 4,11 42

48 Tab.č. 7- Vzorek s obsahem matrice Vzorek A EtOH navážka /mg/ VZ_3/ ,4 99,7 VZ_3/ ,0 VZ_4/ ,2 VZ_4/ ,6 Průměr 44478,55 SD 675,81 RSD 1,52 Z naměřených výsledků byla zjištěna velká variabilita výsledků (RSD v rozmezí 1,52-4,11), která pro kvantifikaci není příliš vhodná. Od této metody bylo tedy upuštěno. Porovnáním ploch píku ethanolu ve vzorku bez matrice a s matricí bylo dále zjištěno, že matrice neovlivňuje výsledky měření (výtěžnost= 100,8%) Metoda vnitřního standardu Výběr vnitřního standardu Z předchozích měření je patrné, že vyhodnocování měření bez použití vnitřního standardu je zatíženo relativně velkým rozptylem hodnot plochy píku ethanolu. Proto bylo uvažováno použití vnitřního standardu pro další měření, který bude chybu korigovat. Pro podobné vlastnosti byl vybrán 1-propanol a 2-propanol. Příprava vzorku uvedena v kapitole Výsledky měření jsou shrnuty v tab.č. 8 a na obr.č. 9. Měřeno metodou Standardy. 43

49 Tab. č. 8- Výsledky měření pro výběr vnitřního standardu vzorek A EtOH A 2P A 1P EtOH/2P EtOH/1P VZ_ , , ,40 0,3726 0,4227 VZ_ , , ,40 0,3729 0,4228 VZ_ , , ,30 0,3755 0,4247 VZ_ , , ,70 0,3740 0,4220 VZ_ , , ,80 0,3722 0,4219 VZ_ , , ,60 0,3732 0,4225 průměr 36522, , ,03 0,3734 0,4228 SD 671, , ,26 0,0012 0,0010 RSD 1,84 1,76 1,82 0,32 0,24 Obr. č. 9- Chromatografický záznam píku ethanolu, 2-propanolu a 1-propanolu 5.0 uv(x10,000) Chromatogram propanol ethanol 1-propanol min Na chromatografickém záznamu je rozlišení jednotlivých píků pro oba standardy vyhovující (2,54 pro ethanol a 2-propanol a 7,47 pro ethanol a 1-propanol). Dále byly počítány SD a RSD pro samotný ethanol, poté v poměru s vnitřním standardem. Z tab.č. 8 vyplývá, že vnitřní standard 44

50 výrazně snižuje rozptyl jednotlivých výsledků. Relativní směrodatná odchylka ploch pro plochy samotného ethanolu je 1,84%, zatímco při použití 2-propanolu je 0,32%, pro 1-propanol je 0,24%. Byl potvrzen závěr z předchozí kapitoly, že metoda vnějšího standardu nebude vhodná. Z důvodu kratší doby analýzy byl za vnitřní standard vybrán 2-propanol, pokud by ovšem docházelo k interferenci mezi standardem a matricí, je možné použít 1-propanol Vliv matrice na stanovení obsahu ethanolu Pro vyloučení vlivu matrice na množství stanoveného ethanolu byla provedena série měření. Nejprve byly analyzovány roztoky ethanolu- tab. č. 9 (bez obsahu matrice), pomocí metody Standardy, poté vzorky s obsahem matrice- tab. č. 10 (metoda Final), u obou bylo jako rozpouštědlo použita voda. Ke všem vzorkům byl přidán 2-propanol jako vnitřní standard. Tab. č. 9- Vzorek bez obsahu matrice A EtOH A 2P EtOH/2P m EtOH /mg/ m 2P /mg/ VZ_1/ , ,7 0, ,7 104,2 VZ_1/ , ,7 0,4432 průměr 0,4427 SD 0,0004 RSD 0,0984 Tab. č. 10- Vzorek s obsahem matrice A EtOH A 2P EtOH/2P m EtOH /mg/ m 2P /mg/ VZ_2/ , ,4 0, ,2 101,9 VZ_2/ , ,6 0,4632 průměr 0,4617 SD 0,0016 RSD 0,

51 Tab. č. 11- Výpočet vlivu matrice na stanovení ethanolu VZ_1/1+1/2 VZ_2/1+2/2 průměr EtOH 40588, ,05 m [mg] 107,2 105,7 A EtOH /m 378,63 411,47 VZ_1/1+1/2 VZ_2/1+2/2 průměr 2P 87914, ,20 m [mg] 101,9 104,2 A 2P /m 862,75 942,78 (A EtOH /m EtOH_ )/(A 2P /m 2P ) 0,4389 0,4364 výtěžnost EtOH 100,5 Z výsledků měření byla spočítána výtěžnost ethanolu (viz. tab.č. 11) ve vzorcích bez matrice a s matricí. Bylo zjištěno, že matrice nemá vliv na stanovené množství ethanolu Metoda standardního přídavku Jako poslední metoda pro kvantifikaci byla testována metoda standardního přídavku bez i s přídavkem vnitřního standardu. a/ Bez IS- Nejprve byl analyzován roztok Přípravku č.1 bez přídavku ethanolu, poté se vzrůstajícím přídavkem zásobního roztoku ethanolu (c= 10 mg/ml): 0,5 ml; 0,75 ml a 1,0 ml. Každý vzorek byl připraven ve dvou navážkách. Byla sledována linearita odezvy- viz tab.č

52 Tab. č. 12- Metoda standardního přídavku bez vnitřního standardu Vzorek A EtOH navážka přípr.1 /mg/ průměr SD RSD VZ_1/ ,3 63, ,10 843,15 1,83 VZ_1/ ,9 VZ_2/ ,0 61, ,90 285,81 0,63 VZ_2/ ,8 VZ_3/1+0,5ml 56932,9 59, ,90 188,09 0,33 VZ_3/2+0,5ml 56666,9 VZ_4/1+0,5ml 57404,7 61, , ,27 3,27 VZ_4/2+0,5ml 60123,2 VZ_5/1+0,75ml 71871,9 66, , ,38 1,91 VZ_5/2+0,75ml 73838,2 VZ_6/1+0,75ml 72702,0 71, ,75 197,64 0,27 VZ_6/2+0,75ml 72981,5 VZ_7/1+1ml 72627,4 58, , ,14 1,95 VZ_7/2+1ml 70647,3 VZ_8/1+1ml 70137,1 55, ,05 946,18 1,36 VZ_8/2+1ml 68799,0 Obr. č. 10- Závislost plochy píku na koncentraci bez použití vnitřního standardu Závislost plochy píku na koncentraci y = x R 2 = 0, plocha píku ,4-0,3-0,2-0,1 0 0,1 0,2 0,3 koncentrace [mg/ml] Výsledky měření byly vyneseny do grafu- obr. č. 10, kde hodnota spolehlivosti vychází R 2 = 0,8877. Hodnoty RSD se v tomto případě pohybovaly v rozmezí 0,27-3,27. 47

53 b/ S IS: Z důvodu vysokých hodnot RSD byla změřena série vzorků o stejném složení s přidáním vnitřního standardu viz -tab.č. 13. Tab. č. 13- Metoda standardního přídavku s použitím vnitřního standardu navážka průměr vzorek A EtOH A 2P přípr.1 /mg/ EtOH/2P SD RSD VZ_9/ , ,6 59,4 0,5089 0,5075 0,001 0,28 VZ_9/ , ,9 0,5061 VZ_10/ , ,5 56,2 0,4770 0,4755 0,002 0,33 VZ_10/ , ,8 0,4739 VZ_11/1+0,5ml 69912, ,2 58,6 0,6417 0,6374 0,004 0,67 VZ_11/2+0,5ml 59145, ,2 0,6331 VZ_12/1+0,5ml 63153, ,6 66,6 0,7035 0,7043 0,001 0,11 VZ_12/2+0,5ml 64671, ,7 0,7050 VZ_13/1+0,75ml 60370, ,2 57,7 0,7124 0,7119 0,001 0,07 VZ_13/1+0,75ml 73214, ,1 0,7114 VZ_14/1+0,75ml 60033, ,3 59,9 0,7085 0,7060 0,002 0,35 VZ_14/2+0,75ml 65101, ,2 0,7035 VZ_15/1+1ml 68930, ,4 59,9 0,7706 0,7752 0,005 0,60 VZ_15/2+1ml 70836, ,7 0,7798 VZ_16/1+1ml 76370, ,8 62,3 0,7956 0,7981 0,002 0,31 VZ_16/2+1ml 69120, ,1 0,8005 Obr.č. 11- Závislost plochy píku na koncentraci s použitím vnitřního standardu Závislost plochy píku na koncentraci y = 1,4477x + 0,491 0,9 R 2 = 0,992 0,8 0,7 plocha píku 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0-0,25-0,15-0,05 0,05 0,15 0,25 koncentrace [mg/ml] 48

54 Plochy píku ethanolu byly v tomto případě korigovány plochou píku vnitřního standardu a RSD se pohybovaly v rozmezí 0,07-0,67. Ze získaných výsledků byl sestaven graf-obr.č. 11, a vypočtena hodnota spolehlivosti R 2 = 0,992. Do grafu nebyl zahrnut výsledek pro vzorek 11/1 a 11/2, kde vyšla odlehlá hodnota. Z hodnoty spolehlivosti byla ověřena linearita odezvy. Tuto metodu by bylo pro kvantifikaci možné použít, ale z důvodu náročnosti na provedení od ní bylo upuštěno. Shrnutí kvantifikačních metod: V této práci byly testovány tyto kvantifikační metody: - vnějšího standardu: velké rozpětí hodnot RSD, malá přesnost měření - vnitřního standardu: vyhovující hodnoty RSD, metoda je pro kvantifikaci vyhovující a v další části práce byla validována - metoda standardního přídavku bez použití vnitřního standardu: opět velké rozpětí hodnot RSD, není linearita odezvy - metoda standardního přídavku za použití vnitřního standardu: hodnoty RSD a linearita odezvy jsou vyhovující. Ovšem pro časovou náročnost a pracnost nebylo s touto metodou dále pracováno. 49

55 5.5. Validace metody vnitřního standardu Linearita Prvním měřeným parametrem byla linearita. Jednotlivé vzorky byly připraveny ředěním zásobního roztoku ethanolu (c=14,89 mg/ml). Přesné koncentrace a navážky jsou uvedeny v tab.č.14. K uvedenému množství zásobního roztoku ethanolu byl přidán vždy 1 ml zásobního roztoku 2-propanolu o koncentraci 10 mg/ml do 25 ml odměrné baňky a doplněno vodou po rysku. Pro každou hladinu koncentrace byl připraven jeden vzorek, ze kterého proběhly vždy 3 měření. Tab.č. 14- Koncentrace výsledných roztoků pro měření linearity navážka zásobního roztoku koncentrace výsledného ethanolu (g) roztoku (mg/ml) 1,67 0,9947 1,25 0,7445 0,84 0,5003 0,42 0,2502 0,17 0,1013 0,084 0,0500 0,042 0,0250 0,021 0,0125 odebráno 0,25 ml ze vzorku o koncetraci 0,5003mg/ml 0,0005 odebráno 0,25 ml ze vzorku o koncetraci 0,1013 mg/ml 0,0010 Výsledky měření byly shrnuty v tab. č. 15 a vyneseny do grafu-obr. č

56 Tab. č. 15- Linearita linearita EtOH 2P průměr EtOH/2P průměr SD RSD 0,9947_ , , ,13 2,5233 2,5032 0,0149 0,60 0,9947_ , ,5 2,4986 0,9947_ , ,2 2,4876 0,7745_ , , ,43 1,8309 1,8245 0,0045 0,25 0,7745_ , ,9 1,8214 0,7745_ , ,8 1,8211 0,5003_ , , ,20 1,1910 1,1844 0,0047 0,40 0,5003_ , ,7 1,1802 0,5003_ , ,9 1,1819 0,2502_ , , ,63 0,5657 0,5664 0,0010 0,17 0,2502_ , ,7 0,5678 0,2502_ , ,6 0,5658 0,1013_1 9780, , ,53 0,2171 0,2159 0,0012 0,54 0,1013_ , ,4 0,2143 0,1013_3 9817, ,6 0,2163 0,05_1 5139, ,7 5091,13 0,1089 0,1098 0,0006 0,55 0,05_2 5023, ,5 0,1103 0,05_3 5110, ,3 0,1101 0,025_1 2373, ,0 2494,70 0,0529 0,0533 0,0003 0,54 0,025_2 2567, ,8 0,0536 0,025_3 2542, ,6 0,0534 0,0125_1 1192, ,4 1141,23 0,0241 0,0240 0,0004 1,80 0,0125_2 1097, ,7 0,0234 0,0125_3 1134, ,2 0,0244 0,005_1 442, ,7 460,63 0,0091 0,0094 0,0004 3,77 0,005_2 499, ,2 0,0099 0,005_3 440, ,5 0,0092 0,001_1 87, ,0 97,03 0,0019 0,0020 0,0001 5,92 0,001_2 105, ,1 0,0021 0,001_3 97, ,1 0,0021 Obr. č. 12- Linearita 3 Linearita y = 2,4928x - 0,0188 R 2 = 0,999 EtOH/2P 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 koncentrace [mg/ml] 51

57 Z výsledků byl sestaven graf závislosti plochy ethanolu na koncentraci a ze směrnice přímky vypočítána hodnota spolehlivosti R 2 = 0,999. Linearita byla ověřena Opakovatelnost Dalším parametrem validace byla opakovatelnost. Pro měření bylo připraveno 6 vzorků, každý byl analyzován dvakrát. Navážka 2-propanolu v zásobním roztoku byla 96,1 mg. Výsledky měření jsou shrnuty v tab. č. 16. Tab. č. 16- Opakovatelnost vzorek A EtOH A 2P m EtOH /mg/ EtOH/2P/ EtOH/2P metoh (EtOH/2P/ metoh).m2p VZ_1/ , ,7 50,7 2,9583 0,0583 5,6073 VZ_1/ , ,0 2,9154 0,0575 5,5260 VZ_2/ , ,1 50,3 2,9927 0,0595 5,7176 VZ_2/ , ,4 2,9867 0,0594 5,7061 VZ_3/ , ,0 50,8 2,9503 0,0581 5,5811 VZ_3/ , ,8 2,9810 0,0587 5,6392 VZ_4/ , ,4 49,9 2,9165 0,0584 5,6168 VZ_4/ , ,5 2,9214 0,0585 5,6262 VZ_5/ , ,5 52,1 3,0354 0,0583 5,5989 VZ_5/ , ,7 3,0467 0,0585 5,6198 VZ_6/ , ,9 49,7 2,8726 0,0578 5,5544 VZ_6/ , ,6 2,8825 0,0580 5,5736 průměr 0,0584 5,6139 SD 0,0006 0,0535 RSD 0,9526 0,9526 ověřena. Z hodnot měření byla vypočítána RSD=0,9526. Opakovatelnost byla Mezilehlá přesnost Pro potvrzení mezilehlé přesnosti metody byla provedena stejná série měření, opět se 6 vzorky s obsahem ethanolu a 2-propanolu (navážka v zásobním roztoku byla 97,4 mg). Výsledky měření jsou shrnuty v tab. č

58 Tab. č. 17- Mezilehlá přesnost EtOH/2P/ (EtOH/2P/ vzorek A EtOH A 2P m EtOH /mg/ EtOH/2P metoh metoh).m2p VZ_7/ , ,1 49,6 2,7926 0,0563 5,4839 VZ_7/ , ,9 2,8135 0,0567 5,5248 VZ_8/ , ,3 51,1 3,0110 0,0589 5,7392 VZ_8/ , ,6 2,9972 0,0587 5,7128 VZ_9/ , ,1 50,4 2,8645 0,0568 5,5357 VZ_9/ , ,7 2,8682 0,0569 5,5428 VZ_10/ , ,3 50,0 2,9160 0,0583 5,6804 VZ_10/ , ,9 2,8517 0,0570 5,5550 VZ_11/ , ,5 51,7 2,9308 0,0567 5,5215 VZ_11/ , ,1 2,9780 0,0576 5,6104 VZ_12/ , ,5 50,7 2,8687 0,0566 5,5111 VZ_12/ , ,8 2,8723 0,0567 5,5180 průměr 0,0573 5,5780 SD 0,0008 0,0827 RSD 1,4837 1,4837 Výsledky měření byly zkorigovány na navážku vnitřního standardu a vyhodnoceny pomocí t-testu-viz obr. č. 13. Obr.č. 13- Výsledky t-testu Provedením těchto t-testů nebyl nalezen rozdíl mezi stanovením pro opakovatelnost a mezilehlou přesnost. Obě sady tedy pochází z jednoho základního souboru. 53