TOP2A IQFISH pharmdx. Kód K vydání. In vitro diagnostikum Souprava obsahuje činidla postačující na 20 testů /

Transkript

1 / TOP2A IQFISH pharmdx Kód K vydání In vitro diagnostikum Souprava obsahuje činidla postačující na 20 testů. P04092CZ_02/K str. 1/37

2 Obsah Strana Použití... 3 Souhrn a vysvětlení... 3 Princip metody... 4 Činidla... 4 Dodávané materiály... 4 Potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky... 5 Bezpečnostní opatření... 6 Skladování... 8 Příprava vzorků... 9 Řezy zalité v parafínu... 9 NÁVOD K POUŽITÍ A. Příprava činidla A.1 Roztok pro předběžné zpracování A.2 Stringentní promývací pufr Wash Buffer A.3 Promývací pufr Wash Buffer A.4 Etanolové řady A.5 Roztok pepsinu B. Postup barvení B.1 Poznámky k postupu B.2 Zpracování tkání před barvením B.3 Protokol barvení Kontrola kvality Interpretace zabarvení Omezení Všeobecná omezení Charakteristiky účinnosti Analytická citlivost Analytická specifičnost Studie odolnosti Opakovatelnost Reprodukovatelnost Klinické využití Pilotní studie Potvrzovací studie DBCG 89D/TOP2A Záměr studie Statistická metodologie Výsledky Diskuze a závěr Řešení problémů Příloha Příloha Příloha Reference Vysvětlivky k symbolům P04092CZ_02/K str. 2/37

3 Použití In vitro diagnostikum. Kit TOP2A IQFISH pharmdx je určen k detekci amplifikace a delece (změn počtu kopií) genu TOP2A za použití metody fluorescenční in situ hybridizace (FISH) na vzorcích tkáně lidské rakoviny prsu, fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu. Delece a amplifikace genu TOP2A slouží jako marker pro špatnou prognózu u pacientů s vysokým rizikem rakoviny prsu. Amplifikace genu TOP2A zjištěná analýzou TOP2A IQFISH pharmdx se dále používá jako pomůcka predikce přežití bez rekurence u pacientů s rakovinou prsu s vysokým rizikem podstupujících adjuvantní chemoterapii epirubicinem. Výsledky testování za použití TOP2A IQFISH pharmdx jsou určeny k použití jako doplněk stávajících klinických a patologických informací. Souhrn a vysvětlení Gen TOP2A kóduje enzym topoizomerázu IIα (topo IIα), který katalyzuje rozbití a opětovné spojení dvouvláknové DNA vedoucí k uvolnění nadšroubovic DNA. Topoizomerázy typu II jsou důležité enzymy, které interkonvertují topologické formy DNA vytvářením přechodných dvouřetězcových zlomů na kostře DNA (1). Tyto enzymy hrají důležitou roli v řadě základních nukleových procesů, (2) včetně replikace DNA, transkripce, struktury chromozomu, kondenzace a segregace (3). Gen topoizomerázy IIα, TOP2A, je přítomen ve 2 kopiích ve všech normálních diploidních buňkách a je lokalizován na chromozomu 17q21 (4). Gen TOP2A zabírá oblast přibližně 27,5 kb a obsahuje 35 exonů kódujících protein o molekulové hmotnosti 170 kda (5). Bylo prokázáno, žeprotein topo IIα je makerem proliferace a že exprese topo IIα se během buněčného cyklu v normálních a rakovinových buňkách liší (6). Exprese topo IIα v nádorech prsu koreluje s expresí Ki-67 (7-10). Nebyl prokázán žádný jednoduchý vztah pro topo IIα na proteinové a genové úrovni (7, 9, 10). Pouze 20 % případů nadměrně exprimujících protein topo IIα má amplifikaci genu TOP2A, avšak mezi případy s amplifikovaným genem TOP2A vykázalo 93 % nadměrnou expresi proteinu topo IIα (11). Nadměrné exprese topo IIα pravděpodobně přispívá řada faktorů, a to amplifikace specifická pro rakovinu i zvýšená míra buněčné proliferace. Proteiny Ki-67 a topo IIα jsou exprimovány obdobně, což lze interpretovat jako potvrzení vlivu míry buněčné proliferace na expresi topo IIα i v případech s amplifikací TOP2A (12). Topoizomerázy typu II jsou cílem antracyklinů, jako jsou například doxorubicin a epirubicin, které jsou rovněž označovány jako inhibitory topoizomerázy (13-15). Stav HER2 jako prediktivní marker pro antracykliny je kontroverzní záležitost a je třeba zdůraznit, že biologická základna pro toto spojení chybí. Diskutuje se také teze, zda se dívat na HER2 jako na zástupný marker nebo pseudo-marker skutečného cíle antracyklinu, tedy topoizomerázy II (16-18). Bylo prokázáno, že počet kopií TOP2A má vliv na citlivost nádoru vůči inhibitorům topoizomerázy (16-28). Klinická účinnost kitu Dako TOP2A FISH pharmdx byla zkoumána ve dvou studiích prováděných Dánskou kooperativní skupinou pro rakovinu prsu (Danish Breast Cancer Cooperative Group, DBCG) v Kopenhagenu (21, 29, 30). Nejnovější studie (21, 30) uvádí amplifikaci genutop2a v přibližné 10 případů rakoviny prsu a deleci ve stejné výši, pokud jsou ve studii zařazeny jak HER2 pozitivní, tak negativní nádory. Zpočátku se předpokládalo, že abnormální počty kopií genu TOP2A, jako výsledek amplifikace nebo delece, se omezují pouze na HER2 amplifikované nádory (16, 31). Později byly prokázány změny v počtu kopií TOP2A ve vzorcích nádorů s normálním stavem genu HER2 (21, 23, 29, 30, 32, 33). Ve studii DBCG byly změny TOP2A prokázány u téměř 60 % HER2 amplifikovaných primárních nádorů prsu, přičemž 20 % TOP2A abnormálních nádorů mělo normální stav genu HER2 (21, 23, P04092CZ_02/K str. 3/37

4 29, 30, 32). Studie byla potvrzena kanadskou studií, která prokázala, že stav genu TOP2A (amplifikace nebo delece) je signifikantní prediktivní faktor pro přínos léčby chemoterapií na základě epirubicinu (23). V této studii 35 % pacientů mělo HER2 amplifikované nádory a statisticky významnou asociaci se stavem HER2 a aberacemi TOP2A (23, 34). Většina studií týkajících se aberací TOP2A byla konzistentní s ohledem na prediktivní hodnotu testování TOP2A (21-25, 30), což je kontrastu k více nesouhlasným výsledkům testování HER2 (35). Ačkoli jsou geny HER2 a TOP2A umístěny ve stejném amplikonu a ačkoli se některé studie zaměřovaly na ko-amplifikaci genů (22, 24, 25), studie DBCG 89D a další studie prokázaly, že na geny by se mělo pohlížet nezávisle a testovat je odděleně (10, 20, 21, 26-30). Princip metody TOP2A IQFISH pharmdx obsahuje všechna základní činidla nezbytná k provedení metody FISH na formalínem fixovaných, do parafínu zalitých vzorcích tkáňových řezů. Po odstranění parafínu a rehydrataci jsou vzorky zahřívány v roztoku, následuje proteolytické natrávení za použití pepsinu. Po předběžné úpravě zahříváním a proteolytickým štěpením využívá kit směs netoxických sond IQISH k přímému použití, založenou na kombinaci technologií PNA (peptid nukleová kyselina) (36) a DNA. Tato směs sond se skládá ze směsi klonů cosmidu DNA značených texaskou červení pokrývající celkem 228 kb aplikonu TOP2A a směsi sond PNA značených fluoresceinem směřujících na centromerickou oblast chromozomu 17. Specifický hybridizace na tyto dva cíle vytváří výrazný fluorescenční červený signál na každém aplikonu TOP2A a výrazný fluorescenční zelený signál na každé centromerické oblasti chromozomu 17. Po důkladném promytí jsou vzorky montovány za použití fluorescenčního montovacího média obsahujícího DAPI a zakryty krycím sklíčkem. Výsledky se pak interpretují pomocí fluorescenčního mikroskopu vybaveného příslušnými filtry (viz Příloha 3). Rakovinové buňky jsou lokalizovány a vyhodnoceny s ohledem na poměr signálů TOP2A/CEN-17. Normální buňky v analyzované tkáni poslouží jako vnitřní pozitivní kontrola předběžné úpravy a účinnosti hybridizace. Více informací naleznete v části Interpretace zabarvení. TOP2A IQFISH pharmdx, kód K5733 se používá pro manuální barvení. Činidla Dodávané materiály Materiály uvedené níže postačí na 20 testů (jeden test je definován jako cílová oblast o velikosti 22 mm x 22 mm). Počet testů vychází z použití 250 µl z lahvičky 2A (5 8 kapek) na jedno sklíčko, 10 µl z lahvičky 3 na jedno sklíčko a 15 µl z lahvičky 5 na jedno sklíčko. Roztoky v lahvičce 3 a 5 jsou viskózní a je možné, že bude potřeba je krátce odstředit v mikrocentrifuze, aby se shromáždilo všechno dodané činidlo. Kit obsahuje dostatek materiálů na 10 samostatných cyklů barvení (čtyři oddělené cykly, pokud se používá pepsinová metoda ponořování). TOP2A IQFISH pharmdx se dodává na suchém ledu. Suchý led musí být přítomen až do převzetí, aby bylo zajištěno, že komponenty kitu nebudou vystaveny vysokým teplotám během přepravy. Upozorňujeme, že některé součásti kitu mohou zůstat rozmražené, toto neovlivní výkonnost kitu TOP2A IQFISH pharmdx. Lahvička 1 Lahvička 2A Roztok pro předběžné zpracování (20x) 150 ml, 20x koncentrovaný Pufr MES (2-[N-morfolino]etansulfonická kyselina). Pepsin 4 x 6,0 ml, k okamžitému použití Roztok pepsinu, ph 2,0; obsahuje stabilizátor a antimikrobiální prostředek. P04092CZ_02/K str. 4/37

5 Lahvička 2B Lahvička 3 Lahvička 4 Lahvička 5 Lahvička 6 Ředící roztok pepsinu (10x) 24 ml, 10x koncentrovaný Ředicí pufr, ph 2,0; obsahuje antimikrobiální látku. Směs sond TOP2A/CEN-17 IQISH 0,2 ml, k přímému použití Směs sond značených texaskou červení TOP2A DNA a sond značených fluoresceinem CEN-17 PNA; dodávané v hybridizačním pufru IQISH. Stringentní promývací pufr Wash Buffer (20x) 150 ml, 20x koncentrovaný SSC (saline-sodium citrate) pufr s detergentem (Tween20). Fluorescenční montovací médium 0,4 ml, k přímému použití Fluorescenční montovací médium s 500 µg/l DAPI (4,6-diamidin-2-fenylindol). Promývací pufr Wash Buffer (20x) 500 ml, 20x koncentrovaný Tris/HCl pufr. Těsnící prostředek pro krycí sklíčka 1 tuba, k přímému použití Roztok pro odstranitelné těsnění krycích sklíček. POZNÁMKA: Následující činidla z kitu: Roztok pro předběžnou úpravu (20x), pepsin, ředící roztok pepsinu (10x), stringentní promývací pufr Wash Buffer (20x), fluorescenční montovací médium, promývací pufr Wash Buffer (20x) a těsnící prostředek pro krycí sklíčka je možné nahradit odpovídajícími činidly z kitu Dako Histology FISH Accessory Kit, kód K5799. Potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky Laboratorní činidla Destilovaná nebo deionizovaná voda Etanol, 96% Xylen nebo substituty xylenu Laboratorní vybavení Absorpční ubrousky Nastavitelné pipety Kalibrovaný imerzní teploměr (rozsah C) Kalibrovaný povrchový teploměr (rozsah C) Krycí sklíčka (22 mm x 22 mm) Dako Hybridizer (kód S2450 nebo S2451)* Topný blok nebo hybridizační trouba* Vlhkostní hybridizační komora* Kleště P04092CZ_02/K str. 5/37

6 Digestoř Mikrocentrifuga Sklíčka Dako Silanized Slides, kód S3003 nebo sklíčka potažená poly-l-lysinem (viz Příprava vzorků) Barvící nádoby nebo lázně Časovač (na 2- až 15-minutové intervaly) Vířivý mixér Vodní lázeň s víkem (schopná udržovat teplotu 37 (±2) C, 63 (±2) C a od 95 C do 99 C) Mikrovlnná trouba se schopností snímání, v případě, že je předběžné zpracování prováděno pomocí mikrovlnné trouby (viz B3. Protokol barvení Krok 1: Předběžná úprava, metoda B) * Jako alternativní metoda k hybridizéru Dako Hybridizer je použití topného bloku nebo hybridizační trouby k denaturaci (66 (±1) C) a hybridizaci (45 (±2) C) společně s vlhkostní hybridizační komorou. Mikroskopické vybavení a příslušenství Filtry pro fluorescenční mikroskop: Dvojitý filtr DAPI a FITC/texaská červeň nebo jednoduché filtry FITC a jednoduché filtry na texaskou červeň - viz Přílohu č. 3 pro další podrobnosti. Jako světelný zdroj by se měl použít fluorescenční mikroskop se 100wattovou rtuťovou lampou. S těmito filtry se nedoporučuje používat jiné světelné zdroje. Složka na mikroskopická sklíčka (kartonová přihrádka pro 20 sklíček se sklápěcím víkem nebo podobně). Bezpečnostní opatření 1. Pro diagnostiku in vitro. 2. Určeno pro profesionální uživatele. 3. Lahvička 1, Roztok pro předběžné zpracování (20x), nevyžaduje rizikové označení. Bezpečnostní listy (SDS) jsou pro profesionální uživatele k dispozici na vyžádání. 4. Lahvička 2A, Pepsin, obsahuje 5-<10% propan-2-ol, 0,1-<0,3% pepsin A a 0,011-<0,1% 5- chloro-2-metyl-4-isothiazolin-3-on a 2-methyl-2H-isothiazol-3-on. Lahvička 2a je označena: Nebezpečí H314 H317 P280 Způsobuje těžké poleptání kůže a poškození očí. Může způsobit alergickou reakci pokožky. Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranu očí a obličeje. Používejte obličejový štít. P304 + P340 + P310 PŘI VDECHNUTÍ: Přeneste postiženého na čerstvý vzduch a ponechte jej v klidu v poloze usnadňující dýchání. Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO nebo lékaře. P301 + P310 + P331 PŘI POŽITÍ: Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO nebo lékaře. NEVYVOLÁVEJTE zvracení. P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 PŘI STYKU S KŮŽÍ (nebo s vlasy): Veškeré kontaminované části oděvu okamžitě svlékněte. Opláchněte kůži vodou nebo osprchujte. Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO nebo lékaře. PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO nebo lékaře. Skladujte uzamčené. Odstraňte obsah a obal v souladu se všemi místními, oblastními, národními a mezinárodními předpisy. 5. Lahvička 2B, Ředicí pufr pro pepsin (10x) obsahuje 50-<75% propan-2-ol a 5-<10% 2- amino-2-(hydroxymetyl) propan-1,3-diol hydrochlorid. Lahvička 2B je označena: P04092CZ_02/K str. 6/37

7 Nebezpečí H225 Vysoce hořlavá tekutina a výpary. H319 Způsobuje vážné podráždění očí. H336 Může způsobit ospalost nebo závratě. P280 Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranu očí a obličeje. P210 Chraňte před teplem, horkými povrchy, jiskrami, otevřeným ohněm a jinými zdroji zapálení. Nekuřte. P241 Používejte elektrická, ventilační, osvětlovací zařízení a všechna zařízení pro manipulaci s materiálem vhodná do výbušného prostředí. P304 + P340 PŘI VDECHNUTÍ: Přeneste postiženého na čerstvý vzduch a ponechte jej v klidu v poloze usnadňující dýchání. P303 + P361 + P533 PŘI STYKU S KŮŽÍ (nebo s vlasy): Veškeré kontaminované části oděvu okamžitě svlékněte. Opláchněte kůži vodou nebo osprchujte. P235 Uchovávejte v chladu. P501 Odstraňte obsah a obal v souladu se všemi místními, oblastními, národními a mezinárodními předpisy. 6. Lahvička 3, sonda HER2/CEN-17 IQISH Mix, obsahuje 10-<25% etylenkarbonát a 3-<5% chlorid sodný. Lahvička 3 je označena: Varování H319 Způsobuje vážné podráždění očí. P280 Používejte ochranu očí a obličeje. P264 Po manipulaci si důkladně omyjte ruce. P305 + P351 + P338 PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně oplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. 7. Lahvička 4, Stringentní odmývací roztok (20x), obsahuje 10-<25% chlorid sodný a 10-<20% 2-amino-2-(hydroxymetyl) propan-1,3-diol hydrochlorid. Lahvička 4 je označena: Varování H319 Způsobuje vážné podráždění očí. H315 Způsobuje podráždění kůže. P280 Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranu očí a obličeje. P264 Po manipulaci si důkladně omyjte ruce. P305 + P351 + P338 PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně oplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. 8. Lahvička 6, Promývací pufr (20x), obsahuje 10-<25% chlorid sodný a 10-<20% trometamol. Lahvička 6 je označena: Varování H319 Způsobuje vážné podráždění očí. H315 Způsobuje podráždění kůže. P280 Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranu očí a obličeje. P264 Po manipulaci si důkladně omyjte ruce. P305 + P351 + P338 PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně oplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout P04092CZ_02/K str. 7/37

8 snadno. Pokračujte ve vyplachování. 9. Těsnicí materiál krycího sklíčka obsahuje 100% ropu (petrolej), hydrogenovanou lehkou a je označen: Nebezpečí H225 Vysoce hořlavá tekutina a výpary. H304 Při požití a vniknutí do dýchacích cest může způsobit smrt. H411 Toxický pro vodní organismy, s dlouhodobými účinky. P280 Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranu očí a obličeje. P210 Chraňte před teplem, horkými povrchy, jiskrami, otevřeným ohněm a jinými zdroji zapálení. Nekuřte. P241 Používejte elektrická, ventilační, osvětlovací zařízení a všechna zařízení pro manipulaci s materiálem vhodná do výbušného prostředí. P273 Zabraňte úniku do životního prostředí. P301 + P310 + P331 PŘI POŽITÍ: Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO nebo lékaře. NEVYVOLÁVEJTE zvracení. P303 + P361 + P353 PŘI STYKU S KŮŽÍ (nebo s vlasy): Veškeré kontaminované části oděvu okamžitě svlékněte. Opláchněte kůži vodou nebo osprchujte. P235 P501 Uchovávejte v chladu. Odstraňte obsah a obal v souladu se všemi místními, oblastními, národními a mezinárodními předpisy. 10. Se vzorky a veškerým materiálem jim vystaveným by mělo být, před a po fixaci, nakládáno jako s možným zdrojem infekce a měly by být za řádných podmínek takto likvidovány (37). Nikdy nenabírejte činidla do pipety ústy a zamezte kontaktu činidel a vzorků s kůží a sliznicemi. Jestliže se činidla dostanou do kontaktu s citlivými oblastmi, omyjte je dostatečným množstvím vody. 11. Minimalizujte mikrobiální kontaminaci činidel, abyste zabránili chybným výsledkům. 12. Nedodržení inkubační doby, teploty nebo metody může vést k chybným výsledkům. 13. Jiné než předepsané metody fixace tkáně a tloušťky vzorků mohou způsobit ztrátu morfologie tkáně nebo změnit intenzitu signálu. 14. Zamezte vypařování směsi sond TOP2A/CEN-17 IQISH během hybridizace zajištěním dostatečné vlhkosti v hybridizační komůrce. 15. Činidla jsou optimálně naředěna. Další ředění může způsobit chybnou účinnost. 16. Používejte osobní ochranné prostředky, aby nedošlo k zasažení očí nebo pokožky. Další informace viz bezpečnostní list (Safety Data Sheet, SDS). 17. Pro metodu ponoření do pepsinu je nutno používat pouze čisté nádoby na barvení (Krok 2, metoda C). Skladování Směs sond TOP2A/CEN-17 IQISH (lahvička 3) uchovávejte při teplotě -18 C v temnu. Všechna ostatní činidla uchovávejte při teplotě 2 8 C v temnu. Všechna činidla snáší uchovávání v mrazničce. Zmrazování a rozmrazování činidel až 10krát neovlivňuje výkonnost. Pepsin, směs sond TOP2A/CEN-17 IQISH a fluorescenční montovací médium (lahvičky 2A, 3 a 5) mohou být nepříznivě ovlivněny působením tepla. Neponechávejte tyto komponenty při pokojové teplotě. Směs sond TOP2A/CEN-17 IQISH a fluorescenční montovací médium (lahvičky 3 a 5) mohou být nepříznivě ovlivněny při vystavení nadměrnému působení světla. Neuchovávejte tyto součásti nebo neprovádějte analýzu při silném světle, jako je přímé sluneční světlo. Nepoužívejte kit po uplynutí data exspirace, které je vyznačené na krabici kitu. Pokud jsou činidla uchovávána za jiných podmínek, než jsou stanoveny v příbalovém letáku v tomto balení, musí uživatel validovat jejich výkonnost (38). P04092CZ_02/K str. 8/37

9 Neexistují žádné známky toho, že by tyto produkty byly nestabilní. Proto je důležité vyhodnotit normální buňky v analyzovaném tkáňovém řezu. Pokud dojde k nečekanému vzoru fluorescence, který nelze vysvětlit odchylkami v laboratorních postupech a máte-li podezření na problém s kitem TOP2A IQFISH pharmdx, kontaktujte technické služby společnosti Dako. Příprava vzorků Se vzorky pro biopsii je nutno nakládat tak, aby byla zachována tkáň pro FISH analýzu. U všech vzorků by měly být použity standardní metody zpracování tkání pro imunohistochemické barvení (39). Řezy zalité v parafínu K použití jsou vhodné pouze tkáně uchovávané v neutrálním pufrovaném formalínu a zalité v parafínu. Vzorky z biopsie by měly být například bločkovány na tloušťku 3 nebo 4 mm a fixovány po dobu hodin v neutrálním pufrovaném formalínu. Tkáně se potom dehydrují v řadě alkoholů a xylenu a potom jsou napuštěny rozpuštěným parafínem a skladovány při teplotě ne více než 60 C. Řádně fixované a zalité bločky tkáně exprimující protein c-kit vydrží před řezáním a montáží na podložní sklo neurčitou dobu, pokud se skladují na chladném místě (15 25 C) (39, 40). Jiná fixativa nejsou vhodná. Vzorky tkání je nutno rozřezat na řezy o tloušťce asi 4 6 µm. Sklíčka pro analýzu amplifikace TOP2A genu a ověření přítomnosti nádoru by měla být připravována zároveň. Je doporučeno provést nejméně 3 řezy, 1 řez na přítomnost nádoru, barvený hematoxylinem a eosinem (H a E barvení) a 1 řez pro analýzu aberace TOP2A genu a 1 řez jako záloha. Tkáňové řezy je doporučeno montovat na silanizovaná sklíčka Dako Silanized Slides, kód S3003, SuperFrost Plus nebo sklíčka potažená poly-l-lysinem. Pokud jsou vzorky uchovávány za pokojové teploty (20 25 C), měly by být analyzovány do 4 6 měsíců po krájení; pokud jsou uchovávány při teplotě 2 8 C, je třeba provést analýzu do 2 let. P04092CZ_02/K str. 9/37

10 NÁVOD K POUŽITÍ A. Příprava činidla Je vhodné připravit před barvením následující činidla: A.1 Roztok pro předběžné zpracování V lahvičce 1 se mohou objevit krystaly, ale ty se při pokojové teplotě rozpustí. Před přípravou činidel zkontrolujte, zda se v nich nevyskytují krystaly. Rozřeďte dostatečné množství z lahvičky 1 (roztok pro předběžné zpracování 20x) rozředěním koncentrátu v poměru 1:20 destilovanou nebo deionizovanou vodou. Nepoužitý naředěný pufr lze skladovat jeden měsíc při 2 8 C. Pufr zlikvidujte, pokud je zakalený. A.2 Stringentní promývací pufr Wash Buffer Rozřeďte dostatečné množství z lahvičky 4 (stringentní promývací pufr 20x) rozředěním koncentrátu v poměru 1:20 destilovanou nebo deionizovanou vodou. Nepoužitý naředěný pufr lze skladovat jeden měsíc při 2 8 C. Pufr zlikvidujte, pokud je zakalený. A.3 Promývací pufr Wash Buffer Rozřeďte dostatečné množství z lahvičky 6 (promývací pufr Wash Buffer 20x) rozředěním koncentrátu v poměru 1:20 destilovanou nebo deionizovanou vodou. Nepoužitý naředěný pufr lze skladovat jeden měsíc při 2 8 C. Naředěný pufr zlikvidujte, pokud je zakalený. A.4 Etanolové řady Z roztoku 96% etanolu připravte 3 nádobky o koncentracích etanolu 70 %, 85 % a 96 %. Zakryté nádoby skladujte při pokojové teplotě nebo při 2 8 C a použijte pro maximálně 200 podložních skel. Roztoky zlikvidujte, pokud jsou zakalené. A.5 Roztok pepsinu Roztok pepsinu je potřebný pouze, když se používá pepsinová metoda ponořování (metoda C). Pepsinový roztok se připravuje následujícím způsobem. Pro nádobu s kapacitou šesti sklíček připravte 60 ml roztoku pepsinu: Do nádoby přidejte 48 ml destilované nebo deionizované vody pokojové teploty (20 25 C). Do nádoby přidejte 6 ml studeného (2 8 C) ředicího roztoku pepsinu (10x) (lahvička 2B). Do nádoby přidejte 6 ml studeného (2 8 C) pepsinu (lahvička 2A). Na nádobu dejte víko a ve vodní lázni zahřejte roztok pepsinu na teplotu 37 (±2) C. Pro nádobu s kapacitou 24 sklíček připravte 240 ml roztoku pepsinu: Do nádoby přidejte 192 ml destilované nebo deionizované vody pokojové teploty (20 25 C). Do nádoby přidejte 24 ml studeného (2 8 C) ředicího roztoku pepsinu (10x) (lahvička 2B). Do nádoby přidejte 24 ml studeného (2 8 C) pepsinu RTE (lahvička 2A). Na nádobu dejte víko a ve vodní lázni zahřejte roztok pepsinu na teplotu 37 (±2) C. Zahřátý roztok pepsinu se musí použít během 5 hodin. P04092CZ_02/K str. 10/37

11 B. Postup barvení B.1 Poznámky k postupu Uživatel by si měl pečlivě přečíst tyto pokyny a před použitím se dobře seznámit se všemi součástmi. (viz Bezpečnostní upozornění). U všech činidel by mělo dojít před použitím k vyvážení na odpovídající teplotu následujícím způsobem: Lahvička 1, zředěný roztok k předběžné úpravě by měl být vyvážen na C, je-li použita vodní lázeň pro předběžnou úpravu (B3. Protokol barvení, krok 1: Předběžné zpracování, metoda A). Je-li pro předběžnou úpravu používána mikrovlnná trouba se schopností snímání (B3. Protokol barvení, krok 1: Předběžné zpracování, metoda B) zředěný roztok k předběžnému zpracování by měl být vyvážen na pokojovou teplotu C. Lahvička 2A, ředicí roztok pepsinu se aplikuje při teplotě 2 8 C (B3, Protokol barvení, krok 2: metoda A a B) a udržovat stále chladný. Lahvička 2B: Ředicí roztok pepsinu (10x) se aplikuje při teplotě 2 8 C (B3, Protokol barvení, krok 2: metoda C). Lahvička 3, směs sond TOP2A/CEN-17 IQISH se při uchovávání při teplotě -18 C dělí na dvě fáze. Před použitím lahvičky 3 zajistěte, aby se provedla jedna fáze vyvážení na pokojovou teplotu směsi sond (20 25 C) následovaná mísením. Lahvičku 3 rozmrazujte na pokojovou teplotu (20 25 C) po dobu maximálně 30 minut (chraňte před silným světlem), potom použijte vířivý mixér a pečlivě po dobu 15 sekund při ot./min nechejte vířit. Po použití lahvičku 3 ihned uložte při teplotě -18 C. Lahvička 4, naředěný stringentní promývací pufr Wash Buffer; před použitím by jedna nádobka měla být vyvážena na pokojovou teplotu, další nádobka na 63 (±2) C. Lahvička 5, fluorescenční montovací médium smí být aplikováno při jakékoli teplotě od 2 25 C. Lahvička 6, naředěný promývací pufr Wash Buffer by měl být vyvážen na pokojovou teplotu C. Těsnící prostředek pro krycí sklíčka může být aplikován při teplotě od 2 25 C. Všechny kroky musí být prováděny při uvedené teplotě. Postup zahrnuje počet dehydrací následovaných vysoušením tkáňových řezů. Ujistěte se, že tkáňové řezy jsou před provedením dalšího kroku úplně suché. V průběhu dalších kroků nenechejte tkáňové řezy vyschnout. Pokud musí být proces barvení přerušen, mohou být sklíčka po deparafinizaci uchovávána v promývacím pufru Wash Buffer až 1 hodinu při pokojové teplotě (20 25 C), aniž by došlo k ovlivnění výsledků. B.2 Zpracování tkání před barvením Odstraňovaní parafínu a rehydratace: Před provedením analýzy musí být ze sklíček s tkáněmi odstraněn parafín, aby se odstranilo zalévací médium, a potom sklíčka rehydratovat. Zajistěte úplné odstranění parafínu. Přítomnost zbytků zalévacího média způsobí zvýšené nespecifické zabarvení. Tento krok by měl být prováděn při pokojové teplotě (20 25 C). 1. Vložte podložní sklíčka do xylenové lázně a inkubujte 5 (±1) minut. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 2. Oklepejte přebytečnou tekutinu a umístěte sklíčka do 96 % etanolu po dobu 2 (±1) minut. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 3. Oklepejte přebytečnou tekutinu a umístěte sklíčka do 70 % etanolu po dobu 2 (±1) minut. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. 4. Oklepejte přebytečnou tekutinu a umístěte sklíčka do zředěného promývacího pufru Wash Buffer (viz NÁVOD K POUŽITÍ, část A.3) na minimálně 2 minuty. Začněte postup barvení, jak je popsáno v části B.3, krok 1, Předběžné zpracování. Roztoky xylenu a alkoholu by měly být vyměněny po zpracování 200 nebo méně sklíček. Mohou být použity substituty xylenu. P04092CZ_02/K str. 11/37

12 POZNÁMKA: Činidla a návody dodané v této soupravě byly navrženy pro optimální účinnost. Další ředění činidel nebo změna inkubačních teplot může vést k nesprávným nebo nesouhlasným výsledkům. Rozdíly v zpracování tkání a v technických postupech v laboratoři uživatele mohou znehodnotit výsledky studie. B.3 Protokol barvení Krok 1: Předběžné zpracování Předběžná úprava může být prováděna ve vodní lázni, viz metoda A) nebo jako alternativa, mikrovlnná trouba se schopností snímání, metoda B). Metoda A: Předběžné zpracování při použití vodní lázně Naplňte barvící nádobky zředěným roztokem pro předběžné zpracování (viz NÁVOD K POUŽITÍ, část A.1). Vložte barvicí nádoby obsahující zředěný roztok pro předběžné zpracování do vodní lázně. Zahřejte vodní lázeň a roztok pro předběžné zpracování na C. Měřte teplotu uvnitř nádoby cejchovaným teploměrem, aby byla zajištěna správná teplota. Přikryjte nádoby víkem, aby se stabilizovala teplota a zabránilo se odpařování. Ponořte řezy, ze kterých byl odstraněn parafín při pokojové teplotě do předehřátého roztoku pro předběžné zpracování v nádobách na barvení. Zkontrolujte teplotu a inkubujte po dobu 10 (±1) minut při teplotě C. Vyjměte celou nádobku se sklíčky z vodní lázně. Odstraňte víčko a nechte sklíčka po dobu 15 minut chladit v roztoku pro předběžné zpracování při pokojové teplotě. Přemístěte sklíčka do nádobky se zředěným promývacím pufrem Wash Buffer (viz NÁVOD K POUŽITÍ, odd. A.3) na dobu 3 minut při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. POZNÁMKA: Roztok pro předběžné zpracování je určen pouze na jedno použití. Nepoužívejte opakovaně. Metoda B: Předběžné zpracování prováděné v mikrovlnné troubě se schopností snímání Naplňte plastovou nádobu naředěným roztokem pro předběžné zpracování pokojové teploty (20 25 C). Ponořte řezy zbavené parafínu do roztoku pro předběžné zpracování, zakryjte nádobu víkem s otvory a umístěte ji do mikrovlnné trouby. Zvolte funkci vaření se snímačem a program, který běží po dobu 10 minut poté, co bylo dosaženo teploty bodu varu*. Po 10 minutách inkubace vyjměte nádobu se sklíčky z trouby, sejměte víko a nechejte ochladit 15 minut při pokojové teplotě. Přeneste podložní skla do nádoby s naředěným pufrem Wash Buffer na 3 minuty při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. * Použití mikrovlnné trouby s funkcí snímání znamená, že trouba musí obsahovat snímač a program, který nejprve zahřeje roztok pro předběžné zpracování k bodu varu a potom udržuje požadovanou teplotu předběžného zpracování (nad 95 ºC) a zároveň odečítá nastavený čas (10 (±1) minut). Některé modely mikrovlnných trub s funkcí snímání nemají možnost nastavení odečítání času. Pokud model zahrnuje pouze předem nastavené programy, je potřeba zvolit program, který udržuje požadovanou teplotu předběžného zpracování (nad 95 ºC) po dobu nejméně 10 (±1) minut a manuálně ukončit program po 10 (±1) minutách. POZNÁMKA: Roztok pro předběžné zpracování je určen pouze na jedno použití. Nepoužívejte opakovaně. Krok 2: Pepsin, připravený k okamžitému použití (ready-to-use, RTU) nebo roztok pepsinu Inkubace pepsinem se může provádět přímo použitím kapek pepsinu RTU na sklíčka při pokojové teplotě (20 25 C) (metoda A) nebo při 37 C (metoda B). Sklíčka se také mohou ponořit do roztoku pepsinu a inkubovat při 37 (±2) C (metoda C) Metoda A) a metoda B): Přebytek pufru oklepejte. Použijte materiál nezanechávající chloupky (jako např. absorpční ubrousek nebo gázový tampon), opatrně otřete okolí vzorku k odstranění zbývající tekutiny a k udržení činidel v předepsané oblasti. Pro zakrytí vzorku aplikujte 5 8 kapek (250 µl) studeného (2 8 C) pepsinu (lahvička 2A). Pepsin uchovávejte vždy při 2 8 C. Metoda A: Pepsin, RTU inkubace při teplotě C P04092CZ_02/K str. 12/37

13 Inkubujte po dobu 5 15 minut při pokojové teplotě (20 25 C). Inkubační doba 5 15 minut bude dostatečná pro většinu vzorků, ale optimální inkubační doba může záviset na tkáňové fixaci nebo na tloušťce vzorku a měla by být stanovena uživatelem. Přebytek pepsinu oklepejte a ponořte řezy do zředěného promývacího pufru Wash Buffer (viz NÁVOD K POUŽITÍ, odd. A.3) na dobu 3 minut při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Pokračujte dehydratací. Metoda B: Pepsin, RTU inkubace při teplotě 37 C Vzorky s pepsinem vložte na topný blok při 37 C např. Dako Hybridizer a inkubujte 3 5 minut. Inkubační doba 3 5 minut bude dostatečná pro většinu vzorků, ale optimální inkubační doba může záviset na tkáňové fixaci nebo na tloušťce vzorku a měla by být stanovena uživatelem. Přebytek pepsinu oklepejte a ponořte řezy do naředěného promývacího pufru Wash Buffer na 3 minuty při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Pokračujte dehydratací. Dehydrujte tkáňové řezy ve vzestupné alkoholové řadě: 2 minuty v 70% etanolu, 2 minuty v 85% etanolu a 2 minuty v 96% etanolu. Nechejte tkáňové řezy dokonale oschnout na vzduchu. Metoda C: Roztok pepsinu - ponoření sklíček do pepsinového roztoku o teplotě 37 C Kit obsahuje činidla postačující na čtyři jednotlivé cykly (60 ml roztoku pepsinu, malá nádobka na šest sklíček) nebo na jeden cyklus (240 ml roztoku pepsinu, velká nádoba na 24 sklíček). Roztok pepsinu připravte podle návodu v části A.5. Na nádobu dejte víko a ve vodní lázni zahřejte roztok pepsinu na teplotu 37 (±2) C. Zkontrolujte, zda je teplota stabilní. Měřte teplotu uvnitř nádoby cejchovaným teploměrem, aby byla zajištěna správná teplota. Přebytek promývacího pufru Wash Buffer oklepejte. Sklíčka ponořte do pepsinového roztoku o teplotě 37 (±2) C a inkubujte po dobu minut. Inkubační doba minut bude dostatečná pro většinu vzorků, ale optimální inkubační doba může záviset na fixaci tkání nebo na tloušťce vzorku a měla by být stanovena uživatelem. Přebytek pepsinu oklepejte a ponořte řezy do naředěného promývacího pufru Wash Buffer na 3 minuty při pokojové teplotě (20 25 C). Vyměňte promývací pufr Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Pokračujte dehydratací. Dehydrujte tkáňové řezy ve vzestupné alkoholové řadě: 2 minuty v 70 % etanolu, 2 minuty v 85 % etanolu a 2 minuty v 96 % etanolu. Nechejte tkáňové řezy dokonale oschnout na vzduchu. Krok 3: Směs sond TOP2A/CEN-17 IQISH Směs sond TOP2A/CEN-17 IQISH se při uchovávání při teplotě -18 C dělí na dvě fáze. Před použitím lahvičky 3 zajistěte, aby se provedla jedna fáze vyvážení na pokojovou teplotu směsi sond (20 25 C) následovaná mísením. Lahvičku 3 rozmrazujte na pokojovou teplotu (20 25 C) po dobu maximálně 30 minut (chraňte před silným světlem), potom použijte vířivý mixér a pečlivě po dobu 15 sekund při ot./min nechejte vířit. Po použití lahvičku 3 ihned uložte při teplotě -18 C. Aplikujte 10 µl směsi sond TOP2A/CEN-17 (lahvička 3) do středu tkáňového řezu. Ihned překryjte směs sond krycím sklíčkem 22 mm x 22 mm a nechejte směs pod sklíčkem rovnoměrně rozprostřít. Zamezte vzniku vzduchových bublin. Pokud se vytvoří bublinky vzduchu, jemně je vyklepejte pomocí pinzety. Nezapomeňte ihned po použití uložit lahvičku 3 při teplotě -18 C. Krycí sklíčko utěsněte těsnícím prostředkem vytlačením těsnícího prostředku podél obvodu krycího sklíčka. Překryjte těsnícím prostředkem krycí sklíčko k podložnímu uhnětením těsnícího prostředku kolem krycího sklíčka. Zajistěte, aby těsnící prostředek pro krycí sklíčka pokryl celou hranu krycího sklíčka. P04092CZ_02/K str. 13/37

14 Připravte Dako Hybridizer* (kód S2450/S2451) na hybridizační cyklus. Zkontrolujte, zda jsou kontrolní proužky Humidity Control Strips (kód S2452) vlhké a optimální pro použití. Spusťte hybridizér a zvolte program, který: bude denaturovat při teplotě 66 C po dobu 10 minut a potom hybridizovat při teplotě 45 C po dobu minut. Sklíčka umístěte do hybridizéru, zkontrolujte, zda je víko dobře uzavřené a spusťte program. Podrobné informace naleznete v návodu k použití hybridizéru Dako Hybridizer. * K denaturaci a hybridizaci lze použít vybavení odpovídající výše popsaným podmínkám, např. způsobem popsaným níže: Umístěte sklíčka na rovnou kovovou nebo kamennou plochu (topný blok nebo do hybridizační trouby) předehřátou na 66 (±1) C. Denaturujte po dobu přesně 10 minut. Umístěte podložní skla do předehřáté vlhkostní hybridizační komory. Zakryjte komůrku víčkem a inkubujte při teplotě 45 (±2) C po dobu minut. Teplota hybridizace 37 C není vhodná pro použití se sondami v tomto kitu. Krok 4: Stringentní promývání Naplňte dvě barvící nádobky zředěným pufrem pro důkladné promytí (viz NÁVOD K POUŽITÍ, část A.2). Pro každé sklíčko v každé nádobce je doporučen minimální objem 100 ml nebo 15 ml. Umístěte jednu z barvících nádobek se zředěným stringentním promývacím pufrem Wash Buffer při pokojové teplotě do digestoře a druhou do vodní lázně. Zahřejte vodní lázeň a zředěný pufr pro důkladné promytí na 63 (±2) C. Zajistěte ustálení teploty. Přikryjte nádoby víkem, aby se stabilizovala teplota a zabránilo se odpařování. Kalibrovaným teploměrem měřte teplotu v nádobce s vodní lázní, aby dosáhla správné výše. Stringentní promývací pufr Wash Buffer obsahuje detergent a při 63 C se může zkalit; toto neovlivní výsledek. Použijte pinzetu nebo rukavice a vyndejte sklíčka z hybridizační komůrky a opatrně odstraňte těsnící prostředek a krycí sklíčko a umístěte sklíčka jedno po druhém do předmývací nádobky o pokojové teplotě. Nevkládejte sklíčka do pufru pro stringentní promývání, pokud nejsou odstraněna krycí sklíčka. Jakmile byla odstraněna všechna krycí sklíčka, přeneste podložní skla z pokojové teploty, předmývací nádobu do nádoby s teplotou 63 (±2) C do vodní lázně. Ihned po přenesení sklíček do lázně zředěného stringentního promývacího pufru Wash Buffer o teplotě 63 (±2) C je třeba spustit časovač. Proveďte stringentní promývání přesně po dobu 10 minut. Vyjměte sklíčka ze zředěného stringentního promývacího pufru Wash Buffer a po dobu 3 minut při pokojové teplotě (20 25 C) řezy máčejte ve zředěném promývacím pufru Wash Buffer. Vyměňte naředěný Wash Buffer a ponořte řezy na další 3 minuty. Dehydrujte tkáňové řezy ve vzestupné alkoholové řadě: 2 minuty v 70 % etanolu, 2 minuty v 85 % etanolu a 2 minuty v 96 % etanolu. Nechejte tkáňové řezy úplně vyschnout. Krok 5: Montáž Na cílovou oblast sklíčka aplikujte 15 µl fluorescenčního montovacího média obsahujícího DAPI (lahvička 5) a přikryjte krycím sklíčkem. POZNÁMKA: Podložní skla lze číst po 15 minutách nebo během 7 dnů po montáži. Pokud jsou však sklíčka vystavena světlu nebo vysokým teplotám, může se objevit vyblednutí. Pro minimalizaci blednutí sklíček je uchovávejte ve tmě při teplotě C. P04092CZ_02/K str. 14/37

15 Kontrola kvality 1. Signály musí být světlé, výrazné a snadno hodnotitelné. 2. Normální buňky umožňují vnitřní kontrolu barvicího cyklu. Normální buňky by měly mít 1 2 jasně zřetelné zelené signály poukazující na to, že sonda CEN-17 PNA byla úspěšně hybridizována na centromerickou oblast chromozomu 17. Normální buňky by měly také mít 1 2 jasně zřetelné červené signály poukazující na to, že sonda TOP2A DNA byla úspěšně hybridizována na cílovou oblast TOP2A. V důsledku krájení tkáně budou mít některé normální buňky méně než 2 očekávané signály každé barvy. Normální buňky, u kterých probíhá dělení, mohou obsahovat více než je normální počet 1 2 signály každé barvy. Selhání detekce signálů v normálních buňkách indikuje selhání testu a výsledky by měly být považovány za neplatné. 3. Pokud se při hodnocení používá filtr DAPI, musí být jaderná morfologie intaktní. Četné jakoby průhledné buňky a obecně špatná jaderná morfologie indikují nadměrné natrávení vzorku, což může mít za následek ztrátu nebo fragmentaci signálů. Takové vzorky by měly být považovány za neplatné. 4. Rozdíly ve fixaci tkání, zpracování a zalití tkání v laboratoři uživatele mohou způsobit výraznou variabilitu výsledků, která si vyžádá pravidelné provádění vlastních kontrol. Interpretace zabarvení Hodnotitelná tkáň Testovány by měly být pouze vzorky pacientů s invazivním karcinomem. V případě výskytu karcinomu in situ a invazivního karcinomu ve stejném vzorku se hodnotí pouze invazivní komponenta. Vyhněte se nekrotickým oblastem a oblastem, kde jsou nukleové hranice nejasné. Nezahrnujte jádra, která vyžadují subjektivní posouzení. Vynechejte jádra se slabou intenzitou signálu a nespecifickým nebo přílišným pozadím. Ke kontrole rovnoměrného zabarvení jader použijte filtr DAPI. Výpočet signálů: Lokalizujte nádor v rámci celého sklíčka barveného H a E a zhodnoťte stejnou oblast na sklíčku barveném FISH. Prohlédněte několik oblastí s nádorovými buňkami a zhodnoťte případnou heterogenitu. Vyberte oblast s dobrou distribucí jader. Začněte analyzovat v levém horním čtverci zvolené oblasti zleva doprava a zjistěte počet signálů nacházejících se na okrajích zvolené oblasti k hodnocení podle pokynů uvedených níže (viz Příloha 3). Postupujte shora dolů a hledejte všechny signály v jednotlivých jádrech. Počítejte dva signály, které jsou stejně velké a vzdálené od sebe stejně nebo méně než je průměr signálu, jako pouze jeden signál. V jádrech s vysokými hladinami amplifikace genu TOP2A mohou být signály TOP2A lokalizovány těsně vedle sebe a mohou vytvářet shluk signálů. V těchto případech není možno množství signálů TOP2A spočítat, ale musí se odhadnout. Zvláštní pozornost je třeba věnovat zeleným signálům, protože shluky červených signálů TOP2A mohou překrýt zelené signály a učinit je tak neviditelnými. V případě pochybností prosím zkontrolujte zelené signály použitím specifického filtru FITC. Nepočítejte jádra bez signálu. Počítejte pouze ta jádra, která vykazují jeden nebo více zelených referenčních signálů. Zapište počty do tabulky, jak je ukázáno v Příloze č. 2. P04092CZ_02/K str. 15/37

16 Návod pro počítání signálů 1 Nepočítejte. Jádra se překrývají, nejsou viditelné všechny oblasti jader. 2 Počítejte jako dva zelené signály. 3 Dva červené signály, nepočítejte jádra s pouze červenými signály. 4 Počítejte jako 3 zelené a 12 červených signálů (odhadování shluku) 5 Počítejte jako 1 zelený a 1 červený signál. Dva signály stejné velikosti a vzdálené stejně nebo méně než je průměr jednoho signálu jsou počítány jako jeden. 6 Nepočítejte (jádra s nadměrným nebo malým nebo proteolytickým štěpením). Chybějící signály ve středu jádra (jádro ve tvaru koblihy). 7 Počítejte jako 2 zelené a 3 červené signály. Dva signály stejné velikosti a vzdálené stejně nebo méně než je průměr jednoho signálu jsou počítány jako jeden. 8 Počítejte jako 1 zelený a 5 červených signálů 9 Počítejte jako 3 zelené (1 zelený mimo ohnisko) a 3 červené signály 10 Shluk červených signálů skrývající zelené signály, zkontrolujte zelené signály specifickým filtrem FITC nebo nepočítejte. Signály se mohou počítat konvenční metodou (41) nebo alternativní metodou, snižující potřebu času a práce (21, 29). Namísto konvenční metody sčítání signálů v 60 jádrech se sečte celkem 60 případů, kde jeden případ je červený genový signál. Při sčítání touto alternativní metodou se počítá různý počet jader, až se dosáhne počet 60 červených TOP2A signálů. Zaznamená se odpovídající počet zelených signálů CEN-17 ve stejném jádru. Minimální počet sčítaných jader je 6. V normálních vzorcích bude stačit průměrně 35 jader, aby se dosáhlo 60 červených signálů. U amplifikovaných případů se zahrne 6-35 jader. Často dokonce i u případů s delecemi bude postačovat méně než 60 jader. Je-li to možné, počítejte jádra ze 3 výrazných oblastí nádoru (42). Spočítejte poměr TOP2A/CEN-17 vydělením celkového počtu červených signálů TOP2A celkovým počtem zelených signálů CEN-17. Vzorky s poměrem TOP2A/CEN-17 vyšším nebo rovným 2 by měly být pokládány za pozitivní pro amplifikaci genu TOP2A a vzorky s poměrem TOP2A/CEN-17 menším než 0,8 by měly být pokládány za deleci TOP2A (18, 21, 29). Výsledky odpovídající mezní hodnotě nebo se k ní blížící (1,8 2,2 pro amplifikace a 0,7 0,9 pro delece) by měly být interpretovány s opatrností. Doporučuje se zkontrolovat, zda součty neobsahují vysoké procento normálních jader. Jestliže poměr spadá do některé z těchto dvou nejasných zón, nebo v případě nejistoty se doporučuje, aby se odečet vzorku verifikoval ještě jedním hodnocením další osobou, kdy se počítají jádra z dalších 3 oblastí nádoru a/nebo se sečte celkem 60 jader. Doporučuje se jako kriterium přijatelnosti ±10 % CV. Finální poměr by se měl spočítat znovu na základě všech sčítání. U hraničních případů je odůvodněna konzultace patologa s ošetřujícím lékařem. P04092CZ_02/K str. 16/37

17 Omezení Všeobecná omezení 1. FISH je vícestupňový proces, který vyžaduje specializovaný zácvik ve výběru vhodných činidel, stejně jako výběru tkáně, fixace, zpracování a přípravě FISH sklíčka a interpretaci výsledků barvení. 2. Výsledky FISH závisejí na zacházení s tkání a jejím zpracování před barvením. Nesprávná fixace, promývání, vysoušení, zahřívání, prořezávání nebo kontaminace jinými tkáněmi nebo tekutinami může ovlivnit hybridizaci sond. Výsledky mohou být nekonzistentní v důsledku použití různých metod fixace a zalití nebo v důsledku vnitřních nepravidelností v tkáni. 3. Pro dosažení optimálních a reprodukovatelných výsledků musí být sklíčka s tkání kompletně deparafinizována. Odstranění parafínu musí být dokončeno na začátku procesu barvení. (viz NÁVOD K POUŽITÍ, část B.2). 4. Používána by měla být pouze teplotně kalibrovaná vodní lázeň, topný blok a hybridizační pec. Použití vybavení jiného typu může vést k odpaření směsi sond TOP2A/CEN-17 během hybridizace a musí být validováno uživatelem. Charakteristiky účinnosti Analytická citlivost Citlivost směsi sond TOP2A/CEN-17 IQISH byla zkoumána za použití 18 vzorků normálního lidského epitelu prsu. Poměr mezi množstvím signálů TOP2A a CEN-17 signálů byl počítán na základě hodnocení 60 jader na jeden vzorek. Poměr signálů TOP2A/CEN-17 pro těchto 18 vzorků normálního lidského epitelu prsu byl v rozmezí 0,97 1,11. Analytická specifičnost TOP2A DNA sondy ve směsi sond TOP2A /CEN-17 IQISH byly koncově setříděny a zmapovány, aby bylo potvrzeno celkové pokrytí v rozsahu 228 kb včetně genu TOP2A. CEN-17 PNA sondy ve směsi sond TOP2A /CEN-17 IQISH byly testovány jednotlivě a v kombinaci, aby byla potvrzena jejich specifická hybridizace na centromerickou oblast chromosomu 17. K vyhodnocení schopnosti testu identifikovat pouze cílové substance TOP2A a CEN-17 bez interference s jinými substancemi byly provedeny studie na tkáňových vzorcích normálního lidského epitelu prsu za použití lahvičky 3, která obsahuje hybridizační pufr, ale bez směsi sond. Bylo hodnoceno celkem 18 vzorků na přítomnost signálů, které nesouvisejí se směsí sond. V žádném z 18 vzorků nebyla zjištěna detekce jiných cílových chromozomů ani interference s úzce souvisejícími látkami. Studie odolnosti Odolnost analýzy TOP2A IQFISH pharmdx byla testována za různých časů, teplot a metod ohřevu pufru pro předběžné zpracování (mikrovlnná trouba nebo vodní lázeň), časů a metod inkubace s pepsinem (pepsin RTU nebo ponoření), denaturačních časů a teplot, časů hybridizace a časů a teplot stringentního promývání. Při níže popsaných experimentálních podmínkách nebyly zaznamenány žádné významné rozdíly ve výsledcích: Metoda A) předběžného zpracování, vodní lázeň 10 minut v kombinaci s každou z teplot 95 C, C a 99 C společně s dobou trvání 9, 10 a 11 minut při teplotě C. Metoda B) předběžného zpracování, mikrovlnná trouba po dobu 9, 10 a 11 minut při teplotě > 95 C. Metoda A) natrávení pepsinem s inkubačními dobami 5, 10 a 15 minut při pokojové teplotě (20 25 C). Metoda B) natrávení pepsinem s inkubačními dobami 3, 4 a 5 minut při teplotě 37 C. P04092CZ_02/K str. 17/37

18 Metoda C) natrávení pepsinem s inkubačními dobami 20, 25 a 30 minut v kombinaci s každou z teplot 35, 37 a 39 C. Denaturace po dobu 10 minut v kombinaci s každou z teplot 65, 66 a 67 C společně s dobou trvání 9, 10 a 11 minut při teplotě 66 C. Čas hybridizace 60, 90 a 120 minut při teplotě 45 C. Stringentní promývání po dobu 10 minut v kombinaci s každou z teplot 61, 63 a 65 C společně s dobou trvání 9, 10 a 11 minut při teplotě 63 C. Některé hraniční časy a teploty vedly k lehce snížené kvalitě struktury tkáně, ale nebyly pozorovány žádné významné rozdíly v intenzitě signálu. Postup barvení s TOP2A IQFISH pharmdx nabízí proměnné protokolu pro teplotu předběžného zpracování, natrávení pepsinem a časy hybridizace. Každá jednotlivá možnost kombinace byla validována s ohledem na stav genu TOP2A. Validace byla provedena na 10 vzorcích lidského karcinomu prsu FFPE pro všech 12 možných kombinací. TOP2A FISH pharmdx Kit (K5333) byl použit jako reference. Poměr TOP2A/CEN-17 pro každý jednotlivý vzorek je zobrazen na obrázku 1. Křížová srovnání v tabulkách mezi těmito 12 testy a referenčním barvením prokázala všeobecnou shodu ve stavu genu TOP2A ve 100 % (10/10) s dolní a horní mezí 95% intervalu spolehlivosti 78,3 %, resp. 100 %. Hodnota kappa byla 1,00 a McNemarův test neprokázal odchylku (oboustranná p-hodnota 1,00). Obrázek 1. Jednotlivé poměry TOP2A/CEN-17 pro 10 lidských vzorků karcinomu prsu barvených za použití 12 možných variant kombinací protokolu pomocí TOP2A IQFISH pharmdx (kód K5733) (test 1 12) a TOP2A FISH pharmdx Kit (kód K5333) reference (R). Horní horizontální přímka zobrazuje mezní hodnotu 2,0 a spodní horizontální přímka zobrazuje mezní hodnotu 0,8. Opakovatelnost Opakovatelnost poměru TOP2A/CEN-17 byla zjišťována za použití analýzy TOP2AIQFISH pharmdx pomocí postupných řezů devíti lidských vzorků karcinomu prsu s deletovaným, normálním nebo amplifikovaným stavem genu TOP2A. Ve stejném cyklu byl každý vzorek P04092CZ_02/K str. 18/37

19 testován trojmo. Průměrný variační koeficient byl 3 % (rozmezí od 1 % do 4 %) pro vzorky s delecítop2a, 7 % (rozmezí od 2 % do 10 %) pro vzorky s normálním stavem TOP2A a 5,3% (rozmezí od 4 % do 7 %) pro vzorky s amplifikací genu TOP2A. S TOP2A IQFISH pharmdx byly testovány celkem čtyři konsekutivní vzorky lidského karcinomu prsu s různou tloušťkou (3, 4, 5, 6 a 7 µm). Průměrný variační koeficient poměru TOP2A/CEN-17 byl 9,8 % (rozmezí od 6 % do 13 %). Reprodukovatelnost Reprodukovatelnost analýzy TOP2A IQFISH pharmdx byla testována mezi jednotlivými šaržemi a mezi jednotlivými vyšetřovateli za použití tří šarží TOP2A IQFISH pharmdx a tří vyšetřovatelů. Reprodukovatelnost byla testována na devíti vzorcích lidského karcinomu prsu s delecí, amplifikací nebo s normálním stavem genu TOP2A. Průměrný variační koeficient reprodukovatelnosti mezi šaržemi byl 3,7 % pro vzorky s delecí genu TOP2A (rozmezí od 2 % do 6 %), 10,3 % pro vzorky s normálním stavem TOP2A (rozmezí od 10 % do 11 %) a 9,3 % pro vzorky s amplifikovaným stavem genu TOP2A (rozmezí od 5 % do 12 %). Průměrný variační koeficient reprodukovatelnosti mezi vyšetřovateli byl 13,7 % pro vzorky s delecí genu TOP2A (rozmezí od 7 % do 17%), 7 % pro vzorky s normálním stavem TOP2A (rozmezí od 2 % do 11 %) a 12,7 % pro vzorky s amplifikovaným stavem genu TOP2A (rozmezí od 10 % do 15 %). Klinické využití Doxorubicin a epirubicin jsou antracykliny, které představují nejčastěji používané protirakovinné léky, a bylo prokázáno, že topoizomeráza IIα je molekulárním cílem farmakologického účinku těchto látek (14, 15). Bylo prokázáno, že doxorubicin a epirubicin jsou účinné léky proti řadě různých maligních nádorů, včetně rakoviny prsu, přičemž se používají jak v případě metastatického onemocnění, tak v adjuvantní léčbě (15). V případě adjuvantní léčby rakoviny prsu klinické údaje prokázaly, že režimy chemoterapie obsahující doxorubicin nebo epirubicin vykazují statisticky významné prodloužení doby přežívání v porovnání s režimy, které antracykliny neobsahují (43, 44). Terapeutický index antracyklinů je nízký a jeho zvýšená účinnost je za cenu vyšší toxicity v porovnání s ostatními režimy chemoterapie, např. CMF (cyklofosfamid/metotrexát/5-fluorouracil) (19, 45). Kromě akutní toxicity může vést léčba přípravky doxorubicin nebo epirubicin k dlouhodobým nežádoucím účinkům, jako je kardiotoxicita a sekundární akutní myeloidní leukémie (AML) (6, 15). Kardiomyopatie vyvolaná touto léčbou je často nevratná a může pokračovat městnavým srdečním selháním po několika měsících i letech po ukončení léčby. Aby se léčba přípravky doxorubicinem a epirubicinem optimalizovala je pro lékaře důležité mít k dispozici nástroje, které pomohou identifikovat pacienty, pro které terapie přípravky doxorubicinem a epirubicinem může mít přínos. Klinická účinnost kitu Dako TOP2A FISH pharmdx (kód K5333) byla zkoumána ve dvou studiích prováděných Dánskou kooperativní skupinou pro rakovinu prsu (Danish Breast Cancer Cooperative Group, DBCG) v Kopenhagenu (21, 29, 30, 46). Pilotní studie Klinická účinnost kitu TOP2A FISH pharmdx byla zkoumána v pilotní studii (29) ve spolupráci s DBCG na vzorcích od 120 pacientů s rakovinou prsu. Celkem 20 nádorů vykázalo změny v počtu kopií TOP2A, téměř rovnoměrně rozložené mezi amplifikace (n=11) a delece (n=9). Změny TOP2A nebyly výlučně prokázány v HER2 pozitivních nádorech, jelikož 4 nádory (20 % abnormálních případů genu TOP2A) byly HER2 negativní. Poměr (červené signály/zelené signály) větší nebo roven 2 rozlišuje amplifikované a normální případy, zatímco poměr menší než 0,8 souvisí s delecí genu. Tato pilotní studie prokázala, že 2 různé metody sčítání dávají stejné výsledky: Buď bylo sčítáno 60 jader nebo bylo sečteno celkem 60 červených signálů se zelenými signály ve stejném jádru. Předností druhé metody je, že nejvyšší počet buněk se sčítá v případech s delecí a normálních případech, zatímco nejnižší počet buněk se sčítá v případech s amplifikací. Amplifikované případy jsou často jasně identifikovatelné již pouhým prohlédnutím P04092CZ_02/K str. 19/37

20 pod mikroskopem, ale na jejich sčítání je potřeba více času, pokud je potřeba vyhodnotit 60 jader. Potvrzovací studie DBCG 89D/TOP2A Klinická účinnost kitu TOP2A FISH pharmdx byla ve větší míře hodnocena na základě vzorků nádorů prospektivně shromážděných v adjuvantní studii DBCG 89D (21, 30, 46, 47). Záměr studie Primárním cílem studie DBCG 89D/TOP2A bylo zjistit, zda aberace genu TOP2A (amplifikace nebo delece) mohou sloužit jako prediktivní marker pro celkovou dobu přežívání bez rekurence u pacientů s vysoce rizikovou rakovinou prsu, kteří jsou určeni pro adjuvantní léčbu chemoterapií na bázi epirubicinu. Dalším cílem studie bylo zjistit prognostické vlastnosti aberací genu TOP2A a korelací mezi geny TOP2A a HER2. Studie DBCG 89D byla koncipována jako otevřená, prospektivní, randomizovaná studie. Po chirurgickém zákroku bylo 980 pre- a postmenopauzálních žen s vysoce rizikovou invazivní rakovinou prsu náhodně rozděleno do skupin s chemoterapií CMF nebo CEF (cyklofosfamid/epirubicin/5-fluorouracil). Primárním výsledkem účinnosti bylo přežívání bez rekurence (RFS, recurrence free survival) s celkovou dobou přežívání (OS, overall survival) jako sekundárním hlediskem. Pro biologickou podstudii byly shromážděny tkáňové bločky DBCG 89D/TOP2A pacientů, kteří se účastnili studie DBCG 89D, ze studijních míst a byly centrálně analyzovány retrospektivně ohledem genových aberací TOP2A a HER2 (Dako HER2 FISH pharmdx Kit) a rovněž co se týče nadměrné exprese genu HER2 (Dako HercepTest ). K dispozici byly tkáňové bloky od 806 z 980 pacientů ze studie DBCG 89D. Z hlediska aberací genu TOP2A a HER2 se poměr vypočetl jako počet signálů pro genové sondy děleno počtem signálů pro centromer 17. Případy byly hodnoceny jako s FISH amplifikací genu HER2 nebo TOP2A, pokud byl poměr 2. Za deleci genutop2a se případ považoval, když poměr byl < 0,8. Stav genu TOP2A byl zatříděn do následujících skupin: Stav s delecí genu: poměr TOP2A/CEN-17 < 0,8 Normální stav genu: 0,8 poměr TOP2A/CEN-17 < 2,0 Stav s amplifikací genu: poměr TOP2A/CEN-17 2,0 Při testování s HercepTest byly všechny pozitivní vzorky s intenzitou 1+, 2+ a 3+ předmětem analýzy HER2 FISH. Skóre HER2 pozitivity (48) ve studii bylo následující: Pozitivní: HercepTest=3+ nebo HercepTest=2+ a poměr FISH HER2 2,0 Negativní: HercepTest=0,1 nebo HercepTest=2+ a poměr FISH HER2 < 2,0 Klinická studie (DBCG 89D) a biologická podstudie (DBCG 89D/TOP2A) byly provedeny podle Helsinské deklarace a schváleny podle lokální etické komise. Statistická metodologie Primárním cílem studie bylo přežívání bez rekurence (RFS), definované jako doba od randomizace do události nebo cenzorování. Sekundárním hlediskem byla celková doba přežívání (OS), definovaná jako doba od randomizace do smrti nebo cenzorování. Účinnost léčby chemoterapií CEF nebo CMF na RFS a OS byla kvantifikována na základě poměru rizika, odhadem za použití Coxova modelu proporcionálních rizik. Coxův model proporcionálních rizik byl upraven podle výsledků testování dobré shody a zkoumání interakce a definován základní Coxův model s množstvím proměnných pro analýzu RFS a OS. Poměr rizik (HR), 95% interval spolehlivosti a p-hodnota Waldova testu byla provedena pro všechny kovariáty a interakční členy v Coxově modelu. Z výsledků byl odhadnut poměr rizika (hazards ratio, HR) léčby s chemoterapií CEF oproti léčbě CMF pro každou podskupinu TOP2A (a HER2 podskupinu) a zobrazen pomocí tzv. lesního grafu (forrest plot). P04092CZ_02/K str. 20/37

21 Poté, co byl Coxův model proporcionálních rizik RFS a OS upraven podle výsledků testování dobré shody a zkoumání interakce, byly provedeny 3 typy sekundárních analýz. Odhad více proměnných ve 3 podskupinách TOP2A: stav s delecí, normální stav, stav s amplifikací. Odhad více proměnných ve 2 podskupinách HER2: negativní, pozitivní. Unifikovaný odhad více proměnných pro všechny pacienty včetně TOP2A a HER2 interakce. Korelace mezi stavem genu TOP2A a klinickými a patologickými proměnnými včetně stavu genu HER2 byly testovány pomocí χ2-testu. Pokračování pozorování bylo kvantifikováno na základě Kaplan-Meierova výpočtu odhadu potencionální doby sledování. Byly provedeny analýzy možného zkreslení výběru za použití χ2-testu a log-rank testu. Pacienti s chybějícími hodnotami, kromě stavu receptoru, byly z analýzy více proměnných v Coxově modelu proporcionálních rizik vyřazení. Výsledky Analýza TOP2A FISH byla úspěšná na 773 z 806 (96 %) vzorcích rakoviny prsu. Celkové rozložení stavu TOP2A mezi vhodnými pacienty je zobrazeno v tabulce 1. Amplifikace TOP2A byla prokázána u 92 (11,9 %) ze 773 vhodných pacientů a delece u 87 (11,3 %). Tabulka 1. Rozložení stavu TOP2A Stav TOP2A n (%) Delece Normální Amplifikace 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) Celkem 773 (100) Rozložení amplifikací a delecí stavu genu TOP2A ve vztahu ke stavu genu HER2 je zobrazeno v tabulce 2. Tabulka 2. Rozložení stavu HER2 ve vztahu ke stavu TOP2A Stav HER2 TOP2A N n (%) Negativní 527 (100) Pozitivní 246 (100) Celkem 773 (100) Delece n (%) Normáln í n (%) 26 (4,9) 487 (92,4) (24,8) (43,5) (11,3) (76,8) Amplifikac e n (%) 14 (2,7) 78 (31,7) 92 (11,9) p- hodnota χ 2 p< 0,0001 Podíváme-li se na stav HER2, více aberacítop2a bylo prokázáno mezi nádory HER2 pozitivními. Aberace TOP2A byly prokázány u 139 (56,5 %) z celkem 246 HER2 pozitivních nádorů a u 40 (7,6 %) z celkem 527 HER2 negativních nádorů. Bylo tedy přehlédnuto 40 (22,3 %) pacientů s TOP2A aberacemi, jestliže byly analyzovány pouze HER2 pozitivní vzorky. Rozložení TOP2A aberací ve vztahu ke stavu HER2 FISH je zobrazeno v tabulce 3. Co se týče stavu HER2 byla prokázána významná korelace se stavem TOP2A. P04092CZ_02/K str. 21/37

22 Tabulka 3. Rozložení stavu HER2 FISH ve vztahu ke stavu TOP2A HER2 FISH TOP2A N n (%) Normální 539 (100) Amplifikac 234 e (100) Celkem 773 (100) Delece n (%) Normáln í n (%) 31 (5,8) 493 (91,5) (23,9) (43,2) (11,3) (76,8) Amplifikac e n (%) 15 (2,8) 77(32,9) 92 (11,9) p- hodnota χ 2 p< 0,0001 Rozložení TOP2A aberací ve vztahu ke skóre HercepTest je zobrazeno v tabulce 4. Co se týče stavu HER2 byla prokázána významná korelace se stavem TOP2A. Tabulka 4. Rozložení skóre HercepTest ve vztahu ke stavu TOP2A Hercep Test TOP2A N n (%) (100) (100) (100) (100) Celkem 773 (100) Delece n (%) Normáln í n (%) 11 (5,3) 192 (91,9) 13 (5,1) 238 (92,6) 3 (3,9) 65 (83,3) (26,2) (43,3) (11,3) (76,8) Amplifikac e n (%) 6 (2,9) 6 (2,3) 10 (12,8) 70 (30,6) 92 (11,9) p- hodnota χ 2 p< 0,0001 U šesti ze 773 pacientů s dostupnými údaji o stavu TOP2A chyběly klinické údaje, takže byly vyřazeni z analýzy více proměnných. U pacientů s dostupnými údaji z testování stavu TOP2A byla potencionální délka doby dalšího přežití bez rekurence RFS 9,4 let a odpovídající počet příhod byl 371. Medián potencionální délky doby celkového přežití OS byl 11,1 let a počet příhod byl 336. Kaplan Meierův graf pro hodnotu RFS vůči 2 léčebným skupinám v každé ze 3 TOP2A skupin je zobrazen na obrázcích 2 4. P04092CZ_02/K str. 22/37

23 Obrázek 2. RFS pro pacienty léčené CMF a CEF s nádory s TOP2A amplifikací genu Obrázek 3. RFS pro pacienty léčené CMF a CEF s nádory s normálním stavem genu TOP2A Obrázek 4. RFS pro pacienty léčené CMF a CEF s nádory s delecí genu TOP2A U obou skupin pacientů se změněným stavem genu, amplifikací TOP2A i delecí TOP2A, byla léčba CEF kvalitnější než CMF. U skupiny pacientů s amplifikací genu TOP2A byl rozdíl výrazný (p=0,037). Tento rozdíl nebyl zjištěn u skupiny pacientů s normálním stavem genu TOP2A. Analýza k primárnímu hledisku studie (RFS) za použití Coxova modelu proporcionálních rizik prokázala, že aberace genu TOP2A je signifikantním prediktivním markerem (p=0,016). U skupiny pacientů s amplifikací genu TOP2A došlo k relativnímu snížení rizika o více než 60 %, v případě léčby CEF v porovnání k léčbě CMF (HR=0,389, p- hodnota=0,0017). Snížení rizika bylo prokázáno rovněž u delece genu TOP2A, avšak nejedná se o statisticky významnou změnu (HR=0,608, p-hodnota=0,0828). Obrázek 5 znázorňuje relativní účinek léčby CEF ve všech podskupinách TOP2A a HER2 s hlediska RFS. P04092CZ_02/K str. 23/37

24 Obrázek 5. Relativní účinek léčby CEF v každé podskupině TOP2A a HER2 s hlediska RFS (lesní graf) Pro OS bylo dosaženo podobných výsledků jako pro RFS, avšak nejedná se o statisticky významné hodnoty (p=0,14). U skupiny pacientů s amplifikací genu TOP2A došlo ke snížení rizika o více než 50 %, v případě léčby CEF v porovnání k léčbě CMF (HR=0,485, p-hodnota=0,0142). Tak jako u hodnoty RFS bylo prokázáno statisticky nevýznamné snížení rizika u delece genu TOP2A (HR=0,678, p-hodnota=0,155). Obrázek 6 znázorňuje relativní účinek léčby CEF ve všech podskupinách TOP2A a HER2 s hlediska OS. P04092CZ_02/K str. 24/37

25 Obrázek 6. Relativní účinek léčby CEF v každé podskupině TOP2A a HER2 s hlediska OS (lesní graf) Byla zkoumána rovněž prediktivní hodnota stavu genu HER2 a údaje neprokázaly signifikantní účinek terapeutických interakcí, ani pro RFS ani OS. Analýza rozložení aberací genu TOP2A z hlediska počátečních vlastností prokázala významnou souvislost s několika osvědčenými histopatologickými prognostickými faktory. Údaje dále prokázaly, že počet žen s aberacemi genu TOP2A se s věkem zvyšuje, takže větší výskyt je mezi postmenopauzálními než premenopauzálními ženami. Analýza přežití o jedné proměnné prokázala významný negativní účinek na RFS i OS, neboť pacienti s amplifikací a delecí genu zaznamenali výrazné snížení doby přežití v porovnání s pacienty s normálním stavem genu TOP2A. Křivky přežití dále ukázaly, že pacienti s delecí genu měly dokonce horší prognózu než pacienti s amplifikovaným nebo normálním stavem genu TOP2A. Křivky přežití pacientů s amplifikovaným, normálním stavem nebo stavem s delecemi genu TOP2A jsou zobrazeny na obrázku 7. P04092CZ_02/K str. 25/37

26 Obrázek 7. Stav TOP2A ve vztahu k RFS a OS (N=767) Bylo prokázáno, že aberace genu TOP2A kromě souvislosti s osvědčenými prognostickými faktory mají samy o sobě prognostický význam. Na základě Coxova modelu proporcionálních rizik bylo prokázáno, že aberace genu TOP2A jsou spojeny s významně horší prognózou doby RFS (p=0,0169) a rovněž doby OS (p=0,0118). HR a 95% intervaly spolehlivosti na základě Coxova modelu proporcionálních rizik pro hodnoty RFS a OS jsou zobrazeny v tabulce 5 a 6. P04092CZ_02/K str. 26/37

27 Tabulka 5. HR pro RFS TOP2A včetně léčebných interakcí Proměnná p- hodnota Menopauza 0,0576 Pre Post Velikost nádoru pr. zvětšení v cm Pozitivní lymfatické uzliny Stav TOP2A Delece Normální Amplifikace Stav HER2 Negativní Pozitivní <0,0001 <0,0001 0,0169 0,2998 HR 1 1,26 95% CI (0,99 1,60) 1,15 (1,09 1,22) 1 2,01 4,16 1,66 1 1,56 (1,39 2,91) (2,88 6,02) (1,12 2,45) (1,00 2,42) 1 1,15 (0,88 1,49) Tabulka 6. HR pro OS TOP2A včetně léčebných interakcí Proměnná p- hodnota Menopauza 0,0124 Pre Post Velikost nádoru <0,0001 pr. zvětšení v cm Pozitivní <0,0001 lymfatické uzliny Stav TOP2A 0,0118 Delece Normální Amplifikace Stav HER2 0,0519 Negativní Pozitivní HR 95% CI 1 1,37 (1,07 1,75) 1,16 (1,10 1,23) 1 2,62 5,50 1,82 1 1,37 (1,70 4,04) (3,58 8,45) (1,22 2,71) (0,87 2,16) 1 1,31 (1,00 1,72) Poměry HR různých proměnných v tabulce 5 (RFS) jsou z hlediska prognostické hodnoty řazeny následujícím způsobem: počet pozitivních lymfatických uzlin > stav TOP2A > stav menopauzy > stav HER2 a velikost nádoru. Jak vyplývá z tohoto pořadí, představuje počet pozitivních lymfatických uzlin proměnnou, která má největší prognostický dopad, potom následuje stav genu TOP2A, stav v menopauze, velikost nádoru a stav genu HER2. Po provedení uspořádání pro hodnotu OS (tabulka 6) byly výsledky podobné jako u RFS, což potvrzuje silnou prognostickou hodnotu stavu genu TOP2A. Byla zkoumána i prognostická hodnota stavu genu HER2 a analýza přežití s jednou proměnnou ukázala významný negativní vliv jak na dobu RFS tak na OS, protože u HER2 pozitivních pacientů P04092CZ_02/K str. 27/37

28 se prokázalo snížení doby přežívání v porovnání s pacienty s normálním stavem HER2. Primární analýza RFS za použití Coxovy regresní analýzy proporcionálních rizik neprokázala žádný statisticky významný vliv stavu genu HER2. Když se analýza opakovala pro OS, prokázalo se, že pozitivní stav genu HER2 má významně negativní dopad na dobu přežívání. Diskuze a závěr Studie DBCG 89D/TOP2A prokázala, že aberace genu TOP2A mají významnou prediktivní a prognostickou hodnotu. Na základě porovnání výsledků ke stavu genu HER2 je možné, že stav genu HER2 a TOP2A nelze zaměnit ani pro účely predikce ani prognózy. Gen TOP2A je molekulárním cílem farmakologického účinku epirubicinu a studie prokázala, že aberace genu TOP2A, zejména amplifikace, je užitečný prediktivní marker odpovědi na látku epirubicin. Chemoterapie na bázi antracyklinu s doxorubicinem nebo epirubicinem patří mezi nejaktivnější režimy v léčbě rakoviny prsu. Tyto látky však mohou způsobovat akutní a dlouhodobé závažné nepříznivé účinky, jako je kardiotoxicita a leukémie. Komparativní studie mezi kity TOP2A FISH pharmdx a TOP2A IQFISH pharmdx Kit Dako TOP2A IQFISH pharmdx (kód K5733) byl porovnán s kitem Dako TOP2A FISH pharmdx (kód K5333) v komparativní studii na 80 vzorcích prsní tkáně lidského karcinomu prsu. Křížová srovnání stavu genu TOP2A v tabulce získaná z těchto dvou analýz vyprodukovala všeobecnou shodu 100 % s dolní a horní mezí 95% intervalu spolehlivosti 96,9 % a 100 %. Hodnota kappa byla 1. P04092CZ_02/K str. 28/37

29 Řešení problémů Problém Pravděpodobná příčina Doporučený postup 1. Žádné nebo slabé signály 1a. Kit byl vystaven během přepravy nebo skladování vysokým teplotám. 1a. Zkontrolujte podmínky skladování. Zkontrolujte, zda byl přítomen suchý led, když byla zásilka přijata. Zkontrolujte, zda lahvička 3 byla skladována při teplotě - 18 C v temnu. Zkontrolujte, zda lahvičky 2A a 5 byly skladovány při teplotě maximálně 2 8 C a zda lahvičky byly skladovány v temnu. 1b. Mikroskop nefunguje správně. - Nasazení nesprávného filtru - Nevhodná lampa - Rtuťová lampa je příliš stará - Špinavé nebo prasklé kolektorové čočky - Nevhodný imerzní olej 1b. Zkontrolujte mikroskop a ujistěte se, že použité filtry jsou vhodné pro sadu fluorochromů, a že rtuťová lampa je správná a nebyla použita po ukončení doby životnosti. (viz Příloha č. 3). V případě pochyb kontaktujte svého dodavatele mikroskopů. 1c. Vybledlé signály 1c. Vyhněte se dlouhému mikroskopickému vyšetřování a minimalizujte vystavení silným zdrojům světla. 2. Žádné zelené signály 3. Žádné červené signály 1d. Nesprávné podmínky předběžného zpracování 1e. Vypařování směsi sond během hybridizace 2a. Nesprávné podmínky pro důkladné promytí 3a. Nesprávné podmínky předběžného zpracování 1d. Zkontrolujte, zda se používá doporučená teplota a doba předběžného zpracování. 1e. Zajistěte dostatečnou vlhkost v hybridizační komůrce 2a. Ujistěte se, že byla dodržena doporučená teplota a doba při důkladném promytí, a že byla krycí sklíčka odstraněna před provedením důkladného promytí. 3a. Zkontrolujte, zda se používá doporučená teplota a doba předběžného zpracování. 4. Oblasti bez signálu 4a. Příliš malý objem sondy 4a. Zajistěte, aby byl objem sond dostatečný k pokrytí plochy pod krycím sklíčkem 4b. Vzduchové bubliny zachycené během aplikace směsi sond nebo montování 4b. Zamezte vzniku vzduchových bublin. Pokud vzniknou, jemně je vyklepejte pomocí pinzety P04092CZ_02/K str. 29/37

30 5. Přílišné zabarvení pozadí 6. Špatná morfologie tkáně 5a. Nevhodná fixace tkáně 5a. Zajistěte, aby byly použity pouze formalínem fixované, do parafínu zalité tkáňové řezy 5b. Parafín není zcela odstraněn 5b. Postupujte podle kroků odstranění parafínu a rehydratace uvedených v části B.2 5c. Příliš nízká teplota při důkladném promytí 5d. Příliš dlouhé vystavení hybridizovaného řezu silnému světlu 5c. Zajistěte teplotu důkladného promytí 63 (±2) C 5d. Vyhněte se dlouhému mikroskopickému vyšetřování a minimalizujte vystavení silným zdrojům světla. 6a. Špatná úprava pepsinem 6a. Používejte doporučené inkubační doby pepsinu. Viz část B.3, krok 2. Zkontrolujte, zda je s pepsinem nakládáno při správné teplotě. Viz část B.1 6b. Nesprávné podmínky předběžné úpravy mohou způsobit nejasný nebo zakalený vzhled 6c. Příliš dlouhé zpracovávání pepsinem nebo velmi tenké řezy mohou způsobit výskyt průhledných buněk. 6b. Zkontrolujte, zda se používá doporučená teplota a doba předběžného zpracování. 6c. Zkraťte inkubační doby Pepsinu. Viz část B.3, krok 2. Zkontrolujte, zda tloušťka řezů je v rozsahu 4 6 µm. 7. Vysoká úroveň zelené autofluorescence na sklíčku včetně oblastí bez tkáně FFPE 7. Použití prošlých nebo nevhodných podložních sklíček 7. Zkontrolujte, zda potažené sklíčko (Dako Silanized Slides, kód S3003 nebo poly-l-lysinem potažené sklíčko) nemá prošlou dobu použitelnosti. POZNÁMKA: Pokud nelze za příčinu problému považovat žádnou z uvedených příčin nebo pokud se nepodaří problém doporučeným postupem vyřešit, obraťte se s žádostí o pomoc na technické služby společnosti Dako. P04092CZ_02/K str. 30/37

31 Příloha 1 TOP2A IQFISH pharmdx, kód K5733 Kontrolní list protokolu Datum provádění cyklu: TOP2A IQFISH pharmdx, K5733 šarže: Identifikační kód vzorku: Identifikační kód vybavení: Datum ředění/použitelnosti pufru pro důkladné promytí (lahvička 6, ředěno v poměru 1:20): / Identifikační kód série barvení: Tkáň fixovaná v neutrálním pufrovaném formalínu Ano Ne Krok 1: Předběžné zpracování Datum ředění/exspirace roztoku pro předběžnou úpravu Pre-Treatment Solution (ampule 1 ředěná 1:20) Měřená teplota roztoku pro předběžné zpracování (95 99 C) C Předběžná úprava (10 minut) a chlazení (15 minut) Promytí v promývacím pufru Wash Buffer (ampule 6 ředěná 1:20) (2 x 3 minuty) Krok 2: Pepsin Trvání zpracování pepsinem (lahvička 2) při 37 C nebo Trvání úpravy pepsinem (lahvička 2) při pokojové teplotě nebo Trvání ponoření do pepsinu při 37 (±2) C Promytí v promývacím pufru Wash Buffer (ampule 6 ředěná 1:20) (2 x 3 minuty) Dehydrujte sklíčka (3 x 2 minuty) vzestupnou etanolovou řadou a nechte na vzduchu vyschnout Krok 3: Směs sond TOP2A/CEN-17 IQISH Aplikujte směs sond Probe Mix (ampule 3), opatřete krycím sklíčkem a utěsněte těsnícím prostředkem Coverslip Sealant Naměřená teplota denaturace (66 ±1 C) C Denaturace po dobu 10 minut Naměřená teplota hybridizace (45 ±2 C) C Hybridizace přes noc (ochrana před světlem) Krok 4: Stringentní promývání Datum ředění/použitelnosti pufru pro důkladné promytí (lahvička 4, ředěno v poměru 1:20) Naměřená teplota stringentního promývacího pufru Wash Buffer (63 ±2 C) C Důkladné promytí (10 minut) po odstranění krycích sklíček Promytí v promývacím pufru Wash Buffer (ampule 6 ředěná 1:20) (2 x 3 minuty) Dehydrujte sklíčka (3 x 2 minuty) vzestupnou etanolovou řadou a nechte na vzduchu vyschnout Krok 5: Montáž Aplikujte 15 µl fluorescenčního montovacího média (lahvička 5) a překryjte krycím sklíčkem Poznámky: / / minut minut minut Datum a podpis, laborant: P04092CZ_02/K str. 31/37

32 Příloha 2 TOP2AIQFISH pharmdx, kód K5733 Schéma posuzování Identifikační kód (ID) záznamu o cyklu barvení: Datum provádění cyklu: TOP2A IQFISH pharmdx, K5733 šarže: Identifikační kód vzorku: Jádro č. Stav TOP2A Stav CEN-17 Jádro č. Stav TOP2A Stav CEN Jádro č. Stav TOP2A Stav CEN-17 Celkem (1-20) Celkem (21-40) Celkem (41-60) Ke stanovení poměru TOP2A/CEN-17 spočítejte počet signálů TOP2A a počet signálů CEN-17 v 60 jádrech, nebo počet jader potřebných na 60 signálů TOP2A (viz část Interpretace zabarvení). Vydělte celkový počet signálů TOP2A celkovým počtem signálů CEN-17. Jestliže je poměr TOP2A/CEN-17 hraniční (0,7 0,9 nebo 1,8 2,2), přepočítejte vzorky a znovu vypočítejte poměr na bázi všech počítaných buněk. Počet sečtených buněk Signály TOP2A Signály CEN-17 Poměr TOP2A/CEN-17 Delece genu TOP2A (poměr < 0,8) Normální stav genu TOP2A (0,8 Poměr < 2) Amplifikace genu TOP2A (Poměr 2) Datum a podpis, laborant: Datum a podpis, patolog: Poznámky: Návod k hodnocení: viz Interpretace zabarvení. P04092CZ_02/K str. 32/37

33 Příloha 3 TOP2AIQFISH pharmdx, kód K5733 Specifikace fluorescenčního mikroskopu Společnost Dako doporučuje pro použití s kitem TOP2A IQFISH pharmdx, K5733 následující vybavení: 1. Typ mikroskopu Episkopický fluorescenční mikroskop. 2. Lampa 100 wattová rtuťová lampa (veďte si záznamy o době záření). 3. Objektivy Pro skrínink tkání jsou vhodné objektivy 10X suchá fluorescence nebo 16X fluorescence olejová imerziva. Pro velké rozlišení a hodnocení signálů se doporučují pouze fluorescenční objektivy olejová imerziva, např. 100X. 4. Filtry Filtry jsou navrženy pro konkrétní fluorochromy a jejich výběru je třeba věnovat náležitou pozornost. Společnost Dako doporučuje používání specifického filtru DAPI spolu s vysoce kvalitním dvojitým filtrem Texas Red/FITC. Filtr DAPI Texaská červeň / dvojitý filtr FITC Texas Red a FITC jednoduché filtry mohou být použity po ověření. Fluorochrom Excitační vlnová délka Emisní vlnová délka FITC 495 nm 520 nm Texaská červeň 596 nm 615 nm Pro každý typ mikroskopu jsou určeny specifické filtry, proto je výběr filtru zásadní pro interpretaci výsledků. Pokud máte zájem o podrobnější informace, kontaktujte svého dodavatele mikroskopů nebo zástupce firmy Dako. 5. Olej Imerzní olej, který nemá vlastní fluorescenci. Bezpečnostní opatření 50-wattová rtuťová lampa se nedoporučuje. Rodaminové filtry nepoužívejte. Trojité filtry se nedoporučují. Neoptimalizovaný mikroskop může způsobit problémy při čtení fluorescenčních signálů. Je důležité, aby světelný zdroj neměl prošlou expirační dobu a aby byl správně nastaven a nasměrován. Zákazníci by měli sledovat a dodržovat pokyny výrobce rtuťové lampy. Mikroskop by měl být udržován a rtuťová lampa před hodnocením výsledků seřízena. Aby bylo zamezeno vyblednutí fluorescence, je třeba vzorek vystavit excitačnímu světlu po co nejkratší dobu. Doporučujeme před započetím fluorescenční in situ hybridizace projednat seřízení konkrétního mikroskopu s výrobcem nebo odkazujeme na literaturu. P04092CZ_02/K str. 33/37

34 Reference 1. Wang JC. Cellular roles of DNA topoisomerases: a molecular perspective. Nat Rev Mol Cell Biol 2002;3: Austin CA, Marsh KL. Eukaryotic DNA topoisomerase II beta. Bioessays 1998;20: Roca J. The mechanisms of DNA topoisomerases. Trends Biochem Sci 1995;20: Tsai-Pflugfelder M, Liu LF, Liu AA, Tewey KM, Whang-Peng J, Knutsen T, et al. Cloning and sequencing of cdna encoding human DNA topoisomerase II and localization of the gene to chromosome region 17q Proc Natl Acad Sci U S A 1988;85: Sng JH, Heaton VJ, Bell M, Maini P, Austin CA, Fisher LM. Molecular cloning and characterization of the human topoisomerase IIalpha and IIbeta genes: evidence for isoform evolution through gene duplication. Biochim Biophys Acta 1999;1444: Smith K, Houlbrook S, Greenall M, Carmichael J, Harris AL. Topoisomerase II alpha coamplification with erbb2 in human primary breast cancer and breast cancer cell lines: relationship to m-amsa and mitoxantrone sensitivity. Oncogene 1993;8: Petit T, Wilt M, Velten M, Millon R, Rodier JF, Borel C, et al. Comparative value of tumour grade, hormonal receptors, Ki-67, HER-2 and topoisomerase II alpha status as predictive markers in breast cancer patients treated with neoadjuvant anthracycline-based chemotherapy. Eur J Cancer 2004;40: Nakopoulou L, Lazaris AC, Kavantzas N, Alexandrou P, Athanassiadou P, Keramopoulos A, et al. DNA topoisomerase II-alpha immunoreactivity as a marker of tumor aggressiveness in invasive breast cancer. Pathobiology 2000;68: Durbecq V, Desmed C, Paesmans M, Cardoso F, Di Leo A, Mano M, et al. Correlation between topoisomerase-iialpha gene amplification and protein expression in HER-2 amplified breast cancer. Int J Oncol 2004;25: Mueller RE, Parkes RK, Andrulis I, O'Malley FP. Amplification of the TOP2A gene does not predict high levels of topoisomerase II alpha protein in human breast tumor samples. Genes Chromosomes Cancer 2004;39: Callagy G, Pharoah P, Chin SF, Sangan T, Daigo Y, Jackson L, et al. Identification and validation of prognostic markers in breast cancer with the complementary use of array-cgh and tissue microarrays. J Pathol 2005;205: Cardoso F, Durbecq V, Larsimont D, Paesmans M, Leroy JY, Rouas G, et al. Correlation be tween complete response to anthracycline-based chemotherapy and topoisomerase II-alpha gene amplification and protein overexpression in locally advanced/metastatic breast cancer. Int J Oncol 2004;24: Hande KR. Topoisomerase II inhibitors. Cancer Chemother Biol Response Modif 2003;21: Tewey KM, Rowe TC, Yang L, Halligan BD, Liu LF. Adriamycin-induced DNA damage mediated by mammalian DNA topoisomerase II. Science 1984;226: Hortobagyi GN. Anthracyclines in the treatment of cancer. An overview. Drugs 1997;54 Suppl 4: Järvinen TA, Tanner M, Rantanen V, Barlund M, Borg A, Grenman S, et al. Amplification and deletion of topoisomerase IIα associate with ErbB-2 amplification and affect sensitivity to topoisomerase II inhibitor doxorubicin in breast cancer. Am J Pathol 2000;156: Coon JS, Marcus E, Gupta-Burt S, Seelig S, Jacobson K, Chen S, et al. Amplification and Overexpression of Topoisomerase IIalpha Predict Response to Anthracycline-based Therapy in Locally Advanced Breast Cancer. Clin Cancer Res 2002;8: Di Leo A, Gancberg D, Larsimont D, Tanner M, Jarvinen T, Rouas G, et al. HER-2 amplification and topoisomerase IIalpha gene aberrations as predictive markers in node-positive breast cancer patients randomly treated either with an anthracycline-based therapy or with cyclophosphamide, methotrexate, and 5-fluorouracil. Clin Cancer Res 2002;8: Di Leo A, Cardoso F, Durbecq V, Giuliani R, Mano M, Atalay G, et al. Predictive molecular markers in the adjuvant therapy of breast cancer: state of the art in the year Int J Clin Oncol 2002;7: P04092CZ_02/K str. 34/37

35 20. Park K, Kim J, Lim S, Han S. Topoisomerase II-alpha (topoii) and HER2 amplification in breast cancers and response to preoperative doxorubicin chemotherapy. Eur J Cancer 2003;39: Knoop AS, Knudsen H, Balslev E, Rasmussen BB, Overgaard J, Nielsen KV, et al. Retrospective analysis of topoisomerase IIa amplifications and deletions as predictive markers in primary breast cancer patients randomly assigned to cyclophosphamide, methotrexate, and fluorouracil or cyclophosphamide, epirubicin, and fluorouracil: Danish Breast Cancer Cooperative Group. J Clin Oncol 2005;23: Tanner M, Isola J, Wiklund T, Erikstein B, Kellokumpu-Lehtinen P, Malmstrom P, et al. Topoisomerase IIalpha gene amplification predicts favorable treatment response to tailored and dose-escalated anthracycline-based adjuvant chemotherapy in HER-2/neu-amplified breast cancer: Scandinavian Breast Group Trial J Clin Oncol 2006;24: O'Malley F, Chia S, Tu D, Shepherd L, Levine M, Huntsman D, et al. Prognostic and predictive value of topoisomerase II alpha in a randomized trial comparing CMF to CEF in premenopausal women with node positive breast cancer (NCIC CTG MA.5). Journal of Clinical Oncology, 2006 ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol 24, No. 18S (June 20 Supplement): Press MF, Mass RD, Zhou JY, Sullivan-Halley J, Villalobos IE, Lieberman G, et al. Association of topoisomerase II-alpha (TOP2A) gene amplification with responsiveness to anthracyclinecontaining chemotherapy among women with metastatic breast cancer entered in the Herceptin H0648g pivotal clinical trial. In: ASCO Annual Meeting; Abstract No Slamon D, Eiermann W, Robert N, al. e. Phase III randomized trial comparing doxorubicin and cyclophosphamide followed by docetaxel (AC-T) with doxorubicin and cyclophosphamide followed by docetaxel and trastuzumab (AC-TH) with docetaxel, carboplatin and trastuzumab (TCH) in HER2 positive early breast cancer patients: BCIRG 006 study. Breast Cancer Res Treat 2005; 94: S5 (Abstr 1). 26. Harris L, Dressler L, Cowan D, Berry D, Cirrincione C, Broadwater G, et al. The role of HER-2 + Topo IIa Amplification in predicting benefit form CAF dose escalation CALGB ASCO Annual Meeting; Abstract no Park K, Han S, Gwak GH, Kim HJ, Kim J, Kim KM. Topoisomerase II-alpha gene deletion is not frequent as its amplification in breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2006;98(3): Villman K, Sjostrom J, Heikkila R, Hultborn R, Malmstrom P, Bengtsson NO, et al. TOP2A and HER2 gene amplification as predictors of response to anthracycline treatment in breast cancer. Acta Oncol 2006;45: Olsen KE, Knudsen H, Rasmussen BB, Balslev E, Knoop A, Ejlertsen B, et al. Amplification of HER2 and TOP2A and deletion of TOP2A genes in breast cancer investigated by new FISH probes. Acta Oncol 2004;43: Knoop A, Knudsen H, Balslev E, Rasmussen B, Overgaard J, During M, et al. TOP2A aberrations as predictive and prognostic marker in high-risk breast cancer patients. A randomized DBCG Trial (DBCG89D). In: Journal of Clinical Oncology, ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol 24, No. 18S (June 20 Supplement), 2006: Järvinen TAH, Tanner M, Bärlund M, Borg Å, Isola J. Characterization of Topoisomerase IIα Gene Amplification and Deletion in Breast Cancer. Genes Chromosomes Cancer 1999;26: Jarvinen TA, Liu ET. Topoisomerase IIalpha gene (TOP2A) amplification and deletion in cancer-- more common than anticipated. Cytopathology 2003;14: Bofin AM, Ytterhus B, Hagmar BM. TOP2A and HER-2 gene amplification in fine needle aspirates from breast carcinomas. Cytopathology 2003;14: Pritchard KI, Shepherd LE, O'Malley FP, Andrulis IL, Tu D, Bramwell VH, et al. HER2 and responsiveness of breast cancer to adjuvant chemotherapy. N Engl J Med 2006;354: Sledge GW, Jr. Is HER-2/neu a predictor of anthracycline utility? No. J Natl Cancer Inst Monogr 2001: Nielsen KV, Müller S, Poulsen TS, Gabs S, Schonau A. Combined Use of PNA and DNA for Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). In: Nielsen PE, editor. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. 2 ed. Norfolk: Horizon Bioscience; p Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI P04092CZ_02/K str. 35/37

36 document M29-A3 [ISBN ]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule C, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: Mosby Company; Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press; Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer 2001;92: Ellis IO, Bartlett J, Dowsett M, Humphreys S, Jasani B, Miller K, et al. Best Practice No 176: Updated recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol 2004;57: Poole CJ, Earl HM, Hiller L, Dunn JA, Bathers S, Grieve RJ, et al. Epirubicin and cyclophosphamide, methotrexate, and fluorouracil as adjuvant therapy for early breast cancer. N Engl J Med 2006;355: Group EBCTC. Effects of chemotherapy and hormonal therapy for early breast cancer on recurrence and 15-year survival: an overview of the randomised trials. Lancet 2005;365: Kelleher M, Miles D. 21. The adjuvant treatment of breast cancer. Int J Clin Pract 2003;57: Jørgensen JT, Nielsen KV, Ejlertsen B. Pharmacodiagnostics and Targeted Therapies - A rational approach for individualizing medical anti-cancer therapy in breast cancer. Oncologist 2007;12: Ejlertsen B, Mouridsen HT, Jensen MB, Andersen J, Cold S, Edlund P, et al. Improved outcome from substituting methotrexate with epirubicin: Results from a randomised comparison of CMF versus CEF in patients with primary breast cancer. Eur J Cancer 2007;43: Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol 2003;16: P04092CZ_02/K str. 36/37

37 Vysvětlivky k symbolům Katalogové číslo Teplotní rozmezí od do Čislo šarže In vitro diagnostický zdravotnický prostředek Chraňte před slunečním světlem (viz sekci o skladování) Použitelné do Viz Návod k použití Lze použit pro <n> testů Výrobce Piktogram GHS(viz část o bezpečnostních opatřeních) Piktogram GHS(viz část o bezpečnostních opatřeních) Piktogram GHS(viz část o bezpečnostních opatřeních) Piktogram GHS(viz část o bezpečnostních opatřeních) Piktogram GHS(viz část o bezpečnostních opatřeních) Revize Výrobce: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Dánsko Tel Fax P04092CZ_02/K str. 37/37