HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING

Transkript

1 HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING Ref Ref. 4390* 2010/01

2 POUŽITÍ SADY Sada HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING je navržena pro kvalitativní detekci a identifikaci různých fenotypů alfa-1 antitrypsinu (A1AT). Výsledky fenotypizace společně s klinickými nálezy a dalšími laboratorními vyšetřeními pomáhají při diagnóze deficience alfa-1 antitrypsinu. Analýza se provádí v lidském séru rozděleném elektroforeticky a připraveném pro kvalitativní analýzu. Tento postup zahrnuje isoelektrickou fokusaci na agarosovém gelu prováděnou poloautomatickým systémem HYDRASYS následovanou imunofixací pomocí antiséra anti-alfa-1 antitrypsinu. enzymu označeného antisérem anti-alfa-1 antitrypsinu zlepšuje detekci a identifikaci různých fenotypů. Každý agarosový gel v sadě HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING je určen k analýze 18 vzorků. Pro diagnostické použití In Vitro. PRINCIP TESTU Alfa-1 antitrypsin (A1AT) je polymorfní glykoprotein obsažený v normálním lidském séru. Patří do skupiny proteinů, které inhibují různé lidské proteasy, včetně trypsinu, katepsinu G, nutrofilní elastasy atd. (1, 3, 6, 11). Gen pro A1AT je kódován na jednom místě chromozomu 14 a je produkován především v jaterních buňkách a imunitním systémem. Tento polymorfický gen se vyskytuje v různých alelách označovaných písmeny, například M po normální, Z a S pro deficientní, nebo chybějící (2, 4, 7, 12). Jedinci s ZZ, SZ, MZ nebo nulovým fenotypem vykazují zvýšené riziko onemocnění, které se může lišit u pacientů se stejným fenotypem (5, 8). Deficience A1AT je genetická porucha poprvé popsaná u pacientů s pulmonální emfysémií (5, 14). Vyšetření se provádí ve dvou stupních : Isoelektrická fokusace na agarosovém gelu s cílem rozštěpit proteiny v vzorcích séra. Imunofixace enzymem (peroxidasou) označeným antisérem anti-alfa-1 antitrypsin pro detekci různých fenotypů alfa-1 antitrypsinem. Poloautomatický systém HYDRASYS provádí všechny kroky potřebné pro získání gelů připravených k interpretaci. REAGENTY A MATERIÁLY DODÁVANÉ V SADĚ HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING POLOŽKA PN 4357 PN 4390* Agarosové gely (připravené k použití) 10 gelů 80 gelů Roztok etylenglykolu (připravený k použití) 1 lahvička, 3 ml 8 lahvičky, 3 ml Anodický roztok (připravený k použití) 1 lahvička, 50 ml 8 lahvičky, 50 ml Katodický roztok (připravený k použití) 1 lahvička, 50 ml 8 lahvičky, 50 ml Proužky 10 balení po 2 kusech 80 balení po 2 kusech Ředicí roztok pro vzorek CSF / A1AT (připravený k použití) 1 lahvička, 85 ml 2 lahvičky, 85 ml Ředicí roztok pro antisérum A1AT (připravený k použití) 1 lahvička, 3 ml 8 lahvičky, 3 ml Rehydratační roztok (připravený k použití) 2 lahvičky, 70 ml 16 lahvičky, 70 ml Rozpouštědlo TTF3 (připravené k použití) 2 lahvičky, 20 ml 16 lahvičky, 20 ml TTF3 (zásobní roztok) 2 lahvičky, 0.5 ml 16 lahvičky, 0.5 ml Aplikátory (připravené k použití) 1 balení po 10 kusech (18 zubů) 8 balení po 10 kusech (18 zubů) Nádoby s tlumicím roztokem (připravené k použití) 1 balení po 2 kusech 8 balení po 2 kusech Jednožlábkový antisérový segment (připravený k použití) 1 balení po 10 kusech 8 balení po 10 kusech Filtrační papíry - Tenké 1 balení po 10 kusech 8 balení po 10 kusech Filtrační papíry - Silné 3 balení po 10 kusech 24 balení po 10 kusech (*) HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING MAXI-KIT Během přepravy může být souprava uchována bez zmražení (15 až 30 C) až po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti. PRO OPTIMÁLNÍ VÝSLEDKY : Společně smějí být používána pouze činidla ze stejné sady a podle pokynů v příbalovém letáku. PROSÍME, ČTĚTE PEČLIVĚ PŘÍBALOVÝ LETÁK. 1. AGAROSOVÉ GELY Agarosové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarosu, 1 g/dl, amfolyty, přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Nosné médium pro isoelektrickou fokusaci a imunofixaci bílkovin. Gely skladujte horizontálně v originálním ochranném balení a v chladničce (2 až 8 C). Jsou stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady a na balení gelu (šipka na přední straně krabice musí směřovat nahoru). Neskladovat v blízkosti okna nebo tepelného zdroje. Zamezte prudkým změnám teploty při skladování. NEMRAZIT. Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelu a pokud struktura změkne (oboje v důsledku zmrazení gelu), (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování) SEBIA NÁVOD - Czech

3 2. ROZTOK ETYLENGLYKOLU Roztok etylenglykolu je připraven k použití. VAROVÁNÍ : Při požití zdraví škodlivý. HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING /01 Účelem je vytvoření efektivního kontaktu mezi plastovým podkladem gelu a tepelně regulační destičkou migračního modulu během elektroforetické migrace. Zásobní roztok etylenglykolu skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady či na štítku lahvičky. 3. ANODICKÉ A KATODICKÉ ROZTOKY Anodický roztok (kyselý roztok) a katodický roztok (zásaditý roztok) jsou připravené pro použití. Oba tyto roztoky obsahují přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. POZNÁMKA : Anodický roztok má červenou barvu, což napomáhá jeho aplikaci a snadné identifikaci připraveného anodického proužku. VAROVÁNÍ : Katodický roztok obsahuje hydroxid sodný. Dráždivý pro oči a kůži. V případě zasažení očí vypláchněte okamžitě velkým množstvím vody a vyhledejte lékařskou pomoc. Jako elektrolyty pro přípravu anodických a katodických proužků pro isoelektrickou fokusaci. DŮLEŽITÉ : Po každém použití lahvičku s katodickým roztokem okamžitě a těsně uzavřete, abyste zabránili karbonaci tohoto roztoku. Anodický a kyselý roztok může být skladován při pokojové teplotě nebo v chladničce do doby expirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. Roztoky nesmí obsahovat sraženiny. 4. PROUŽKY Namočte dva sací proužky do anodického případně katodického roztoku 5 minut před použitím : Na rovný povrch položte šedou nádobu pro anodický proužek a modrou pro katodický. Naneste 5 ml červeného anodického roztoku do šedé nádoby a 5 ml bezbarvého katodického roztoku do modré nádoby. Otevřete balení sacích proužků položte je do každé nádoby. Při manipulaci držte proužky za plastové konce. Rovnoměrně je namočte několikerým stlačením špičkou odpovídajících pipet. Namočené proužky ihned použijte. DŮLEŽITÉ : Proužky namáčejte těsně před použitím, abyste zabránili karbonaci katodického roztoku. POZNÁMKA : Pokud je houbovitý proužek před namočením v roztoku suchý (tvrdý), doporučuje se ponořit jej do horké vody (okolo 60 C) ; poté vyždímat, omýt v destilované nebo deionizované vodě a znovu vyždímat v měkké látce. Tento krok zlepší nasátí anodického nebo katodického roztoku houbičkou. VAROVÁNÍ : Doporučuje se použít opatrně horkou vodu (s teplotu 40 C). Proužky namočené v anodickém nebo katodickém elektrolytickém roztoku zaručují kontakt mezi gelem a elektrodami a určují rozsah ph během fokusace. Vlhké proužky v originálním ochranném obalu mohou být ukládány při pokojové teplotě nebo v chladničce. Musí být ukládány vodorovně (šipka na přední straně krabice musí směřovat nahoru). Jsou stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na balení proužků. NEMRAZIT. 5. ŘEDICÍ ROZTOK NA VZOREK CSF / A1AT Ředicí roztok na vzorek CSF / A1AT je připravený k použití. Obsahuje fyziologický roztok doplněný albuminem bovinního séra, azidem sodným a přídavnými látkami nezbytně nutnými pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. VAROVÁNÍ : Ředicí roztok na vzorek obsahuje azid sodný. Azid sodný může reagovat s kyselinami, olovem nebo s mědí za vzniku toxických a výbušných sloučenin. Před znehodnocením vždy propláchněte velkým množstvím vody. Pro ředění vzorků séra. Ředicí roztok pro vzorek CSF / A1AT skladujte v chladničce (2 až 8 C). Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky. Ředicí roztok nesmí obsahovat sraženiny. 6. ŘEDICÍ ROZTOK NA ANTISÉRUM A1AT Ředicí roztok na antisérum je připraven k použití. Obsahuje přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pro ředění antiséra těsně před použitím. Ředicí roztok na antisérum může být uchováván při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky. Ředicí roztok na antisérum nesmí obsahovat sraženiny. POZNÁMKA : Během uložení může ředicí roztok na antisérum zmodrat. Nemá to vliv na jeho funkci

4 7. REHYDRATAČNÍ ROZTOK Rehydratační roztok je připraven k použití. Obsahuje složky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pro rehydratici agarosového gelu před vizualizačním krokem na základě peroxidasy. Rehydratační roztok může být skladován při pokojové teplotě nebo v chladničce do doby expirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. Rehydratační roztok nesmí obsahovat sraženiny. 8. ROZPOUŠTĚDLO TTF3 Rozpouštělo TTF3 je připraveno k použití. Obsahuje složky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pro přípravu vizualizačního roztoku TTF3, jak je popsáno v bodu 10. Rozpouštědlo TTF3 může být skladováno při pokojové teplotě nebo v chladničce do doby expirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. Rozpouštědlo TTF3 nesmí obsahovat sraženiny. 9. TTF3 Těsně před použitím připravte pracovní vývojový roztok. Přidejte činidla v následujícím pořadí. 4 ml rozpouštědla TTF3, 100 µl TTF3 a 4 µl peroxidu (H 2 O 2 ) o koncentraci 30 %. VAROVÁNÍ : TTF3 obsahuje dimetylformamid. Při vdechování zdraví škodlivé! V případě nedostatečného větrání používejte vhodné respirační vybavení. Nepožívejte! Při požití ihned vyhledejte pomoc lékaře! Zdraví škodlivé při styku s kůží. Noste vhodný ochranný oděv. Dráždivé pro oči. V případě zasažení očí vypláchněte okamžitě velkým množstvím vody a vyhledejte lékařskou pomoc. Zabraňte expozici a opatřete si před použitím potřebné pokyny. Může způsobit rakovinu. Pokud se necítíte dobře, vyhledejte okamžitě lékařskou pomoc (a ukažte štítek výrobku). Pro vizualizaci fenotypů alfa-1 antitrypsinu separovaného pomocí isofokusace pomocí antiséra označeného peroxydasou. Zásobní roztok TTF3 skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky. TTF3 roztok nesmí obsahovat sraženiny. 10. APLIKÁTORY Nařezané aplikátory pro jednorázové použití určené k nanášení vzorků na gel. Aplikátory skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 11. NÁDOBY NA TLUMICÍ ROZTOK Barevné nádoby pro opakované použití při přípravě anodických a katodických proužků. Šedá nádoba je určena na anodický proužek a modrá nádoba je určena na katodický proužek. Po každém použití vypláchněte obě dvě nádoby destilovanou nebo deionizovanou vodou a vysušte je. Skladování, stabilita a známky znehodnocení Čisté nádoby na tlumicí roztok skladujte na rovném povrchu při pokojové teplotě. 12. ANTISÉROVÉ SEGMENTY Barvené segmenty na jedno použití pro aplikaci antiséra na gely k imunofixaci pomocí dynamické masky. VAROVÁNÍ : Se segmeny s antisérem musí být zacházeno opatrně. 13. TENKÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Nařezané bločky tenkého absorpčního papíru pro jednorázové použití jsou určeny pro odsátí přebytečné vlhkosti z povrchu gelu před nanesením vzorků. Skladování Tenké filtrační papíry skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 14. SILNÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Bločky tlustého absorpčního papíru pro jednorázové použití určené k odsátí nevysrážených bílkovin z povrchu gelů po provedení imunofixace a rehydratace. Skladování Tlusté filtrační papíry skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce

5 POTŘEBNÁ ČINIDLA PRODÁVANÁ SAMOSTATNĚ 1. ANTISÉRUM ANTI-A1AT - PER Lahvička antiséra anti-a1at - PER (SEBIA, kat. č. 4746) obsahuje savčí imunoglobuliny zaměřené proti lidskému alfa-1 antitrypsinu, konjugované s peroxidázou. Antisérum anti-a1at - PER je ve stabilizované lyofilní formě. Pro snadnou identifikaci a jako pomůcka pro sledování jeho použití je antisérum obarveno neškodným barvivem tak, aby jeho barva odpovídala štítku lahvičky. Rozpusťte obsah lahvičky antiséra anti-a1at - PER v přesně 0,55 ml destilované nebo deionizované vody. Nechte 5 minut stát a lehce zamíchejte (dbejte, ať nedojde k tvorbě pěny). Potom připravte těsně před použitím pracovní roztok (zředěné antisérum). 40 µl anti-a1at - PER a 300 µl ředicího roztoku na antisérum. Dobře zamíchejte. Pro imunofixaci a vizualizaci fenotypů lidského alfa-1 antitrypsinu rozdělených isoelektrickou fokusací. Před rozpuštěním skladujte anitsérum anti-a1at - PER v lyofilní formě v chladu (2 až 8 C) a temnu. Je stabilní do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky roztoku nebo krabice. Rozpuštěné roztoky antiséra anti-a1at - PER skladujte při 2-8 C a v temnu. Vzhledem k riziku mikrobiologické kontaminace a denaturace je použijte během jednoho týdne. Rozpuštěné antisérum může být rovněž zmraženo (v alikvotních podílech) a uloženo při teplotě - 20 C po dobu nejvýše 6 měsíců. DŮLEŽITÉ: Po uložení při 2-8 C nebo při - 20 C homogenizujte rozpuštěné antisérum anti-a1at - PER před přípravou pracovního roztoku (zředěné antisérum). Před použitím uložte rozmražené antisérum anti-a1at - PER při 2-8 C a použijte je během jednoho dne. Nezmrazujte a nerozmrazujte antisérum více než dvakrát. Antisérum vyřaďte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. POZNÁMKA: Antiséra mohou pocházet z různých zvířecích druhů. Nemíchejte dvě různé lahvičky s antiséry i když jsou stejné specifikace a při výměně lahviček s antiséry VŽDY měňte špičky pipety. POZNÁMKA: Během přepravy může být antisérum uchováno bez chlazení (15 až 30 C) až po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti. 2. PEROXID VODÍKU : H 2 O 2, 30 % (110 Obj.) Peroxid musí být uchováván v tmavé lahvi a v chladničce (2 až 8 C). Při dávkování vždy používejte čistou pipetu, abyste zabránili kontaminaci obsahu lahve. 3. ODBARVOVACÍ ROZTOK Každá lahvička zásobního Odbarvovacího Roztoku (SEBIA, kat č. 4540, 10 lahviček, 100 ml v každé) může být zředěna destilovanou nebo deionizovanou vodou až na 100 litrů. Praktické je zředit pouze 5 ml zásobního roztoku na 5 litrů, což je objem láhve na odbarvovací roztok. Po zředění pracovní odbarvovací roztok obsahuje : kyselinu citronovou, 50 mg/dl. Pro opláchnutí gelu po enzymatické vizualizaci a sušení a pro vypláchnutí barvicího prostoru HYDRASYS. K neutralizaci kyselé reakce odbarvovacího roztoku před zneškodněním nalijte do prázdného nádoby na odpady 15 ml 50 % roztoku NaOH. Zásobní odbarvovací roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní jeden týden při skladování v uzavřené láhvi při pokojové teplotě. Pro zabránění mikrobiálního růstu ve zředěném odbarvovacím roztoku skladovaném déle než 1 týden lze přidat 5 µl/dl roztoku ProClin 300. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem ProClinu je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby expirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. Nepřidávat azid sodný. Pracovní odbarvovací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. 4. HYDRASYS - PROMÝVACÍ ROZTOK Každá lahvička Promývacího Roztoku HYDRASYS (SEBIA, kat č. 4541, 10 lahviček, 80 ml každá) může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 5 litrů. Po zředění pracovní prací roztok obsahuje : zásaditý tlumicí roztok o ph 8.8 ± 0.3 ; azid sodný. VAROVÁNÍ : Zásobní promývací roztok obsahuje % azidu sodného. Nepožívejte! Při požití ihned vyhledejte pomoc lékaře! Azid sodný může reagovat s kyselinami, olovem nebo s mědí za vzniku toxických a výbušných sloučenin. Před znehodnocením vždy propláchněte velkým množstvím vody. Prací roztok HYDRASYS je určen pro čištění barvicího prostoru HYDRASYS. Používejte jej pravidelně například při každodenním používání přístroje promývejte barvicí prostor jednou týdně. Viz příbalový leták s návodem k použití. Zásobní i pracovní roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách. Stabilní jsou do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky promývacího roztoku. Pracovní promývací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace

6 POTŘEBNÉ VYBAVENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ 1. HYDRASYS Systém SEBIA, kat. č s OPTION FOCUSING HYDRASYS SEBIA, kat. č nebo HYDRASYS FOCUSING System SEBIA, kat. č nebo 2. HYDRASYS Systém SEBIA, kat. č. 1200, kat. č s OPTION FOCUSING HYDRASYS SEBIA, kat. č nebo HYDRASYS FOCUSING System SEBIA, kat. č. 1202, kat. č Manuální nebo automatizovaný mikropipetor například HYDRAPLUS SEBIA, kat. č nebo HYDRAPLUS 2 SEBIA, kat. č pro alternativní plnění vzorkových aplikátorů nebo segmentů antisér. 4. Vlhká Zásobní Komora, kat. č. 1270, dodávána se systémem HYDRASYS. 5. Vodicí tyčka šablony dodávaná se systémem HYDRASYS SEBIA. 6. Dynamická maska, SEBIA, kat. č Pomocná sada pro HYDRASYS A1AT ISOFOCUSING SEBIA, kat. č obsahuje reagenční aplikační masku ENZ 4 ml a jednožlábkový držák segmentů, který je potřebné pro tuto metodu. 8. Destička s 18 jamkami s antisérovými segmenty (10 jednotek), SEBIA, kat. č. 4398, pro antisérové aplikace (podle zvoleného postupu, viz odstavec "POSTUP Č. 1, NASTAVENÍ IMUNOFIXACE"). 9. Souprava nádob dodávaná se systémem HYDRASYS. 10. Pipety : 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1 ml a 5 ml (nebo značené pipety / pipetory : µl, µl a 1-10 ml). VZORKY PRO ANALÝZU Odběr a skladování vzorků Pro analýzu je třeba používat čerstvé vzorky séra. Vzorky séra musí být odebírány v souladu se zavedenými postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. Vzorky mohou být uskladněny v tmavé lahvi a v chladničce (2 až 8 C) až dva týdny. VAROVÁNÍ : Vzorky séra by měly být považovány za biologicky nebezpečné a proto je třeba dodržovat standardní laboratorní zásady a postupy bezpečného zacházení. vzorků Zřeďte vzorky séra 10x pomocí ředicího roztoku na vzorky. POSTUP Systém HYDRASYS je poloautomatický víceparametrový přístroj. Automatizované kroky zahrnují zpracování agarosových gelů HYDRAGEL v následujícím pořadí : nanesení vzorku, isolelektrická zaostřovací migrace, inkubace s enzymem označeným antisérem, inkubace pomocí enzymového substrátu, zastavení enyzmatické reakce, odsátí, vysušení, omytí a konečné vysušení gelu. Manuální kroky zahrnují manipulaci se vzorky a gely, nanesení reagentů a nastavení přístroje k činnosti. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE UŽIVATELSKÝ NÁVOD K PŘÍSTROJI HYDRASYS / HYDRASYS 2. DŮLEŽITÉ : Zkontrolujte, zda je dynamická maska správně umístěna a zda jsou perfektně vyrovnány elektroforetické profily a jamky masky. I. NASTAVENÍ MIGRACE 1. Zapněte přístroj HYDRASYS 2. Pro dosažení vysokého napětí potřebného pro isoelektrickou fokusaci stiskněte zelený spínač vysokého napětí pro zapnutí vysokonapěťového režimu. Spínač zčervená. POZNÁMKA : Vysokonapěťový spínač zobrazuje informace o migraci. Během migrace jsou zobrazeny hodnoty volt. hodiny (Vh) a proudu (ma). Při stisknutí během migrace se zobrazí hodnoty napětí (V) a výkonu (W). Při opakovaném stisknutí se na displeji opět zobrazí hodnoty Vh a ma. Když je HYDRASYS ve vysokonapěťovém režimu, je na displeji zobrazena skutečná hodnota proudu a jedna z deseti dalších hodnot, například napětí, volt. hodiny a výkon. 3. Umístěte jeden aplikátor na rovný povrch s čísly jamek vpravo nahoře. 4. Naneste 10 µl vzorku séra zředěného 10x (ředicím roztokem na vzorek) do každé jamky aplikátoru (Obr. 1). Aplikátor naplňte do 2 minut. - Vložte aplikátory do vlhké zásobní komory zoubky směrem nahoru (při vkládání je uchopte za ochranný plastový rámeček) ; - nechejte vzorky difundovat do zoubků po dobu 5 minut od nanesení posledního vzorku. Další informace jsou uvedeny v příbalovém letáku pro vlhkou komoru. 5. Otevřete víko migračního modulu a zvedněte nahoru migrační rámeček s elektrodami a nosičem aplikátorů. VAROVÁNÍ : Nikdy nezavírejte víčko, pokud jsou držáky zdviženy! 6. Z nabídky přístroje (levá strana klávesnice) vyberte program migrace "A1AT FOCUSING". 7. Připravte elektrodové proužky s katodickým a anodickým roztokem. Viz bod 4 v DODÁVANÁ ČINIDLA A MATERIÁLY. 8. Vyjměte proužky z anodické a katodické nádoby. Přitom je držte za plastové konce. Na zdviženém nosiči je děrovanými konci plastikového vyztužení upevněte na kovové výstupky elektrodového nosiče, přičemž musí plastikové vyztužení proužků směřovat k nosiči (Obr. 2). Červený anodický proužek je na dně (anoda), bezbarvý katodický proužek je nahoře (katoda). 9. Vybalte desku s agarosovým gelem HYDRAGEL. 10. Položte plastovou stranu dolů na látku nebo filtrační papír, abyste odstranili kapky vody. 11. Odsajte přebytečnou kapalinu tak, že na povrch gelu rychle a rovnoměrně narolujete filtrační papír. Papír ihned odstraňte. VAROVÁNÍ : Neponechávejte filtrační papír delší dobu na povrchu, mohlo by dojít k dehydrataci gelu. 12. Naneste pás 300 µl etylenglykolu (EG) do dolní třetiny rámu vyraženého na destičce pro sledování teploty migračního modulu. 13. Opřete gelovou desku (gelem nahoru) dolním okrajem o zarážku na spodní části vyznačeného rámečku na migrační ploše (Obr. 3). Ohněte gel a položte jej pomalu dolů na pás EG. Ověřte, zda nedošlo k zachycení vzduchových bublin, že je EG rozprostřen po celém povrchu gelové desky a že je gel vyrovnán s vyznačeným rámečkem. 14. Sklopte oba držáky dolů. V této pozici se pufrované proužky nedotýkají gelu. NESTLAČUJTE DRŽÁKY AŽ DOLŮ

7 15. Vyjměte aplikátor z vlhké komory. Uchopte jej při tom za ochranný rámeček. - Odlomte ochranný rámeček chránící zuby aplikátoru. - Položte aplikátor do polohy č. 1 na rámečku. DŮLEŽITÉ : Čísla vyznačená na aplikátorech musí směřovat k operátorovi (Obr. 4). 16. Uzavřete víko migračního modulu. 17. Ihned zahajte proces stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice. DŮLEŽITÉ : Zkontrolujte, zda není blokován otvor vzduchové ventilace na pravé straně přístroje. HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING /01 MIGRACE - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Oba nosiče jsou sklopeny a proužky s pufrem i aplikátory jsou v kontaktu s povrchem gelu. Probíhá aplikace vzorků do gelu. Migrace se provádí při napětí 400 V, dokud není naakumulováno 360 Vh a při 1500 V do akumulace 150 Vh (konečná hodnota 510 Vh) při 20 C. Migrace je řízena Peltierovým efektem (přibližně jednu hodinu). Po zvednutí nosiče elektrod se elektrody odpojí. Ozve se pípnutí a víko se odjistí. Signál zní do zásahu obsluhy. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "e AS" / "e ANTISERA" signalizující nutnost nanesení antiséra. POZNÁMKA : Víko migračního modulu zůstává během migrace zavřené. Imunofixační krok může být proveden pomocí jednoho ze dvou postupů : Postup č. 1 nebo postup č. 2. POSTUP Č. 1 II. NASTAVENÍ IMUNOFIXACE POZNÁMKA : V tomto postupu může být imunofixace provedena výběrem se dvěma typy antisérových segmentů : - s jednožlábkovým antisérovým segmentem (dodávaným v sadě HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING) nebo, - s 18jamkovým antisérovým segmentem (není dodáváno v sadě, viz odstavec POTŘEBNÉ VYBAVENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ). Několik minut před koncem migrace sestavte dynamickou masku, která obsahuje antisérový segment, držák segmentu a rámeček dynamické masky (viz Obr. 5). 1. Položte rámeček dynamické masky na rovný povrch. 2. Vložte antisérový segment do držáku (viz Obr. 6). - Antisérový segment nakloněný v úhlu 45 vtlačte proti plastikovým pružinkám do držáku. - Zatáhněte za segment a otočte jej, dokud nezapadne do zářezů na držáku segmentů. VAROVÁNÍ : Ujistěte se, že jsou segmenty správně umístěny na držáku. Výstupky na konci segmentu musí být upevněny v zářezech držáku. 3. Vložte držák se segmentem do rámečku dynamické masky (viz Obr. 7). 4. Naneste antisérum : Jednožlábkový antisérový segment (dodávaný v sadě HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING). Naneste 20 µl/jamku antiséra anti-a1at - PER, v předchozím kroku zředěném, do každé jamky segmentu. Při pipetování se vyvarujte nasátí bublin do špičky pipety. Antisérový segment s 18 jamkami (není součástí sady) : Naneste 16 µl/jamku antiséra anti-a1at - PER, v předchozím kroku zředěném, do každé jamky segmentu. Při pipetování se vyvarujte nasátí bublin do špičky pipety. 5. Naneste činidlo (viz Obr. 8) : - Přidržte pipetu šikmo a položte špičku lehce na okraj jamky. - Vstříkněte objem činidla do jamky bez doteku se dnem jamky. III. IMUNOFIXACE (POSTUP Č. 1) 1. Po skončení migrace otevřete víko (zpráva přestane blikat). 2. Vyjměte a zneškodněte aplikátor vzorku. 3. Zdvihněte oba nosiče, vyjměte pufrované proužky za plastové konce a zneškodněte. 4. Vyjměte oba nosiče. 5. Očistěte elektrody opatrným otřením vlhkou látkou. 6. Gel ponechejte na místě v migračním modulu. 7. Připravte dynamickou masku pro aplikaci antiséra následujícím postupem (viz Obr. 9) : - Umístěte vodicí kovovou tyčku dynamické masky na ukotvující trny (může být ponechána v migračním modulu po celou dobu). - Uchopte dynamickou masku a položte ji na vodicí tyčku, přičemž zářezy jsou vyrovnané se značkami. - Sklopte dynamickou masku na desku HYDRASYS. - Ujistěte se, že je držák segmentu v nejnižším bodu vodicího rámečku dynamické masky, směrem k operátorovi. Uchopte držák segmentu za úchytku na pravé straně a zatlačte prstem druhé ruky na centrální tlakový bod tak, aby se antisérový segment dostal do kontaktu s gelem. Uvolněte tlak ; reagent se rozptýlí po celém segmentu (viz Obr. 10). - Nyní, za použití úchytky držáku segmentu, pohybujte segmentem pomalu, ale plynule nahoru a dolů po celé délce gelu, aby došlo k rovnoměrné aplikaci činidla. Opakujte tento krok dvakrát. Aplikace by měla trvat přibližně 5 sekund pro každý průchod (viz Obr. 11). Během tohoto kroku držte masku pouze za úchytku držáku segmentu pro nanášení antisér. Nedotýkejte se vodícího rámečku. 8. Ponechte dynamickou masku v komoře HYDRASYS s antisérovým segmentem v nejnižším bodě vodícího rámečku masky. 9. Uzavřete víko migračního modulu. 10. Ihned zahajte proces inkubace stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "[INCUBATION]". nebo

8 POSTUP Č. 2 II. NASTAVENÍ IMUNOFIXACE Několik minut před koncem migrace sestavte dynamickou masku, která obsahuje antisérový segment, držák segmentu a rámeček dynamické masky (viz Obr. 5). 1. Položte rámeček dynamické masky na rovný povrch. 2. Vložte antisérový segment do držáku (viz obr. 6) : - Antisérový segment nakloněný v úhlu 45 vtlačte proti plastikovým pružinkám do držáku. - Zatáhněte za segment a otočte jej, dokud nezapadne do zářezů na držáků segmentů. VAROVÁNÍ : Ujistěte se, že jsou segmenty správně umístěny na držáku. výstupky na konci segmentu musí být upevněny v zářezech držáku. 3. Vložte držák se segmentem do rámečku dynamické masky (viz Obr. 7). III. IMUNOFIXACE (POSTUP Č. 2) 1. Po skončení migrace otevřete víko (zpráva přestane blikat). 2. Vyjměte a zneškodněte aplikátor vzorku. 3. Zdvihněte oba nosiče, vyjměte pufrované proužky za plastové konce a zneškodněte. 4. Vyjměte oba nosiče. 5. Očistěte elektrody opatrným otřením vlhkou látkou. 6. Gel ponechejte na místě v migračním modulu. 7. Připravte dynamickou masku pro aplikaci antiséra následujícím postupem (viz Obr. 9) : - Umístěte vodicí kovovou tyčku dynamické masky na ukotvující trny (může být ponechána v migračním modulu po celou dobu). - Uchopte dynamickou masku a položte ji na vodicí tyčku, přičemž zářezy jsou vyrovnané se značkami. - Sklopte dynamickou masku na desku HYDRASYS. - Ujistěte se, že je držák segmentu v nejnižším bodu vodicího rámečku dynamické masky, směrem k operátorovi. 8. Naneste jednorázově 300 µl/jamku antiséra anti-a1at - PER, v předchozím kroku zředěném, do každé jamky segmentu a na gel přes prostřední jamku (jamka č. 8). Při pipetování se vyvarujte nasátí bublin do špičky pipety. DŮLEŽITÉ : Pro tento krok použijte špičku pipety 1 ml a kontrolujte, aby špička pipety nezapadla do jamky segmentu. 9. Nanesení činidel (viz Obr. 8) : - Držte pipetu rovně a lehce opřete špičku pipety o dno jamky (na segment netlačte). - Opatrně a postupně vstřikujte antisérum během přibližně 5 sekund. Činidlo se rozšíří po celém segmentu. - Pokud je to nutné, stiskněte středový bod tak, aby se antisérum dostalo do rovnoměrného kontaktu s gelem. 10. Nyní, za použití úchytky držáku segmentu, pohybujte segmentem pomalu, ale plynule nahoru a dolů po celé délce gelu, aby došlo k rovnoměrné aplikaci činidel. Opakujte tento krok dvakrát. Aplikace by měla trvat přibližně 5 sekund pro každý průchod (viz Obr. 11). Během tohoto kroku držte masku pouze za úchytku držáku segmentu pro nanášení antisér. Nedotýkejte se vodicího rámečku. 11. Ponechte dynamickou masku v komoře HYDRASYS s antisérovým segmentem v nejnižším bodě vodicího rámečku masky. 12. Uzavřete víko migračního modulu. 13. Ihned zahajte proces inkubace stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "[INCUBATION]". IMUNOFIXACE - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Inkubace řízená Peltierovým efektem trvá 10 minut při 20 C. Ozve se pípnutí a odjistí se víko migračního modulu. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "e PAP." / "e THICK FILTER PAPER". POZNÁMKA : Víko migračního modulu zůstává během inkubace zajištěné. IV. ODSÁTÍ GELU 1. Otevřete víko migračního modulu. 2. Vyjměte sestavu dynamické masky : - Vyjměte držák segmentu za úchyt ; - Vyjměte antisérový segment z držáku a zneškodněte jej. VAROVÁNÍ : Se segmeny s antisérem musí být zacházeno opatrně. 3. Položte na gel silný filtrační papír hladkou stranou dolů : - Skloňte filtrační papír v úhlu přibližně Vyrovnejte dolní stranu filtračního papíru s okrajem gelu. - Položte filtrační papír na gel. DŮLEŽITÉ : Pevně přitlačte na celý povrch filtračního papíru k zajištění jeho dokonalého přilnutí ke gelu. 4. Uzavřete víko migračního modulu. 5. Zahajte postup vysoušení stisknutím tlačítka "START" (označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice). ODSÁTÍ - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Odsátí při 20 C trvá 3 minuty a je řízeno Peltierovým efektem. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "[BLOTTING]". Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "a PAP. + e REHYD1" / "a THICK FILTER PAPER, e REHYDRATING 1" signalizuje nutnost odstranit filtrační papír a nanést první rehydratační roztok. V. REHYDRATACE GELU 1. Otevřete víko migračního modulu. 2. Odstraňte filtrační papír a gel ponechte na desce migračního modulu. 3. Připravte masku pro aplikaci činidel ENZ 4 ml (viz Obr. 12). 4. Naneste 7 ml rehydratačního roztoku skrz otvor v šabloně (viz Obr. 13)

9 5. Při pipetování rehydratačního roztoku se vyvarujte nasátí bublin do špičky pipety. Zkontrolujte, že je roztok rovnoměrně rozprostřen v obdélníkovém prostoru pod šablonou. Pipetu držte kolmo. Lehce zatlačte špičku pipety do otvoru šablony. Opatrně a postupně vstříkněte roztok pod šablonu, aniž by došlo ke vniknutí vzduchu. 6. Uzavřete víko migračního modulu. 7. Ihned zahajte proces inkubace stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice. REHYDRATACE GELU - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Peltierovým efektem řízená inkubace trvá 5 minut při 20 C. Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "a REHYD1 + e PAP." / "a REHYDRATING 1, e THICK FILTER PAPER", která signalizuje nutnost odstranit první rehydratační roztok odpipetováním nadbytečného množství kapaliny a pomocí silného filtračního papíru. VI. ODSTRANĚNÍ REHYDRATAČNÍHO ROZTOKU 1. Otevřete víko migračního modulu. 2. Odstraňte rehydratační roztok. 3. Držte pipetu svisle a lehce přitlačte špičku pipety do jamky (viz Obr. 13). 4. Opatrně a progresivně vypusťte činidlo. 5. Uchopte aplikační masku na činidla za výstupek, zdvihněte a odstraňte. Oblast gelu musí být rehydratována. VII.ODSÁTÍ GELU 1. Položte na gel silný filtrační papír, jak je popsáno v odstavci IV (hladkou stranou dolů na gel). 2. Celý povrch filtračního papíru pevně přitlačte ke gelu pro zajištění jeho dokonalého přilnutí. 3. Uzavřete víko migračního modulu. 4. Zahajte postup vysoušení stisknutím tlačítka "START" (označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice). ODSÁTÍ - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Odsátí při 20 C trvá 3 minuty a je řízeno Peltierovým efektem Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "a PAP. + e REHYD2" / "a THICK FILTER PAPER, e REHYDRATING 2", která signalizuje nutnost odstranit filtrační papír a nanést druhý rehydratační roztok. VIII. REHYDRATACE GELU 1. Otevřete víko migračního modulu. 2. Odstraňte filtrační papír a gel ponechte na desce migračního modulu. 3. Připravte masku pro aplikaci činidel ENZ 4 ml (viz Obr. 12). 4. Otvorem v šabloně naneste 7 ml rehydratačního roztoku (viz Obr. 13). 5. Při pipetování rehydratačního roztoku se vyvarujte nasátí bublin do špičky pipety. Zkontrolujte, že je roztok rovnoměrně rozprostřen v obdélníkovém prostoru pod šablonou. Pipetu držte kolmo. Lehce zatlačte špičku pipety do otvoru šablony. Opatrně a postupně vstříkněte roztok pod šablonu, aniž by došlo ke vniknutí vzduchu. 6. Uzavřete víko migračního modulu. 7. Ihned zahajte proces inkubace stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice. REHYDRATACE GELU POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Inkubace řízená Peltierovým efektem trvá 5 minut při 20 C. Po uplynutí doby první inkubace zazní pípnutí a na displeji se zobrazí blikající zpráva : "a REHYD2 + e TTF3" / "a REHYDRATING 2, e TTF3", která signalizuje nutnost odstranit rehydratační roztok a nanést vizualizační roztok. IX. ODSTRANĚNÍ REHYDRATAČNÍHO ROZTOKU 1. Otevřete víko migračního modulu. 2. Odstraňte rehydratační roztok, jak bylo popsáno výše v odstavci VI. 3. Šablonu nechte na místě. X. VIZUALIZACE 1. Naneste 3.5 ml vizualizačního roztoku TTF3 připraveného těsně před použitím do prostoru pod šablonu. Dodržujte stejné zásady, jako jsou popsané výše. 2. Při pipetování vizualizačního roztoku TTF3 se vyvarujte nasátí bublin do špičky pipety. Zkontrolujte, že je roztok pod šablonou rovnoměrně rozprostřen v obdélníkovém prostoru se středem v otvoru šablony. 3. Uzavřete víko migračního modulu. 4. Ihned zahajte proces inkubace stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice. INKUBACE - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Inkubace řízená Peltierovým efektem trvá 10 minut při 30 C. Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "a TTF3 + e PAP." / "a TTF3, e THICK FILTER PAPER", která signalizuje nutnost odstranit vizualizační roztok a nanést jeden silný filtrační papír. XI. ODSTRANĚNÍ VIZUALIZAČNÍHO ROZTOKU 1. Otevřete víko migračního modulu. 2. Odstraňte vizualizační roztok, jak bylo popsáno výše v odstavci VI. 3. Uchopte aplikační masku na činidla za výstupek, zdvihněte a odstraňte

10 XII.ODSÁTÍ GELU HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING /01 1. Položte na gel silný filtrační papír, jak je popsáno v odstavci IV (hladkou stranou dolů na gel). 2. Celý povrch filtračního papíru pevně přitlačte ke gelu k zajištění jeho dokonalého přilnutí. 3. Uzavřete víko migračního modulu. 4. Zahajte postup vysoušení stisknutím tlačítka "START" (označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice). 5. Opláchněte šablonu destilovanou vodou a důkladně ji vysušte měkkým absorpčním papírem. Před opakovaným použitím zkontrolujte, že je šablona zcela suchá a odstraňte kapky z jamek poklepáním na měkkém papíru. POZNÁMKA : Po vizualizačním kroku s TTF3 je možné pro očištění aplikační šablony ENZ 4 ml použít alkohol. ODSÁTÍ - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Odsátí trvá 3 minuty při 30 C a je řízeno Peltierovým efektem. Zazní pípnutí. Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "a PAP." / "a THICK FILTER PAPER", která signalizuje nutnost odstranit filtrační papír. XIII. VYSUŠENÍ GELU 1. Otevřete víko migračního modulu. 2. Odstraňte filtrační papír a gel ponechte na místě. 3. Zavřete kryt HYDRASYSU. 4. Zahajte krok vysoušení stisknutím tlačítka "START" (označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice). Na displeji se zobrazí blikající zpráva : "[DRYING]". VYSUŠENÍ - POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Gel vysušujte při 50 C po dobu 3 minut. Ozve se pípnutí signalizující nutnost otevření víka. Otevřete víko. Vyjměte vysušený gel. POZNÁMKY : - Teplota desky se sníží na 20 C za méně než 5 minut. Když je dosažena teplota 20 C, je možné zahájit novou migraci. - Položte aplikátor vzorků a nosič elektrod zpět na místo. - Otřete migrační plochu jemnou vlhkou látkou. XIV. OMYTÍ A KONEČNÉ ZPRACOVÁNÍ GELU Po vysušení se gel omyje v barvicím prostoru pomocí programu "WASH ISOENZ/GEL". Pokud byl tento prostor použit k barvení gelu, vyčistěte jej pomocí programu "WASH CHAMBER". 1. Otevřete držák gelu. Položte jej na rovnou plochu a gel umístěte (gelovou stranou vzhůru) do žlábků obou tyček a držák uzavřete. Ujistěte se, že gel je uvnitř držáku správně umístěn (viz Obr. 14). 2. Držák gelu vložte do modulu pro vyvíjení a barvení gelu. DŮLEŽITÉ : Před spuštěním programu pro vyvíjení / barvení zkontrolujte následující : - zda nádoba na odbarvovací roztok obsahuje nejméně 400 ml odbarvovacího roztoku ; - zda je nádoba na odpad prázdná. 3. Připojení vedení činidel : viz informace zobrazené na obrazovce přístroje (vyberte klávesu : REAGENT LINES). DŮLEŽITÉ : Nezapomeňte uzavřít nepoužité přívody. 4. Z menu přístroje vyberte promývací program "WASH ISOENZ/GEL" a spusťte program stisknutím tlačítka "START" (označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice). Během promývání, odbarvování a sušení je tento prostor uzamčen. Po ochlazení se odjistí víko migračního modulu (větrání zůstane zapnuté až do vyjmutí držáku gelu). 5. Vyjměte držák gelu z modulu, otevřete úchytky a vyjměte vysušený gel. Je-li zapotřebí, očistěte zadní stranu (plastovou nosnou stranu) vysušeného filmu vlhkým jemným papírem. Gel je připraven pro vyhodnocení. KONTROLA KVALITY Doporučuje se do každé řady analýzy zařadit normální vzorek nebo testovaný vzorek séra obsahují isoformy alfa-1 antitrypsinu (například A1AT Controls, SEBIA, kat. č. 4771). POZNÁMKA : Kontrolní roztok A1AT se prodává samostatně. VAROVÁNÍ : Kontrolní roztok A1AT, SEBIA, kat. č. 4771, by měl být používán pro kontrolu kvality dokazující 3 odpovídající fenotypy, jak je uvedeno v příbalovém letáku kontrolního roztoku A1AT. Kontrolní roztok A1AT je navržen jako prostředek pro kontrolu migrace isoformních vzorů A1AT pomocí postupu HYDRAGEL

11 VÝSLEDKY Očekávané hodnoty Následující tabulka znázorňuje pro informaci fenotypy A1AT a koncentrace (15). A1AT fenotyp Koncentrace A1AT (mg/dl) MM MS SS MZ SZ ZZ Nulový / Nulový 0 Interpretace Fenotypizace se používá společně s klinickými nálezy a dalšími laboratorními vyšetřeními. Zahrnuje kvantifikační a funkční aktivitu (10) při určování deficience A1AT. Interpretace je kvalitativní : Cílem této techniky je charakterizovat různé A1AT fenotypy podle pozice samostatných frakcí isoforem (7). Pomocí isoelektrické fokusace lze dosáhnout isoelektroforetického rozdělení 8 isoformních proužků alely M : Hlavní frakce jsou na pozici č. 4 a 5 a používají se jako "markery" pro fenotypizaci A1AT (viz VZORY MIGRACE). Do současné doby bylo identifikováno více než 75 variant A1AT. Jsou klasifikovány v abecedním pořadí podle jejich elektroforetické mobility, nejrychlejší a kyselé varianty jsou klasifikovány písmeny od A do K, nejpomalejší a zásadité jsou klasifikovány písmeny N až Z (2, 4, 6). U osob s vážnou deficiencí A1AT je fenotyp ZZ spojen s variantou, která migruje k nejvyššímu isoelektrickému bodu. POZNÁMKA : Frakce na pozicích č. 7 a 8 fenotypu Z nemusí být na elektroforetickém záznamu isoforem A1AT viditelné, vzhledem k nízké koncentraci A1AT nebo slabé denaturaci. Charakterizaci fenotypu Z potom umožňují frakce v pozicích 2, 4 a 6. Jsou popsány dvě hlavní poruchy (14) : - Onemocnění jater u dětí ve spojení s chronickou hepatitidou a klinické diagnostikovanými anomáliemi jater. Představuje predispozici k cirhóze u dětí, která může vést k transplantaci jater (8). - Plicní onemocnění je spojeno s emyfysemií u pacientů mladších než jsou osoby bez A1AT deficience. Souvisí s nevyrovnanou aktivitou proteasy / antiprosteasy. A1AT je antiproteasa s antielastasovou aktivitou. Její hlavní funkcí je ochrana pojivové tkáně v plicích proti proteolytickému poškození neutrofilní elastasou syntetizovanou polynukleárními neutrofilními buňkami ; deficience A1AT výsledků vede k destrukci této pojivé tkáně (12). Riziko emfysemie se zvyšuje u pacientů-kuřáků a úroveň plicního onemocnění se může lišit. Doporučuje se používat doplňkové techniky, jako je genotypizace, například pro identifikaci fenotypů alfa-1 antitrypsinu detekovaných, ale necharakterizovaných postupem HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING a rovněž fenotyp "Nulový / Nulový" (13, 14). Interference a Omezení Nebylo zjištěno žádné rušení postupu HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING v důsledku vysoké koncentrace cholesterolu ( 6.9 mmol/l), triglyceridy ( 8.0 mmol/l), bilirubin ( 20 mg/dl) a hemoglobin ( 0.35 g/dl) ve vzorku. Náhradní léčba A1AT může změnit fenotyp pacienta. Tento jev pozorovali Snyder et al. (Clin. Chem., 2006). jiného antiséra, než je součástí sady HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING, může ovlivnit výsledky. Vzhledem k omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy je možné, že některé isoformy alfa-1 antitrypsinu nebudou touto metodou detekovány. Odstraňování problémů Pokud při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku testy nevycházejí, kontaktujte technickou podporu svého dodavatele. Bezpečnostní listy pro činidla a informace o zneškodňování odpadu jsou rovněž k dispozici prostřednictvím technické podpory dodavatele. ÚDAJE O VÝKONU Byly použity standardní materiály, příprava vzorku a postupy. Všechny elektroforegramy byly vyhodnoceny vizuálně. Po vizuálním prozkoumání elektroforegramů nebyly zjištěny rozdíly v opakovaném stanovení. Byla dosažena dobrá reprodukovatelnost mezi gely a na gelu (přesnost). Reprodukovatelnost v rámci gelu Reprodukovatelnost na gelu byla prokázána na 2 vzorcích séra (fenotypy M1 a M1M2) a na 6 patologických vzorcích séra s různými fenotypy alfa-1 antitrypsinu (fenotypy MS, SS, SZ, MZ, ZZ a MX) pomocí postupu HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING na gelech ze stejné šarže. Každý vzorek byl analyzován v 15 nebo 18 stopách jednoho gelu. Všechna opakovaná stanovení vedla ke shodným výsledkům v rámci gelu a vzory odpovídaly typu každého testovaného vzorku. Postupem HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING byly správně učeny různé isoformy odpovídající každému fenotypu pomocí imunofixace každého z 8 analyzovaných vzorků a na každém gelu. Nebyly zjištěny falešně pozitivní výsledky a nebyly zjištěny rozdíly mezi opakovanými pokusy. V normálních vzorcích nebyl zjištěn žádný abnormální fenotyp. Reprodukovatelnost mezi gely a specificita Reprodukovatelnost mezi gely byla prokázána na 7 normálních sérových vzorcích, 8 patologických vzorcích séra s různými fenotypy alfa-1 antitrypsinu a na 3 kontrolních vzorcích A1AT s MM fenotypem (normální kontrolní vzorek) a MZ a SZ fenotypy (patologické kontrolní vzorky). Tyto vzorky byly analyzovány 12krát na gelech ze 2 různých šarží pomocí postupu HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING. Všechna opakovaná stanovení vedla ke shodným výsledkům mezi gely a mezi šaržemi a vzory odpovídaly typu každého testovaného vzorku. Postupem HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING byly správně učeny různé isoformy odpovídající každému fenotypu pomocí imunofixace každého z 18 analyzovaných vzorků a na každém gelu. Nebyly zjištěny falešně pozitivní výsledky a nebyly zjištěny rozdíly mezi opakovanými pokusy. V normálních vzorcích nebyl zjištěn žádný abnormální fenotyp

12 Citlivost Postupným ředěním byly připraveny homozygotní ZZ fenotypové sérové vzorky s koncentrací alfa-1 antitrypsinu 27 mg/dl a analyzovány postupem HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING. Minimální limit detekce isoformy alfa-1 antitrypsinu byl okolo 5 mg/dl. Studie shody Studie shodnosti byla prováděna na 68 vzorcích séra mezi HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING a polyakrylamidovým gelovým systémem pro fenotypizaci alfa-1 antitrypsinu isoelektrickou fokusací : Oběma metodami bylo analyzováno 23 normálních a 45 různých patologických vzorků séra. Celkové koncentrace alfa-1 antitrypsinu se pohybovala od 16 do 235 mg/dl. Studie prokázala 100 % shodu mezi oběma technikami. 23 normálních vzorků séra : naprostá shoda. 45 patologických vzorků séra : naprostá shoda. U všech analyzovaných patologických vzorků séra byly výsledky získané jednotlivými postupy ve shodě a různé fenotypy byly charakterizovány ve všech patologických vzorcích v každém systému. Výše uvedená data mohou být sumarizována v následující tabulce pro diagnostické charakteristiky nového zařízení. Sada HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING Diagnostika Pozitivní Neprůkazná* Negativní** Celkem Pozitivní 39 2*** 41 Neprůkazná* 4 Negativní Celkem * Neprůkazné vzorky byly ze studie vyřazeny (představují jiné fenotypy než MM, MZ, MS, ZZ, SS a SZ). ** Patologie nesouvisí s diagnostikou jaterního nebo plicního onemocnění. *** Dva (2) ze 41 pacientů, kteří byli testováni jako pozitivní na A1AT poruchu pomocí sady HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING nevykazovali žádné klinické známky onemocnění (jaterního nebo plicního). Jeden z těchto dvou pacientů byl klasifikován jako fenotyp MZ (s neplodností páru, jako jedinou známou klinickou informací). Druhý pacient měl fenotyp MS s panniculitidou (dermatologické onemocnění) jako jedinou známou diagnózou. Protože je možné mít abnormální fenotyp bez doprovodných klinických příznaků, předpokládá se, že tito pacienti jsou nositelé tohoto rysu. Pro 4 ekvivokální a tyto 2 negativní vzorky byl fenotyp získaný postupem HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING stejný, jako fenotyp získaný pomocí výše uvedeného zařízení. Citlivost (1) = 39 / 39 = 100 % Specificita (1) = 23 / 25 = 92 % Celková procentní shoda (1) = 62 / 64 = 97 % (1) Vypočítané hodnoty zahrnují nosiče abnormálního fenotypu A1AT bez projevených klinických symptomů Při vyloučení těchto nosičů z analýzy je specificita a celková procentní shoda 100 %. POZNÁMKA : Pomocí HYDRAGEL 18 A1AT ISOFOCUSING, Negativní = normální M A1AT fenotyp a Positivní = abnormální A1AT fenotyp (jiný než MM fenotyp)

13 BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY 1. Bienvenu J. Les protéines de la réaction inflammatoire. Définition, physiologie et méthodes de dosage. Ann. Biol. Clin., 1984, 42 : Cox DW, Johnson AM, Fagerhol MK. Report of nomenclature meeting for α1-antitrypsin. Am. J. Hum. Genet., 1980, 32 : Engler R. Protéines de la réaction inflammatoire. Fonctions régulatrices. Ann. Biol. Clin., 1988, 46 : Fagerhol MK, Laurell CB. The polymorphism of "prealbumins" and alpha-1-antitrypsin in human sera. Clin. Chim. Acta, 1967, 16 : Fagerhol MK. Quantitative studies on the inherited variant of serum alpha-1-antitrypsin. Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1969, 23 : International Alpha-1-Antitrypsin Pi System Workshop. Lancet, 1975, 1 : Jeppsson JO, Franzen B. Typing of genetic variants of alpha 1-antitrypsin by electrofocusing. Clin. Chem., 1982, 28 : Johnson AM, Alper CA. Deficiency of alpha 1-antitrypsin in childhood liver disease. Pediatrics, 1970, 46 : Keren DF. "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, MA, USA, 1994, 397 pp. 10. Mullins RE, Miller RL, Hunter RL, Bennett B. Standardized automated assay for functional alpha 1-antitrypsin. Clin. Chem., 1984, 30 : Romette J. Les marqueurs protéiques de l inflammation et de la dénutrition. Feuillets de Biologie, 1987, XXVIII, 156 : Silverman EK et al. Variability of pulmonary function in alpha 1-antitrypsin deficiency : Clinical correlation. Ann. Intern. Med., 1989, 111 : Snyder MR et al. Diagnosis of α-1-antitrypsin deficiency : An algorithm of quantification, genotyping and phenotyping. Clin. Chem., 2006, 52 : Stoller JK, Aboussouan LF. α1-antitrypsin deficiency. Lancet, 2005, 365 : Vidal et al. Guidelines for the diagnosis and management of α-1-antitrypsin deficiency. Arch. Bronconeumol., 2006, 42 (12) : Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. Impact-Internat, 1986, Sept :

14 SCHÉMAS / FIGURES Figure 1 Figure Figure 3 Figure sebia

15 SCHÉMAS / FIGURES Figure 5 Barrette antisérum Antiserum Segment Bossage (Boss) Ergot (Pin) Puits (wells) Support barrette Segment Holder Poignée (Flap) Encoche (notch) Point d'appui central (Central Pressure Point) Ressorts (Springs) Guide du masque dynamique Dynamic Mask Guide Poignée (Flap)

16 SCHÉMAS / FIGURES Figure 6 Figure Figure 8 Figure 9 GEL 9 CSF ISOFOCUSING 2 2' 3' 3'' 4 4' 5 5' 6 6' 7 7' 8 8' 9 9' Figure 10 Figure 11 DRAGEL 9 CSF ISOFOCUSING 1' 2 2' 3 3' 4 4' 5 5' 6 6' 7 7' 8 8' 9 9' DRAGEL 9 CSF ISOFOCUSING 1' 2 2' 3 3' 4 4' 5 5' 6 6' 7 7' 8 8' 9 9'

17 SCHÉMAS / FIGURES Figure 12 Figure 13 Figure 14 HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30 sebia HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30 sebia

18 SCHÉMAS / FIGURES PROFILS ÉLECTROPHORÉTIQUES - ELECTROPHORETIC PATTERNS Figure 15 Représentation schématique des allèles Pi M, Pi S et Pi Z après isoélectrofocalisation Schematic pattern of alleles Pi M, Pi S and Pi Z after isoelectric focusing M S Z