Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin. Detekce aflatoxinu B 1 ve vybraných potravinách Diplomová práce

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Detekce aflatoxinu B 1 ve vybraných potravinách Diplomová práce Vedoucí práce: MVDr. Olga Cwiková, Ph.D. Vypracovala: Bc. Hana Koubková Brno 2010

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe jsem diplomovou práci na téma Detekce aflatoxinu B 1 ve vybraných potravinách vypracovala samostatně a pouţila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţeném seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a můţe být pouţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis diplomanta.

3 Poděkování Ráda bych na tomto místě poděkovala především vedoucí své diplomové práce MVDr. Olze Cwikové, Ph.D. za cenné rady a připomínky, povzbudivá slova a všechen čas, který mi vţdy s ochotou věnovala. Ráda bych také poděkovala Ing. Tomáši Gregorovi, Ph.D. za pomoc při měření a vyhodnocování. Na závěr děkuji svým rodičům za finanční a morální podporu v průběhu mého studia.

4 ABSTRAKT Aflatoxin B 1 je vysoce toxický a karcinogenní sekundární metabolit, produkovaný především plísněmi Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus. Bývá častým kontaminantem arašídů, ořechů a výrobků z nich. Předloţená diplomová práce se zabývá detekcí aflatoxinu B 1 v těchto potravinách. Na obsah aflatoxinu B 1 bylo testováno celkem 33 vzorků ořechů, arašídů a výrobků z nich. Pro analýzu byla pouţita heterogenní kompetitivní enzymová imunoanalýza (metoda ELISA). Z celkového počtu vzorků bylo 97 % pozitivních na přítomnost aflatoxinu B1 v rozsahu 0,68 7,02 µg/kg. Koncentrace AFB1 nad povolenou legislativní hranicí byla stanovena u 8 vzorků (24 %). Nejvyšší naměřené hodnoty byly zaznamenány ve vzorku vlašských ořechů (7,021 µg/kg). Naopak poměrně nízký obsah této látky obsahovaly mandle (průměrně 0,96 µg/kg). V odvozených výrobcích byly stanoveny vyšší koncentrace aflatoxinu neţ v samotných skořápkových plodech. Klíčová slova: aflatoxin B1, ELISA, suché skořápkové plody ABSTRACT The aflatoxin B 1 is highly toxic and carcinogenic secondary metabolite, which is mainly produced by the fungi Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus. It has been commonly found as contaminants of peanuts, tree nuts and their products. This thesis deals with the detection of aflatoxin B 1 in these foodstuffs. A total of 33 samples of nuts, peanuts and their products were tested for contain of aflatoxin B 1. For analysis was used competitive heterogeneous enzyme immunoassay (ELISA). 97 % of samples were contaminated with aflatoxin B 1 in the range of 0,68 7,02 µg/kg. Levels of AFB1 above the regulatory limits were found in 8 samples (24 %). The highest level of this aflatoxin was detected in a sample of walnuts (7,021 µg/kg). The relatively low content of this substance was involved in almonds (mean value 0,96 µg/kg). The derivate products contained higher concentration of aflatoxin B1 than just nuts. Key words: aflatoxin B1, ELISA, nuts

5 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Vláknité mikroskopické houby Morfologie Rozmnoţování Pohlavní (sexuální) rozmnoţování Nepohlavní (asexuální) rozmnoţování Rod Aspergillus producent aflatoxinů Mykotoxiny Klasifikace Faktory ovlivňující tvorbu mykotoxinů Nejvýznamnější skupiny mykotoxinů Detoxikace mykotoxinů Aflatoxiny Rozdělení Fyzikální a chemické vlastnosti Podmínky vzniku aflatoxinů Toxicita Změny obsahu aflatoxinů při potravinářském zpracování Limity Metody detekce Detekce vláknitých mikromycet Metody přímé mikroskopie Kultivační techniky Stanovení specifických skupin vláknitých mikromycet Chemické a fyzikálně chemické metody... 28

6 Imunologické metody Identifikace vláknitých mikromycet dle makro- a mikromorfologických znaků Chemické metody pro kvalitativní stanovení vláknitých mikromycetů FF MicroPlate firmy Biolog (biochemická metoda) Molekulárně biologické metody Detekce mykotoxinů Vzorkování Extrakce a čištění Vlastní stanovení mykotoxinů MATERIÁL A METODIKA Pouţité přístroje a reagencie Charakteristika materiálu Metoda stanovení Příprava vzorků Analytická metoda Měření absorbance Kalkulace výsledků Metody statistického vyhodnocení VÝSLEDKY A DISKUZE Porovnání výsledků s legislativními limity Porovnání výsledků s výsledky jiných studií ZÁVĚR SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM TABULEK SEZNAM ZKRATEK PŘÍLOHY... 65

7 1 ÚVOD Snad ţádný člověk na světě nemůţe tvrdit, ţe se nikdy nesetkal s vláknitými mikroskopickými houbami. A i kdyby to přece jen tvrdit chtěl, stačí mu vysvětlit, ţe tento název pod sebou skrývá docela obyčejné plísně. V poslední době také stále více proniká do podvědomí lidí fakt, ţe některé plísně mohou produkovat do potravin látky, které jsou toxické pro hospodářská zvířata i pro člověka. Proto se, naštěstí, stále méně setkáváme s nešvary, jakými jsou okrajování plesnivého sýra, odloupávání plísně z dţemů a marmelád či zkrmování plesnivého chleba. Tyto látky - jedy niţších hub, jsou odborníky nazývány pojmem mykotoxiny. Onemocnění způsobená mykotoxiny provázejí lidstvo jiţ od nepaměti, ačkoliv původce těchto chorob nebyl aţ do šedesátých let dvacátého století znám. V některých zemích byly sice mikromycety v potravinách zkoumány (SSSR, Japonsko) nicméně po objevení penicilinu zahltila svět euforie z této podivné léčící plesniviny a výzkumy na dlouhá léta ustaly. Poté však přišel zlom v podobě úhynu velkého počtu krůt v Anglii, jehoţ příčinnou bylo zkrmování zaplísněné arašídové moučky. Od této doby byly vláknité mikromycety i jejich sekundární metabolity intenzivně zkoumány celou řadou vědců po celém světě. Snad nejlépe popsanými mykotoxiny jsou aflatoxiny, produkované především mikroskopickými houbami Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus. Důvodem, proč se aflatoxiny zabývá tak velké mnoţství studií je fakt, ţe patří mezi vůbec nejtoxičtější mykotoxiny. Mnohé z nich jsou karcinogenní a u řady dalších tuto vlastnost předpokládáme, prokázána byla také hepatotoxicita a teratogenita některých aflatoxinů. Jako nejnebezpečnější z aflatoxinů se pak jeví aflatoxin B 1, který je dokonce 68x toxičtější neţ arzén. Kontaminace tímto aflatoxinem bývá velmi často popisována v suchých skořápkových plodech, kterých se v České republice zkonzumuje průměrně 4 kg na osobu a rok, přičemţ Světová zdravotnická organizace (WHO) doporučuje konzumaci ještě navýšit. Nutno však podotknout, ţe podstatné mnoţství ořechů a arašídů je zkonzumováno i v podobě takzvaných odvozených výrobků, tedy především cukrovinek na bázi ořechů, které nejsou v této statistice zahrnuty. Vzhledem k výše uvedeným faktům se předloţená diplomová práce zabývá detekcí aflatoxinu B1 v suchých skořápkových plodech a výrobcích z nich. 8

8 2 CÍL PRÁCE Cílem předloţené diplomové práce bylo: prostudovat moţné metody stanovení aflatoxinu B 1 v potravinách, doplnit literární rešerši bakalářské práce o danou problematiku, ve spolupráci s vedoucím naplánovat druh a schéma odběru vzorku, monitorovat ve vybraných potravinách výskyt aflatoxinu B 1, výsledky vyhodnotit a vyvodit z nich závěry. 9

9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Vláknité mikroskopické houby Vláknité mikromycety jsou spolu s jinými skupinami organismů, které společně sdílejí podobné vlastnosti, řazeny do samostatné říše hub 1 (Malíř, Ostrý, 2003). Na základě velikosti rozeznáváme dvě skupiny hub. První skupina zahrnuje houby mikroskopické, zkráceně zvané mikromycety. Druhou skupinu pak tvoří houby makroskopické velikosti, neboli makromycety (Klaban, 2001). Dosud bylo popsáno 100 tisíc druhů hub a předpokládá se existence více neţ 1,5 milionu druhů (Lederberg, 2000). Mikroskopické houby dále dělíme na vláknité mikroskopické houby, kvasinky a kvasinkovité mikroorganismy (Ostrý, 1998). Pro vláknité mikromycety se všeobecně pouţívá termín plísně (Chumchalová, 2001). Botaničtí systematici však pouţívají název plísně pouze pro houby s nepřehrádkovaným myceliem (Šilhánková, 2002). V současné době existuje několik systémů členění hub, které se shodují v klasifikaci hub do čtyř velkých skupin: Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota a Basidiomycota 2 (Malíř, Ostrý, 2003). Váňa (1998) uvádí následující klasifikaci: Říše: Houby (Fungi) oddělení: Chytridiomycota oddělení: Eumycota (houby vlastní) pododdělení: Zygomycotina pododdělení: Ascomycotina pomocné pododdělení: Deuteromycotina 3 pododdělení: Basidiomycotina Houby obecně patří mezi eukaryota, coţ znamená, ţe mají pravé jádro, individualizované a oblaněné. Jsou tzv. heterotrofní (nejsou schopny samy si 1 Ve starším pojetí říše hub (Fungi) sdruţovala heterotrofní organismy bez plastidů z různých taxonomických skupin, s odlišnou biologií, které byly vymezeny především ekologicky. Na základě studia rdna byl navrţen systém pěti říší obsahující i říši Fungi (Sedlářová, Vašutová 2004). 2 Do říše hub se jiţ v současnosti nezařazují Oomycota. Ty se řadí do říše Chromista. Mezi Oomycota patří mimo jiné také Phytophthora infestans plíseň bramborová (Malíř, Ostrý, 2003). 3 Neboli Fungi imperfecti, mitosporické houby (Malíř, Ostrý, 2003). Do tohoto pododdělení náleţí houby charakteristické absencí sexuálního stádia (Forsythe, Hayes, 1998). 10

10 syntetizovat organické látky z látek anorganických a musí je proto přijímat z prostředí ve formě ţivin). Z hlediska výţivy jsou houby většinou saprotrofové, získávající ţiviny z organických zbytků, nebo parazité, napadající ţivé organismy, kterým odnímají asimiláty a další látky. Tzv. saproparazité jsou navíc schopni, po usmrcení hostitele, změnit svůj způsob výţivy a přeţívat jako saprotrofové na jeho usmrcených buňkách. Houby však mohou získávat organické látky i symbioticky; zde je třeba jmenovat především mykorhizu, a lichenismus (Kalina, Váňa, 2005). Vzhledem k nárokům na kyslík je většina hub striktně aerobní, přesto některé mohou být fakultativně anaerobní a několik druhů je i striktně anaerobních (například mikroflóra bachoru; Lederberg, 2000). Optimální teploty pro růst mikromycet jsou od 18 do 32 C, ačkoliv mnohé přeţívají i pod bodem mrazu. Teplota 71 C je pro houby letální. Některé mikromycety patří mezi termotolerantní a rostou při teplotách kolem 40 C. Dostatečná vlhkost prostředí je důleţitým faktorem pro růst mikromycet, relativní vlhkost nad 65% je podstatná (Macháček, 2004). Šilhánková (2002) uvádí i další zajímavé vlastnosti plísní, je to jejich schopnost rozmnoţovat se za nízké vodní aktivity prostředí či nízkém ph a schopnost napadat neporušená rostlinná pletiva (čímţ se zahajuje i bakteriální rozklad) Morfologie Základem těla mikromycet je vegetativní vláknitý útvar stélka (thallus; Ostrý, 1998). Stavební jednotkou stélky je duté vlákno - hyfa. Ta můţe být opatřena přehrádkou (septum; Ascomycota a mitosporické houby) nebo je coenocytická (bez přehrádek, typické pro spájivé houby - Zygomycota). Typ přehrádky je charakteristický pro jednotlivá oddělení hub. Jednotlivé buňky hyfy mohou mít jedno jádro (monokaryotické mycelium), dvě jádra (dikaryotické mycelium) nebo více geneticky odlišných jader (heterokaryóza; Malíř, Ostrý, 2003). Mycelium je soubor hyf, které se navzájem proplétají. Z hlediska umístění mycelia v přírodním substrátu se rozeznává mycelium extramatrikální a intramatrikální. Extramatrikální mycelium se vyskytuje na povrchu hostitele či na povrchu jeho orgánů. Naproti tomu intramatrikální mycelium se nachází uvnitř pletiv napadené rostliny. Část mycelia vrůstajícího do substrátu se označuje jako mycelium bazální (vegetativní). Druhá část mycelia zůstává nad povrchem a tvoří tzv. mycelium vzdušné (Klaban, 2001). 11

11 Tvrdý polokulovitý útvar tvořený hustou spletí hyf se nazývá sklerocium. Má většinou tmavou barvu a je odolný vůči nepříznivým podmínkám. Koţovitá spleť hyf se nazývá stroma a nalézá se často u plísní parazitujících na ovoci a jiném rostlinném materiálu (Šilhánková, 2002). Některé houby mají schopnost růst v kvasinkové nebo vláknité formě. Tento fenomén se nazývá dimorfismus. Dimorfických je značný počet mikromycet patogenních pro ţivočichy (Lederberg, 2000) Rozmnoţování Plísně se rozmnoţují jednak rozrůstáním hyf, jednak spórami. Spóry vznikají buď vegetativním způsobem (tzv. nepohlavní neboli vegetativní spóry) nebo po spájení (pohlavní spóry; Šilhánková, 2002). Pohlavní spóry se nazývají meiospóry, nepohlavní mitospóry 4. Podle místa vzniku se spóry dělí na exospóry a endospóry. Existují dva základní způsoby vzniku spór thalický a blastický. Thalický vývoj představuje vznik spóry z jiţ existující struktury hyfy, obvykle kombinací lytických procesů a rozpadu hyfy. Při blastickém vývoji se buňky spór tvoří de novo (Malíř, Ostrý, 2003). Cyklus nepohlavního rozmnoţování můţe proběhnout několikrát během vegetační sezóny. Stadium, kdy se houba rozmnoţuje nepohlavně, se označuje jako mitosporická houba; obvykle je toto stadium známo jako anamorfa. Pohlavní stadium nazýváme teleomorfa, hovoříme o meiosporické houbě. Meiosporická houba byla v minulosti často popisována jako jiný druh neţ odpovídající mitosporická houba. Řada druhů dosud představuje tzv. mitotickou holomorfu. Prakticky to znamená, ţe se druh vyskytuje pouze jako anamorfa. Druhy představované mitotickou holomorfou bývají řazeny do pomocné skupiny Deuteromycota. Holomorfou označujeme celou houbu, tj. jedince určitého druhu s jeho dosud známým reprodukčním vybavením, tzn. anamorfou i teleomorfou (Kalina, Váňa, 2005) Pohlavní (sexuální) rozmnožování Většina pravých hub je schopna pohlavního rozmnoţování (meiotické rekombinace), jejímţ výsledkem je tvorba askospór, bazidiospór nebo zygospóry. Pohlavní spóry vznikají u heterothalických druhů spojením jedinců s odlišným pohlavním typem 4 Tyto názvy vychází z pouţitého buněčného dělení. V prvním případě bude pouţita meióza neboli redukční dělení kdy při dělení buněk dochází ke vzniku buněk dceřinných s redukovaným počtem chromozomů. Ve druhém případě, při mitóze, je počet chromozomů zachován. 12

12 u homothalických fúzí kmenů stejného pohlavního typu (Malíř, Ostrý, 2003). Většina plísní je heterothalická (Šilhánková, 2002). Zygomycota jsou charakteristická vytvářením přeměněných hyf zvaných gametangia, které splynou do podoby tlustostěnného zygosporangia obsahujícího zygospóru. Ascomycota neboli houby vřeckovýtrusné produkují pohlavní spóry ve vakovité struktuře zvané vřecko (ascus), spóry se nazývají askospóry. Basidiomycota (stopkovýtrusné houby) produkují své pohlavní spóry na stopkách basidiích (Lederberg, 2000) Nepohlavní (asexuální) rozmnožování Vegetativní spóry se tvoří buď na vegetativních hyfách, nebo na zvláštních fruktifikačních orgánech. Podle způsobu tvorby rozeznáváme oidie neboli artrospóry, které vznikají rozpadem vláken v jednotlivé buňky, blastospóry, které se tvoří pučením a konidie, které vznikají ze základní buňky. Fialospóry vznikají ze speciální lahvovité buňky neboli fialidy. Jestliţe je hyfa nesoucí konidie zřetelně odlišena od ostatních hyf, nazývá se konidiofor (Šilhánková, 2002). Na těchto útvarech vznikají konidie buď přímo nebo nepřímo (z konidiogenních buněk). Rozlišujeme jednobuněčné mikrokonidie nebo vícebuněčné makrokonidie (Malíř, Ostrý, 2003). Endospóry vznikající ve vakovitém útvaru zvaném sporangium se nazývají sporangiospóry. Sporangium je umístěno na sporangioforu. Z potravinářsky důleţitých plísní se sporangia vyskytují pouze u třídy Zygomycetes. Sporangiospóry mají většinou více jader (Šilhánková, 2002). Konidie a sporangiospóry plísní jsou intenzivně zbarvené a vytvářejí většinou na povrchu plesnivých poţivatin zelené, modrozelené, ţluté, hnědé nebo černé skvrny (Görner, Valík, 2004) Rod Aspergillus producent aflatoxinů Aspergillus je anamorfní rod oddělení Ascomycota, řádu Eurotiales a čeledi Trichocomaceae. Z fylogenetického hlediska je pokládán za velmi starý rod 5. Jde o mikromycety vyskytující se na nejrůznějším materiálu, neboť jsou velmi bohatě vybaveny enzymy (amylolytickými, pektolytickými a proteolytickými; Šilhánková, 1995). Rod Aspergillus v současnosti obsahuje více neţ 221 druhů (Malíř, Ostrý, 2003). 5 Kulturní kmeny mikromycetů Aspergillus oryzae a A. sojae jsou pouţívány v Japonsku a v dalších asijských zemích k výrobě fermentovaných potravin několik tisíc let (Malíř, Ostrý, 2003). 13

13 Nepohlavní rozmnoţovací struktury jsou tvořeny konidioforem, který je hlavicově zakončen. Konidiofor je ţlutě nebo hnědě zbarvený. Na vrcholu se pozvolna nebo náhle rozšiřuje v měchýřek. Po celém povrchu nebo na části měchýřku vyrůstají fialidy, a to buď v jedné řadě, nebo ve dvou řadách nad sebou. Fialidy jsou lahvicovitého tvaru a jsou na vrcholu zúţeny v krátký konidiogenní krček. Jím vypučí tvořící se mladé konidie v řetězcích. Měchýřek s fialidami a s řetězci konidií tvoří konidiální hlavici (Malíř, Ostrý, 2003). Průřez rozmnoţovacím orgánem připomínal starým botanikům kropítko, odtud i český název Kropidlák (Šimůnek, 2004). U některých druhů je známa téţ tvorba neuspořádaných asků obsahujících 8 askospór (Šilhánková, 1995). Aspergily ohroţují člověka dvojím způsobem intoxikací a infekcí. Infekční onemocnění se nazývá aspergilóza. Primárně jsou poškozeny dýchací cesty. Nejčastějším původcem mykóz je A. fumigatus, méně A. flavus a A. niger (Bednář aj., 1999). Aspergilus fumigatus je odpovědný etiologicky aţ za 80 % lidských aspergilových infekcí. Jeho nejznámější toxiny jsou fumitremorginy a fumigaklavin (A, B, C, D). Aspergillus niger tvoří nápadně černě pigmentované kolonie. S oblibou roste na pečivu v igelitových sáčcích. Produkuje ochratoxin A. Aspergillus flavus, tvoří ţlutozelené kolonie. Optimálně rostě kolem 35 C. Pro svou teplotní náročnost je nejrozšířenější v subtropech a tropech. Napadá olejnaté plody a potraviny, exotické koření, častý je také v chovech drůbeţe. Tvoří toxiny, z nichţ nejznámější je aflatoxin B. V ovzduší je sezónní plísní s maximem výskytu na podzim (Macháček, 2004). O toxinogenitě tohoto aspergilu svědčí fakt, ţe při ročním testování skladovaných arašídů v Brazílii bylo 93,8 % izolátů A. flavus producenty aflatoxinů B 1 a B 2 (Nakai, 2007). Na potravinách o poměrně nízké vlhkosti (chlebu, obilí, sušeném mase, sušeném ovoci a zelenině) nebo na materiálech obsahujících látky toxické pro většinu organismů se vyskytují druhy skupiny A. versicolor. Z askosporogenních druhů je důleţitý ještě osmofilní A. glaucus, který je příčinou plesnivění dţemů, chleba a jiných potravin o poměrně nízkém obsahu vody (Šilhánková, 1995). Často způsobuje zkázu potravin s vysokým obsahem cukru a soli, například cukrovarnické těţké šťávy (Görner, Valík, 2004). 14

14 3.2 Mykotoxiny Mykotoxiny jsou toxické látky mikroskopických hub nebílkovinné povahy, toxické vůči člověku a (nebo) hospodářským zvířatům a k expozici jimi dochází proti vůli a zájmům člověka (Šimůnek, 2004). Představují nesmírně pestrou skupinu sloučenin, jejichţ relativní molekulová hmotnost běţně nepřesahuje 500 Da (Velíšek, 2002). Mykotoxiny (sekundární metabolity plísní) nejsou nezbytné pro růst a rozmnoţování plísní ve srovnání např. s primárními metabolity (aminokyselinami, mastnými a nukleovými kyselinami nebo proteiny; Ostrý, 2006). Důvod, proč jsou mykotoxiny produkovány je vysvětlován tím, ţe jsou prostředkem vláknitých mikromycet v boji o potravu a v boji o přeţití (Malíř, Ostrý, 2003). V současné době je známo přes 350 mykotoxinů. I nadále jsou objevovány a chemicky charakterizovány další nové mykotoxiny (Ostrý, 2006). Dle Betiny (1990) platí následující pravidla pro produkci mykotoxinů vláknitými mikroskopickými houbami: přítomnost houby ještě není důkazem, ţe produkovala toxin příslušný toxin můţe přetrvávat v potravinách nebo v krmivu, i kdyţ se zde toxinogenní houba uţ nevyskytuje houba můţe produkovat víc neţ jen jeden toxin příslušný toxin mohou produkovat rozdílné rody hub Mykotoxiny vykazují řadu negativních toxických účinků. Významné jsou jejich mutagenní a karcinogenní účinky. Jsou spojovány s celou řadou akutních chronických otrav u lidí, s tzv. mykotoxikózami. K nejstarším popsaným mykotoxikózám patří ergotismus (otrava námelovými alkaloidy), alimentární toxická aleukie (otrava fuzáriovými mykotoxiny) a onemocnění ze ţluté rýţe (otrava např. citrininem; Ostrý, 2006) Klasifikace Mykotoxiny lze rozdělit podle velkého mnoţství kritérií. Ţádné z dosud pouţívaných však nelze povaţovat za univerzálně pouţitelné. Nejjednodušší je rozdělení podle chemické struktury: furanofurany: aflatoxiny, versicolorin aj. substituované pyreny a hydroxypyreny: kyselina koji, sekalonové kyseliny aj. 15

15 substituované chinony: luteoskyrin, rubratoxin nenasycené laktony: patulin, kyselina penicillová griseofulviny: griseofulvin epoxytrichotheceny: deoxynivalenol, T-2 toxin polycyklické substituované indolové deriváty: kyselina cyklopiazonová cyklické dipeptidy: roquefortin, gliotoxin mykotoxiny jiné struktury: zearalenon, curvularin, citrinin, PR-toxin, moniliformin, kyselina betanitropropionová aj. (Šimůnek, 2004). Jako přirozené kritérium klasifikace mykotoxinů lze pouţít mechanismus biosyntézy základního skeletu jejich molekuly (Velíšek, 2002). D Mello (2003) rozděluje mykotoxiny na: vycházející z acetylkoenzymu A, vznikající polyketidovou cestou. Příkladem jsou aflatoxiny, patulin, citrinin a zearalenon vycházející z mevalonové kyseliny, například trichotheceny syntetizované z aminokyselin, například ergotové alkaloidy. Velíšek (2002) dále popisuje mykotoxiny vzniklé reakcí aminokyselin s mevalonátem (tzv. tremorgenní mykotoxiny, jejichţ zástupcem je např. rokvefortin) a tzv. nonadriny, které vznikají reakcemi obdobnými pochodům Krebsova cyklu. Z hlediska toxikologické praxe má značný význam dělení podle toxicity (Šimůnek, 2004). Ostrý (2006) popisuje: dermatotoxiny ( např. trichoteceny) estrogeny (zearalenon) genotoxiny (např. aflatoxiny, sterigmatocystin, ochratoxin A, citrinin, zearalenon, patulin, trichoteceny, fumonisiny) hematotoxiny (aflatoxiny, ochratoxin A, zearalenon, trichoteceny) hepatotoxiny (aflatoxiny, luteoskyrin, sterigmatocystin) imunotoxiny (např. aflatoxiny, ochratoxin A, trichoteceny, patulin) nefrotoxiny (citrinin, ochratoxin A) neurotoxiny (penitrem A, fumitremorgeny, verukulogeny, fumonisiny) toxiny gastrointestinálního traktu (trichoteceny) 16

16 3.2.2 Faktory ovlivňující tvorbu mykotoxinů Tvorba mykotoxinů je závislá, vedle druhu mikroskopické houby, na chemických, fyzikálních a biologických podmínkách růstu. Z hlediska druhových podmínek toxinogenity jde o schopnost houby produkovat ty enzymy, které se podílejí na přeměně prekursoru na mykotoxin. Mezi nejdůleţitější fyzikální vlastnosti ovlivňující tvorbu mykotoxinů patří teplota. Zpravidla existuje určité teplotní rozmezí, uvnitř kterého mohou být mykotoxiny vytvářeny, přičemţ od optima směrem k limitům klesá jednak mnoţství produkovaného toxinu, jednak často i procento kmenů, schopných produkovat detekovatelné mnoţství mykotoxinu. Důleţité jsou i osmotické vlastnosti substrátu, charakteristické nejlépe tzv. vodní aktivitou (Šimůnek, 2004). Pro produkci mykotoxinů je potřebná vyšší vodní aktivita potraviny (Ostrý, 2006) 6. Taktéţ struktura substrátu můţe výrazně ovlivňovat jak dostupnost chemických látek ze substrátu, tak i přístup vzduchu k myceliu. Čas musíme chápat rovněţ jako fyzikální veličinu. I na něm závisí obsah mykotoxinů v substrátu, protoţe mycelium začne produkovat měřitelná mnoţství mykotoxinů aţ po určité době a po vyčerpání zdrojů se produkce zastaví. Obsah mykotoxinů poté klesá přirozeným rozkladem (Šimůnek, 2004). Martochová (2009) udává jako další fyzikální faktor ovlivňující tvorbu mykotoxinů ionizující záření. Z chemických faktorů jmenujme přísun energie a nezbytných chemických látek (Martochová, 2009). Důleţitý je obsah kyslíku v prostředí. Pokles koncentrace O 2 pod 1 % vede k útlumu produkce mykotoxinů (aflatoxin). Výjimkou je plíseň Fusarium verticillioides, která je schopna růst v prostředí s obsahem aţ 60 % CO 2. Obecně lze konstatovat, ţe plísním vyhovuje spíše kyselé, neţ zásadité prostředí (Suchý, 2008). Významné jsou i faktory biologické. Je popsán prudký pokles produkce mykotoxinů ve směsných kulturách. Například japonští autoři pozorovali sníţení aţ ztrátu produkce aflatoxinů kulturou Aspergillus flavus pokud byla ve spórách kmene příměs spor netoxinogenního kmene, popř. jiného druhu (Aspergillus niger; Šimůnek, 2004). Mezi faktory biologické zařazujeme i přítomnost jednoho, resp. více druhů toxinogenních plísní, coţ můţe vést k synergickým i antagonistickým vztahům. Synergické efekty byly zaznamenány například mezi deoxynivalenolem (DON) a kyselinou fusarovou (Suchý, 2008). 6 Velké mnoţství studií prokázalo, ţe teplota a vodní aktivita, která je nejpříznivější pro růst mikroskopických hub nemusí být nezbytně optimální i pro produkci toxinů (Hussein, Brasel, 2001). 17

17 3.2.3 Nejvýznamnější skupiny mykotoxinů Aflatoxiny patří mezí nejpřísněji sledované mykotoxiny pro své extrémně toxické účinky na zdraví člověka i hospodářských zvířat. Tyto mykotoxiny podrobně popisuje kapitola 3.3. Ochratoxin A je typickým kontaminantem kávových (ale také sojových a kakaových) bobů (Komprda, 2004). Hlavním zdrojem ochratoxinu A je obilí. Dalším zdrojem jsou masné výrobky, coţ je dáno faktem, ţe ochratoxin A vytváří rezidua ve tkáních. Byla rovněţ popsána produkce ochratoxinu A kulturními plísněmi, pouţívanými k finalizaci některých uzenářských výrobků (Šimůnek, 2004). Nejvýznamnějšími producenty ochratoxinů jsou plísně Aspergillus ochraceus. V chladnějších klimatických pásmech Evropy jsou producenty ochratoxinu A penicilia, především Penicillium viridicatum. Nejváţnějším biologickým účinkem zaznamenaným u zvířat exponovaných ochratoxinu A je nefrotoxicita, dále byla prokázána jeho hepatotoxicita, genotoxicita, imunotoxicita a karcinogenita (Velíšek, 2002). Patulin je nejtypičtějším kontaminantem ovoce v rámci mykotoxinů. Z takto kontaminované suroviny se patulin přenáší do ovocné šťávy (Komprda, 2004). Při produkci se uplatňují především čtyři rody: Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces a Byssochlamys. Mezi nejdůleţitější patří zejména Penicillium expansum, dále Aspergillus clavatus a Byssochlamys nivea. U patulinu byly popsány účinky imunosupresivní, neurotoxické a mutagenní (Malíř, Ostrý, 2003). Při produkci kyseliny cyklopiazonové se uplatňují především rody Aspergillus a Penicillium. Toxicita se projevuje různými příznaky u různých organismů, např. se jedná o nekrotické účinky na gastrointestinální trakt, ledviny, játra, kosterní svaly a další orgány (Malíř, Ostrý, 2003). V menším mnoţství se mykotoxin pravidelně vyskytuje v plísňových sýrech pod pokryvem P. camemberti, vyskytuje se i v tavených sýrech (kam se dostává s plesnivými odkrojky), plísňových salámech apod. Nedodrţení klasické technologie camembertských sýrů můţe vést k mohutnému vzestupu její koncentrace v plísňovém pokryvu. Dalším uvaţovaným zdrojem je drůbeţí maso (Šimůnek, 2004). 18

18 Fumonisiny jsou skupinou látek (fumonisin A 1, A 2, B 1 B 4 ; nejčastěji je nalézán fumonisin B 1 ), odvozené od nenasycených mastných kyselin. Jsou produkovány některými druhy mikroskopických hub rodu Fusarium a patrně i dalšími mikroskopickými houbami. Vyvolávají několik typů onemocnění hospodářských zvířat, přičemţ nejznámější je leukoencephalomalacie koní a zhoubné nádory u laboratorních potkanů. U člověka existují epidemiologické souvislosti s výskytem karcinomu jícnu. V našich podmínkách je patrně hlavním zdrojem této skupiny mykotoxinů v lidské výţivě kukuřice včetně výrobků z ní (Šimůnek, 2004). Nejvýznamnějšími producenty mykotoxinů ze skupiny trichothecenů jsou fusaria. Největším problémem ve smyslu rizika dietární expozice člověka těmto mykotoxinům je kontaminace cereálií, zvláště pšenice a kukuřice. Na základě experimentů se zvířaty se některé z nich povaţují za potenciálně karcinogenní a mutagenní sloučeniny. Podle charakteristických chemických vlastností se rozlišují 4 podskupiny trichothecenů, a to trichotheceny A, B, C a D. Typ A obsahuje mj. T-2 toxin. K typu B se řadí nivalenol (NIV), deoxynivalenol (DON) a další (Velíšek, 2002). Nejdůleţitější toxické účinky trichothecenů jsou záněty trávicího traktu, poškození krvetvorby, aborty (zvíře), imunosuprese (zvíře; Komprda, 2004). Zearalenon není akutně toxický. Má estrogenní účinky, které byly prokázány u různých zvířecích druhů. Producenty jsou zejména toxinogenní kmeny rodu Fusarium. Hlavním producentem je Fusarium graminearum, která široce infikuje krmivářské a potravinářské obilí. Výskyt zearalenonu v kukuřici má celosvětový význam (Malíř, Ostrý, 2003). Alternáriové mykotoxiny jsou produkovány mikromycety rodu Alternaria v relativně širokém spektru obvykle v předsklizňovém stadiu úrody. Nejčastěji se jedná o kyselinu tenuazovou, alternariol metyléter a aternariol, zatímco altenuen, izoaltenuen a altertoxiny I III se vyskytují méně často. Kyselina tenuazonová je nejvíce akutně toxická. Inhibuje syntézu proteinů, můţe způsobit kardiovaskulární kolaps, vyvolává salivaci, anorexii, erytémy, křeče, zvracení, tachykardii, masivní gastrointestinální hemoragie a smrt. Altertoxiny vykazují vysokou akutní toxicitu, jsou však mikromycety produkovány v malých mnoţstvích a tudíţ představují pro konzumenty menší riziko. Poměrně vysoké koncentrace alternariolu, alternariol 19

19 metyléteru a kyseliny tenuazonové se vyskytly v jablkách, rajčatech a rajčatových protlacích (Malíř, Ostrý, 2003). Citrinin je produkován některými druhy rodu Penicillium a snad i Aspergillus. Původně byl objeven a pouţíván jako antibiotikum, ale pro značnou toxicitu (je nefrotoxický) vyřazen. Můţe se vyskytovat ve ţluté rýţi ale v našich podmínkách je zejména kontaminantem obilí (Šimůnek, 2004) Detoxikace mykotoxinů Mykotoxiny se zpravidla vyznačují značnou odolností vůči vlivům prostředí. Ve velkém se vlastně provádí pouze detoxikace u aflatoxinů. Nejčastěji se uţívá promývání substrátů kapalným čpavkem, jsou známy i pokusy o detoxikaci pomocí kyseliny octové (Šimůnek, 2004). Účinného odstranění aflatoxinů z olejninových šrotů lze dosáhnout pomocí různých rozpouštědel (aceton, ethanol). Jde však o ekonomicky náročný proces, který navíc vede k ochuzení šrotů o řadu rozpustných ţivin a můţe mít vliv na jejich organoleptické vlastnosti. K částečné degradaci aflatoxinů B 1 a G 1 vede téţ reakce s oxidem siřičitým. Toto konzervační činidlo můţe rozkládat i patulin. Pouţívání různých sorbentů pro odstranění mykotoxinů bylo a je předmětem intenzivního studia. Pro odstranění aflatoxinů z mléka, smetany či podzemnicového oleje se osvědčil hydratovaný hlinitokřemičitan vápenatý či bentonit. Zmíněné minerální materiály se někdy přímo přidávají do krmiv s cílem imobilizovat mykotoxiny přímo v trávicím traktu hospodářských zvířat (Velíšek, 2002). Laboratorní sklo se dekontaminuje lázní s louhem a chlornanem sodným. Touto lázní lze ošetřit i potřísněné povrchy. Hladké bezprašné povrchy lze téţ ozařovat UV lampou (má spíše podpůrný a doplňující účinek; Šimůnek, 2004). Biologickou detoxikací se v praxi rozumí biotransformace či biodegradace účinkem enzymů. Slibné výsledky při detoxikaci trichothecenů přinesly biotechnologické metody vyuţívající mikrofloru trávicího traktu monogastrických zvířat (Velíšek, 2002). 20

20 3.3 Aflatoxiny Aflatoxiny patří s ohledem na svoji extrémně vysokou toxicitu mezi nejvíce sledované mykotoxiny (Velíšek, 2002). Historicky byly povaţovány za produkt plísně Aspergillus flavus odtud také pochází název aflatoxin (Aspergillus flavus toxin). Později byla produkce aflatoxinů připsána i jiným druhům (Pohanka, 2008). Výčet aflatoxinogenních mikromycet publikovali Škarková a Ostrý (2003): Aspergillus flavus, A. nominius, A. parasiticus, A. tamarii (u kterého je průkaz toxinogenity a druhové identifikace nutno ještě konfirmovat molekulárně biologickými metodami) a nově popsané druhy A. bombycis, A. pseudotamarii a Aspergillus zhaoqingensis. Malíř a Ostrý (2003) dále uvádějí Aspergilla argeninicus. Bylo však prokázáno, ţe v tropických a subtropických oblastech jsou aflatoxiny produkovány zejména vláknitým mikromycety A. flavus a A. parasiticus (Malíř, Ostrý, 2003). Mezi plodiny, které jsou často napadeny plísněmi rodu Aspergillus patří cereálie (např. kukuřice, čirok, rýţe, pšenice), olejniny (např. podzemnice, sojové boby, slunečnice, bavlna), koření (chilli papričky, pepř černý, koriandr, kurkuma, zázvor aj.) a ořechy (např. mandle, pistácie, vlašský ořech, kokos, para-ořech; Kvasničková, 2010) Rozdělení Přestoţe bylo identifikováno 20 aflatoxinů, pouze 4 z nich tj. aflatoxiny B 1, B 2, G 1 a G 2 se vyskytují přirozeně a jsou významnými kontaminanty široké škály potravin a krmiv (Sherif aj., 2008). Písmena B a G pochází z označení jejich fluorescence v UV světle (blue = modrá, green = zelená; Görner, Valík, 2004). Aflatoxiny pronikají i do mléka a tedy následně do sýrů. Při průchodu mléčnou ţlázou se původní aflatoxiny B 1, B 2, G 1, G 2 transformují na metabolity M 1 a M 2, které jsou ještě podstatně toxičtější neţ výchozí látky (Komprda, 2004). Přechodový faktor, tj. poměr mezi mnoţstvím přijatého prekurzoru a exkretovaným aflatoxinem M 1 se pohybuje zhruba v rozmezí 100:1 aţ 300:1 (Velíšek, 2002). Z kultur A. flavus byly izolovány aflatoxiny GM 1 a GM 2, které jsou hydroxyderiváty aflatoxinu G 1 (Deshpande, 2002). Dihydroxyaflatoxiny se označují M 2a a GM 2a. Relativně netoxické aflatoxiny B 2a a G 2a byly izolovány taktéţ z kultur A. flavus (Betina, 1990). Vznikají neenzymovým působením především nízkého ph na aflatoxiny B 1 a G 1 (Pohanka, 2008). Mezi analogy aflatoxinů, které jsou buď přírodními metabolity nebo produkty biotransformace aflatoxinů patří aflatoxin B 3 a aflatoxikol 21

21 (aflatoxin R 0 ). Aflatoxiny P 1 a Q 1 jsou metabolity aflatoxinu B 1 vznikající jeho biotransformací v ţivočiších. Látky D 1 a D 2 pak vznikají detoxikací aflatoxinů působením amoniaku (Betina, 1990) Fyzikální a chemické vlastnosti Aflatoxiny se rozdělují na skupiny difurokumarocyklopentanů a difurokumarolaktonů (Betina, 1990). Jsou to polycyklické, nesaturované, vysoce substituované kumariny (Malíř, Ostrý, 2003). Obr. 1 Aflatoxin B 1 (Šimůnek, 2003) Po fyzikální stránce představují aflatoxiny skupinu látek s nepolární povahou (Pohanka, 2008). Jsou to krystalické látky (Deshpande, 2002), dobře rozpustné v metanolu, chloroformu, acetonu a acetonitrilu. Teplota tání se pohybuje od 190 C (aflatoxin G 2a ) po 299 C (AFM 1 ). Molekulová hmotnost je nízká, v rozmezí , coţ má vliv na případnou imunitní odpověď u intoxikovaných jedinců (Pohanka, 2008). Fyzikální a chemické vlastnosti aflatoxinu B 1 shrnul Betina (1990): sumární vzorec je C 17 H 12 O 6, relativní molekulová hmotnost 312, teplota rozkladu pak 267 C Podmínky vzniku aflatoxinů Biogeneticky jsou aflatoxiny dekaketidy, které vznikají z acetátu přes polyhydroxyantrachinonové meziprodukty (Betina, 1990). Tvorba aflatoxinů začíná ve stejnou dobu, kdy se tvoří konidie. Největší koncentrace jsou syntetizovány v lag fázi, tj. v období intenzivní sporulace (Malíř, Ostrý, 2003). Produkce aflatoxinů silně závisí na teplotě, vlhkosti, přístupu vzduchu, struktuře a chemickém sloţení substrátu. Důleţité jsou i vlivy doprovodné mikroflóry (například inhibice tvorby aflatoxinů vlivem A. niger). Existují látky, které jsou s to biosyntézu aflatoxinů do určité míry blokovat (Šimůnek, 2004) např. soli benzoové kyseliny, zinek nebo kofein (Velíšek, 22

22 2002), jiné naopak jejich produkci zvyšují (Šimůnek, 2004) např. mastné kyseliny s dlouhým uhlovodíkovým řetězcem nebo propionová kyselina (Velíšek, 2002). Vodní aktivita nezbytná pro růst aflatoxinogenních vláknitých mikromycetů a produkci mykotoxinů se pohybuje mezi 0,83 a 0,87. Zvýšenou syntézu aflatoxinů lze pozorovat při a w 0,95-0,99 a optimální teplotě v rozsahu C. Kolísání teplot je pro tvorbu aflatoxinů méně příznivé neţ konstantní teplota. Koncentrace CO 2 nad 10 % nebo koncentrace O 2 pod 20 % a nad 90 % potlačuje tvorbu alfatoxinů (Malíř, Ostrý, 2003). Minimální teplota pro tvorbu aflatoxinů je 13 C (Šmerák, 2003) Toxicita Aflatoxiny mají toxické, karcinogenní, mutagenní a teratogenní účinky na laboratorní zvířata (Sherif aj., 2008). Nadměrný příjem aflatoxinů organizmem má za následek rozvinutí otravy nazývané aflatoxikóza (Pohanka, 2008). Je to především: A) akutní aflatoxikóza způsobená jednorázovým pozřením středního aţ vysokého mnoţství aflatoxinů. Projevy zahrnují krvácení, akutní poškození jater, otoky, poruchy trávení, vstřebávání a/nebo metabolismu ţivin a případně i smrt (Schmidt, Rodrick, 2003). Nejvyšší akutní toxicitu má aflatoxin B 1, po něm následují s klesající toxicitou aflatoxiny G 1, B 2 a G 2 (Betina, 1990). Hodnota LD 50 byla popsána pro aflatoxin B 1 v rozmezí 1 17,9 mg/kg tělesné váhy v závislosti na typu laboratorního zvířete (D Mello, 2003). Akutní aflatoxikóza není příliš častá. Pravděpodobně první sporadické případy byly popsány v roce 1967 u dětí na Taiwanu. Děti zemřely na jaterní selhání a zdrojem toxinu byla rýţe (Moravcová, Nedělník, 2006). B) chronická aflatoxikóza vzniká dlouhodobější konzumací nízkých aţ středních dávek aflatoxinů (Schmidt, Rodrick, 2003) nejčastěji ze zaplísněných potravin (Pohanka, 2008). Projevy jsou většinou subklinické a tak obtíţně rozpoznatelné. Častějšími symptomy jsou poruchy trávení a růstu (Schmidt, Rodrick, 2003). Nejváţnějším dopadem chronické aflatoxikózy je cirhóza respektive karcinom jater (Pohanka, 2008). Aflatoxin B 1 je nejsilnější známý přírodní karcinogen a nejúčinnější hepatokarcinogen u zvířat (Malíř, Ostrý, 2003). Na moţnost karcinogenního rizika upozornily rozsáhlé epidemiologické studie v Africe a Asii. (Moravcová, Nedělník, 2006). Aflatoxiny jsou také s to vyvolat u člověka Reyův syndrom, kwashiorkor a stavy útlumu imunity. Reyův syndrom je polyetiologický chorobný stav, který lze vyvolat i některými léky, jedy, virovou infekcí a snad existuje i dědičná dispozice. Bylo 23

23 prokázáno, ţe u řady kojenců krmených umělou výţivou je etiologickým faktorem aflatoxin. V Československu bylo publikováno kolem 100 ověřených případů. Onemocnění se vyznačuje rychlým přechodem do těţkého bezvědomí po hořečnatém onemocnění s nespecifickými příznaky, připomínajícími virózu. V komatu se projeví současné těţké postiţení jater a mozku, které je i příčinou smrti. Kwashiorkor se vyskytuje převáţně v rozvojových zemích s výskytem hladomorů. Je původně popsán jako výţivová dysbalance, kdy při relativním energetickém dostatku je nedostatek plnohodnotných bílkovin. Při výzkumech byl zjištěn úzký vztah mezi výskytem tohoto onemocnění a příjmem aflatoxinů potravou, zejména u dětí. Útlum imunity je blokáda proteosyntézy, která zastavuje mnoţení rychle proliferujícíh buněk, kam patří i buňky imunitního systému (Šimůnek, 2004). Další akutní a chronická onemocnění lidí spojovaná s aflatoxiny jsou dle Malíře a Ostrého (2003): cirhóza dětí v Indii, chronická gastritida, respirační onemocnění (mimo jiné popsané i v ČSFR) a mentální retardace dětí. Mezi pozdní toxické účinky pak řadíme mutagenitu, aflatoxiny totiţ mohou přímo pozměnit genetickou výbavu organizmů od prokaryot evolučně výše. Významnější je toto působení u obratlovců včetně člověka (Pohanka, 2008). Z testů vyplynulo, ţe AFB1 vykazuje nejvýznamnější mutagenní aktivitu ze všech dosud studovaných mykotoxinů (Malíř, Ostrý, 2003) Změny obsahu aflatoxinů při potravinářském zpracování Aflatoxiny jsou poměrně hydrofilní sloučeniny, proto není jejich afinita k tukové sloţce potravinářských surovin vysoká a při výrobě rostlinných olejů se koncentrují ve šrotech. Při zpracování mléka, při kterém dochází k oddělení mléčného tuku, je nutné počítat s relativním nárůstem obsahu aflatoxinu M 1 (Velíšek, 2002). AFM1 je vázán na proteinovou sloţku mléka, proto je v sýrech většinou zaznamenáván vyšší obsah neţ v mléce (Moravcová, Nedělník, 2006). V některých případech mykotoxiny nepřecházejí do finálního výrobku (u obilí např. do škrobu a do lihu; Šimůnek, 2004). Aflatoxiny jsou relativně rezistentní k tepelné inaktivaci a ničí se pouze teplotami okolo 250 C (Magan, Olsen, 2004). Rozsah poklesu hladin aflatoxinů pochopitelně závisí na obsahu vlhkosti, mnoţství tuku a dalších sloţkách přítomných v dané potravině. Příklady experimentálních údajů jsou shrnuty v tabulce. V některých 24

24 případech se pokles nálezů tohoto toxinu přičítá jeho vazbě na přítomné organické makromolekuly, zvláště tvorbě komplexů s proteiny (Velíšek, 2002). Tab. 1 Změny obsahu aflatoxinu B 1 a M 1 při zpracování kontaminovaných surovin (Velíšek, 2002) Produkt Podmínky zpracování Ztráty [%] arašídy praţení, 150 C, 30 min 20 suché praţení 31 praţení v oleji 35 výrobky z arašídů praţení, 204 C podzemnicový olej záhřev, 120 C, 10 min 0 rýţe napařování 0 vaření za tlaku, 120 C 27 normální vaření 51 mléko pasterace, 72 C, 45 s 35 sterilace 115 C 19 Magan a Olsen (2004) dále uvádějí příklad praţení kávových zrn při 200 C po dvanáct minut, které způsobilo sníţení hladiny aflatoxinů o 79 %, po patnácti minutách bylo zničeno dokonce 94 % toxinů. Zmiňují také degradaci aflatoxinů v průběhu fermentačních procesů (jmenovitě při výrobě asijské potraviny miso, při kvašení piva, výrobě mléčných produktů či při kynutí chleba). Malíř a kolektiv (2001) naopak upozorňují, ţe aflatoxin B 1 není úplně eliminován v procesu výroby piva (zůstane % původní kontaminace) Limity Dle Ostrého (2006) byla expozice aflatoxinu B 1 prozkoumána na zasedání Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives and Contaminants a na základě tohoto zasedání byl vyhodnocen expoziční limit pro aflatoxin B 1 jako ALARA as low as reasonably achievable co nejniţší moţný přívod. Ostrý (2006) také odhaduje průměrný příjem aflatoxinů v potravinách v rámci ČR pod 3 ng na kilogram tělesné hmotnosti a den. Hygienické limity aflatoxinů v potravinách dle Nařízení komise (ES) č.165/2010 ze dne 26. února 2010, jímţ se mění nařízení (ES) č.1881/2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách, pokud jde o aflatoxiny; jsou uvedeny v příloze 1. 25

25 3.4 Metody detekce V následující kapitole jsou popsány metody stanovení vláknitých mikromycet a mykotoxinů v potravinách Detekce vláknitých mikromycet Metody stanovení a identifikace vláknitých mikromycet v mykologii potravin se dělí na metody kvantitativní a metody kvalitativní (Malíř, Ostrý, 2003). I kdyţ nám tyto metody nestanoví obsah mykotoxinů přímo, mnohé z nich jsou podstatně jednodušší neţ analýza mykotoxinů. Mohou být pouţity jako jakési prvotní detekční metody pro záchyt podezřelých komodit (Stroka, Anklam, 2002). Kvantitativní metody stanovení plísní jsou popsané v článcích , kvalitativní pak od článku dále Metody přímé mikroskopie Metoda Howardova čísla je zaloţena na vytvoření suspenze potraviny a nanesení definovaného mnoţství na podloţní sklo s mříţkou, kde se spóry s úlomky mycelia počítají pod mikroskopem. Howardovo číslo bylo zavedeno do mikrobiologické praxe pro kontrolu rajčatových výrobků (Malíř, Ostrý, 2003). Postup popisuje ČSN Výrobky z rajčat. Stanovení obsahu plísní podle Howarda (Řezníček, 2008). Dále je moţno k detekci vláknitých mikromycet vyuţít specifických barviv, ta mají afinitu k stěnám hyf a spór mikromycet, které zbarví specifickým způsobem. Zbarvené spóry a mycelia jsou vyhodnoceny mikroskopicky. MoldQuant TM -T: slouţí ke stanovení celkového počtu vláknitých mikromycet v syrových rajčatech a zpracovaných rajčatových výrobcích. Měření se provádí na fluorimetru (Malíř, Ostrý, 2003) Kultivační techniky Ke stanovení plísní se vyuţívají také klasické plotnové metody, oproti bakteriím je nutno počítat s delší dobou kultivace. Norma většinou předepisuje i pro stanovení počtů mikroskopických hub diluční metodu, tj. rozmíchání nebo oplach vyšetřovaného materiálu do sterilního fyziologického roztoku, který je dále ředěn a jednotlivá ředění vyočkována na povrch půdy nebo zalita rozvařenou půdou, ochlazenou na cca o C. V případě, ţe lze očekávat přítomnost sporulujících bakterií, přidáváme do půdy antibiotika. Nevýhodou je, ţe vláknité houby při tomto postupu hůře rostou a častěji dojde k jejich potlačení a přerůstání kvasinkami a bakteriemi. Zachycené kmeny 26

26 izolujeme nejlépe na Petriho miskách (Šimůnek, 2003). Kultivační plotnové metody pro stanovení mikroskopických hub jsou v ČR ošetřeny technickými normami (Malíř, Ostrý, 2003). K lednu roku 2010 platí pro výrobky potravinářského průmyslu následující normy: ČSN ISO Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu kvasinek a plísní - Část 1: Technika počítání kolonií u výrobků s aktivitou vody vyšší neţ 0,95; ČSN ISO Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu kvasinek a plísní - Část 2: Technika počítání kolonií u výrobků s aktivitou vody niţší neţ nebo rovnou 0,95; ČSN ISO 6611 Mléko a mléčné výrobky Stanovení počtu jednotek vytvářejících kolonie kvasinek a/nebo plísní Technika počítání kolonií vykultivovaných při 25 C; ČSN ISO Korkové zátky. Stanovení počtu jednotek tvořících kolonie kvasinek, plísní a bakterií schopných růstu v půdě s alkoholem (Řezníček, 2008). Dalšími kultivačními metodami ke stanovení vláknitých mikromycet jsou: Hygicult, Dipslides aj.: Test obsahuje destičku oboustranně pokrytou kultivačním médiem, která je zakotvena ve víčku sterilní nádobky. Odběr vzorku a inokulace se provádějí buď přitlačením destičky na testovaný povrch, ponořením do testovaných tekutin nebo smočením povrchu kultivačního média tekoucí vodou (Smetanová, 2008). Inkubace probíhá při 27 C 3-5 dní (Malíř, Ostrý, 2003). Petrifilmy jsou destičky pro přesnou kontrolu mikrobiologické kvality potravin nebo prostředí potravinářských provozů. Destičky se skládají ze dvou vrstev filmů, které obsahují ţivná média, gel rozpustný ve studené vodě a speciální indikátor, který zvýrazní narostlé kolonie mikroorganismů na destičce (Cacková, 2009). SimPlate: jedná se o speciální plastové misky s jamkami, do kterých se dávkuje rozpuštěné médium smíšené se vzorkem. Součástí média je barevný indikátor usnadňující detekci mikroorganismů. Při vyhodnocování se spočítá počet barevně změněných jamek (Oldřichová, 2003). Mikrobitesty: komerčně vyráběné prouţky, na nichţ je nanesená příslušná ţivná půda (Plášková, 2008). Na českém trhu jsou k dostání mikrobitesty P (ke stanovení plísní) pro běţné tekutiny, pro viskózní tekutiny (smetana, vejce aj.) a v modifikaci otiskové metody ( 2005). Detekční prouţek je při převozu uloţen v plastovém obalu a před otiskem se ponoří do sterilní 27

27 destilované vody a pak se ihned pomocí sterilní pinzety či tyčinky přitiskne na zkoumanou plochu. Po otisknutí se okamţitě vrátí do plastového obalu, který se parotěsně zataví nad plamenem. Takto získané vzorky se kultivují přímo v plastových obalech (Plášková, 2008) Stanovení specifických skupin vláknitých mikromycet Stanovení speciálních skupin mikroskopických hub (xerofilních, toxinogenních, termorezistentních, stresovaných) není technickou normou řešeno. Tyto otázky řeší vydaná doporučení odborníků Mezinárodní komise mykologie potravin (Malíř, Ostrý, 2003). Příkladem je průkaz toxinogenních mikromycetů Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus zpracovaný Ostrým a Škarkovou roku 2003: průkaz je zaloţen na reakci kyseliny aspergilové, produkované toxinogenními mikromycety a ţelezitých iontů, které jsou součástí testovacího média. Při této reakci dochází ke vzniku oranţovo ţlutého komplexu, který způsobuje pigmentaci spodní strany kolonie Chemické a fyzikálně chemické metody Stanovují se chemické látky, které jsou součástí např. stěny hyfy nebo vznikají metabolickou činností mikromycetů (Malíř, Ostrý, 2003). Ergosterol, téţ zvaný provitamin D 2 patří mezi hlavní steroly produkované niţšími i vyššími houbami. Je sloţkou buněčných membrán hub a má podobnou funkci jako cholesterol v ţivočišných buňkách. Můţe být pouţit jako indikátor výskytu plísní. Pro stanovení mnoţství plísní můţe být pouţito také ATP a chitin, které jsou hlavními komponenty buněčných stěn plísní. Nicméně, odhad na mnoţství plísní pomocí stanovení ergosterolu je spolehlivější metodou k detekci a ke stanovení mnoţství existujících mykologických plísní (Kaderová, 2008). Dále se mohou stanovovat volatilní (těkavé) látky, ty vznikají metabolickou činností mikromycetů a jsou indikátorem jejich metabolické aktivity a růstu v potravinách (Malíř, Ostrý, 2003). K identifikaci těchto těkavých látek slouţí v současné době nejčastěji plynová chromatografie s hmotnostní detekcí. Pro detekci lze s výhodou pouţít i zařízení zvaná umělé nosy respektive umělé jazyky (Dohnal aj., 2008). Fluorescenční techniky vyuţívají fluorescenčních činidel a specifických protilátek značených fluorescenčními činidly (Malíř, Ostrý, 2003). V praxi bývá vyuţívána jednoduchá ale nepříliš spolehlivá jasně zeleno-ţlutá fluorescenční metoda. Principem je detekce kyseliny kojové, která je fluoreskujícím metabolitem A. flavus 28

28 (Stroka, Anklam, 2002). Jedná se o nejrozšířenější předběţný test pouţívaný pro aflatoxiny. (Dąbrowski, Sikorski, 2005). Další metody průkazu vláknitých mikromycet jsou dle Malíře a Ostrého (2003): měření vodivosti a stanovení oxidu uhličitého Imunologické metody Mikromycety rodu Aspergillus a Penicillium v potravinách a potravinových surovinách je moţno hodnotit pomocí latex-aglutinačních testů a ELISA metod. Tyto rody produkují imunologicky identické a aktivní extracelulární polysacharidy galaktomanany, které jsou rozpustné ve vodě. Jejich produkce je závislá na rozvoji a hmotnosti mycelia a je tedy v relaci se stavem kontaminace potravin mikromycety (Malíř, Ostrý, 2003) Identifikace vláknitých mikromycet dle makro- a mikromorfologických znaků Určení rodu sledované mikromycety na základě makroskopických a mikroskopických morfologických znaků se provádí podle klíčů vypracovaných pro celé třídy mikromycet nebo pro určité skupiny. Sledujeme: rychlost růstu, charakter povrchu kolonií, barvu mycelia, sporové vrstvy hyf, barvu a vzhled rubu kolonií, přítomnost pigmentu difundujícího do agaru, přítomnost a barvu kapek transpirované kapaliny (výpotku) na vzdušném myceliu, přítomnost zvláštních útvarů viditelných okem (koremia, sklerotia), zápach nebo vůni. Pod lupou prohlédneme větší struktury (charakter mycelia, sklerocií, plodniček apod.), pro studium dalších struktur, na nichţ je zaloţena identifikace, připravíme mikroskopický preparát. Zde sledujeme charakter mycelia, způsob tvoření a uspořádání fruktifikačních orgánů, přítomnost a charakter jiných útvarů (chlamydospory, sklerocium; Lysková, 2005). Povrchovou ornamentaci spór, např. konidií jako identifikační údaj je moţné hodnotit s vyuţitím elektronového mikroskopu (Malíř, Ostrý, 2003) Chemické metody pro kvalitativní stanovení vláknitých mikromycetů Vyuţívá se tzv. elektroforéza izoenzymů, izoenzymy jsou enzymy s geneticky odlišnou strukturou produkované jedním organismem a vykazující stejnou substrátovou a účinkovou specifitu. Izoenzymy se mezi sebou liší fyzikálně chemickými parametry, funkčními vlastnostmi, buněčnou lokalizací nebo distribucí mezi tkáněmi. Na základě těchto a dalších odlišností lze izoenzymy oddělit, isolovat a stanovit (Kodíček, 2007) Primárním experimentálním výstupem izoenzymové analýzy jsou zymogramy 29