Rapid-VIDITEST C. difficile toxin A+B Card/Blister

Transkript

1 Rapid-VIDITEST C. difficile toxin A+B Card/Blister (Jednokrokový imunochromatografický test pro diferenciální detekci Toxinu A a Toxinu B z Clostridium difficile ve stolici) Návod k použití soupravy Výrobce: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II 365, Vestec, Jesenice u Prahy, Tel: , Fax: , objednavky@vidia.cz, Web: POUŽITÍ: Rapid-VIDITEST C. difficile toxin A+B Card/Blister umožňuje proces kvalitativní detekce Clostridium difficile toxinu A (TcdA) a toxinu B (TcdB) ve dvou oddělených liniích. Pozitivní linie pro jeden nebo druhý toxin je známkou probíhající infekce způsobené C. difficile (ICD), která by měla vzbudit pozornost lékaře. Test je určen pro detekci ze vzorků tekuté nebo polotekuté stolice. U pevných vzorků je potřeba mít na paměti, že může jít o asymptomatický průběh a tudíž zdravého jedince. Na rozdíl od jiných testovacích systémů ELISA nebo Rapid, které pouze detekují přítomnost TcdA a TcdB najednou bez diferenciace mezi oběma druhy, tento test umožňuje diferenciaci obou toxinů za použití dvou oddělených linií červená linie, která se objeví pod modrou kontrolní linií, znamená přítomnost toxinu A (TcdA) a jiná červená linie, která se objeví nad kontrolní linií, znamená přítomnost toxinu B (TcdB) ve vzorku (Viz obr.1). Tento test je založen na vazbě barevných mikročástic na specifické monoklonální protilátky proti TcdA a TcdB, které byly imobilizovány ve dvou oddělených místech na membráně, během jejich průchodu membránou. Pouze pro laboratorní použití. ÚVOD: Presumptivní diagnózy infekce C. difficile (ICD) Clostridium difficile produkuje dva různé toxiny, které tvoří základní faktory virulence pro indukci ICD. Provedené výzkumy 1,2 prokázaly, že každý z toxinů samostatně může vyvolat onemocnění.. C. difficile je zodpovědné za přibližně 25% průjmových onemocnění spjatých s podáváním antibiotik jako je clindamycin, druhá a třetí generace cefalosporinů, inhibitorů gyrázy, ampicilinu, nebo amoxicilinu. Kromě průjmu, může onemocnění vést k pseudomembranózní kolitidě (PMC), která vyžaduje okamžité léčení antibiotiky účinnými proti C. difficile a která může vést bez léčení k ohrožení života pacienta. ICD mortalita může být od 6% až do 30%, zejména když pacient trpí pseudomembranózní kolitidou. Pacient trpící infekcí C. difficile související s předcházející léčbou antibiotiky potřebuje o cca 6-10 dní delší hospitalizaci, což přináší vícenáklady 6-8 tisíc EUR. 3 1

2 C. difficile popis bakterie Clostridium difficile je anaerobní, gram-pozitivní sporulující bakterie. Asi 5% zdravé populace mohou být přenašeči. V průběhu hospitalizace může procento přenašečů narůst až na 30%, což vede k rozvoji nosokomiální infekce. Děti jsou kolonizovány C. difficile brzy po narození, ale neprojevuje se to i přes intenzivní vyšetřování žádnými klinickými symptomy. Současné diskuze poukazují na nedostatek střevních receptorů pro toxiny, nebo na rozdíly v ph stolice u dětí, které brání aktivitě toxinů. Jak bylo výše zmíněno, C. difficile může produkovat různé toxiny 4. Toxin A (TcdA) (308 kda) je enterotoxin, který může vyvolávat mnoho symptomů ve zvířecím modelu. TcdA také vykazuje vysokou cytotoxicitu, ale pouze na specifických TcdA citlivých buňkách, jako je HT Toxin B (TcdB) (279 kda) je klasifikován jako cytotoxin. Ve většině buněčných kultur v laboratořích (např. Vero, CHO nebo HELA) je tento toxin 1000x silnější než Toxin A. Aminokyselinová sekvence TcdB se pohybuje v určitém rozmezí v závislosti na různých kmenech 6. TcdA/TcdB detekční systémy Na základě produkce toxinů mohou být detekovány následující kmeny Clostridium difficile: Netoxigenní kmeny jsou nepatogenní kmeny, které neprodukují TcdA a TcdB, ani binární toxin. TcdA+ / TcdB+ kmeny jsou nejběžnějšími kmeny, které vyvolávají ICD. Nejvyšší prevalenci v Evropě mají ribotypy 001; 014 a TcdA- / TcdB+ kmeny byly poprvé identifikovány v Belgii Delmée et.al 8. Jsou považovány za patogenní, i když neprodukují toxin A. 9 Ribotypy kmene 017 patří k této skupině a jsou zodpovědné za ohniska infekce v severní Americe. TcdA+ / TcdB- kmeny mohou být identifikovány ze vzorku stolice přímo tímto testem, který umožňuje jednoduchou a rychlou diferenciaci a detekci toxinu A a toxinu B v jednom testu. Doposud je známo jen několik izolátů těchto kmenů. Výsledky provedených studií ukazují, že TcdB mutantní kmeny C. difficile vyvolávají IDC u křečků v důsledku produkce toxinu A 2. Tyto výsledky odrážejí přítomnost těchto kmenů v klinických vzorcích. PRINCIP TESTU: Rapid-VIDITEST C. difficile toxin A+B Card/Blister využívá kombinace: 1) Červených latexových částic konjugovaných se specifickou protilátkou proti toxinu A, která reaguje s protilátkou jiného typu, která je umístěna na membráně pod kontrolní linií. 2) Jiné červené latexové částice konjugované se specifickou protilátkou proti toxinu B, která reaguje s protilátkou jiného typu, která je umístěna na membráně nad kontrolní linií. 3) Modré latexové částice konjugované s antigenem, který je rozpoznáván protilátkou specifickou pro tento antigen a je vázán na membráně a slouží jako kontrolní linie testu. Při provedení testu je vzorek nejprve naředěn v ředicím roztoku pro vzorek (součást soupravy), toxin je extrahován ze vzorku stolice. Po extrakci toxinu je část supernatantu aplikována na testovací strip a 15 minut se nechá působit. Extrakt prochází testovací membránou, dochází k migraci barevných částic. V případě, že je vzorek pozitivní, specifické protilátky na membráně reagují s antigenem navázaným na barevné 2

3 částice. Po 15 minutách inkubace při laboratorní teplotě získáme linie, které slouží k interpretaci výsledku (viz obr. 1) OBSAH SOUPRAVY: Souprava je k dispozici ve dvou různých formátech: - Blister : reakční strip balený v hliníkové folii. Souprava obsahuje testovací zkumavku, která je pro ředění a extrakci toxinu ze vzorku. Lze použít i ELISA destičku. Strip se ponoří do zkumavky, nebo jamky mikrotitrační destičky (96-jamkové s plochým dnem) - Kazeta : reakční strip je uzavřen uvnitř plastové kazety. Extrakt se aplikuje přímo do okénka testovací kazety. Oba formáty vykazují stejné charakteristiky, i když jsou zde určité rozdíly v pracovním postupu (viz Pracovní postup) Souprava obsahuje: - testovací kazety/blistery - ředicí roztok pro vzorky - jednorázové plastové pipety s vyznačeným objemem (jen pro formát blistr) - jednorázové plastové pipety bez vyznačeného objemu (žluté) - dřevěnou odběrovou tyčinku pro odběr a aplikaci vzorku stolice - 1,5 ml mikrozkumavky s uzávěrem - Testovací zkumavky (jen pro formát blistr) - Stojánek na zkumavky (jen pro formát blistr) - návod k použití - certifikát kontroly balení POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU - centrifuga na 1,5 ml zkumavky - jednorázové rukavice - stopky - míchačka (vortex) SBĚR A PŘÍPRAVA VZORKŮ: Vzorky: Tento test je určen pro analýzu tekutých a polotekutých vzorků stolice. Můžete analyzovat i pevné vzorky, není to však obvyklé vzhledem k tomu, že hlavním symptomem infekce C. difficile je průjem. Nepoužívejte vzorky, které jsou v transportním médiu, nebo jsou odebrány do média obohaceného různými konzervačními látkami (např. formalin, SAF, PVA apod.), které mohou interferovat v tomto testu. Je doporučena analýza nezpracovaných čerstvě odebraných vzorků. Jestliže je potřeba vzorky skladovat déle, uchovávejte je po dobu 1-2 dnů v lednici při teplotě +2 až +8 C. Pro delší skladování vzorky zamražte (-20 C), vezměte ale na vědomí, že některé vzorky mohou zamražením ztratit reaktivitu. Obzvláště dávejte pozor při testování hemoragických vzorků, protože často dávají falešně pozitivní výsledky, když obsahují větší množství krve. Indikátorem 3

4 destabilizace je často změna barvy barevné linie (do fialova nebo tmavě modré zbarvení). Před zpracováním zajistěte, aby byly zmražené vzorky kompletně rozmraženy a temperovány při pokojové teplotě před zpracováním. Vyvarujte se opakovaného zmrazování a rozmrazování vzorků, může být poškozena celistvost toxinů Příprava vzorků stolice: Obecná doporučení: Po celou dobu zpracování vzorků a testování používejte jednorázové rukavice, se vzorkem zacházejte jako s potenciálně infekčním materiálem. Po ukončení testu proveďte opatření uvedená v bodě: Bezpečnostní opatření. Protokol přípravy vzorku je stejný pro oba formáty testu (kazeta a blister) a je následující: 1. Pro tekuté a polotekuté vzorky přeneste 3 kapky (asi 75 µl) pomocí žluté negraduované jednorázové pipety do mikrozkumavky o objemu 1,5ml. Je-li vzorek tuhý, odeberte cca 75 mg (malá kulička o průměru 3 mm) pomocí dřevěné odběrové tyčinky a vložte do 1,5 ml mikrozkumavky. Důležité : Pro zajištění homogenity vzorku odeberte části vzorku ze 3 různých míst. Je to metoda, jak získat co nejvíce representativní vzorek. 2. Přidejte 1 ml ředicího roztoku k odebranému vzorku do 1,5ml zkumavky (v případě, že vzorek má větší objem, zachovejte poměr mezi množstvím ředicího roztoku a vzorku tj 75 µl (75mg)vzorku /1 ml ředicího roztoku 3. Vortexujte mikrozkumavku po dobu 30 sekund, abyste dobře resuspendovali vzorek v ředicím roztoku. 4. Centrifugujte 1,5 ml mikrozkumavku po dobu 5 minut při 700g (přibližně 3000 rpm) ve stolní centrifuze pro odstranění pevných částic. Pokud nemáte k dispozici centrifugu, nechte zkumavku 3-5 minut po vortexování na stole a poté odeberte supernatant. Nejlepších charakteristik testu je dosaženo, pokud je supernatant čirý a pokud po extrakci vzorek centrifugujeme. PRACOVNÍ POSTUP: Před testováním nechte kazetu, vzorek stolice a kontroly vytemperovat na laboratorní teplotu (+15 až +30 C). Postup pro KAZETU (Card): 1. Těsně před použitím vyjměte kazetu Rapid-VIDITEST C. difficile toxin A+B Card z obalové folie a položte ji na vodorovnou podložku. Desikant zlikvidujte, slouží pouze k odstranění nežádoucí vlhkosti. Pro každý vzorek a kontrolu použijte samostatnou odběrovou zkumavku a kazetu. 2. Pipetujte 4 kapky (cca 100 µl) vzorku upraveného podle odstavce Příprava vzorků pomocí žluté pipety do kruhového okénka pro vzorek (označené šipkou). 3. Po 15 minutách odečtěte výsledek. 4

5 Postup pro Blister test: 1. Po vytemperování blisteru otevřete obalovou folii v označeném místě. 2. Pokud budete testovat vzorek ve zkumavce, vložte zkumavku do stojánku na zkumavky 3. Odeberte alikvotu ze vzorku po centrifugaci (viz odstavec Příprava vzorků ) přibližně 265 µl (čtvrtá značka na plastové graduované pipetě) a přeneste tento objem do testovací zkumavky 4. Pokud používáte 96-jamkovou mikrotitrační destičku, dostatečné množství vzorku je přibližně 150 µl (třetí značka na plastové graduované pipetě) 5. Ponořte strip do zkumavky nebo jamky mikrotitrační destičky tak, že šipka ukazuje směrem do kapaliny 6. Inkubujte strip při pokojové teplotě 15 minut, poté odečtěte výsledek (viz obr.1) INTERPRETACE VÝSLEDKU: Na Obr.1 je 5 stripů, kde jsou demonstrovány různé výsledky, které mohou být získány testem Rapid-VIDITEST toxin A+B. Jsou zde tři různé barevné linie: Modrá linie: kontrolní linie, která indikuje správné provedení testu Vrchní červená linie: vzorek pozitivní na TcdB Spodní červená linie: vzorek pozitivní na TcdA Modrá linie (kontrolní) by se měla při testu objevit vždy. Pokud se objeví navíc některá z červených linií, indikuje to přítomnost C. difficile, která produkuje TcdA a/nebo TcdB v analyzovaném vzorku. Obr.1: Strip 1: NEGATIVNÍ výsledek : vzorek neobsahuje C.dificille, nebo obsahuje kmen, který neprodukuje TcdA/TcdB. Na stripu v centrální části se objeví jedna vodorovná MODRÁ linie, pokud používáte formát kazet, objeví se modrá linie v části označené písmenem C. 5

6 Tato kontrolní linie by se měla objevit při každém testu a indikuje, že chromatografie proběhla bez problémů. Stripy 2-4 POZITIVNÍ výsledky: Strip 2: Detekce TcdA: Pod kontrolní MODROU linií se objeví ČERVENÁ. Používáte li formát kazety, červená linie se objeví v místě označeném písmenem T1. Intenzita červené linie závisí na koncentraci toxinu A ve vzorku. Strip 3: Detekce TcdB: Nad kontrolní MODROU linií se objeví ČERVENÁ. Používáte li formát kazety, červená linie se objeví v místě označeném písmenem T2. Intenzita červené linie závisí na koncentraci toxinu B ve vzorku. Strip 4: Detekce obou toxinů TcdB i TcdA: Nad i pod kontrolní MODROU linií se objeví ČERVENÁ (jedna nad kontrolní linií (TcdB) a jedna pod kontrolní linií (TcdA). Strip 5: NEPLATNÝ výsledek: Neobjeví se MODRÁ linie. Indikuje to anomální test. Příčiny mohou být následující: Některé reagencie mohou být nestabilní a hůře funkční nebo test je proexpirovaný Vzorek nebyl připraven a zpracován podle Návodu k použití Vysoký obsah krve ve vzorku V případě, že dostanete neplatný výsledek, je doporučeno test opakovat a striktně dodržet pracovní postup. Pro vzorky s obsahem krve doporučujeme použít alternativní metody, protože destabilizace obyčejně závisí více na matrici vzorku než na testu samotném. Pokud se objeví jakákoli linie po době delší než 15 minut, nemá tato linie žádný diagnostický význam. Poznámka: Konečná diagnóza ICD/PMC musí být stanovena lékařem. Tento test pouze detekuje toxin A+B ve vzorku pacienta, ale nelze jím jednoznačně potvrdit, zda pacient má nebo nemá ICD. OMEZENÍ TESTU: 1. Tento test analyzuje tekuté a polotekuté vzorky stolice, tuhé vzorky mohou být použity, ale test pro ně není optimalizován. Zřídka se objevují případy, kdy sekvestrace toxinu byla pozorována u takovýchto tuhých vzorků. 2. Tento test je kvalitativní, ne kvantitativní, ačkoli intenzita červených linií souvisí s množstvím toxinu ve vzorku. 3. Byla provedena studie funkční způsobilosti na více než 200 vzorcích stolice k zajištění správných charakteristik testu. Srovnání výsledků tohoto testu s jinými technikami (ELISA, stanovení cytotoxicity) byla velmi dobrá. Přesto však nemůže být vyloučena interference u jiných vzorků. 4. Slabý signál může být způsoben malým množstvím použitého vzorku. Pokud nastane tento případ, je doporučeno test opakovat s větším množstvím vzorku, poměr mezi ředicím roztokem a množstvím vzorku musí být zachován (viz kapitola Příprava vzorků) 5. Přebytek vzorku může způsobit špatné vzlínání vzorku (kontrolní linie zůstává neviditelná). Pro zabránění tohoto jevu je doporučeno opakovat test s menším množstvím vzorku. To je důležité zejména u tuhých vzorků stolice. 6

7 6. Negativní výsledek zcela nevylučuje možnost infekce Clostridium difficile (ICD). Výsledek testu musí být interpretován ve vztahu ke klinickým symptomům pacienta. Navíc je potřeba mít na paměti, že toxin není stabilní molekula, může být snadno degradována např. zahřátím při nevhodném skladování vzorků, nebo přítomností inhibitorů. Za těchto podmínek pak může být koncentrace nižší, než je detekční limit testu. (viz kapitola Analytická citlivost) 7. Pozitivní výsledek získaný z tuhých vzorků musí být interpretován s velkou opatrností. V principu je průjem hlavním příznakem infekce Clostridium difficile a tuhé vzorky vylučují přítomnost průjmu. Osoba provádějící test musí o této skutečnosti informovat lékaře. Tato informace společně s klinickým obrazem pacienta, umožní lékaři stanovit správnou diagnózu. 8. Předpokládaná možnost křížové reaktivity s dvěma dalšími mikroorganismy: * Clostridium sordellii, který produkuje letální toxin (TcsL), který je homologní s TcdB bakterie Clostridium difficile 10. K hodnocení možné křížové reaktivity s TcsL byly kultivovány ve vhodném médiu 2 kmeny Clostridium sordelii (IP82 a RE1522). Supernatant ze 3 dny staré kultury byl použit pro test Rapid-VIDITEST C.dificille toxin A+B. Neobjevily se žádné pozitivní červené linie. Předpokládáme tedy, že se neobjeví žádná křížová reaktivita v testu pro jiné kmeny Clostridium sordelii, které produkují TcsL. Entamoeba histolytica: Byl pozorován určitý stupeň křížové reaktivity s tímto parazitem u vzorků, které obsahovaly jeho vysokou koncentraci. Výsledek testu byl negativní v případě, že se použil izolát (bez matrice vzorku stolice). Výsledky různých ELISA a Rapid testů dávají podobné výsledky pro takovéto vzorky. Bylo prokázáno, že všechny takovéto křížově reagující vzorky stolice se prezentují stejným výsledkem v testu Rapid- VIDITEST C. difficile toxin A+B: toxin A je negativní, zatímco toxin B je slabě pozitivní. Proto doporučujeme použít test E.histolytica jako konfirmační test pro vyloučení přítomnosti tohoto parazita ve vzorku stolice. 9. Bylo pozorováno, že vzorky stolice s vysokým obsahem krve můžou negativně ovlivňovat test. Destabilizace testu je často spojena se změnou barvy kontrolní linie. Fialová nebo tmavě modrá se objeví místo očekávané světle modré (viz. Obrázky v odstavci Interpretace výsledů ). V takovém případě doporučujeme provést test alternativní metodou. 10. Osídlení bakterií Clostridium difficile u kojenců udávané v literatuře je až 50%. Vysoká promořenost se udává také u pacientů s cystickou fibrózou. Obvykle tyto dvě skupiny bývají asymptomatické a nevyžadují žádné specifické léčení. Takovéto pozitivní výsledky, které nemají klinický význam, je potřeba zpracovávat opatrně, protože v tomto případě pacienti nevyžadují léčení této infekce. ANALYTICKÁ CITLIVOST: Abychom mohli stanovit citlivost testu z různých zdrojů, byly použity různé kontrolní vzorky jiných výrobců, ředěné v ředicím roztoku z tohoto testu:připravili jsme interní standard v koncentraci 1 g/ml smícháním stejného množství toxinu A (ref: 152, List Biological Laboratories:) a toxinu B (ref.155). Všechny šarže testu Rapid-VIDITEST C. difficile toxin A+B detekovaly tento standard ředěný nejméně do koncentrace 12 ng/ml pro toxin A a 3 ng/ml pro toxin B, většina šarží byla schopna detekovat toxin A v koncentraci až 6 ng/ml a toxin B pod 1 ng/ml.testy byly dále porovnány s komerčními soupravami Tgc BIOMICs a The Native Antigen. Testem Rapid-VIDITEST byla detekována koncentrace 0.75 ng/ml toxinu A i toxinu B v testu se standardem toxinu A (ref: 01A01-1) a toxinu B (ref.01a02-1) od výrobce tgc BIOMICs, a koncentrace 3 ng/ml toxinu A a 12 ng/ml toxinu B v porovnání s testem toxin A (ref: CDA-TNL) a toxin B (ref: CDB-TNL) od The Native Antigen. 7

8 DIAGNOSTICKÁ CITLIVOST A SPECIFICITA: A.- Externí hodnocení Bylo provedeno externí hodnocení na 150 negativních a 44 pozitivních vzorcích charakterizovaných referenční technikou testem cytotoxicity po 48 hodinách. Všechny vzorky byly čerstvé. Do hodnocení byly zahrnuty stejné vzorky testovány na komerčním imunochromatografickém rychlotestu, podobném testu Rapid-VIDITEST C. difficile toxin A+B. Výsledky získané z obou testů a referenční techniky test cytotoxicity po 24 hodinách byly: Citlivost Specifita Rapid-VIDITEST 92.5% 95.5% C. difficile toxin A+B Jiný komerční rychlotest 87.5% 99.3% Výsledky s testem cytotoxicity po 48 hodinách: Citlivost Specifita Rapid-VIDITEST 84.1% 95.3% C. difficile toxin A+B Jiný komerční rychlotest 79.5% 99.3% Je velice důležité mít na paměti, že vzorky charakterizované jako negativní testem cytotoxicity po 24 hodinách a jako pozitivní po 48 hodinách (4 vzorky v této studii) často korelují s nízkým obsahem toxinů ve vzorku. Proto je velmi pravděpodobné, že koncentrace toxinů v těchto vzorcích je pod detekčním limitem rychlotestu a ve skutečnosti tyto 4 vzorky byly detekovány jako negativní v případě obou rychlotestů (Rapid-VIDITEST C. difficile toxin A+B i jiný komerční rychlotest) a tím je spočtena citlivost nižší. A.- Interní hodnocení Rapid-VIDITEST C. difficile toxin A+B byl testován na 242 negativních a 105 pozitivních vzorcích charakterizovaných testem cytotoxicity. Všechny analyzované vzorky byly zamraženy. Výsledky: Citlivost = 99.0% Specificita = 96.3% Rapid-VIDITEST podle tohoto interního hodnocení vykazuje dobrou citlivost a specificitu, s hodnotami nad 90%. PŘESNOST: OPAKOVATELNOST Purifikované toxiny A a B od firmy ListLabs byly použity pro vynesení křivky citlivost, aby se změřila citlivost testu v různých podmínkách. Ředění bylo provedeno dvojkovou řadou a vzorky byly analyzovány stejnou osobou v tripletu v průběhu jednoho testování. Výsledky se lišily o méně než faktor 2, co značí vysokou přesnost testu. REPRODUKOVATELNOST Jedna šarže testu byla použita k měření křivky citlivosti po dobu čtyř dnů za sebou. Výsledky ukazují vysokou reprodukovatelnost testu (byla získána stejná hladina citlivosti pro TcdA a TcdB ve čtyřech dnech měření) 8

9 Pět různých laboratorních pracovníků bez předchozího zaškolení provádělo měření křivky citlivosti v duplikátu. Rozdíly, které byly získány při větším ředění (slabší signál) nepřesáhly faktor 2. Tři různé šarže testu v duplikátu byly použity pro měření křivky citlivosti. Analýza byla provedena jedním pracovníkem v jeden den. Rozdíly mezi jednotlivými šaržemi byly přijatelné a očekávané, nepřesáhly faktor 2. Rozdíly zjištěné při testování jsou akceptovatelné pro kvalitativní imunochromatografické techniky, berou v úvahu přirozenou variabilitu testu. HOOK EFEKT Několik publikací uvádí, že nejvyšší koncentrace nalezena ve vzorcích stolice je přibližně 112 ng/ml u pacientů s těžkou infekcí C. difficile 11. Abychom zjistili efekt vysoké koncentrace toxinů, byly použity pro testování koncentrace 5000 ng/ml. Jsou to koncentrace mnohem vyšší než se nachází u ICD. Jsou asi 400-krát vyšší než detekční limit pro toxin A (12.5 ng/ml) a 1500-krát než detekční limit pro toxin B (3 ng/ml), a asi 40-krát vyšší než u vzorků od pacientů. Pokles intenzity pozitivního signálu nebyl zaznamenán. INTERFERENCE: Substance uvedené v tabulce v určitých koncentracích neinterferují s výsledkem tohoto testu, když byly přidány do vzorků stolice (pozitivním a negativním): Racecadotril 5% (p/v) Ibuprofen 20% (p/v) Cimetidine 10% (p/v) Acetylsalicylic acid 30% (p/v) Loperamide 5% (p/v) Edulcorant 5% (p/v) Metronidazole 10% (p/v) Palmitic acid 40% (p/v) Omeprazole 3% (p/v) Barium Sulfate 5% (p/v) Ampicillin 15% (p/v) Mucin 5% (p/v) KŘÍŽOVÁ REAKTIVITA S JINÝMI MIKROORGANISMY: Rapid-VIDITEST C.difficile toxin A+B test byl testován se silně pozitivními vzorky pro následující mikroorganismy: Adenovirus - Rotavirus - Norovirus - Astrovirus - Helicobacter pylori - Entamoeba histolytica - Giardia lamblia - Cryptosporidium parvum. Určitý stupeň křížové reaktivity byl zaznamenán u silně pozitivních vzorků na Entamoeba histolytica (viz kapitola Omezení testu ) Křížová reaktivita Rapid-VIDITEST C.difficile toxin A+B byla testována s různými mikroorganismy, které se někdy můžou vyskytovat v trávicím traktu v dostatečně vysoké koncentraci. Testy byly provedeny s bakteriální suspenzí 10 8 cfu/ml. Rapid-VIDITEST C.difficile toxin A+B nevykazoval křížovou reaktivitu s níže uvedenými mikroorganismy: Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Bacillus spp, Bacteroides nordii, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Clostridium butyricum, Clostridium cadaveris, Clostridium perfringens, Clostridium sordellii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli 1, Escherichia coli 2, Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus gosseri, Listeria monocitogenes, Plesiomonas shigelloides, Proteus 9

10 mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteriditis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Shigella dysenterie, Shigella flexnerii, Shigella sonneii, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica. SKLADOVÁNÍ A STABILITA: Skladujte v originálním obalu při teplotě +2 až +30 C. Test je stabilní do data expirace uvedeného na obalu. BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ: 1. Se vzorky stolice pacienta zacházejte jako s potenciálně infekčním materiálem. Při práci používejte ochranné pomůcky (jednorázové rukavice, ochranné brýle, laboratorní plášť a další). 2. Ředicí roztok pro vzorky obsahuje azid sodný jako antimikrobiální činidlo. Vyvarujte se přímého kontaktu roztoku s kůží a sliznicemi. Roztok by neměl být používán, pokud jeví známky kontaminace nebo precipitace. 3. Nejezte, nepijte a nekuřte v místnosti, kde pracujete s testem a vzorky. 4. Po dokončení práce se soupravou vyhoďte jednorázové rukavice, dezinfikujte pokožku rukou alkoholovou desinfekcí, pak omyjte mýdlem Výlevku nebo umyvadlo, které při práci používáte, dekontaminujte vhodným prostředkem proti sporám. Spory Clostridium difficile nejsou alkoholem eliminovány. 5. Nezaměňujete reagencie mezi jednotlivými šaržemi souprav. 6. Nechte reagencie a vzorky vytemperovat na pokojovou teplotu před použitím. Nedostatečně vytemperované reagencie nebo vzorky mohou snížit účinnost testu. Vhodná doba je obvykle minut při pokojové teplotě 7. Všechny reagencie jsou pouze pro účely in vitro. 8. Nepoužívejte soupravu po uplynutí data expirace. 9. Jestliže je poškozený obal soupravy, souprava může být použita pouze, pokud nejsou poškozené obaly jednotlivých reagencií. 10. V případě, že používáte formát Kazety, je velmi důležité aplikovat správný objem extrahovaného vzorku. Pokud aplikujete menší objem, než je doporučen v návodu, vzorek se nemusí dostat vzlínáním do reakční zóny a neobjeví se linie. Pokud aplikujete nadměrné množství vzorku, můžou se objevit místo červené a modré linie, linie hnědé. 11. Test je určen na jedno použití a musí být likvidován v souladu s platnou legislativou. 12. Nepoužívejte test v případě, že se objeví jakákoli barevná linie ještě před provedením testu. 13. Kritický je správný odběr pacientského vzorku: přibližně 75mg pevného vzorku (malá kulička o průměru 3 mm), nebo 75 l kapalného nebo polotekutého vzorku. Toto množství je extrahováno v 1 ml ředicího roztoku, který je součástí soupravy. Pokud odeberete větší vzorek, zachovejte poměr mezi množstvím vzorku a ředicího roztoku. Nadměrné množství vzorku v poměru k přidanému množství ředicího roztoku zabraňuje správnému průběhu chromatografie. Toto je kritické zejména při extrakci pevného vzorku, protože je obtížné odměřit správné množství. Mějte na paměti, že tento test je určen pro analýzu tekutého nebo polotekutého vzorku. 14. Abychom zajistili adekvátní průběh chromatografie, je velmi důležité před odběrem supernatantu centrifugovat 1,5ml mikrozkumavky se vzorkem. Správný výsledek nelze zaručit, pokud jsou nerozpuštěné partikule ponechány v roztoku, aby se usadily než aby byly odstraněny centrifugací. Toto se týká zejména pevných vzorků, kde velké množství suspendovaných částice může interferovat při chromatografii. 10

11 15. Je velmi důležité dobře uzavřít obal testu, pokud test nepoužijete, může dojít ke zvlhnutí stripu a tím k jeho poškození. REFERENCE: 1. Lyras D., O Connor J. R., Howard P. M., Sambol S. P., Carter G.P., Phumoonna T., Poon R., Adams V., Vedantam G., Johnson S., Gerding D. N., Rood J. I. Toxin B in essential for virulence of Clostridium dififcile. Nature Apr 30; 458 (7242): Kuehne S. A., Cartman S. T., Heap J. T., Kelly M. L., Cockayne A., Mintn N. P. The role of toxin A and toxin B in Clostridium difficille infection. Nature in press Sep Vonberg RP, Reichardt C, Behnke M, Schwab F, Zindler S, Gastmeier P. Costs of nosocomial Clostridium difficille-associated diarrhoea. J. Hosp. Infect Sep; 70 (1): Rupnik M., Dupuy B., Fairweather N. F., Gerding D. N., Johnson S., Just I., Lyerly D. M., Popoff M. R., Rood J. I., Sonnenshein A. L., Thelestam M., Wren B. W., Wilkins T. D., von Eichel Streiber C. Revised nomenclature of Clostridium difficille toxins and associated genes. J. Med. Microbiol Feb; (Pt 2): Tucker K. D., Carrig P. E., Wilkins T. D. Toxin A of Clostridium difficille is a potent cytotoxin. J. Clin. Microbiol May; 28 (5): Soehn F., Wagenknecht-Wiesner A., Leukel P., Kohl M., Weidman M., von Eichel-Streiber C., Braun V. Genetic rearrangements in the pathogenicity locus of Clostridium difficille strain implications for transcription, expression and enzymatic activity of toxin A and B. Mol. Gen. Genet May; 258 (3): Barbut F., Mastrantonio P., Delmée M., Brazier J., Kuijper E., Poxton I., European Study Group on Clostridium difficille (ESGCD). Prospective study of Clostridium difficille infections in Europe with phenotypic and genotypic characterisation of the isolates. Clin. Microbiol. Infect Nov; 13 (11): Depitre C., Delmee M., Avesani V., L Haridon R., Roels A., Popoff M., Corthier G. Serogroup F strains of Clostridium difficille produce toxin B but not toxin A. J. Med. Microbiol Jun; 38 (6): Drudy D., Harnedy N., Fanning S., Hannan M., Kyne L. Emergence and control of fluoroquinolone-resistant, toxin A-negative, toxin B-positive Clostridium difficille. Infect Control Hosp. Epidemiol Aug; 28 (8): von Eichel Streiber C., Boquet P., Sauerborn M., Thelestam M. Large clostridial cytotoxins--a family of glycosyltransferases modifying small GTP-binding proteins. Trends Microbiol Oct; 4 (10): Alex B. Ryder, Ying Huang, Haijing Li, Min Zheng, Xiaobo Wang, Charles W. Stratton, Xiao Xu and Yi-Wei Tang. Assesment of Clostridium difficile infections by quantitative detection of TcdB toxin by use of a real-time cell analysis system. Journal of Clinical Microbiology, Nov 2010, pp: POUŽITÉ SYMBOLY: In vitro diagnostický prostředek Expirace Datum poslední revize návodu: září 2014 Šarže Výrobce 11