Název diplomové práce Možnosti ovlivnění výtěžnosti bioetanolu z kukuřice

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Název diplomové práce Možnosti ovlivnění výtěžnosti bioetanolu z kukuřice Vedoucí práce: Dr. Ing. Luděk Hřivna Vypracoval: Bc. Barbora Klenovská Brno 2010

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Možnosti ovlivnění výtěžnosti bioetanolu z kukuřice vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. Dne: 30. dubna 2010 Podpis:.

3 PODĚKOVÁNÍ Dovoluji si touto cestou poděkovat vedoucímu mé diplomové práce Dr. Ing. Luďkovi Hřivnovi za odborné vedení, ochotnou spolupráci a cenné rady při zpracování této diplomové práce. Dále bych chtěla poděkovat laborantkám ústavu technologie potravin za pomoc při zpracování vzorků a své rodině za podporu při studiu.

4 ABSTRAKT Tato diplomová práce se zabývá technologií výroby bioetanolu a možností ovlivnění výtěžnosti u použitých hybridů kukuřice. V teoretické části je popsána kukuřice jako surovina a technologický proces výroby bioetanolu. Výtěžnost bioetanolu je ovlivněna řadou faktorů, významnou roli hraje stanoviště a použitá agrotechnika. Vybrané hybridy kukuřice z portfolia firmy Monsanto byly pěstovány na třech lokalitách (Bečváry, Rostěnice a Slatiny). U vzorků zrna byl stanoven obsah škrobu, jeho kvalita a byly provedeny zkoušky na výtěžnost bioetanolu. Byl potvrzen vliv hybridu na výtěžnost bioetanolu. Klíčová slova: kukuřice, škrob, bioetanol ANNOTATION This graduation thesis looks into production of bioethanol and possibilities to influnce recovery factor of maize hybrids. The teorethical part of this work descibe maize as resouce and the technological process of bioethanol production. Gain of bioethanol is influneced by many factors, the main ones are locality and agricultural technology in use. Chosen maize hybrids from Monsanto corporation portfolio were planted in three location (Bečváry, Rostěnice a Slatiny). In sample of maize kernel was determined contend of starch and it s quality. Trials were made to determine gain of bioethanol. Influence of maize hybrids on gain of bioethanol was confirmed. Crucial words: maize, starch, bioetanol

5 OBSAH 1 ÚVOD 7 2 CÍL PRÁCE 9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED Suroviny kvasného průmyslu Suroviny cukernaté Škrobnaté suroviny Lignocelulosové suroviny Kukuřice (Zea mays L.) Botanické řazení kukuřice (KOPÁČOVÁ, 2007) Původ kukuřice Morfologie kukuřice Anatomická stavba kukuřičného zrna Obalové vrstvy Endosperm Klíček (embryo) Chemické složení zrna Sacharidy Škrob Bílkoviny Lipidy Minerální látky Vitamíny Convariety kukuřice Hybridy kukuřice Požadavky na pěstování a produkce kukuřice Bioetanol (energetický zdroj) a technologie výroby Ekologická hlediska Technologie výroby bioetanolu Příprava zápar (zcukřování) Tlakový způsob Beztlaký způsob Úprava suroviny Zapařování Enzymy Enzymy hydrolyzující škrob Kvašení Mikroorganismy Kvasinky Saccharomyces Kontaminace v lihovarských záparách Příprava zákvasu 35

6 Mechanismus lihového kvašení (fermentace) Průběh kvašení zápary Rozkvašování Hlavní kvašení Dokvašení Technologické metody lihového kvašení Destilace a rektifikace Rektifikace Rafinace Deflegmace Odvodňování lihu Odvodňování tuhými látkami Odvodňování pomocí kapalin Odvodňování destilací Odvodňování molekulárními síty Odvodňování pomocí membránových procesů Vedlejší produkty 44 4 MATERIÁL A METODIKA Stručná charakteristika hybridů kukuřice pěstovaných na lokalitách všech lokalitách Charakteristika jednotlivých lokalit a způsobu pěstování Stanovení množství etanolu kvasnou zkouškou Příprava sladké zápary Zjištění obsahu etanolu Amylografické stanovení škrobu Výsledky amylografického stanovení 53 5 VÝSLEDKY A DISKUZE Vyhodnocení výsledků v roce Lokalita Bečváry Lokalita Rostěnice Lokalita Slatiny Vyhodnocení výsledků pro rok Lokalita Bečváry Lokalita Rostěnice Lokalita Slatiny Statistické vyhodnocení dosažených výsledků 71 6 ZÁVĚR 77 7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY 79

7 1 ÚVOD Název líh nebo alkohol se vztahuje v hovorovém jazyce k nejčastěji se vyskytující sloučenině ze skupiny primárních alkoholů-k etanolu (EXNAR a kol., 1998). Vědomosti o etanolovém kvašení mají dávný původ. Již nejstarší civilizace znaly výrobu piva, vína a to již let před našim letopočtem. Objev, že alkohol je možno koncentrovat destilací, je připisován Egypťanům nebo Číňanům (HAMROVÁ, 1988). Líh byl určen k lékařským účelům. K nim byl užíván i u nás v 8. století a jeho prodej byl omezen na lékárny a lékaře. V druhé polovině 17. století bylo zjištěno, že etanolové kvašení je možné jen u cukerných surovin (DYR, 1956). V 18 století nastal rozmach výroby lihu a mnoho publikací se zabývalo kvašením a destilací lihu. Destilaci zdokonalil zejména Baumé, který sestrojil výkonné destilační zařízení již s vodním chladičem. O pokrok v destilační technice se nejvíce zasloužil Barbet, který zavedl nepřetržitou destilaci a destilační přístroje založené na jeho principu se používají dodnes. Rozvojem chemie a mikrobiologie se počátkem 19. století podařilo francouzskému badateli Gay-Lussacovi sestavit rovnici etanolového kvašení a zjistil i hmotnostní poměry složek této reakce. Biochemismem etanolového kvašení se zabýval L. Pasteur. Byly objeveny enzymy a objasněny biochemické pochody, jimiž vzniká etanol (HAMROVÁ, 1988). Tato sloučenina se dá vyrobit i syntetickým způsobem a to hydratací etylenu, ale častější se vyrábí kvasným způsobem. Na území České republiky vznikl první lihovar v 16. století, líh se vyráběl především z obilí, brambory jako surovina přišly v úvahu až koncem 18. století. Nyní se v řadě států využívá jako hlavní suroviny pro výrobu etanolu obiloviny. Pro zpracování obilí na etanol je nejdůležitější obsah bezdusíkatých zkvasitelných látek, tj. škrobu. Největší rozmach výroby etanolu nastal po první světové válce. V období před druhou světovou válkou se počet zemědělských lihovarů vyšplhal až na 900 a bylo vyrobeno kolem hl etanolu. Po roce 1948 došlo k drastickému poklesu výroby zemědělského lihu. V současné době, kdy se jedná o záchranu půdy ležící ladem, o snížení spotřeby fosilních paliv a tím i o snížení tvorby oxidu uhličitého z nich vznikajícího se přistupuje k budování moderního lihovarského průmyslu využívajícího škrobnaté suroviny. Ekonomická a ekologická kritéria stojí v popředí těchto projektů. Nejčastěji využívanou škrobnatou surovinou je kukuřice a žito. Kukuřice se pěstuje

8 hlavně v teplejších krajinách a je jednou z nejvýkonnějších rostlin co se týče hektarových výnosů (EXNAR a kol., 1998). Hrozící nedostatek ropy předpovídaný pro nadcházející desetiletí motivuje rozvoj obnovitelných zdrojů energie. V roce 2005 dosahovala celková celosvětová spotřeba ropy 81,1 mil. barelů denně a celkové známé rezervy činí mld. Barelů, tzn. Že by stávající zásoby stačily pro nadcházejících 40,6 let. Rostoucí podíl obnovitelných zdrojů energie je tedy nezbytný a naléhavý. Z celkové světové spotřeby ropy připadá 50 % na dopravu, a z toho tvoří ropa více než 95 % energetické poptávky (FOLTÝN, ZEDNÍČKOVÁ, 2008). Přídavek etanolu do benzínu se u nás objevuje již před druhou světovou válkou, tehdy se jednalo o povinné přídavky alkoholu do benzínu. V roce 1923 se přidávalo i 10 % alkoholu do nafty. Časté krize v těžebních oblastech a ve světovém obchodu s naftou a nakonec i s rozcházející se prognózou o světových zásobách nafty předurčili i politiku některých států v 70. a 80. letech, která se orientovala na jiné především obnovitelné zdroje energie (EXNAR a kol., 1998). Nyní je problematika výroby a využívání biopaliv z obnovitelných zdrojů energie ze zemědělských surovin aktuální. Brazílie patří dlouhodobě vedle USA k největším a ekonomicky nejvýznamnějším výrobcům bioetanolu a bionafty na světě (FOLTÝN, ZEDNÍČKOVÁ, 2008). 8

9 2 CÍL PRÁCE Cílem této diplomové práce bylo seznámit se s problematikou výroby bioetanolu. Stanovit možnosti využití hybridů kukuřice z portfolia firmy Monsanto pro výrobu bioetanolu 9

10 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Suroviny kvasného průmyslu Suroviny cukernaté Cukernaté suroviny jsou složeny z jednoduchých cukrů jako je glukosa, fruktosa, maltosa, sacharosa a jiné, jsou přímo zkvasitelné. Ze zemědělských surovin obsahující tyto cukry to jsou: cukrovka, polocukrovka a ovoce (MATHEWSON, 1980). Ze zemědělských zbytků se používají nejčastěji melasa řepná, třtinová i melasy citrusové ( PELIKÁN a kol., 2004) Škrobnaté suroviny Škrobnaté suroviny obsahují komplexní sacharidy, jako je škrob a inulin, které je nutné rozštěpit pomocí enzymů (ze sladu, bakteriálních nebo plísňových enzymů) na jednoduché sacharidy v procesu zvaném sladování. Nejvíce se využívají tyto škrobnaté suroviny: brambory, kukuřice, čirok, ječmen, pšenice, topinambury, maniok a další (METHEWSON, 1980). Obiloviny patří v zahraničí k velmi důležitým surovinám lihovarského průmyslu. Nejčastěji zpracovávanými obilninami jsou kukuřice, žito a pšenice. U nás se v důsledku zvýšené spotřeby lihu zpracovává měkká pšenice a námelové žito. Kukuřice přichází v úvahu jen velmi zřídka. Dále se zpracovává obilí havarované (samozáhřev), které nelze použít v jiných odvětvích. Ze zbytků potravinářského průmyslu se zpracovávají kalové škroby, jádrový škrob a z výroby brambor tzv. černý odpad ( PELIKÁN a kol., 2004). 10

11 3.1.3 Lignocelulosové suroviny Lignocelulosové suroviny se v posledních letech dostávají do popředí zájmu v mnoha průmyslově vyspělých zemích. U nás se zatím využívají pro výrobu krmných kvasnic pouze výluhy, vznikající při výrobě celulosy ( PELIKÁN a kol., 2004). Perspektivně se uvažuje o možnosti využití druhotných surovin ze zemědělství jako je (sláma), dřevo (štěpky, piliny), stonky kukuřice, bavlna atd. Tyto materiály jsou rozkládány pomocí enzymů (METHEWSON, 1980). V souvislosti se zpracováním a úpravou lignocelulosových materiálů byla vypracována řada technologií založených na chemických, fyzikálně-chemických a biochemických metodách ( PELIKÁN a kol., 2004). 3.2 Kukuřice (Zea mays L.) Botanické řazení kukuřice (KOPÁČOVÁ, 2007) - Čeleď: Lipnicovité (Poaceae) - Skupina: Kukuřicovité (Maydae) - Rod: Kukuřice (Zea) - Druh: Kukuřice setá (Zea mays) - Convarieta: koňský zub (identata, syn. dentiformis) obecná, tvrdá (induráta, syn. vulgaris) polozubovitá (aorista syn. semiindentata) pukancová (everta syn. microsperma) cukrová (saccharata) škrobnatá (amylacea) vosková (ceratina) 11

12 3.2.2 Původ kukuřice Kukuřice pochází ze Střední a Jižní Ameriky, kde ji pěstovali Aztékové, Mayové a Inkové. Její stáří se odhaduje na 5600 let. V současné době je rozšířena po celé zeměkouli. Do Evropy se dostala v průběhu 16. a 17. století. K nám ji údajně přivezli Rómové z Turecka a Rumunska v 17. století. Říkalo se jí turecká pšenice nebo turecké žito, z čehož pravděpodobně na Moravě zůstal krajový název turkyně (TICHÁ, VYZÍKOVÁ, 2006). Původně tropická rostlina se dnes pěstuje po celém světě a to i v regionech s mírným podnebím ( 2009). Kukuřice se u nás stala jednou z významnějších jednoletých pícnin (TICHÁ, VYZÍKOVÁ, 2006) Morfologie kukuřice Kukuřice je jednoděložná, jednoletá rostlina a její vegetační doba je jeden rok. Je to mohutná rostlina 1,5 až 2,5 m (ale i 3m) vysoká. Kořen kukuřice patří podle svého původu k primární nebo sekundární kořenové soustavě. Primární kořenová soustava tvoří kořeny, které se zakládají jíž v zárodku, sekundární soustava představuje kořeny, vznikající v přeslenech okolo bazálních uzlů. Význam primární kořenové soustavy je především v suchých letech, kdy se v důsledku přesychání povrchové vrstvy půdy nemají možnost vyvinout přesleny uzlových kořenů. Pro vyšší přesleny je charakteristické, že kořeny vyrůstají ze stébla nad povrchem půdy. Pro jejich formování se výrazně uplatňuje mechanická funkce (podpora rostliny a ochrana před polehnutím). Kukuřice má stéblo vzpřímené a lysé. Úlohou stébla je nést listy, generativní orgány a zprostředkovávat cévní spojení listů s kořeny. Stéblo je rozděleno na uzly (nódy), nazývané též kolénka a na články (internódia) Jednotlivé články stébla nejsou stejně dlouhé a jejich počet kolísá podle hybridu, stanovištních podmínek a délky vegetačního období. Podzemní bazální část stébla, má stejně jako nadzemní část, tvar obráceného kužele. Bazální část tvoří 4-9 podzemních článků, na kterých vznikají adventivní (přídatné) kořeny a na prvních 4 článcích opěrné kořeny. Bazální články jsou velmi krátké, následné jsou delší, vrcholové pak opět kratší. Výška 12

13 stébla závisí na růstových podmínkách, tj. teplotě, množství srážek před metáním, hustotě porostu, množství živin a dalších činitelích. Pravá plná kolénka dodávají stéblu pevnost a jsou hustěji zastoupeny ve spodní části. Z těchto kolének mohou vyrůstat odnože, které však berou živiny hlavnímu stéblu a proto jsou nežádoucí (snižují výnosy zrna). Listy slouží k asimilaci CO 2 a vypařování vody. Velká, do plochy rozšířená čepel je u kukuřice široká, dlouze kopinatá, pásovitá s nápadným žebrem. Listy vyrůstají po jednom na každém kolénku, střídavě ve dvou protilehlých řadách. Okraj čepele je mírně zvlněný, což je způsobeno nestejně rychlým růstem středu a okraje listové čepele. Povrch listu bývá slabě ochlupený a je více či méně drsný (VRZAL, 2009). U listu kukuřice je obtížné rozpoznat, která strana je horní a spodní. Obecně platí, že strana orientovaná ke slunci nese voskovou a lesklou vrstvu a tlustší kutikulu ( Rub listu je hladký. Spodní část listu tvoří mohutná pochva, která obklopuje stéblo, chrání jednotlivé články a dlouho si uchovává meristémový charakter. Na vnitřní straně listu, na hranici mezi čepelí a pochvou, vyrůstá v podobě blanitého výrůstku obrvený jazýček bez oušek. Počet listů kolísá v závislosti na hybridu, je to jejich znakem (obr. 1). Generativní orgány kukuřice jsou různopohlavní z typu rostlin diklinických s prašníkovým a pestíkovým květenstvím, sestaveném po dvou do klásku, které jsou základním charakteristickým prvkem květenství trav. Základním stavebním prvkem květenství samičího (laty) jsou klásky prašníkové, kdežto samčí (palice) klásky pestíkové. Z toho vyplývá, že kukuřice je cizosprašná. Tyčinkové květy dozrávají dříve než pestíkové (pouze u některých je to naopak). Interval mezi počátkem kvetení je od 1 až 5 dnů. Tvar vřete je charakteristickým znakem hybridů (válcovitý tvar vřetene je výhodnější) (VRZAL, 2009). Sklízejí se tzv. palice, které se skládají z vřetene s hustě uloženými kukuřičnými zrny. Obilky jsou velké, zploštělé, většinou sklovité, barvy bílé, světle žluté, tmavožluté až oranžové (DYR, 1956). Kukuřice jako mnoho jiných tropických rostlin je plodinou s fotosyntézou typu C4. Díky tomu je kukuřice schopná za dostatečného osvětlení velmi rychle růst a produkovat enormní množství biomasy ( U C4 rostlin je cyklus fixace CO 2 do čtyřuhlíkatých molekul (oxaloctan) za pomocí enzymu 13

14 phosphoenolpyruvatu (PEP), který má k CO 2 vysokou afinitu. Tento mechanismus souvisí s unikátní stavbou listů, ve které je žilnatina listu obklopena CO 2 a tak zůstává v přímém kontaktu s mezofylem buněk ( Obrázek č. 1: Kukuřice setá Zdroj: Anatomická stavba kukuřičného zrna Obilka (obr. 2) se skládá z obalových vrstev, endospermu a klíčku. Hmotnostní podíl jednotlivých částí zrna je proměnlivý vlivem vnitřních a vnějších faktorů. Jednotlivé složky zrna mají různé strukturní, mechanické a fyzikálně chemické vlastnosti a plní v životě obilky i při následném využití a zpracování své specifické funkce Obalové vrstvy Obalové vrstvy nebo-li ektosperm (oplodí a osemení) tvoří asi 8-12,5 % hmotnosti zrna, chrání obilku před vnějšími vlivy. Jsou tvořeny několika vrstvami buněk, jenž chrání klíček a endosperm před vysycháním a mechanickým poškozením. Obsahuje celulosu, hemicelulosu a minerální látky což je vláknina (KUČEROVÁ, 2004). 14

15 Obalové vrstvy obsahují také vitamíny skupiny B, hlavně thiamin, riboflavin, kyselinu nikotinovou a pantotenovou Endosperm Endosperm se skládá z jedné vrstvy aleuronových buněk a z moučnatého jádra (TICHÁ, VYZÍKOVÁ, 2006). Endosperm je vnitřní obsah zrna, představuje největší podíl zrna, asi % a je technologicky nejvýznamnější částí. Aleuronová vrstva- nachází se mezi obalovými vrstvami a moučnatým jádrem, tvoří asi 8% z celého zrna a obsahuje především protoplastické bílkoviny, tuky, vitamíny, a minerální látky (KUČEROVÁ, 2004). Bílkoviny se řadí mezi albuminy a globuliny, které mají příznivé složení aminokyselin (TICHÁ, VYZÍKOVÁ, 2006). Moučnaté jádro- obsahuje hlavně škrob ve formě škrobových zrn, bílkoviny (zásobní látky pro klíčící rostlinu) Klíček (embryo) Klíček (embryo) tvoří nejmenší podíl zrna %, je vlastním zárodkem nové rostliny a nositel genetických informací. Je cenným zdrojem tuků, jednoduchých cukrů, bílkovin, enzymů a vitamínů například vitamínu E (KUČEROVÁ, 2004). Obrázek č. 2: Zrno (obilka) kukuřice seté Zdroj: vfu- 15

16 3.2.5 Chemické složení zrna Chemické složení kolísá podle oblasti, odrůdy, hnojení, doby výsevu, agrotechniky, klimatických podmínek a celé řady dalších činitelů. Důležitou složkou je voda, protože všechny biochemické a fyziologické procesy probíhající během růstu, dozrávání a skladování probíhají za její účasti (TICHÁ, VYZÍKOVÁ, 2006) Sacharidy Monosacharidy- jsou ve zralém zrně v nepatrném podílu jedná se o pentosany a hexosy. Oligosacharidy-vyskytují se v nízkých koncentracích (sacharosa, maltosa). Polysacharidy-jsou nejvýznamnější složkou, mají funkci zásobní a stavební. Patří mezi ně neškrobové polysacharidy (celulosa, hemycelulosa, ) a škrob (KUČEROVÁ, 2004) Škrob Škrob je hlavní zásobní živinou rostlin, sloužící jako pohotová zásoba glukosy. V kukuřici se vyskytuje 65 až 75 % škrobu. Na rozdíl od strukturních polysacharidů, které jsou součástí buněčných stěn, se škrob nachází v organelách cytoplasmy nazývaných plastidy. V pletivech, kde probíhá fotosyntéza je v malém množství v chloroplastech, ve velkém množství v amyloplastech (VELÍŠEK, 2002). Škrob se v rostlinách vyskytuje ve formě škrobových zrn (škrobových granulí). Je složen ze dvou frakcí a to z amylosy a amylopektinu. Poměr je u kukuřice 25 % amylosy a 75 % amylopektinu. Obě frakce se díky struktuře liší chemickými i fyzikálními vlastnostmi. Amylosa je rozpustná ve vodě a amylopektin pouze bobtná a není schopen tvořit roztok (KUČEROVÁ, 2004). Jednoduchou analytickou zkouškou jejich přítomnosti je použití jodu. Amylosa se jim barví modře a škrobový maz modrofialově (KLOUDA, 2005). Základním stavebním kamenem molekul škrobu je molekula glukosy-je to tedy glukan. Jeho empirický vzorec je (C 6 H 10 O 5 ) n (HAMROVÁ, 1988). 16

17 Ukládání glukosy získané fotosyntézou ve formě škrobu silně snižuje velké intracelulární osmotické tlaky, kterým by jinak byly buňky vystaveny. U kukuřice byly vyšlechtěny odrůdy, v nichž převládá buď amylosa (amyloškroby), nebo amylopektin (tyto odrůdy se nazývají voskové). Molekula amylosy je díky převládajícím vazbám 1 4 ve vodě a v neutrálních roztocích náhodně svinutá, místy s helikální strukturou, vytváří levotočivou šroubovici. V alkalických roztocích převažují globulární struktury (VELÍŠEK, 2002). Amylosa je složkou škrobu s nerozvětvenými řetězci (HAMROVÁ, 1988). Amylosa je lineární α-d-(1 4) glukan, a proto je vlastně polymerem disacharidu maltosy. V omezené míře dochází k větvení asi na deseti místech molekuly. Amylosa je částečně esterifikována kyselinou fosforečnou, tvoří komplexy s lipidy. Molekula amylosy má jeden redukující zbytek monosacharidu (VELÍŠEK, 2002). Stupeň polymerace amylosového řetězce se uvádí (HAMROVÁ, 1988). Molekula amylopektinu se skládá z řetězců D-glukosových jednotek vázaných α-(1 4) vazbami (polymer maltosy), z nichž se po 10 až 100 (průměrně po 25) jednotkách odvětvují vazbou α-(1 6) postranní řetězce (stavební jednotkou je isomaltosa). Výjimečně se mohou vyskytnout také vazby α-(1 3). Stavební jednotkou takto vázané biosy je laminaribiosa. Makromolekula má mnohonásobně větvenou strukturu, kterou tvoří tři typy řetězců, vnější řetězce A, vnitřní B a hlavní řetězec C (VELÍŠEK, 2002). V řetězci je spojeno i více glukosových jednotek. Amylopektin obsahuje vázanou kyselinu fosforečnou (HAMROVÁ, 1988). Želatinace (mazovatění) škrobu Škrobová zrna přijímají z atmosféry při běžné relativní vlhkosti vzduchu asi 0,2g vody (na 1g suchého škrobu) a obsahují zhruba 17 % vody, aniž se mění objem zrn. Děj se nazývá imbibice. Na jednu molekulu glukosy připadá 1,5 molekuly vázané vody. Ve strukturních jednotkách glukanů je celkem pět kyslíkových atomů, které mohou s vodou interagovat. Škrobová zrna jsou ve studené vodě nerozpustná a tvoří suspenzi. Při záhřevu suspenze nepoškozených škrobových zrn množství absorbované vody dále poněkud roste, aniž se poruší jejich integrita, dochází pouze k imbibici. Až do určité teploty, 17

18 při které nastává bobtnání zrn, se jedná o reverzibilní proces. Teplota bobtnání u kukuřice se pohybuje v rozmezí teplot: počáteční 62 C, střední 67 C, konečná 72 C. Želatinační teplota závisí na druhu škrobu a vzájemném poměru škrobu a vody, ph prostředí a přítomnosti dalších složek (soli, cukry, lipidy, bílkoviny). V procesu želatinace jsou změny škrobových zrn nevratné. Tepelným pohybem molekul se přerušují stávající vazby, molekuly vody pronikají amorfními oblastmi zrn a interagují s volnými vazebnými místy polymerů. Hydratované řetězce se vzájemně oddalují, odhalují se tak další vazebná místa, která reagují s vodou, rozpadají se dvojité šroubovice postranních řetězců amylopektinu, čímž mizí krystalické zóny a celá struktura se stává neorganizovanou, amorfní. Granule intenzivně bobtnají a zvětšují svůj objem. Molekuly amylosy se uvolňují do prostředí kde jsou zcela hydratovány. Do extragranulárního prostředí se uvolňuje i malý podíl molekul amylopektinu. Roste viskozita a při dostatečném množství škrobu vzniká viskózní škrobový maz. Ten obsahuje kolapsovaná škrobová zrna, ovšem mnohonásobně zvětšená. V nich se nachází většina molekul amylopektinu a zbývající molekuly amylosy. Pokračuje-li záhřev, viskozita klesá s další ztrátou integrity granulí (VELÍŠEK, 2002). Ochlazením škrobového mazu vznikne gel, viskozita roste, neboť se vytvoří prostorová mřížka spojená vodíkovými můstky mezi molekulami amylosy a amylopektinu (HAMROVÁ, 1988). Je-li koncentrace škrobu dostatečná, vzniká z toho solu pevná trojrozměrná síť zachycující velké množství vody, tzv. škrobový gel (VELÍŠEK, 2002) Bílkoviny Zralé zrno obsahuje dle odrůdy 9-16 % bílkovin, většina je uložena v endospermu a v aleuronové vrstvě. Základní složkou jsou aminokyseliny-dominuje kyselina glutamová. Vyskytují se jednoduché a složené bílkoviny (TICHÁ, VYZÍKOVÁ, 2006). 18

19 Lipidy Kukuřice obsahuje 4-7 % tuku, největší množství se vyskytuje v klíčcích a v aleuronové vrstvě. Podstatný podíl nepolárních tuků tvoří nenasycené mastné kyseliny (KUČEROVÁ, 2004). Tuk se skládá převážně z nenasycených mastných kyselin, kyseliny linolové a olejové. V malém množství se v něm nachází i kyselina palmitová a stearová. Vysoký obsah nenasycených mastných kyselin způsobuje, že tuk snadno podléhá oxidaci (proto by se šrotovaná kukuřice neměla déle skladovat, tuk je pak snadno přístupný vnějším vlivům), (TICHÁ, VYZÍKOVÁ, 2006) Minerální látky Největší množství se nachází v klíčku a v obalových vrstvách, především aleuronové. Nejčastěji: hořčík, draslík, vápník a železo (KUČEROVÁ, 2004) Vitamíny Vysoký obsah vitamínů je v obalových vrstvách a klíčku. Endosperm je na vitamíny chudý. Vyskytují se thiamin (B 1 ), riboflavin (B 2 ), kyselina nikotinová (PP), kyselina pantotenová, vitamin E (KUČEROVÁ, 2004) Convariety kukuřice Kukuřice koňský zub (Zea mays convar. identata, syn. dentiformis) Má zrno klínovitého tvaru, se sklovitými bočními okraji, moučnatý endosperm proniká až k vrcholu zrna. Nerovnoměrné sesychání moučnaté a sklovité části vytváří jamku. Je pozdější, ale výnosnější, hospodářsky je nejvýznamnější convarietou. Kukuřice obecná, tvrdá (Zea mays convar. induráta, syn. vulgaris) Vyznačuje se tvrdým, lesklým, okrouhlím zrnem moučnatý endosperm přechází na okraji ve sklovitý. Má nižší výnosy. 19

20 Kukuřice polozubovitá (Zea mays convar. aorista syn. semiindentata) Tvoří přechod mezi předchozími formami. Jamka na vrcholu zrna je méně zřetelná, zrno má sklovitější endosperm než koňský zub. Kukuřice pukancová (Zea mays convar. everta syn. microsperma) Má menší zrno, tvrdý a sklovitý endosperm. Podle tvaru zrna se rozděluje na kukuřici rýžovou, se zobákovitě zakrouceným vrcholem, a perlovou, se zakulaceným zrnem. Používá se k přípravě pukanců a k výrobě vloček. Kukuřice cukrová (Zea mays convar. saccharata) Má charakteristicky svraštělé zrno se sklovitým endospermem. Obsahuje amylodextrin rozpustný ve vodě. Používá se jako zelenina na vaření a konzervování. V Americe se stala jednou z nejrozšířenějších zelenin. Kukuřice škrobnatá (Zea mays convar. amylacea) Zrno má moučnatý charakter s matným povrchem. Pro vysoký obsah škrobu se využívá ve škrobárnách a lihovarnickém průmyslu. Kukuřice vosková (Zea mays convar. ceratina) Má zrno podobné kukuřici obecné, sklovitý endosperm není průhledný a matný povrch zrna opticky připomíná vosk. Obsahuje dextriny, pěstuje se pro technické účely (KOPÁČOVÁ, 2007) Hybridy kukuřice Výběr hybridů patři mezi jeden z nejdůležitějších pěstitelské opatření. Ranost hybridů se udává v hodnotách FAO, které dosahují Na prvních dvou místech této tříciferné stupnice je uvedena ranost, na třetím místě barva zrna, která je u nás vždy žlutá, tedy 0. Ranost se stanoví podle obsahu sušiny v zrnu, čím ranější hybrid tím je obsah sušiny k určitému datu vyšší. Deset jednotek značí v našich podmínkách rozdíl ve zralosti 1-2 dny, respektive 1-2 % sušiny ve stejné době. U nás jsou registrovány zrnové hybridy o hodnotě FAO Za ranné se považují hybridy s hodnotou do 220, za polorané , za polopozdní a za pozdní s hodnotou Pozdnější hybridy bývají výnosnější (CHLOUPEK, PROCHÁZKOVÁ, HRUDOVÁ, 2009). Hybridy jsou registrovány 20

21 (zapsány ve Státní odrůdové knize), ÚKZUZ každoročně na svých stránkách zveřejňuje nově registrované hybridy s popisem vlastností (ÚKZUZ). Šlechtěním hybridů kukuřice pro výrobu bioetanolu se již zabývá několik firem a každý rok jsou představeny odrůdy vhodné pro výrobu bioetanolu. Jednou z českých firem je i firma Limagrain Česká republika, s. r. o., další firmou je Oseva, Monsanto a jiné (HEZKÝ, 2007) Požadavky na pěstování a produkce kukuřice Příprava půdy by měla být tradiční, středně hluboká orba, kterou předchází podmítka, pokud následuje po stébelnatých plodinách. Předseťová příprava se obvykle provede v jedné operaci kombinátory či kompaktory. Příprava půdy má zajistit dobrou strukturu půdy, uchování vody v půdě, prohřátí půdy a zasakování vody. Lze vysévat i do zmrzlé meziplodiny, vyseté na podzim (CHLOUPEK, PROCHÁZKOVÁ, HRUDOVÁ, 2009). V osevních postupech bývá obvykle řazena po obilovinách, které jsou pro ni velmi dobrou předplodinou. K pěstování sama po sobě je velmi snášenlivá. Nedoporučuje se ale pěstování po sobě víc než 5 let, protože to může vést k zaplevelení (TICHÁ, VYZÍKOVÁ, 2006). Podle klíčivosti a požadovaného počtu rostlin/m 2 se stanoví výsev. Kukuřice klíčí od 8-10 C, tj. vysévá se od poloviny do konce dubna. Dřívější výsev působí zpožděné a nerovnoměrné vzcházení, porost je citlivý na změnu teploty půdy, choroby a škůdce. To se pak projeví mezerovitým porostem. Proto je nutné moření osiva. Pozdní výsevy sice rychle vzcházejí, ale protože mají k dispozici kratší vegetační dobu, bývají méně výnosné. Hloubkou výsevu se reguluje dostupnost vody a teplota půdy, většinou stačí 4-6 cm. Řádky bývají široké až 80 cm. Doporučuje se pěstovat 7-11 rostlin/m 2 -čím pozdější hybrid, tím řidší porost. V hustších porostech hybridy později dozrávají, mají vyšší obsah vody v zrnu a menší počet zrn v palici. Vyšší hustota je možná jen za dostatku vody (CHLOUPEK, PROCHÁZKOVÁ, HRUDOVÁ, 2009). Kukuřice je teplomilná rostlina, optimální teplota pro růst a vývoj generativních orgánů je C. V období intenzivního růstu (metání až mléčná zralost) má vysoké požadavky na vláhu. Na půdu má mnohem menší nároky než na teplo. Vyžaduje půdy strukturní s neutrální reakcí, nevhodné jsou půdy těžké 21

22 a chladné. Pro hnojení kukuřice se využívají většinou organická hnojiva (TICHÁ, VYZÍKOVÁ, 2006). Vzhledem k pomalému počátečnímu vývoji je z počátku i nízká spotřeba živin, ale v období dva týdny před a čtyři týdny po metání přijímá porost kukuřice % všech živin. Další velká potřeba, hlavně dusíku, je v době plnění zrn, ale ta je kryta transportem živin z listů a stébla. Celková spotřeba dusíku činí kg/ha. Hnojí se při setí a ve stádiu 6-8 listů, výhodná je aplikace do blízkosti řádků. Používá se kg fosforu a kg draslíku/ha (většina draslíku zůstane ve slámě). Vliv stresů (chladna, sucha, utužení půdy) lze možné omezit při dostatku stopových prvků a hořčíku. Kukuřice má řídký porost a pomalý počáteční vývoj, proto je málo konkurenceschopná vůči plevelům, jsou používány herbicidy, nebo pečlivá meziřádková kultivace. Kukuřice bývá při příliš včasném výsevu a za chladnějšího počasí napadena hnilobami klíčků, které se později projevují jako načernalé báze stébel a později hnilobami palic. Častý původ těchto chorob jsou fusariózy. Boulovité zduřeniny u nadzemních částí, ze kterých se uvolňují černé spóry je sněť kukuřičná (přežívá na posklizňových zbytcích). Zavíječ kukuřičný je hnědožlutý motýl, který klade vajíčka a larvy se prožírají stéblem. Tvoří otvory o velikosti 3 mm, ze kterých vypadává drť a mohou způsobovat lámání rostlin. Housenky přezimují v posklizňových zbytcích, lze jej hubit insekticidy nebo použít rezistentní GMO kukuřici (CHLOUPEK, PROCHÁZKOVÁ, HRUDOVÁ, 2009). U kukuřice je nutné při sklizni dbát na dobrý výmlat (zamezení ztrát), čistotu zrna. Zrno je po sklizni nutno přečistit a dosoušet na vlhkost do 14 %. Zrno se následně skladuje v silech (KUČEROVÁ, 2004). Největšími producentem kukuřice je v současné době USA, sklízí se ale po celé Evropě (i u nás). Podle údajů FAO se výměra kukuřice v letech 1970 až 2003 zvýšila ze 113 mil. ha na 143 mil. ha, průměrný výnos stoupl z 2,35 t/ha na 4,47 t/ha a celková produkce tak vzrostla z 266 mil. tun na 640 mil. tun. Výnosy kukuřice v rozvinutých zemích jsou výrazně vyšší díky používání hybridního osiva, zavlažovacích systémů, hnojení a ochrany před škůdci (KOPÁČOVÁ, 2007). 22

23 V posledních letech se plochy kukuřice rychle rozšiřují a tato plodina se stává naší třetí nejrozšířenější obilninou a čtvrtou nejdůležitější obilninou. Přispěly k tomu nové hybridy a globální oteplování. Pro pěstování je rozhodující ranost hybridů, které se udávají v hodnotách FAO (CHLOUPEK, PROCHÁZKOVÁ, HRUDOVÁ, 2009). V České republice dochází k postupnému zvyšování plochy oseté kukuřicí. Od počátku 90. let vzrostla výměra kukuřice z přibližně ha na ha v roce 2003 (KOPÁČOVÁ, 2007). Na mapě ( Obrázek č. 3) je uvedená průměrná výtěžnost kukuřice na různých oblastech ČR. Největší výnosy jsou dosaženy v kukuřičné výrobní oblasti (nad 6 t/ha), (KLEMENTOVÁ). V potravinářském průmyslu slouží kukuřice jako zdroj oleje, škrobu, glukózy, fruktózového sirupu a bioetanolu. Uvažuje se rovněž o použití kukuřice pro výrobu biodegradovatelných plastů a proteinů pro léčebné účely. V rozvojových zemích je kukuřice jedním z hlavních energetických zdrojů pro venkovské obyvatelstvo (KOPÁČOVÁ, 2007). Obrázek č. 3: Výnosy kukuřičného zrna v ČR Zdroj: 23

24 3.3 Bioetanol (energetický zdroj) a technologie výroby Bioetanol je vysokooktanové palivo vyrobené z obnovitelných surovin. Bioetanol jako palivo se vyrábí převážně v kvasném procesu (může být vyráběn i chemickým způsobem a to reakcí etylenu s párou). Bioetanol je čirá bezbarvá tekutina, je biologicky odbouratelný, má nízkou toxicitu a nezpůsobuje znečištění životního prostředí ( Použitím bionafty jako paliva (vyrobené přídavkem rostlinných olejů do nafty a vytvoření směsy) se sníží emise až o 41 % oproti naftě. Pokud použijeme přídavek bioetanolu do benzínu mohou být emise sníženy až o 12 % ( Pro využití bioetanolu jako palivo je nejznámější Brazilský lihový program, který ukázal na výhody a nevýhody jeho zavádění a výroby ve velkém měřítku. V USA a ve Francii se využilo těchto zkušenosti (EXNAR a kol., 1998). Dominantní postavení Brazílie ve světě v této oblasti je výsledkem působení několika faktorů, z nichž nejvýznamnější jsou příznivé podmínky pro pěstování cukrové třtiny jako jedné z nejvýznamnějších surovin pro výrobu biopaliv, nízké zemědělské, zpracovatelské i výrobní náklady a levná pracovní síla (FOLTÝN, ZEDNÍČKOVÁ, 2008). Současná doba si vyžaduje nutnost revidovat všechny technologie způsobující znečištění životního prostředí. Jedním z nejvýznamnějších vlivů působících na znečištění ovzduší je spalování fosilních paliv, které přispívá hlavní měrou. V případě spalování nafty a benzínů v motorech nejde jen o emise oxidu uhličitého, ale i o znečištění zplodinami hoření. Proto se hledají alternativní zdroje paliv, které by zajistili naší planetě regeneraci, ale též využití vznikajícího oxidu uhličitého v přírodním cyklu. Těmito látkami nesmí být zhoršena kvalita paliv a mají vnést do směsi určité množství kyslíku a působit jako oxygenát. Biologické pohonné hmoty jsou kyslíkaté sloučeniny, které přidáním do klasických pohonných hmot zlepšují jejich oktanové číslo a spalování, což vede ke snižování obsahu některých škodlivých látek ve výfukových plynech. Bioetanol je určen pro motory benzínové, ale není vyloučeno použití bioetanolu pro naftové motory. Světové petrochemické firmy zkoumají ve svých laboratořích i tyto možnosti. Kombinace ethanolu a řepkového oleje se značně blíží 24

25 svými vlastnostmi naftě. Etanol lze přímo přidávat do benzinu jako je tomu v USA - 10 %, v Brazílii - 22 %, a v Polsku - 5 % (EXNAR a kol., 1998). V současné době díky Státnímu lihovému programu v Brazílii pokrývá líh 40% spotřeby paliv ve vozidlech s Ottovým cyklem (FOLTÝN, ZEDNÍČKOVÁ, 2008). Oxygenáty (mezi ně patří i etanol a aditivum připravené z etanolu, ETBE (etylterciální butyl-ether) snižují obsah oxidu uhelnatého o 10 až 30 % ve spalinách, ale i v produkci ozónu. Etanol snižuje i celkový tlak par benzinu a zvyšuje oktanové číslo paliva. Na druhé straně se však snižuje výkon motoru a následně je zvýšena i spotřeba paliva. ETBE má proti MTBE (metyl-terciální butyl-ether) řadu výhod, proto že metanol pochází z fosilních paliv a při spalování vzniká nebezpečí tvorby formaldehydu, který karcinogenní látkou. Další výhodou etanolu je, že sníží teplotu hoření paliva a tím je sníženo množství vznikajících oxidů dusíku. Vzhledem k nižší těkavosti směsi etanolbenzin, je nutné přídavkem jiných látek odstranit problém studených startů (pro zimní období je výhodnější ETBE). Z ekonomických důvodů je vhodné aby cena výroby bioetanolu byla co nejnižší. To se docílí použitím levných surovin s vysokým obsahem sacharidů, snížením spotřeby energie v destilační části, zavedením odvodňovací jednotky a ekonomickým využitím výpalků. Požadavky na kvalitu lihu se postupně mění, při obsahu etanolu 99,3 až 99,9 % obj. již znečištění nemůže být velké. Optimální jednotky na výrobu budou přesahovat denní kapacitu hl bezvodého produktu. V současné době se ve světě vyrobí více než 50 mil. m 3 etanolu. Brazílie údajně vyrobí jen asi 11 až 16 mil. m 3 (EXNAR a kol., 1998). Protože bioetanol snižuje emise, snižuje oxid uhelnatý a jiné nečistoty, zvyšuje oktanové číslo, je snadno smísitelný s benzínem na směs ETBE a z důvodu ubývání obnovitelných zdrojů se producenti etanolu nebo inženýrské firmy zaměřují na projektování a výstavbu nových závodů na výrobu bioetanolu s cílem uspokojit poptávku ( 25

26 Tabulka č. 1: Globální výroba a obchod s bioetanolem (Global Production and Trade in Bio-Ethanol), ( Celosvětová produkce Největší světový výrobci v roce 2005 Rok Produkce Země Produkce 2000 Méně než 20 bilionů litrů Brazílie 36 % (16 bilionů litru) 2005 Více než 40 bilionů litrů USA 35 % (15 bilionů litrů) 2010 Odhaduje se téměř na dvojnásobek Čína 9 % Indie 4 % Ekologická hlediska Ačkoliv vědecké studie svědčí o tom, že využívání biomasy je z hlediska oxidu uhličitého neutrální, někteří vědci mají jiný názor. Některé studie dokonce ukazují, že změna přírodních ekosystémů na energetické plantáže na základě zrychleného rozkladu organické hmoty by mohla mít za následek vyšší množství CO 2. Důsledky výroby bioenergie ve velkém měřítku by se mohly negativně projevit na biologické různorodosti, kvalitě půdy, užívání vody a zásobování vodou. Rozsáhle rozšířené pěstování energetických rostlin by mohlo mít za následek další mýcení tropických dešťových pralesů v zemích jako je Brazílie. U spotřebitelů by nové technologie mohly narazit na skepsi, zejména jsou-li s nimi spojeny rostoucí náklady (ŠŤASTNÝ). 26

27 3.4 Technologie výroby bioetanolu Příprava zápar (zcukřování) Při přípravě zápar ze škrobnatých surovin se používají dva způsoby, jedním z nich je tlakový (pařákový) způsob a druhý beztlaký způsob. V posledních letech se více využívá beztlaký způsob přípravy zápar a upouští se od tlakového způsobu. Dále následuje proces bobtnání a mazovatění škrobu (EXNAR a kol., 1998) Tlakový způsob Kukuřice pařená v celých zrnech se v pařáku okyseluje kyselinou sírovou ve vodném roztoku (pak je snazší rozluštění zrna). Kukuřice se nejdříve asi jednu hodinu rozvařuje bez tlaku při otevřeném vzdušníku a po jeho uzavření se paří tak aby další půl hodinu stoupl tlak o 1 atmosféru. Za dobu dvou hodin se dosáhne konečného tlaku 4 atmosféry, při tomto tlaku vydržíme ještě asi půl hodinu. Paření v celých zrnech trvá dlouho, spotřebuje se mnoho páry a cukry karamelizují, lze výhodně pařit kukuřici v podobě hrubého šrotu za nižšího tlaku 3 atmosféry po dobu asi dvou hodin. Je-li kukuřice správně upařená, jsou v čiré zcukřené zápaře zřejmé jen její slupky. Škrobnatý endosperm přechází v roztok, který se zfiltruje. Filtrát zápary má být zlatožlutý, ne příliš světlý (volně a těžko prokvašují). Pokud je filtrát tmavý s připáleným zápachem nasvědčuje o karamelizaci. Sladká kukuřičná zápara mívá přirozené ph kolem 5,6. Zákvas je nutno okyselit (DYR, 1956). 27

28 Beztlaký způsob Úprava suroviny Při beztlakém způsobu je nutné kukuřičné zrno namlet na částice odpovídající velikosti. Ze zkušeností odborníků z lihovarů se volí velikost částic menší než 0,4 mm a větší než 1,6 mm. Kreipe (1982) uvádí, že je možné získat velmi dobré výsledky i u částic o velikosti 1,5-2,0 mm. Mletí může být realizováno buď za sucha nebo za mokra. Velikost mletí rozhoduje dále o průběhu enzymového a kvasného procesu, o výtěžnosti alkoholu a o charakteru výpalků. Mokré mletí má výhodu v tom, že při mletí dochází zároveň k bobtnání škrobových zrn a tím i k dalšímu dobrému průběhu enzymového procesu (EXNAR a kol., 1998) Zapařování Úkolem zapařování je zajistit optimální podmínky pro působení amylolytických enzymů (teplotu, dobu působení příslušné teploty a hodnotu ph). Provádí se v zapařovací kádi, která slouží k co nejlepšímu smísení zápary s amylolytickými preparáty, umožňuje regulaci a měření teploty v celém objemu zápary. Během zapařování probíhá ztekucování škrobu a jeho hydrolýza na zkvasitelné cukry (sladká zápara). Enzymatické preparáty se používají buď obchodní preparáty nebo amylolytické enzymy pocházející ze sladu (dnes se moc nevyužívají). Dle enzymu zvolíme teplotní režim. Při zapařování není zcela škrob převeden na zkvasitelný cukr, proto je nutné uchovat aktivitu enzymu i během kvašení (HAMROVÁ, 1988). 28

29 Enzymy Enzymy jsou proteiny specializované na katalýzu chemických reakcí v organismu. Patří mezi globulární bílkoviny a jsou většinou povahy složených bílkovin (ZEHNÁLEK, 2005). Ve zjednodušeném pojetí si můžeme enzym představit jako komplex dvou složek-apoenzymu a koenzymu. Apoenzym je molekula bílkoviny (nosič) a koenzym je nízkomolekulární sloučenina, která vykazuje katalytickou aktivitu, čili ovlivní průběh příslušné reakce. Každý enzym je vysoce specifický co se týče katalyzované reakce i co se týče substrátu. V lihovarství je využívána činnost enzymů sladu, bakteriálních nebo plísňových amyláz a enzymového systému kvasinek (HAMROVÁ, 1988). Na aktivitu a stabilitu enzymů mají vliv tyto faktory: Optimální teplota-s růstem teploty dochází k inaktivaci, aktivita je ovlivněna i dobou působení teploty. Je nutné zvolit optimální teplotní režim. Optimální ph-většina enzymů působí katalyticky v určité oblasti ph, mimo ni jejich účinnost klesá (ZEHNÁLEK, 2005). Koncentrace substrátu-má vliv na rychlost reakce, na stabilitu enzymu a odolnost vůči ostatním faktorům. Ionty solí-některé enzymy potřebují pro svou aktivitu některé ionty (vápník) Inhibitory-látky, které snižují aktivitu enzymů (ionty těžkých kovů ). Činnost enzymu může být inhibována i produktem reakce. (HAMROVÁ, 1988). 29

30 Enzymy hydrolyzující škrob Nejdůležitější je činnost amylolitických enzymů, které převedou polysacharid škrob na zkvasitelné cukry. α-amyláza-hydrolyzuje α(1 4)glukanové vazby škrobu. Působí i na celá, nezmazovatělá škrobová zrna, mnohem rychleji však působí na škrobový maz. Štěpí řetězce makromolekul škrobu přibližně uprostřed, vznikají dextriny o nízké molekulové hmotnosti. Výrazně klesá viskozita škrobového mazu. Tento enzym se nazývá ztekucující nebo také endoamylása (amylopektin je rozštěpen na maltosu a maltotriosu, amylosa hydrolyzovaná na glukosu, maltosu a maltotriosu). Vyžadují pro svou aktivitu přítomnost iontů vápníku. β-amylasa-rovněž hydrolyzuje α(1 4) vazby glukosového řetězce, ale tak, že postupuje od neredukujícího konce řetězce a odštěpuje molekuly maltosy. Proto je nazývána zcukřujícím enzymem. Nativní škrobová zrna nehydrolyzuje, pokud nejsou mechanicky poškozena. Je to exoamylása - postupuje směrem od okraje škrobových makromolekul, hydrolyzuje ji z 60 %, protože není schopna rozštěpit vazbu α(1 6) v místech větvení řetězce. Glukoamylasa- štěpí vazby α(1 4), je to také zcukřující enzym. R-enzym hydrolyzuje α(1 6)glukanové vazby amylopektinu, nepůsobí však na isomaltosu (HAMROVÁ, 1988). Kromě těchto enzymů lze použít i další hydrolytické enzymy, které rozkládají hemycelulasy, proteasy a celulasy. Jejich působením lze zvýšit výtěžek bioetanolu a současně snížit viskozitu media (EXNAR a kol., 1998). Dříve se využívaly enzymy vyrobené z ječného sladu, nyní se využívají komplexní enzymatické preparáty, které obsahují několik enzymů (HAMROVÁ, 1988). Na trhu existuje několik firem, které vyrábějí velmi kvalitní enzymy. Jednou z nejznámějších je dánská firma NOVO NORDISK. Pro lihovarské účely jsou vhodné enzymy: TERMAMYL, BAN a SAN SUPER. Dobré výsledky lze dosáhnout i s enzymem ULTRAFLO L a to hlavně pro jeho β-glukanasovou aktivitu (EXNAR a kol., 1998). 30

31 3.4.2 Kvašení Mikroorganismy Všechny kvasné procesy jsou vyvolávány mikroorganismy, respektive jejich enzymy. Kvasný etanol vzniká činností kvasinek (Sacharomycety), kterých známe velké množství, liší se morfologicky, hlavně však svou fyziologií (DYR, 1956). Kvasinky a kvasinkovité mikroorganismy patří systematicky k houbám (fungi, mycetes). Nejdůležitějšími řády jsou Deuteromycetales a Endomycetales, do jejichž čeledi Saccharomycetaceae patří druh Saccharomyces cerevisiae, používaný v lihovarské technologii (HAMROVÁ, 1988) Kvasinky Kvasinky jsou heterotrofní eukaryotní mikroorganismy. Mají schopnost zkvašovat monosacharidy a některé disacharidy, případně i trisacharidy na etanol a oxid uhličitý. Tvar buněk souvisí se způsobem vegetativního rozmnožování, jenž se děje buď pučením nebo dělením. Nejčastěji je tvar kulovitý, elipsoidní nebo vejčitý (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). O kvasinkovitých mikroorganismech hovoříme v případě pokud se kromě jednotlivých pučících buněk vytváří i vlákna (pravé a nepravé hyfy), které zpravidla netvoří vřecka. Velikost buněk se pohybuje 3-6 x 3 15 µm (BENDOVÁ, JADERNOVÁ, 1999). Buňka se skládá z buněčné stěny (1), která je složena z 80% z polysacharidů, bílkovin, lipidů a fosfolipidů. U mladých buněk je stěna jemná a tvárná, u starších tlustší a křehčí. Na buněčné stěně jsou pozorovatelné jizvy po pučení (2) buňky (u rodu Saccaromyces buňka nikdy nepučí na stejném místě, podle množství jizev lze usuzovat na stáří buňky). Pod buněčnou stěnou se nachází cytoplazmatická membrána (3). Je polopropustná, rozhoduje o látkách vstupujících a vystupujících z buňky. Buněčný obsah tvoří cytoplazma. U mladých buněk je homogenní a u starších zrnitá (může obsahovat lipidy11). Vakuoly (6, 6a je membrána vakuoly) jsou nejlépe pozorovatelnou složkou. U mladých buněk jsou malé a ve větším počtu, u starších bývá zpravidla jedna vakuola. Ve vakuole se nacházejí hydrolytické enzymy a slouží i jako zásobárna látek. Jádro (4, 5 je membrána jádra, 5a-pór) je 31

32 kulovitá až laločnatá organela, obsahuje ještě jadérko. Je nositelem genetické informace. Dále se v buňce nacházejí endoplazmatické retikulum (7), Golgiho aparát (12) a mitochondrie (8) (HAMROVÁ, 1988). Obrázek č. 4: Buňka kvasinky Zdroj: Šilhánková, 1983 Většina rodů kvasinek se vegetativně rozmnožují pučením. Při pučení je vznikající malá dceřinná buňka spojená kanálkem s mateřskou buňkou. Před pučením dochází ke splývání membrán endoplazmatického retikula a pak k jeho dělení, dále k opakovanému dělení vakuol a ke změnám tvaru mitochondrií v dlouze protáhlé. Po počátku tvorby pupenu do něho vstupují drobné vakuoly a mitochondrie. Současně začne mitotické dělení jádra a jeho migrace k pupenu. S jádrem přecházejí do nové buňky také další složky cytoplazmy. Cytoplazmatickou membránou se uzavře kanálek mezi mateřskou a dceřinou buňkou. Dorostlá dceřinná buňka se od mateřské oddělí. Celý proces trvá za optimálních podmínek kolem dvou hodin (obr. 5). U pohlavního rozmnožování jsou výsledkem pohlavní spory. Většina kvasinek tvoří jako pohlavní spory askospory, což jsou endospory, umístěné ve vřecku neboli asku. Některé rody kvasinek však tvoří pohlavní exospory, tj. spory umístěné vně sporotvorných buněk (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Pohlavní rozmnožováni je charakterizováno konjugací (spájením) dvou haploidních buněk a jejich jader (karyogamií) za vzniku diploidního jádra, které se pak meiózou dělí na čtyři haploidní jádra základ pohlavních spor, nebo se dělí mitózou, pak teprve vznikají spory. Izogamní spájení je spájení stejně velkých buněk (Saccharomyces). Heterogamní spájení je spájení nestejně velkých buněk (BENDOVÁ, JADERNOVÁ, 1999). 32

33 Kvasinka může přijímat pro výstavbu své buňky Jen ty látky, které projdou její buněčnou stěnou. Není-li v záparách obsaženo dostatečné množství vhodných živin, nemůže dojít k náležitému množení kvasinek - pomnožení kvasinek se totiž řídí tou živinou, která je v substrátu obsaženo nejméně. Pro výstavbu cytoplazmy a enzymů potřebují kvasinky dusíkaté látky (nejlepší zdroj je organický dusík). V lihovarských záparách by mělo být 150 mg dusíku/l vázaného ve vhodných sloučeninách a v zákvasu dvojnásobek. Další důležitou živinou jsou fosforečnany a uhlík (HAMROVÁ, 1988). Obrázek č. 5: Růstová křivka mikroorganismů Zdroj: Šilhánková, Saccharomyces Druhy kvasinek tohoto rodu jsou schopny zkvašovat většinou několik cukrů, nikdy ale nevyužívají laktosu jako zdroj uhlíku a NO3- jako zdroj dusíku. Jejich tvar je většinou vejčitý, krátce elipsoidní, nebo protáhlý. Rozmnožování spájením je izogamní. Askospory jsou kulovité až elipsoidní, v asku se nachází 1 až 4 askospory. Nepohlavně se rozmnožují pučením. Saccharomyces cerevisiae Z technologického hlediska je to nejdůležitější kvasinka. Tvar buněk je kulovitý až oválný, pro starší buňky je charakteristická zřetelná ostře ohraničená vakuola. Velikost kvasinky se pohybuje kolem 6-7 x 7,5-8,7 µm. Zkvašuje glukosu, galaktosu, sacharosu, maltosu a částečně nebo úplně rafinosu. 33

34 Vzhled a konzistence kolonií: - Nátěr má těstovitou konzistenci, je hladký, barva může být krémová, světle hnědá, lesklý, ale může být i skládaný, kráterovitý, drsný, kučeravý. Kolonie dosahují i menších rozměrů. Prorůstají často do výšky. Charakter nárůstu v kapalném mediu: - V kapalinách tvoří sediment a při okrajích prstenec, po delším čase se může vytvořit i tenká mázdra (BENDOVÁ, JADERNOVÁ, 1999) Kontaminace v lihovarských záparách Při etanolovém kvašení není připravená zápara před zakvašením kvasinkami sterilní, není tedy vyloučena přítomnost dalších mikroorganismů. Kontaminující mikroorganismy mohou škodit tak, že spotřebovávají kvasinkám živiny, tvořit jiný produkt metabolismu než je etanol, mohou produkovat látky, které i v malém množství škodí kvasinkám, mohou svými produkty způsobit aglutinaci kvasinek a nebo mohou odbourávat etanol. Kontaminace může být bakteriemi, plísněmi nebo divokými kvasinkami (HAMROVÁ, 1988). Bakterie mají v kvasném průmyslu jako kontaminanty naprostou převahu. V porovnání s kvasinkami je jejich generační cyklus kratší. Žijí a množí se ze stejného substrátu, avšak cukr mění na nežádoucí zplodiny, brzdí růst kvasinek a dokonce mohou působit i jejich smrt. Do zápar se dostávají vodou, sladem, vzduchem a z nedostatečně vyčištěných nádob a potrubí. Výskyt plísní je z pravidla zanedbanou čistotou a údržbou. Vyšší teplotou se ničí, nejsou pro výrobu tak nebezpečné. Vyskytují se hlavně při dokvašování. Snižují výtěžek bioetanolu. Zdrojem divokých kvasinek je voda, vzduch a slad. Vyskytují se hlavně ve fázi dokvašování, tvoří křís, oxidují etanol až na vodu a CO 2 (PELIKÁN a kol., 2004). 34