Literatura Anzenbacher,, Kovář : Metody chemického výzkumu pro biochemiky. MŠ Praha, Ferenčík, Škárka : Biochemická laboratorní technika. Alfa B

Transkript

1 Metody separace proteinů

2 Literatura Anzenbacher,, Kovář : Metody chemického výzkumu pro biochemiky. MŠ Praha, Ferenčík, Škárka : Biochemická laboratorní technika. Alfa Bratislava 1981.

3 Literatura

4 Separace Analytické kvalitativní kvantitativní Preparativní Charakterizace pi, MW, spektra, AMK

5 Separační metody Vychází z klasických metod chemické analýzy Uplatňují se zde i speciální metody

6 Problémy se vzorkem Komplexnost Malá množství Labilita

7 Zásady pro práci s biologickým materiálem 1. Teplota 2. ph + iontová síla 3. Koncentrace 4. Pěnění 5. Lokální přebytky 6. Proteasy, RNAsy, DNAsy

8 Separace bílkovin

9 Plánování separace

10 Cíl izolace Získání homogenní bílkoviny Zachování biologické aktivity Čistota Závěr : získat vzorek o patřičné čistotě s vynaložením patřičného úsilí

11 Volba vstupního materiálu Preparát z daného organismu Preparát s největším obsahem dané bílkoviny Preparát s nejmenším obsahem nečistot

12 Volba a kombinace separačních metod Selektivita Rozlišovací schopnost Kapacita Zpětný výtěžek Náklady materiál, přístroje, člověk Stupeň zřeďování a koncentrace Slučitelnost mezi metodami Znalosti o dané bílkovině (pi, MW)

13 Základní zásady Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a rozlišením velké množství levného vstupního materiálu Později metody s vysokým rozlišením a výtěžkem, kapacita méně významná ve vzorku již investovaná práce

14 Pořadí volit tak, aby metody na sebe vhodně navazovaly Metody zřeďovací kombinovat s metodami koncentrujícími Metody nepoužívat opakovaně

15 Sledování průběhu separace Metoda Celková bílkovina Celková aktivita Specifická aktivita Přečištění Výtěžek extrakt % HIC % IEX %

16 Sledování průběhu separace SDS PAGE

17 Stanovení koncentrace bílkoviny M etoda založená na stano vení ko ncetrace d usíku na základě optických vlastností na základě elektro chem ických vlastno stí

18 Kjeldahlova metoda stanovení N 2 Mineralizace vzorku převedení organického N na NH + 4 Stanovení NH titrace, fotometrie, selektivní elektrody

19 Kjeldahlova metoda stanovení N 2

20 UV spektrofotometrie 280 nm aromatické AMK interference nukleotidů nm peptidická vazba Výhody - nedestruktivní metoda - není třeba kalibrace

21 UV spektrofotometrie

22 UV spektrofotometrie

23 UV spektrofotometrie Vzorce pro přímé UV stanovení: c (mg/ml) = 1.55 A A260 c (mg/ml) = (A235 - A280)/2.51 c (mg/ml) = (A224 - A233)/5.01 c (mg/ml) = A205 [ (A280/A205)]

24 UV spektrofotometrie Edelhochova metoda při znalosti aminokyselinového složení je možné spočíst extinkční koeficient proteinu e 280. Podmínkou je přítomnost tryptofanu nebo tyrosinu v molekule. e 280 = ntrp ntyr ncys.125 (M - 1.cm - 1 )

25 VIS spektrofotometrie Přídavek činidla barevný derivát Destruktivní metoda Nutná kalibrační závislost

26 Biuretová metoda Princip : Cu 2+ vytváří v alkalickém prostředí komplex se 4 N peptidické vazby Cu 2+ Měření : nm 310 nm

27 Folinova metoda Princip : hydroxyfenolová skupina tyrosinu redukuje fosfomolybdenany (Folin Ciocalteovo reagens) na molybdenovou modř Měření : 725 nm

28 Lowryho metoda Princip : kombinace Folinovy a Biuretové metody Měření : 600 nm

29 Lowryho metoda biuret Lowry

30 Metoda dle Bradfordové Princip : při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 na bílkovinu dochází k posunu absorpčního maxima z 465 na 595 nm. Meření : 595 nm

31 Metoda dle Bradfordové

32 BCA metoda Princip : Na + sůl k. bicinchoninové (BCA), komplexuje Cu + tvořené reakcí peptidové vazby s Cu 2+ Měření : 562 nm

33 BCA metoda

34 Fluorescence Princip : - vazba fluoroforu na bílkovinu měření vzniklé fluorescence (OPA) Měření : exc.340 nm em.440 nm - zhášení fluorescence přídavkem bílkoviny

35 Polarografie Princip : Brdičkova reakce SH skupiny bílkoviny vstupují v přítomnosti Co 2+ katalytické reakce na Hg elektrodě proud

36 Nejčastěji používané metody Metoda Rozsah (ng) Poznámka Biuretová okamžitý vývoj Lowryho pomalý vývoj UV nm interference UV 205 nm interference Bradfordové sorpce barviva

37 Nejčastěji používané metody

38 Stanovení biologické aktivity Enzymatické,imunologické, toxické, hormonální receptorové atd.

39 Vlastní separace

40 Obecné schéma Získání vstupního materiálu Rozrušení buněk Separace

41 Vstupní materiál

42 Mikroorganismy Bakterie, kvasinky, plísně, řasy Výhody - lze jej snadno získat v dostatečné množství - selekce mutantů o požadovaných vlastnostech - genetické inženýrství - termofilní organismy - psychrofilní organismy

43 Mikroorganismy CCM uchovává více než kmenů bakterií (asi druhů) a 800 kmenů vláknitých hub (přibližně 550 druhů), které nabízí ve svém Katalogu kultur. Specializovaná sbírka vodních hyfomycetů obsahuje asi 500 kmenů (60 rodů se 130 druhy).

44 Selekce optimálních producentů snadné získání producenta snadnost purifikačního postupu maximální produkce enzymu

45 Mikroorganismy

46 Bezobratlí Hmyz, plži, mlži Nevýhody - málo se používá, nesnadno se získává

47 Živočišné tkáně Laboratorní zvířata myši, krysy, králíci Jateční zvířata orgány, krev Člověk tělní tekutiny

48 Rostlinné tkáně Špenát, řepa, hrách, tabák, Arabidopsis thaliana Nevýhoda problematický růst za definovaných podmínek

49 Manipulace s biologickým materiálem Pokud možno zpracovat co nejdříve Zmražení - při o C Rozmrazování - co nejrychleji

50 Rozbití a extrakce

51 Bakterie

52 Bakterie Záleží na lokalizaci Extracelulární Intracelulární Cytoplasma Periplazma cytoplasma periplasma

53 Balotina Princip jemné skleněné kuličky přidány do bakteriální suspenze a rychle třepány nebo míchámy nutno chladit

54 French (X) press Princip zmražená bakteriální suspenze protlačována malým otvorem, přičemž dochází k rekrystalizaci a rozrušení buněk

55 French (X) press

56 Ultrazvuk Princip ultrazvuk (> 20 khz) v roztoku vyvolává střižní síly nutno chladit

57 Lysozym + osmotický šok (mírný osmotický šok) Princip lysozym rozruší buněčnou stěnu, následně je bakteriální suspenze zředěna destilovanou H 2 O bakterie popraskají

58 Další Alumina Al 2 O 3 roztírání v třecí misce Opakované zmrazování a rozmrazování

59 Kvasinky

60 Kvasinky Toluenová autolýza Princip toluen extrahuje při o C fosfolipidy buněčné stěny osmotický šok enzymová autolýza Balotina, French press,

61 Živočišné tkáně Bez buněčné stěny Velmi křehké Tkáňové kultury

62 Živočišné tkáně Třecí miska s pískem Ruční homogenizatory Potter Elvehjemův

63 Živočišné tkáně Mixery Osmotická lyse - erytrocyty

64 Rostlinné tkáně Silná buněčná stěna - celulosa Tkáňové kultury křehké

65 Rostlinné tkáně Rozrušení buněčné stěny pomocí celulas, Obsahují hodně fenolických látek, které mohou být oxidovány na chinony melaniny, které mohou modifikovat bílkoviny

66 Optimalizace extrakce Teplota 4-6 o C chlazení ph optimální pro danou bílkovinu práce v pufrech I v prostředí o definované iontové síle Přídavky látek EDTA, - merkaptoethanol, kovové ionty, inhibitory proteas

67 Inhibitory proteas

68 Separace subcelulárních organel Organela Tíhové zrychlení Čas Eukar.buňky g 5 Jádra, chloroplasty g 10 Mitochondrie, bakterie g 20 Lysozomy, membrány g 30 Ribozomy, fragmenty end.retikula a Gold.systém g 60

69 Enzymy - markery Organela Cytoplasma Endoplazmatické retikulum Goldiho systém Peroxisom Lysozom Mitochondrie in Mitochondrie out Enzym LDH Glukosa-6-fosfatasa galaktosyltransferasa katalasa Kyselá fosfatasa cytochromoxidasa monoaminoxidasa

70 Membránově vázané bílkoviny M em bránové bílkoviny interagující integrální elektrostaticky h yd rofob n ě zanořené transm em bránové

71 Izolace membránových bílkovin Chemicky detergenty, chaotropní soli, organická rozpouštědla, nízká iontová síla, Fyzikálně - homogenizace, sonikace Enzymaticky fosfolipasy, lipasy, proteasy

72 Detergenty

73 Detergenty

74 Detergenty