OBSAH... 2 ÚVOD... 4 BARVIVA V P

Transkript

1 Gymnázium Buďánka Seminární práce chemie vedoucí práce Kristýna Bořánková školní rok /2008 PŘÍRODNÍ BARVIVA A JEJICH DĚLENÍ CHROMATOGRAFIÍ NA TENKÉ VRSTVĚ Ludmila Marečková Sekunda C

2 OBSAH OBSAH... 2 ÚVOD... 4 BARVIVA V PŘÍRODĚ, JEJICH TŘÍDĚNÍ A FUNKCE... 4 PROPOJENÍ BAREV A ZRAKOVÉHO VNÍMÁNÍ... 4 FUNKCE BARVIV U ROSTLIN... 4 Různobarevnost rostlin... 4 Pestré barvy podzimu... 5 VNÍMÁNÍ BAREV U SLUNÉČEK A MOTÝLŮ... 5 PŘÍRODNÍ BARVIVA... 6 Z cytologického hlediska... 6 Z chemického hlediska... 6 I. KAROTENOIDNÍ BARVIVA... 7 Karotenoidy... 7 Karoteny... 7 Xantofyly... 8 II. CHINONOVÁ BARVIVA... 8 Deriváty p benzochinonů... 8 Deriváty,1,4,- naftochinonu... 9 Deriváty antrachinonu... 9 Melaniny... 9 III. PYRANOVÁ BARVIVA... 9 Xantony Flavony a izoflavony Flavonoly Antokyaniny Složitější pyranová barviva IV. PYRROLOVÁ BARVIVA Chlorofyly Fykobiliny V. INDOLOVÁ BARVIVA OPTICKÁ RESONANCE OBECNÝ PRINCIP CHROMATOGRAFIE POLARITA LÁTEK DRUHY CHROMATOGRAFIE A RŮZNÁ USPOŘÁDÁNÍ Typy chromatografických metod Adsorpční chromatografie Rozdělovací chromatografie Chromatografie na měničích iontů Chromatografické techniky Instrumentace sloupcových chromatografií Kolona s chromatografickým materiálem PROČ TÉTO METODĚ ŘÍKÁME CHROMATOGRAFIE? Ludmila Marečková Přírodní barviva 2

3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST JAK PŘÍRODA MÍCHÁ BAREVNÉ ODSTÍNY DĚLENÍ PŘÍRODNÍCH SMĚSÍ BAREV PRINCIP TLC CHROMATOGRAFIE ROZDĚLENÍ VYBRANÝCH ROSTLINÝCH A BAKTERIÁLNÍCH BARVIV JEDNODUCHÝMI CHROMATOGRAFICKÝMI POSTUPY Cíl práce Postup PRO LISTOVÁ BARVIVA PRO NEZNÁMÁ BAKTERIÁLNÍ BARVIVA Závěr pokusu VYHODNOCENÍ VÝSKYTU JEDNOTLIVÝCH BAREV VE VYBRANÝCH SKUPINÁCH ORGANISMŮ POČET RŮZNĚ BAREVNÝCH ROSTLIN V JEDNOTLIVÝCH KNIHÁCH POMĚRY BAREV V PŘÍRODĚ PROCENTUELNÍ POČET BARVY ROSTLIN V PŘÍRODĚ POČET RŮZNĚ BAREVNÝCH BAKTERIÍ VYPĚSTOVANÝCH Z PŮDY NA PETRIHO MISKÁCH BARVY NAŠICH I CIZOKRAJNÝCH MOTÝLŮ ZÁVĚRY POZOROVÁNÍ Rostliny Půdní bakterie Motýli ZÁVĚR SUMMARY (SHRNUTÍ) ZDROJE Ludmila Marečková Přírodní barviva 3

4 ÚVOD Téma Dělení směsí přírodních látek jsem si vybrala kvůli máminu nápadu, že by se mi mohla líbit práce u nich v laboratoři a kvůli tomu, že mě baví chemie. Lákalo mne také zjistit více o barvách v přírodě, protože mě příroda vždy zajímala po estetické stránce. Líbilo se mi, když se půdní bakterie, se kterou jsem pracovala v laboratoři, tak pěkně vybarvila. BARVIVA V PŘÍRODĚ, JEJICH TŘÍDĚNÍ A FUNKCE PROPOJENÍ BAREV A ZRAKOVÉHO VNÍMÁNÍ Včela vidí barvy květů jinak než člověk. Kdybychom si vypůjčili její receptory, viděli bychom například žluté květy (žluté pro člověka) některé jako zelené, jiné bychom ani neviděli, protože by byly ultrafialové. (Zda a jak se včele "vnitřně" barvy jeví, to se ovšem dovědět nemůžeme.). Pro včely je výhodné barevně rozpoznat květy s lahodným nektarem, pro rostliny je výhodné barvou svých květů lákat dobře opylující včely. Tak co bylo dřív: různobarevný svět, nebo různobarevný zrak? Člověk i včela mají tři typy receptorů, holub jich má pět. Že by jeho svět byl ještě pestřejší? Dovedu si představit, že vidím méně barev než normálně (stačí si nasadit jednobarevné brýle), nedovedu si však představit, že naopak vidím nějaké zcela nové a nezvyklé barvy. Přesto se zkusme vžít do holubího světa. Možná, že zatímco my se kocháme pohledem na pestře kvetoucí louku, holub rozlišuje desítky různých blankytů, bělob a šedí oblohy, které mu umožňují vždy poznat, kde je Slunce, kde sever a kolik je hodin. Vědci (E. Thompson, F. J. Varela aj.) se domnívají, že barvám se dá porozumět jedině ve vztahu k vizuálnímu vnímání jednotlivce i druhu. Zároveň však tvrdí, že prožívání barev lze pochopit jen na pozadí ekologického kontextu vzájemného vztahu organizmu s prostředím a s vlastní tělesností. Vnímání nelze oddělit od jednání, a obojí má navíc i evoluční dimenzi, jak jsme ostatně viděli na vztahu včel a květů. U včely tedy nelze ostře odlišovat počitek barvy květu, chuť nektaru a nutkání ke květu letět. Včela nevidí zeleň listí a trávy (zeleň pro človka), asi to nepotřebuje. Opravdu, pokud jsou květy "primárně určeny pro opylovače a pro jeho zrak", pak přece skutečné musí být to, co vidí opylovač, nikoliv člověk. FUNKCE BARVIV U ROSTLIN Různobarevnost rostlin Rostliny vnímají světlo jinak než člověk. Receptorem světla v rostlinách je chlorofyl, který poskytuje rostlinám energii potřebnou pro fotosyntézu. Nejlépe se vytváří v červené a modré oblasti spektra, zelená až žlutá barva zůstává kvůli zelené barvě chlorofylu nevyužita. To je důvodem, proč mnoho rostlin obsahuje další barviva k pohlcování světelné energie pro fotosyntézu i k růstu. Pokud se rostlina nachází ve stínu jiné rostliny, dopadá na ni minimum záření červeného, ale dostatek infračerveného, a rostlina se začne natahovat za světlem, znásobí svůj růst. Barva často závisí na prostředí, v němž rostlina žije. Mnohé mořské řasy Ludmila Marečková Přírodní barviva 4

5 jsou červené nebo dokonce hnědé, protože červené vlnové délky nepronikají příliš dobře vodou. V mělkých vodách jsou řasy ještě zelené, ale s hloubkou získávají tmavší zbarvení, aby lépe pohlcovaly světlo. Další takovou výjimkou jsou například chytré begonie. Často mají listy na svrchní straně zelené a vespod červené. To proto, že v přírodě žijí v tmavých částech lesů. Svrchní část listu tak zachycuje sporé paprsky světla pronikající korunami stromů a spodní červená barva zase pohlcuje hnědé a červené spektrum, odražené od povrchu země, zachytí tak více energie. A co onu červenou barvu způsobuje? Vedle již zmíněných látek karotenu a xantofylu, jsou to antokyany. Tato červená barviva patří do skupiny flavonoidů, látek, které dobře známe například z červeného vína a o kterých už dnes víme, že jsou jedněmi z nejúčinnějších antioxidantů, tedy látek schopných odbourávat nebezpečné volné radikály kolem nás. Pestré barvy podzimu Listnaté stromy na podzim ukončí v listech výrobu chlorofylu a nastartují absorbci nových živin. Při dalším vývoji a tvorbě nových listů budou nejvíce potřebovat chlorofyl, který se stáhne z listů do zásoby. V listech začnou převládat další barviva, jako xantofyl (žlutá), nebo karotenoid (červená). To je důvod proč na podzim, kdy chlorofyl z listů zmizí, vidíme všechny listnaté stromy v krásně oslnivých barvách. To ovšem není všechno. Velkou roli zde hrají i antokyany, vznikající v buněčné cytoplasmě. Jejich funkce není dodnes plně objasněna. Jedním z důvodů jejich tvorby může být ochrana proti škodlivému ultrafialovému záření, či ochrana proti volným radikálům. Největší produkce antokyanů začíná na konci vegetačního období, kdy slouží především k ochraně buněk, jejichž funkce jsou oslabeny nedostatkem chlorofylu. VNÍMÁNÍ BAREV U SLUNÉČEK A MOTÝLŮ Hmyz má oproti savcům posunutou citlivost vnímání různých vlnových délek světla. Obecně platí, že vidí i blízké ultrafialové záření, ale nevidí červenou část spektra. Včela má například maxima citlivosti svých tří očních pigmentů při vlnové délce 340 nm (UV), 450 nm (modrá) a 540 nm (zelená, viz též Vesmír 82, 507, 2003/9). Babočka bodláková má také trichromatický barevný systém s maximy 360, 470, 530 nm (J. Compar. Neurology 458, , 2003), na rozdíl od tetra- až hexachromatického systému otakárků (UV, fialový, modrý, zelený, červený a širokospektrý receptor). U několika druhů baboček byl recentně zkoumán dlouhovlnný rhodopsin a zjistila se maxima citlivosti od 510 do 534 nm. Posuv k modré části spektra je způsoben substitucemi určité aminokyseliny rhodopsinu ve stejné pozici, kde známe substituce způsobující několikananometrový modrý posuv i u savců (J. Experimental Biol. 208, , 2005). Bělásci vidí svět kolem sebe zase jinak, kromě pigmentu absorbujícího v zelené části spektra (560 nm) mají i červený (620 nm) a temně červený (640 nm) receptor (J. Experimental Biol. 207, , 2004). Ludmila Marečková Přírodní barviva 5

6 Slunéčka chovaná v laboratoři byla držena při světle bílém (obsahujícím všechny pro nás viditelné barevné složky podobně jako přirozené sluneční světlo), modrém (s vlnovou délkou kolem 475 nm), žlutém (570 nm) a červeném (650 nm), při stejné celkové intenzitě. Měřili rychlost vývoje, plodnost, množství sežrané kořisti a celkovou fitness. Všechny parametry dosahovaly nejvyšších hodnot při bílém světle, nižších při žlutém, pak při modrém a nejnižších při červeném světle, které je vlastně pro hmyz tmou. Zkrátka slunéčka mají ráda sluníčko. (Eur. J. Entomol. 102, 33 37, 2005) PŘÍRODNÍ BARVIVA Rostlinné pigmenty jsou komplexy chemických látek, které odrážejí určité barvy. Způsobují celkový ráz přírody, který je zvláště patrný na jaře, kdy se nevýrazné barvy náhle změní v zeleň s širokou škálou odstínů. V létě přistupují barvy květů a na podzim po degradaci chlorofylu se mění barvy listů na pestré odstíny červené, oranžové a zlaté. To je výsledek rozkladu některých pigmentů a jejich přeměny v živiny, uzavřené v listech nebo převáděné na rozpustné látky ke skladování mimo list. Pouze bílá barva není vyvolána barvivem, ale vzduchem v intercelulárách.(mezibuněčný prostor v pletivu rostlin). Na rozdíl od ostatních barviv není založena na adsorpci určitých vlnových délek viditelné části spektra, ale na jiných fyzikálních principech. Barviva mají v životě rostlin a živočichů nesmírný význam. Někteří živočichové také mění barvy. Změny jsou sezónní nebo jako u chobotnic pod vědomou kontrolou. U hlavonožců je pigment umístěn ve svalových vláknech, je volně pohyblivý. Jeho rozpínání a stahování dokonce odpovídá nervovým signálům. Změna v umístění nebo v množství pigmentu vede ke změnám zabarvení.protože změna rostlinných barviv se odehrává jedině při rozkladu nebo tvorbě pigmentů, jsou pochody barvoměny u rostlin mnohem pomalejší než u živočichů. Rostlinná barviva se uplatňují především v primárním procesu biosféry - fotosyntéze, při pohybech rostlin a dále v ekologii opylování.(květy rostlin, vytvářející nektar pouze jeden den, večer zblednou. Změna barvy oznamuje, že nektar není. Ušetří se čas opylovače a zvyšuje šance pro návštěvu neopylených rostlin). Barviva dělíme je ze dvou hlavních hledisek: Z cytologického hlediska rozeznáváme tři skupiny: - Chymochromní (hydrochromní) - jsou rozpuštěna v buněčné šťávě vakuol, - Plazmochromní (lipochromní) - jsou součástí plastidů a jsou rozpustné v organických rozpouštědlech, - Membránochromní - impregnují buněčné stěny různých morfostruktur. Z chemického hlediska rozeznáváme pět skupin: - Karotenoidní barviva, - Chinonová barviva, - Pyranová barviva, - Pyrrolová barviva, Ludmila Marečková Přírodní barviva 6

7 - Indolová barviva. I. KAROTENOIDNÍ BARVIVA Patří mezi velmi rozšířené rostlinné pigmenty (asi 270 druhů) v široké barevné škále od žluté, oranžové až po červenou. Jsou to tetraterpeny (přirozené látky hojně rozšířené v rostlinách). Ve svých molekulách mají nejčastěji 40 uhlíkových atomů a jejich konstituční jednotkou je molekula izoprénu. Jejich barva je vyvolána systémem většího množství konjugovaných dvojných vazeb (11a více). Tato barviva se nazývají polyenová. Rozpouštějí se v tucích a nepolárních rozpouštědlech. Rozdělují se na primární a sekundární: -Primární karotenoidy jsou vázané na bílkoviny a jsou obsaženy v chloroplastech jako součást fotosystémů. Absorbují světelnou energii a přenášejí ji na chlorofyl. Jedná se o vedlejší pigment a jeho absorpční spektrum je odlišné od chlorofylů. Primární karotenoidy mají význam též při fototropismu (schopnost orientace organismu směrem ke zdroji světla) a mají ochranný účinek proti fotooxidacím, -Sekundární karotenoidy jsou obsažené v chromoplastech. Jsou součástí květů, plodů, stárnoucích vegetativních orgánů a těl parazitických rostlin. Jejich přítomnost v listech vyniká zvláště na podzim, kdy rostliny štěpí chlorofyl, který je na jaře a v létě zcela překrývá. Karotenoidy se dělí na dvě hlavní skupiny: - Bezkyslíkaté karoteny, - Kyslíkaté xantofyly, nejčastěji alkoholy, aldehydy, ketony a karbonové kyseliny. Význam karotenoidů spočívá v ochraně fotosyntetického aparátu před irreverzibilní fotooxidací, zvláště při nadměrné ozářenosti. Barviva ze skupiny xantofylů vyvolávají tzv. fotoinhibici fotosyntézy prostřednictvím konverze světelné energie na tepelnou a jejím výdejem do prostředí. Karoteny Roku 1831 byly izolovány z kořene mrkve obecné, podle toho také dostali název. Obsahují v podstatě tři pigmenty a, b, g - karoten, které se od sebe liší pouze strukturním uspořádáním na koncích molekuly. B- karoten se od a- karotenu se liší jen rozdílnou polohou dvojné vazby v jednom z kruhů. g - karoten má polyenový řetězec na jednom konci otevřený. Podobá se karotenu lykopenu - červenému barvivu bobulí rajčete jedlého, bobulí melounu cukrového. Toto barvivo má řetězec otevřený na obou koncích. Z hlediska výživy člověka má význam b - karoten, který je prekurzorem (výchozí látkou z níž vzniká chemickou přeměnou výsledný produkt) vitamínu A. U živočichů se karoteny vyskytují v peří papoušků a v krovkách slunéčka sedmitečného. Ludmila Marečková Přírodní barviva 7

8 Xantofyly Nejrozšířenějším barvivem této skupiny je žlutý lutein, derivát a-karotenu s hydroxylovou skupinou na a a bionovému jádru. Provází chlorofyl ve všech zelených částech rostlin, je obsažený v květech a plodech. Je běžně nazýván jako xantofyl. Mezi xantofyly patří dále žlutý zexantin, obsažený v obilkách kukuřice seté, violaxantin v zelených řasách a v asimilačních orgánech všech vyšších rostlin, b- kryptoxantin, anteroxantin, neoxantin a taxaxantin, které bývají součástí fotosystémů. Hnědým barvivem řas Chromophyt je fukoxantin, obsažený zvláště u zlativek, chaluh, rozsivek a různobrvek. Xantofylem s ketonickou skupinou je echinenon, vyskytující se u sinic a u některých zelených řas. Dále červený rodoxantin, obsažený v listech některých taxonů vyšších rostlin, zvláště u okrasných dřevin, také u vranečku Podobnou strukturu mají červená barviva kapsantin a kapsorubin, obsažené v perikarpu bobule papriky roční. Z xantofylů s acyklickou strukturou, s karboxylovými skupinami, ale s menším počtem uhlíků než 40 patří červený bixin. Je obsažený v semenech oreláníku barvířského. Je užívaný k přibarvování másla a sýrů. Bixín je zřejmě hlavní složkou barviva, které získávají jihoameričtí Indiáni z rostliny, kterou nazývají urukú a jímž si natírají tělo. Dále sem patří červený krocetin obsažený v šafránu setém. Hlavním barvivem citrusových plodů je b- citraurin. Obsahuje vedle hydroxylové skupiny i aldehydickou. Žlutá barva peří kanárů a žloutků vajíček ptáků je rovněž způsobená xantofyly. II. CHINONOVÁ BARVIVA Jsou nejrozšířenější skupinou přírodních barviv. Přitom k celkovému zbarvení přispívají méně než ostatní, protože se vyskytují v kořenech a kůře stromů a bývají současně překryty i jinými barvivy. Výjimku tvoří pestré zbarvení hub a lišejníků. Chinony vznikají obvykle z fenolů, přes jejich hydroxylové skupiny, na které bývá glykosidicky vázán cukr. Jsou to různě substituované deriváty benzochynonů, nafto-chinonů, antrachinonu a dalších. Oxidace je katalyzována četnými enzymy obsahujícími měď. Probíhá obvykle přes hydroxychinony - temnání rostlinných pletiv na vzduchu, zejména po poranění (řezy, kaše, šťáva). Nemusí se však zastavit na tomto stupni a potom jejich výsledkem je polymerní tmavé až černé barvivo. Tímto mechanismem lze vysvětlit celkem neobvyklou změnu barvy listů některých druhů hrušní, které zčernají. Jejich glykosid (organické sloučenina vyskytující se v přírodě, často velmi jedovatá) arbutin se enzymaticky štěpí v D - glukózu a hydroxichinon, který se enzymaticky oxiduje na černé barvivo, určující podzimní zbarvení jejich listů. Chinonová barviva obsahují čtyři hlavní skupiny: Deriváty p benzochinonů Patří k nim především barviva hub - hnědý fumigatin z kropidláku, - bronzově purpurový spinulopsin ze štětičkovce, - tmavě fialové krystalky kyseliny polyporové z choroše hlináku červenajícího a další. Ludmila Marečková Přírodní barviva 8

9 Deriváty,1,4,- naftochinonu Do této skupiny patří mnoho běžných sloučenin, jejichž jména jsou obvykle odvozena podle zdroje, z něhož je lze získat. Juglon, izolovaný ze zeleného perikarpu slupek vlašského ořechu ořešáku královského barví kůži hnědě. Jeho izomerem je lawson, účinná složka barvícího prostředku nazývaného hennach, připravovaného z listů lawsonie bílé. Po staletí (od starého Egypta) se užívá k barvení vlasů, vousů a nehtů. Z toho důvodu se lawsonie stále pěstují v severní Africe a jihovýchodní Asii. V kombinaci s jiným rostlinným barvivem indigem, lze docílit různých odstínů vlasů od rudohnědých přes hnědé až k modročerným. Deriváty antrachinonu Nejvýznamnější látkou je alizarin, přítomný v kořenech mořeny barvířské. Má krásně červenou barvu. Francouzi ho užívali v době napoleonských válek k barvení uniforem a Turci k barvení fezů (červená pokrývka hlavy kuželovitého tvaru). Odtud se odvozuje turecká červeň, jež je hlinitovápenatý červený lak vzniklý z alizarinu na na-mořené bavlně. Složitějším derivátem antrachinonu je červený a fluorescující hypericin, obsažený v rostlinách čeledi třezalkovitých. Vyvolává světloplachost a podráždění kůže u býložravců, které je spasou. Melaniny Tvoří makromolekulární barviva s chinonovou strukturou, které vznikají oxidací aminokyseliny tyrosinu.tvorbou melaninu je způsobeno hnědé zbarvení poškozených ovocných plodů, bulev, hlíz, plodnic(řezy, kaše, šťáva). Dělí se na: - Enmelaniny - černohnědá barviva, - Feomelaniny - žlutá až červenohnědá barviva. III. PYRANOVÁ BARVIVA V přírodě jsou pyranová barviva vázána na cukr jako glykosidy, rozpustné ve vodě. Jsou převážně žlutá, červená nebo modrá. Jsou obsažena v květech, plodech a v listech. Jsou odvozena od základního skeletu flavonu (žluté rostlinné barvivo rozpustné ve vodě). Rozdělují se podle toho, od které základní sloučeniny jsou odvozena: - Xantonová barviva, - Flavony a izoflavony, - Flavonoly, - Antokyaniny, - Složitější pyranová barviva. Ludmila Marečková Přírodní barviva 9

10 Flavony, izoflavony, flavonoly a antokyany se označují jako flavonoidy neboli flavanové deriváty. Xantony Tvoří přechod mezi antrachinovými a pyranovými barvivy. Jejich nejrozšířenějším zástupcem je gentisin, žlutá sloučenina obsažená v kořenu hořce. Flavony a izoflavony Zahrnují větší množství žlutých pigmentů, které jsou hydroxyderiváty flavonu a izoflavonu. Patří sem apigenin přítomný v petrželi zahradním, v miříku celeru a v heřmánku lékařském. Dále také genistin kručinky barvířské, který se dříve hojně užíval v barvířství. Základní složkou tzv. bílé mouky na stvolech a listech prvosenky pomoučené je právě flavon. Flavonoly Jsou rovněž hojně rozšířeny v přírodě. Patří k nim i jedno z nejrozšířenějších barviv v přírodě - kvercetin, který lze izolovat z dubové kůry. Vyskytuje se též ve chmelu obecném, čaji, česneku kuchyňském a v plodech jírovce maďalu. Je oranžově hnědý a ovlivňuje permeabilitu (schopnost membrán propouštět tekutiny) buněčných stěn. Antokyaniny Jsou známy jako anthokyany a představují hydroxoderiváty flavyliových solí. Jsou rozmanitě zbarveny od modré přes fialovou až po červenou. Jejich barva je znač-ně závislá na ph prostředí a na přítomnosti iontů některých kovů (zvláště železitých a hlinitých). Podobně jako jiné flavonoidy jsou i anthokyanidy glykosidy. Hydrolýzou se štěpí a vedle cukru poskytují aglykony zvané anthokyanidiny. Anthokyanidy souvisí s příslušnými rostlinami: - Peralgonidin - červené barvivo květů pelargónií, - Kyanidin - červené barvivo květů růží, peckovic třešní a bobulí brusinky obecné, - Delfinidin - modré barvivo květů macešky trojbarevné a bobulí révy vinné, - Petunidin - modročervené barvivo květů petúnie zahradní, - Peonidin - červené barvivo květů pivoněk, - Malvidin - růžově červené barvivo malvic jabloně. Složitější pyranová barviva Jsou to barviva dřev.patří k nim jantarově žlutý brazilin, obsažený ve dřevě sapanů (oranžové až tmavě hnědočervené těžké a tvrdé jádrové dřevo, jež slouží v řezbářství k získávání červeného barviva) a světle žlutý hematoxylin dřeva kreveně. Oxidací obou sloučenin a na světle vznikají oranžová až karmínová barviva (fernam-bukové červené dřevo, kampeškové modré dřevo). Do této skupiny patří také rotenon, který je sice bezbarvý, avšak působením Ludmila Marečková Přírodní barviva 10

11 vzduchu na jeho roztoky vznikají intenzívně zbarvené oxidační produkty. Rotenon je přírodní insekticid, obsažený u kožnatce. Užívá se i v lékařství proti infekcím vyvolanými prvoky. Protože rotenon působí paralyticky na ryby, aniž by je činil nepoživatelnými, využívají některé africké kmeny kořenů rostlin, obsahujících rotenon k pohodlnému rybaření. Strukturně blízký rotenonu je munduseron, kterého užívají afričtí domorodci k odhánění krokodýlů od brodů při převádění dobytka. IV. PYRROLOVÁ BARVIVA Patří k nim dvě významné skupiny rostlinných pigmentů: - Chlorofyly, - Fykobyliny. Jsou to fotosynteticky aktivní zelené pigmenty nacházející se v plastidech (chloro- a chromoplastech). Jejich zásadní fyziologický význam spočívá v konverzi světelného záření ne energii chemických vazeb, neboť jenom listová barviva mají možnost absorbce elektromagnetického záření viditelné části spektra za současného spuštění kaskády biofyzikálních a biochemických dějů v tzv. fotosystémech. Fotosystémy se nacházejí v thylakoidech a jsou to supramolekulární pigmentoproteinové komplexy složené z jádra a světlosběrného systému. Jejich organizace je vícestupňová a funkčně uzpůsobená složitosti fotochemických dějů vlastní fotosyntézy. Zajišťují účinný přenos absorbovaných kvant do reakčních center v nichž dochází k oxidačně redukčním reakcím. Rozlišujeme fotosystém I (PSI), který redukuje NADP+ a fotosystém II (PSII), který se podílí na fotolýze vody. Chlorofyly vytvářejí velké molekuly obsahující dusík. Fyklobiliny neobsahují dusík. Chlorofyly Jsou nejdůležitější fotosynteticky aktivní pigmenty rostlin. Podle Darwina je to nejzajímavější organická sloučenina vytvořená přírodou. V současné době je známo 7 typů - chlorofyl a, b, g, d, e, bakteriochlorofyl a bakterioviridin. Dominantní při foto-syntéze jsou chlorofyl a a chlorofyl b. Vyskytují se ve všech autotrofních organismech, s výjimkou pigmentů bakterií. Chlorofyl b chybí sinicím, chaluhám a ruduchám. Chlorofyl a je modrozelený, chlorofyl b je žlutozelený. Ostatní chlorofyly g, d, e se nacházejí jen v řasách a to v kombinaci s chlorofylem a. Bakteriochlorofyl a bakterio-viridin se vyskytují ve fotosyntetizujících purpurových a zelených sirných baktérií. Jsou lyofilní a jejich roztoky fluoreskující. Snadno podléhají kyselé hydrolýze (degradace na feofytin), izolované jsou fotolabilní. U heliofytů (rostliny rostoucí na slunci) převládá množství chlorofylu a nad chlorofylem b, zatímco sciofilní rostliny 9stínomilné rostliny) mají tento poměr obrácený. Sumární vzorec chlorofylu a C55H72O5N4Mg byl určen Willstätterem, který za tento objev dostal roku 1915 Nobelovu cenu. Molekula chlorofylu má cyklickou - porfirinovou strukturou s 10 dvojnými vazbami, tvořenou čtyřmi pyrolovými jádry, která jsou spojena methinovými můstky. V centru má molekula kov hořčík. Dále je v chlorofylu cyklopentanové jádro, obsahu-jící karboxylovou skupinu. Rozdíl mezi chlorofylem a a chlorofylem b je v tom, že na druhém pyrolu má chlorofyl a metylovou skupinu, zatímco chlorofyl b aldehydickou.oba chlorofyly se od sebe liší rozpustností a absorpčním spektrem. Porfyrinová kostra chlorofylů je dominantní strukturou celé řady dalších biologicky vysoce aktivních látek. Červeného krevního barviva hemoglobinu, který obsahuje železo, červeného barviva nitrogenních bakterií Ludmila Marečková Přírodní barviva 11

12 laeghemoglobinu, obsahujícího molybden, červeného myoglobinu ve svalových buňkách, oxidoredukčního enzymu cytochromu, obsahujícího železo. Do hemoproteinů nepatří modré barvivo hemokyanin měkkýšů a členovců, je to protein s obsahem mědi. Všechny výše uvedené látky mají význam při přenosu kyslíku a elektronů v biologických strukturách. Fykobiliny Jsou to fotosyntetické pigmenty sinic, ruduch a skrytěnek, vázané na bílkovinu. Dále jsou to také hydrofilní barviva, která jsou podobná žlučovým barvivům živočichů.mají tetrapyrolovou strukturu, která je však lineární. Pyroly jsou spojeny methinovými a metylenovými můstky. Neobsahují hořčík ani jiný kov, je pro ně příznačná dosti pevná vazba s bílkovinou.v prokyryontní buňce sinic vytváří fykobiliproteiny na povrchu thylakoidů drobná granulární tělíska. Jsou součástí chloroplastů eukaryotní buňky ruduch a skrytěnek. Fykobiliproteiny jsou aktivní při přenosu světelné energie na chlorofyl a. Mají nepřímou funkci ve fotosyntéze, a proto jsou barvivy vedlejšími, podobně jako karotenoidy. V. INDOLOVÁ BARVIVA Nejznámějším indolovým barvivem je indigo. Chemicky je nazýváme indigolin a známé již starověkým Římanům a Egypťanům. Má krásnou modrou barvu a je obsaženo v modřilci - indigovníku. Tato rostlina obsahuje v listech indikan, jehož hydrolýzou se uvolňuje žlutý indoxyl. Ten pak vzdušnou oxidací poskytuje indigo, které se dnes vyrábí synteticky. K indolovým barvivům.se řadí též hydrochromní betalainy, které dostaly název podle výskytu v rodu řepa. Patří k nim žluté betaxanthiny a červené betakyany. Tyto barevné pigmenty způsobují nádherné zbarvení květů mnoha kaktusových druhů. Jsou obsažena též v klobouku muchomůrky červené, v bulvě řepy salátové a v červených plodech líčidla amerického. Toto barvivo se nazývá rostlinný kermes a používá se k barvení vín a cukrovinek. OPTICKÁ RESONANCE Vznik barevných efektů Interferenční zbarvení, tj. zbarvení optického lomu světla se vyskytuje u mnoha živočichů: motýlů, brouků, vážek, ale i u ptáků, např. zrcátko kachny, hlava kačera, paví pero, straka. Dopadá-li na destičku z dvojlomného materiálu polarizované světlo, obecně se štěpí na dva paprsky, které se šíří různou rychlostí (tj. látka má různý index lomu: n e pro paprsek mimořádný a n o pro paprsek řádný). Mezi paprsky vzniká určitý dráhový rozdíl, který je přímo úměrný tloušťce destičky a rozdílu obou indexů lomu. Oba paprsky se po průchodu skládají, přitom výsledek závisí na fázovém rozdílu, kde λ je vlnová délka dopadajícího světla. Fázový rozdíl vytváří tzv. fyzikální zbarvení. Ludmila Marečková Přírodní barviva 12

13 OBECNÝ PRINCIP CHROMATOGRAFIE POLARITA LÁTEK Polární molekuly tvoří dva póly s částečným nábojem, přičemž části s odlišnými částečnými náboji se přitahují a části se souhlasnými částečnými náboji se odpuzují. Nepolární (neutrální) molekuly by tvořily nežádoucí bariéru mezi přitahujícími se póly molekul a proto jsou vytlačovány. Nepolární látky se tedy s polárními nemísí. Naopak dvě polární látky se mísí, protože jejich molekuly se vzájemně přitahují. Tento princip se uplatňuje při chromatografickém dělení, látky jsou rozdělovány podle polarity. Polární látky mají vyšší afinitu k polární zakotvené fázi (kysličník křemičitý), a zůstávají blíže startu, látky nepolární mají naopak vyšší afinitu k méně polární mobilní fázi (směs organických rozpouštědel), doputují tedy dále. DRUHY CHROMATOGRAFIE A RŮZNÁ USPOŘÁDÁNÍ Typy chromatografických metod Moderní separační techniky, v podstatě chromatografické a elektromigrační metody, umožňují separaci velice složitých směsí a získání jednotlivých složek směsi ve velice čistém až homogenním stavu. Na rozdíl od klasických separačních technik, založených většinou na fázových separacích, je frakcionace látek při chromatografii a elektroforéze dána odlišnou pohyblivostí jednotlivých složek směsi za daných podmínek. Moderní separační techniky v současné době slouží nejen k preparativním účelům, ale i k účelům analytickým. Z původního přístupu, kdy se pomocí separačních metod oddělila stanovovaná látka od směsi a v čistém stavu pak mohla být bez nebezpečí interferencí stanovena, se napojením detektorů na různých bázích, zapisovačů ev.computerů, přešlo k přímému chromatografickému či elektromigračnímu stanovení látek ve směsích. Tyto metody umožňují velice efektivním způsobem sledovat a stanovovat látky i ve velmi složitých směsích, což by bylo jinými metodami neproveditelné. Jak již bylo výše uvedeno, chromatografické metody patří mezi separační metody, u nichž je oddělení látek založeno na různé migraci ( pohyblivosti ). U těchto metod jde pak konkrétně o migraci v systému dvou fází, z nichž obvykle jedna fáze je stacionární ( nepohyblivá ) a druhá mobilní ( pohyblivá ). Z hlediska molekulární kinetiky je chromatografie kontinuálním procesem, v němž je prouděním porušována a difuzí opětně nastolována rovnováha mezi látkami rozpuštěnými ve stacionární a mobilní fázi chromatografického systému. Výsledkem je rozdílná rychlost migrace rozpuštěných látek. Chromatografické metody tvoří široká skupina metod, založených na různých principech separace. Nejčastěji se rozlišují dvě hlavní skupiny chromatografických metod podle charakteru fází, a to plynová chromatografie ( GC ) a kapalinová chromatografie ( LC ). Plynová chromatografie pracuje v systému plyn - pevná látka nebo častěji plyn - kapalina. Kapalinová chromatografie pak v systémech kapalina - kapalina ( LLC ) nebo pevná látka - kapalina ( LSC ). V dalším výkladu se budeme zabývat pouze kapalinovou chromatografií. Ludmila Marečková Přírodní barviva 13

14 Podle principu separace látek při kapalinové chromatografii rozlišujeme : - adsorpční chromatografii - chromatografii na iontoměničích - rozdělovací chromatografii Adsorpční chromatografie je založena na různé schopnosti látek v roztoku adsorbovat se na povrchu pevné fáze - adsorbentu ( říkáme, že látky mají různou afinitu k adsorbentu ). Je to tedy chromatografie ve fázi pevná látka - kapalina ( LSC ). Chromatografie probíhá ve dvou stupních - v prvém stupni dojde k adsorpci látek na adsorbent podle jejich afinity k adsorbentu ( látky s větší afinitou se zacyhtí dříve ), ve druhém stupni je třeba látky z vazby na sorbent uvolnit, desorbovat, což se provádí buď prostou elucí ( vymytím ) nebo vytěsněním roztokem látky, která má k adsorbentu větší afinitu než navázaná látka. Z metod adsorpční chromatografie dnes má mimořádný význam afinitní chromatografie, která je jejím zvláštním případem. Rozdělovací chromatografie probíhá v systému dvou navzájem nemísitelných kapalin ( LLC ) a k separaci dochází na základě odlišnosti rozdělovacích koeficientů ( odtud její název ). Vzhledem k tomu, že v průběhu chromatografie nedochází k vazbě rozpuštěných látek na některou z fází, jde o proces jednostupňových ( odpadá nutnost eluce ). V původním provedení obě kapaliny postupovaly protiproudně, v současné době se však již toto uspořádání nepoužívá, ale jedna z kapalných fází se zakotví na inertní pevný nosič a stane se tak fází stacionární ( nepohyblivou ), zatímco druhá fáze přes tuto fázi přetéká ( fáze mobilní, pohyblivá ). Při normálním uspořádání je stacionární fází vodná fáze ( nebo fáze s vodou mísitelná ), fází mobilní pak fáze nepolární. Nosiči stacionární fáze mohou býr látky, které jsou schopny adsorbovat značné procento vody aniž by se změnilo jejich skupenství ( zůstávají stále v pevném stavu ). Takových látek je celá řada, jmenujme např.neklížený papír, silikagel, dextrany ap. Toto uspořádání umožňuje separovat směsi látek ve vodě rozpustných. Látky rozpustné v nepolárních rozpouštědlech je třeba separovat v tzv.chromatografii s převrácenou fází, při níž se stacionární fází stává fáze nepolární. Problémem až donedávna ovšem byly inertní nosiče pro tento druh chromatografie a problém byl definitivně vyřešen až zavedením chromatografie s vázanou fází. Chromatografii s vázanou fází ( BPC ) můžeme s určitými výhradami zařadit k chromatografii rozdělovací. Stacionární fáze, která v případě klasické chromatografie je zakotvena krátkodosažnými silami na enertním nosiči, se na nosič kovalentně anváže. K tomu se ovšem používají speciální nosiče, nejčastěji podle literárních údajů se chemicky modifikuje silikagel, a to reakcí mezi silanovými skupinami a chlorsilanovou sloučeninou, jejíž uhlíkaté radikály určují charakter chromatografického materiálu. Jde-li o radikály s krátkými uhlíkatými řetězci, sorbent bude mít povrch hydrofilní ( alkoholové, aminové a kyanoskupiny). Alkylové řetězce s 8-22 uhlíky dodají sorbentu charakter hydrofobní a užívají se proto jako stacionární fáze převážně v chromatografii s reversní ( převrácenou ) fází. Speciálním případem rozdělovací chromatografie je i permeační gelová chromatografie, kdy nosičem stacionární fáze je gel a stacionární i mobilní fází je voda, tedy systém voda - voda. Stacionární fáze je však uzavřena v gelu, čímž je zajištěna nemísitelnost s fází mobilní. Díky tomuto speciálnímu uspořádání se zcela mění charakter separace, neboť separaci podle rozdělovacího koeficientu podléhají pouze látky, které proniknou póry gelu k stacionární fázi. Ludmila Marečková Přírodní barviva 14

15 Separace tedy probíhá na základě tvaru a velikosti molekul látek ve směsi. Protože látky, které proniknou dovnitř gelu musí opět difundovat ven a ve svém postupu kolonou se zdrží, postupují kolonou nejrychleji látky s velikou molekulou, které nejsou schopny póry gelu projít. Chromatografie na měničích iontů je LSC ( liquid-solid, tj.kapalina - pevná fáze ) chromatografie, jejíž pevnou fází je intoměnič ( v současné době nejčastěji nosič s navázanými nabitýmu skupinami ). Látky ve směsi se pak separují podle stupně ionizace skupin a jejich afinity k ionexu, tedy podle počtu ionizovaných skupin a velikosti jejich nábojů. Je to opět dvoustupňový proces, neboť v prvé fázi se látky podle velikosti neseného náboje na ionexu zachytí a ve druhé fázi ( ve fázi eluční ) musí být z ionexu vytěsněny sloučeninami s větší afinitou k ionexu nebo změnou ph, přičemž dojde ke změně nábojových vlastností. Chromatografické techniky V průběhu posledních 2-3 desetiletí doznala kapalinová chromatografie značného rozvoje. Byly vyvinuty nové vysoce efektivní chromatografické materiály, což umožnilo provádět chromatografii za zvýšeného a vysokého tlaku. Vyvinul se typ chromatografie, který se označuje HPLC ( high performance liquid chromatography ), tedy vysokoúčinná nebo též vysokotlaká ( P může znamenat i pressure ) kapalinová chromatografie. HPLC ovšem neznamenala ve vývoji chromatografie pouze zvýšení výkonnosti metody, ale vznikl typ chromatografie na kvalitativně vyšší úrovni než chromatografie nízkotlaká. Přitom principy separace zůstávají stejné jako u chromatografie nízkotlaké. Z hlediska provozního můžeme tedy chromatografické metody dělit i podle pracovního tlaku na: - chromatografii nízkotlakou ( též gravitační ) - chromatografii středotlakou ( FPLC - fast protein liquid chromatography ) - asi do 3MPa - chromatografii vysokotlakou ( HPLC ) MPa Podle zůsobu umístění pevné fáze pak rozlišujeme: - chromatografii na sloupci - chromatografii v tenké vrstvě ( TLC - thin layer chromatography ) Chromatografie v tenké vrstvě se pouze zřídka používá jako prostředek stanovení skutečně kvantitativního. Jde spíše o semikvantitativní stanovení, ovšem nejčastěji slouží TLC jako prostředek identifikace látek ve směsi. Používá se převážně k separaci za normálního tlaku. Při TLC se chromatografický materiál rozestře v tenké vrstvě na desku z inertního materiálu ( sklo, hliníková folie ap. ), na desku se nanese vzorek ( obvykle současně se standardy ), deska se pomocí filtračního papíru či papírové vaty napojí na mobilní fázi, která pak přetéká přes stacionární fázi. Když mobilní fáze dojde k okraji desky, deska se vyjme, usuší a separované látky se musí na desce zviditelnit. Nechá se proto nejčastěji proběhnout příslušná barevná reakce podle typu separovaných látek, ev.se detekce provede některým z dalších způsobů popsaných v kapitole Elektromigrační metody. Desku je pak možno kvantitativně vyhodnotit densinometrem. Instrumentace sloupcových chromatografií Vybavení potřebné pro sloupcovou kapalinovou chromatografií se velice liší podle typu chromatografie, který budeme provádět. Zařízení pro nízkotlakou ( gravitační ) Ludmila Marečková Přírodní barviva 15

16 chromatografii je velice nenáročné a nezbytná je vlastně jen skleněná či plastiková kolona přednostně z průhledného materiálu. Naopak zařízení pro HPLC je vždy nákladné. I uvnitř těchto vymezených kategorií jsou značné rozdíly. Dnešní průměrně vybavená chromatografická laboratoř má i pro nízkotlakou chromatografii automatizaci, které umožňuje práci bez neustálé přítomnosti obsluhy. Pokud jde o HPLC zařízení, ta je možno nakoupit v nejrůznějších cenových relacích a podle toho i s odpovídajícím vybavením. Nejmodernější přístroje tohoto typu jsou plně řízeny computery a zaručují přesnou a rychlou práci. Zařízení pro chromatografii obsahují: - kolonu s chromatografickým materiálem - aplikátor vzorku - čerpadlo a reservoár na mobilní fázi - gradientový mixér - detektor - jímač frakcí - výstup analyzovaných dat Kolona s chromatografickým materiálem Je to nejdůležitější část zařízení. Na jejím výběru závisí úspěch separace a stanovení. Důležitá je nejen náplň kolony, ale i rozměry kolony. Chromatografický materiál se vybírá podle toho, jaký chromatografický princip budeme k separaci používat, stejně tak rozměry kolony. Důležitá je i velikost částic chromatografického materiálu. Zatímco pro laboratorní nízkotlakou chromatografii se používají kolony s délkou asi cm a vnitřním průměrem 0,5-5 cm, které si většina spotřebitelů je schopna sama plnit chromatografickým materiálem, pro LHPLC se používají kolony kapilárního typu, jejichž rovnoměrné plnění dostatečně jemným materiálem ( asi 3-10 µm ) je velmi náročné a používají se proto obvykle kolony dodávané komerčně. Obvyklé rozměry kolony pro HPLC jsou: vnitřní průměr 1-25 mm, délka cm. Pro analytické účely se používají kolony o vnitřním průměru 1-3 mm, širší kolony se používají pro gelovou chromatografii. PROČ TÉTO METODĚ ŘÍKÁME CHROMATOGRAFIE? V roce 1906 provedl ruský botanik, fyziolog a biochemik M. S. Cvet experiment, při kterém rozdělil chlorofyl na jeho složky - chlorofyl a, chlorofyl b a karotenoidy. Experiment spočíval v tom, že petroletherový extrakt chlorofylu nechal v kolonce protékat přes sloupec křemeliny (CaCO 3 ). Chlorofylový extrakt se při průchodu kolonkou rozdělil na jednotlivá barviva obsažená v chlorofylu a na kolonce se tak vytvořily jednotlivé barevné zóny viditelné okem. Cvet tuto metodu pojmenoval chromatografie ( barvopis, řec. chroma = barva). V uvedeném popisu prvního chromatografického experimentu je důležité si povšimnout, že tento jednoduchý chromatografický systém obsahoval kapalnou a pevnou fázi. Kapalná fáze byla tvořena petroletherem, ve kterém byla rozpuštěna analyzovaná směs (chlorofyl) a pevná fáze byla tvořena křemelinou. Kapalná fáze se v tomto případě pohybovala skrz fázi pevnou. Nyní se dostáváme k definici chromatografie a k základním pojmům chromatografie jako je mobilní fáze a stacionární fáze. Ludmila Marečková Přírodní barviva 16

17 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST JAK PŘÍRODA MÍCHÁ BAREVNÉ ODSTÍNY DĚLENÍ PŘÍRODNÍCH SMĚSÍ BAREV Lipofilní vlastnosti listových barviv umožňují jejich vlastní extrakci z rostlinného materiálu pomocí organických rozpouštědel. Nejčastěji se používá aceton. Účinnost extrakce zvyšuje dokonalá homogenizace za současné neutralizace extraktu hořečnatými či vápenatými ionty. V kyselém prostředí (tedy bez neutralizace) dochází k odštěpení kationtu hořčíku z molekuly chlorofylu a k malé sterické změně porfyrinového kruhu a současně s tím ke změně zabarvení dohněda. Z chlorofylu pak vzniká feofytin. Karotenoidy a xanthofyly jsou stabilnější, vyskytují se však v rostlinných pletivech v menších koncentracích. Homogenát je možno filtrovat či centrifugovat pro oddělení vysokomolekulárních látek. Po tomto kroku musí být předčištěný extrakt pro další práci (TLC, nebo C18-separace a spektrofotometrie) čirý. Následujícím krokem je chromatografické rozdělení jednotlivých barviv a stanovení jejich obsahu spektrofotometricky. Vhodnou preparační chromatografickou metodou je TLC chromatografie na tenké vrstvě. Existují soustavy TLC využívající různé mobilní směsi z organických rozpouštědel (benzen, benzín, toluen, chloroform, alkoholy, petroleter aj.). Tento typ chromatografie je snadný, rychlý a finančně nenáročný. Finančně náročná je HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie), která je však velmi přesná včetně možnosti finální kvantifikace. Nejčastěji se však používá pro stanovení xanthofylů. PRINCIP TLC CHROMATOGRAFIE TENKOVRSTEVNÁ CHROMATOGRAFIE (TLC) je rozdělovací adsorpční metoda. Používá se k rozdělení směsi listových barviv z extraktu, neboť směs fotosyntetických pigmentů je pro svou složitost nevhodná pro přímou spektrofotometrii. Pro TLC listových barviv lze použít tenkou vrstvu Silufol (komerčně dodávaná hliníková deska se silikagelem, různé rozměry) a vyvíjecí směs (mobilní fáze) benzin : izopropanol : H2O = 100 : 10 : 0,25. Extrakt se směsí barviv se nanese skleněnou kapilárou na pomyslný start na chromatografické desce (cca 1 ml extraktu). Po zaschnutí startu se deska vloží v kolmé poloze do chromatografické komory s mobilní fází. Na základě fyzikálně-chemických interakcí jednotlivých barviv s mobilní a stacionární fází dochází k jejich unášení vzhůru po desce. Finální poloha barviv odpovídá hodnotě R f, což je poměr vzdálenosti středu chromatografické skvrny od startu ke vzdálenosti čela mobilní fáze od startu. Ludmila Marečková Přírodní barviva 17

18 ROZDĚLENÍ VYBRANÝCH ROSTLINÝCH A BAKTERIÁLNÍCH BARVIV JEDNODUCHÝMI CHROMATOGRAFICKÝMI POSTUPY ANEB MOJE PRÁCE V LABORATOŘI. Cíl práce Naučit se připravit jednoduchou chromatografickou soustavu Vyzkoušet správnost a přesnost práce na analýze listových barviv Rozdělit neznámé barvivo oranžové bakterie náhodně izolované z půdy Postup 1) Prostudovala jsem návod na přípravu soustavy pro dělení listových barviv 2) Šla jsem ven natrhat pampelišky, a potom jsem je nastříhala na malé kousky. Když jsem to dodělala, začala jsem seškrabovat neznámou oranžovou půdní bakterii z agaru v Petriho misce, kde mi jí máma vypěstovala. Dala jsem oboje zvlášť do malých zkumavek a nasypala jsem tam skleněné kuličky o průměru 0.5 mm. K listům pampelišky jsem ještě přidala vápenec. Do obou zkumavek jsem napipetovala 0,5 ml acetonu, a pak jsem listí i bakterii mlela v kulovém mlýnku 2 minuty při 2500 kmitech za minutu. Pak jsem oba vzorky stočila na centrifuze 2 minuty při rychlosti 6000 otáček za minutu. Barvivo rozpuštěné v acetonu jsem odpipetovala do čisté zkumavky, aby se znovu neznečistilo. 3) Z čistých zkumavek jsem nanášela postupně obě barviva na silikagelové desky hamiltonovou pipetou po malých kapičkách, do dvou teček po 10 a 20 ml a čárky po 50 ml a barvivo z bakterie se změnilo na růžovou, patrně z důvodu změny ph. Potom jsem do vyvíjecí vany nalila petrolether (benzín) izopropanol a vodu v poměru 100 : 10 : 1,25 a mámin kolega tam opatrně dal obě silikagelové desky. Hned jsme viděli, jak se rozdělují listová barviva, a za chvíli i bakteriální. Desku s listovými barvivy jsme mohli vyndat už po 15-ti minutách, protože už byly všechny složky listového barviva dostatečně rozdělené, ale desku s růžovým barvivem jsme tam museli nechat asi 45 minut. 4) Potom jsme obě desky vyfotili a spočítali R f. Ludmila Marečková Přírodní barviva 18

19 PRO LISTOVÁ BARVIVA β karoten R f = 9 10 Chlorofyly R f = Xanthofyly Rf = Ludmila Marečková Přírodní barviva 19

20 PRO NEZNÁMÁ BAKTERIÁLNÍ BARVIVA Světle růžová R f = Tmavě růžová R f = Obr 1. První dvě lahvičky jsou naplněny rozemletými listy a kolonií bakterie, druhé dvě čistým extraktem barviva v acetonu. Ludmila Marečková Přírodní barviva 20

21 Obr. 2. Rozdělení rostlinných barviv na silikagelové desce. Obr. 3. Rozdělení bakteriálního barviva na silikagelové desce. Ludmila Marečková Přírodní barviva 21

22 Závěr pokusu Listová barviva se rozdělila podle předlohy, daly se rozlišit xantofyly, chlorofyly a karoteny. Neznámé barvivo půdní bakterie se rozdělilo pouze na dvě složky, asi by bylo bývalo lepší vyvíjet ho v méně polární soustavě. VYHODNOCENÍ VÝSKYTU JEDNOTLIVÝCH BAREV VE VYBRANÝCH SKUPINÁCH ORGANISMŮ TABULKA 1 POČET RŮZNĚ BAREVNÝCH ROSTLIN V JEDNOTLIVÝCH KNIHÁCH POMĚRY BAREV V PŘÍRODĚ KNIHA / BARVA bílá modr á, fialov á žlutá, oranžov á Červen á růžová Nový průvodce přírodou The Audubon Society - Field buide to North American Wild Flowers Naše květiny 1. Díl Naše květiny 2. Díl Naše květiny dohromady Alpine flowers celkem každá barva TABULKA 2 PROCENTUELNÍ POČET BARVY ROSTLIN V PŘÍRODĚ 26,34 24,28 27,57 21,81 37,52 13,15 24,37 35,40 37,55 10,78 33,46 18,22 30,30 15,53 25,38 28,79 33,96 13,13 29,46 23,45 27,71 22,51 25,97 23,81 30,97 17,36 26,59 25,07 Ludmila Marečková Přírodní barviva 22

23 TABULKA 3 POČET RŮZNĚ BAREVNÝCH BAKTERIÍ VYPĚSTOVANÝCH Z PŮDY NA PETRIHO MISKÁCH celkem červená zelená šedá bílá, smetanová hnědá, béžová růžová žlutá procenta TABULKA 4 BARVY NAŠICH I CIZOKRAJNÝCH MOTÝLŮ celkem hnědá bílá žlutá černá béžová oranžová červená modrá zelená procenta 33,97 16,10 6,82 3,00 6,14 19,24 3,14 10,91 0,68 ZÁVĚRY POZOROVÁNÍ Rostliny U našich rostlin převládá bílá, a poté s malým rozdílem žlutá. Modré je nejméně. V Alpách se nejčastěji vyskytuje bílá, ale všechny barvy jsou velice vyrovnané. V severní Americe je nejvíce bílé a potom červené, nejméně je modré, podobně jako u nás. Půdní bakterie Půdních bakterií je nejvíce do běla zbarvených, a málo je červených a zelených. Motýli Nejvíce je jich hnědých a oranžových, nejméně zelených Ludmila Marečková Přírodní barviva 23

24 ZÁVĚR Díky této seminární práci jsem se naučila pracovat v laboratoři, s pipetou a použila jsem kulový mlýnek. Sama jsem také pomocí odměrných válců připravila směs mobilní fáze dělící soustavy. Nejvíce se mi líbila práce v laboratoři, a moc mě nebavilo počítání barev rostlin a motýlů. SUMMARY (SHRNUTÍ) Rostlinné pigmenty jsou komplexy chemických látek, které odrážejí určité barvy. Způsobují celkový ráz přírody, který je zvláště patrný na jaře, kdy se nevýrazné barvy náhle změní v zeleň s širokou škálou odstínů. V létě přistupují barvy květů a na podzim po degradaci chlorofylu se mění barvy listů na pestré odstíny červené, oranžové a zlaté. V pokusu jsem si vyzkoušela, jak se rozdělí listové barvivo tenkovrstvou chromatografií. Pomocí atlasů rostlin a motýlů jsem zjistila, že v každé zeměpisné oblasti se vyskytují jiné poměry barev v přírodě. Plant pigments are complexes of chemical compounds, which reflect specific colors. They produce the general image of nature, which is particularly apparent in spring, when monotonous colors change suddenly to green of many shades. In summer appear flower colors and in fall after chlorophyll degradation occur bright shades of red, orange and golden. In the experiment I experienced the separation of leaf pigments with the thin layer chromatography. Also, I found using field guidebooks that each at geographical region appears a different ration of colors. ZDROJE Jiří Davídek a kol., Laboratorní příručka analýzy potravin, SNTL Praha 1977 Jiří Cífka a kol., Chromatografie na tenké vrstvě, Nakladatelství ČSAV Praha 1965 Nový průvodce přírodou The Audubon Society - Field buide to North American Wild Flowers Naše květiny 1. a 2. díl Alpine flowers Vypracovala Ludmila Marečková V Praze, dne Ludmila Marečková Přírodní barviva 24