Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně. Agronomická fakulta. Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin

Transkript

1 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin MIKROBIOLOGICKÁ CHARAKTERISTIKA PROBIOTICKÝCH PREPARÁTŮ Diplomová práce Vedoucí práce: prof. RNDr. Marta Tesařová, CSc. Vypracovala: Kateřina Horáková Brno 2007

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Mikrobiologická charakteristika probiotických preparátů vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. V Brně, dne Podpis diplomanta.

3 PODĚKOVÁNÍ Děkuji prof. RNDr. Martě Tesařové, CSc. za konzultace, věcné připomínky, odborné vedení a poskytování cenných rad při vypracování této diplomové práce. Také chci poděkovat společnosti Polymer Institute Brno, spol. s r.o. a zejména RNDr. Pospíšilovi za pomoc a odbornou spolupráci. V neposlední řadě děkuji také svým rodičům a blízkým za veškerou podporu.

4 ABSTRAKT Tématem této diplomové práce byla Mikrobiologická charakteristika probiotických preparátů. Cílem bylo provést kvantitativní zhodnocení a prověření účinnosti pěti vybraných probiotických preparátů dostupných v obchodní síti. Běžnými laboratorními mikrobiologickými metodami byl zjišťován počet probiotických bakterií rodů Lactobacillus a Bifidobacterium, jejich antimikrobiální aktivita a rozpustnost jednotlivých preparátů. Dále bylo analyzováno složení obalových materiálů preparátů ve spolupráci se společností Polymer Institute Brno, spol. s r.o. Bylo zjištěno, že počet probiotických bakterií byl v průměru o jeden až dva řády nižší než byl počet uváděný výrobci. Nejvíce se deklarovanému množství přibližoval preparát Lactomax, největší rozdíl byl u preparátu Laktobacily 5. U všech preparátů byla prokázána antimikrobiální aktivita proti patogenní bakterii a to na základě tvorby inhibičních zón. Největší tvorba inhibičních zón se projevila u preparátu Probiotic. Účinnost jednotlivých preparátů může být ale ovlivněna typem materiálu, ze kterého je vyroben obal preparátu. Nejmenší rozpustnost vykazoval obalový materiál použitý u preparátu Laktobacily 5. FTIR analýza prokázala, že důvodem byla zřejmě přítomnost hydrofóbního acetátu a ftalátu celulózy. Klíčová slova: probiotika, Lactobacillus, Bifidobacterium, střevní mikroflóra

5 ABSTRACT K. Horáková: Microbiological characteristics of probiotic preparations The aim of diploma thesis was to analyse counts of probiotic bacteria Lactobacillus and Bifidobacterium in five selected probiotic preparations available in trade network. The result of analyses showed lower counts of bacteria in comparison with data given by producers. On the other hand probiotic bacteria of all preparations exhibited relatively high antimicrobial activity against bacterial pathogen. The efficiency of individual preparations can be influenced by chemical composition of covers. Using FTIR analyse, the presence of hydrofobic acetat and ftalat celulose was proved in the preparation Laktobacily 5. It can be reason of low solubility of this preparation in the solution with different ph. Key words: probiotics, Lactobacillus, Bifidobacterium, gut microflora

6 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Definice termínu probiotikum Mikroorganismy s probiotickými účinky Charakteristika rodů bakterií s probiotickým účinkem Lactobacillus Bifidobacterium Enterococcus Streptococcus Lactococcus Propionibacterium Symbióza mezi probiotickými mikroorganismy Význam probiotik Pozitivní účinky probiotik Antagonistické účinky proti pathogenním bakteriím Protinádorová aktivita Pokles hladiny cholesterolu v krvi Vliv na průjmová onemocnění Laktózová intolerance Atopické onemocnění Nespecifická zánětlivá střevní onemocnění Vliv na vstřebávání minerálů a produkci vitamínů Stimulace imunity Negativní účinky probiotik Vlastnosti probiotických bakterií Zdravotní hledisko Technologické hledisko Mechanizmus působení probiotik Střevní mikroflóra Vývoj střevní mikrofóry od narození Složení střevní mikroflóry... 25

7 3.5 Faktory ovlivňující činnost probiotik a střevní mikroflóru Formy probiotik Legislativa Zdravotní tvrzení a značení Definice pojmů MATERIÁL A METODY Materiál Metody analýzy Příprava laboratorního skla Živné půdy Vlastní provedení mikrobiologického rozboru Kultivace Způsob vyhodnocování výsledků Chemické složení obalů jednotlivých preparátů Rozpustnost preparátů VÝSLEDKY A DISKUZE ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM TABULEK, OBRÁZKŮ A GRAFŮ SEZNAM PŘÍLOH... 48

8 1 ÚVOD Růst zájmu veřejnosti o prostředky, které pozitivně ovlivňují zdraví, harmonizují organismus a posilují imunitní systém, je v posledních letech více než patrný. Zejména obyvatelé vyspělých zemí, kteří jsou každý den vystavováni působení řady škodlivých látek, patří mezi nejčastější spotřebitele nejrůznějších doplňků stravy. Během posledních dvaceti až třiceti let se věnovalo značné úsilí zlepšení zdravotního stavu populace modulací střevní mikroflóry hostilele, neboť není pochyb, že gastrointestinální mikroflóra má značný vliv na zdravotní stav člověka i zvířat. A právě tento příznivý účinek vykazují živé mikroorganismy, které byly označeny jako probiotika. První záznamy o zkoumání živých bakterií lidmi jsou starší více než 2000 let. Slovo probiosis pochází z řečtiny: pro (pro) a biosis (život). První vědecký základ výzkumu probiotik položili začátkem minulého století Mečnikov a Tissier v Instituci Luise Pasteura v Paříži. Mečnikov předpokládal, že obyvatelé balkánského poloostrova se dožívali vysokého věku díky konzumaci kyselého mléka obsahujícího probiotické bakterie Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, které se spolu se Streptococcus salivarius ssp. thermophilus používají k fermentování mléka při výrobě tradičních jogurtů. Tissier studoval dětský průjem a zaznamenal nepřítomnost bakterií nepravidelného Y tvaru, které jsou dominantní ve fekáliích zdravých dětí. Odůvodnil si, že konzumace těchto bakterií, které jsou nyní označovány jako Bifidobacterium, by mohla léčit tyto potíže. 9

9 2 CÍL PRÁCE Cílem této práce bylo běžnými laboratorními mikrobiologickými metodami provést kvantitativní zhodnocení a prověření účinnosti pěti vybraných probiotických preparátů dostupných v obchodní síti. 10

10 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Definice termínu probiotikum Probiotikum je živý mikrobiální dodatek stravy, který prospěšně ovlivňuje hostitele zlepšením jeho střevní mikrobiální bilance. To znamená, že podáváním probiotik se podávají v nadbytku bakterie, které působí prospěšně na zdravotní stav hostitele (KOHOUT, TUČEK, 2002). 3.2 Mikroorganismy s probiotickými účinky Mezi mikroorganismy s probiotickými účinky se podle různých autorů řadí níže uvedené mikroorganismy (KVASNIČKOVÁ, 2000, KLAENHAMMER, 2001, ČURDA et al., 2004, NEVORAL, 2005, TAMIME, 2005, ŠPELINA, 2006). V žádném případě ale následující seznam nelze považovat za úplný (pozn.: takový vyčerpávající seznam nebyl nikde publikován). Laktobacily Bifidobakterie Lactobacillus acidophilus Lactobacillus casei ssp. rhamnosus Lactobacillus casei Shirota Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Lactobacillus reuteri Lactobacillus fermentum Lactobacillus plantarum Lactobacillus gasseri Lactobacillus salivarius Lactobacillus johnsonii Lactobacillus paracasei Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium adolescentis Bifidobacterium infantis Bifidobacterium longum Bifidobacterium breve Bifidobacterium lactis 11

11 Grampozitivní koky Lactococcus lactis ssp. cremoris Lactococcus lactis ssp. lactis Streptococcus salivarius ssp. thermophilus Enterococcus faecium Propionibacterium freudenreichii Kvasinkové mikroorganismy Saccharomyces boulardii Ačkoliv jsou Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus a Streptococcus salivarius ssp. thermophilus uváděny jako probiotika, nepřežívají tyto bakterie průchod horní částí gastrointestinálního traktu (ČURDA et al., 2004). Jejich prospěšné účinky spočívají v tom, že slouží jako zdroj enzymů, které zlepšují zažívání ve střevě. Například betagalaktosidasa je potřebná pro štěpení laktózy (GILLILAND, 2001) Charakteristika rodů bakterií s probiotickým účinkem Lactobacillus Laktobacily jsou grampozitivní nepohyblivé tyčinkovité bakterie o velikosti 0,5-1, µm, nesporulující, fakultativně anaerobní nebo mikroaerofilní. Hlavním metabolitem je kyselina mléčná ale i octová, ethanol a CO 2. Jsou všeobecně acidotolerantní až acidofilní, ph snižují až pod 4,0, tím působí inhibičně až mikrobicidně (zvláště málo disociované kyseliny mléčná a octová). Optimální růstová teplota je 30 až 40 C, optimumální ph je obvykle mezi 5,5 až 6,2 (GÖRNER, VALÍK, 2004). Jsou klasickými představiteli bakterií mléčného kvašení (KILLER et al., 2006). Laktobacily jsou široce rozšířené v prostředí, obzvláště v nejrůznějších potravinách živočišného nebo rostlinného původu, nápojích, čisté i znečištěné vodě, kysaném zelí, silážích. Běžně osídlují gastrointestinální trakt ptáků a savců, vagínu savců a jsou součástí ústní flóry mnoha teplokrevných živočichů včetně člověka. Pouze vzácně jsou patogenní. Na základě konečných produktů fermentace cukrů je možno rozdělit laktobacily do tří skupin (GÖRNER, VALÍK, 2004, SEDLÁČEK, 2007): Skupina I obligátně homofermentativní (tab.1): hexózy fermentují výhradně na kyselinu mléčnou; pentózy ani glukonát nefermentují. 12

12 Tab.1 Obligátně homofermentativní laktobacily Druh ssp. Prostředí ve kterém se převážně vyskytuje a jiné charakteristiky L. delbrueckii ssp. bulgaricus Jogurty a sýry L. acidophilus Intestinální trakt lidí a zvířat, ústní dutina lidí L. salivarius Ústní dutina a intestinální trakt lidí a zvířat Skupina II fakultativně heterofermentativní (tab.2): hexózy fermentují na kyselinu mléčnou, či na směs kyseliny mléčné, octové, mravenčí a ethanolu; pentózy fermentují na kyselinu mléčnou a octovou. Tab.2 Fakultativně heterofermentativní laktobacily Druh ssp. Prostředí ve kterém se převážně vyskytuje a jiné charakteristiky L. casei ssp. rhamnosus Mléko, sýry, mléčné výrobky, pekařské kvasnice, kravský hnůj, siláž, intestinální trakt a ústní dutina lidí L. plantarum Mléčné výrobky, siláž, kysané zelí a jiná zelenina, pekařské kvasnice, intestinální trakt a ústní dutina lidí, kravský hnůj Skupina III. Obligátně heterofermentativní (tab.3): hexózy fermentují na kyselinu mléčnou, octovou (ethanol) a CO 2 ; pentózy fermentují na kyselinu mléčnou a octovou. Tab.3 Obligátně heterofermentativní laktobacily Druh ssp. Prostředí ve kterém se převážně vyskytuje a jiné charakteristiky L. fermentum Kvasnice, mléčné výrobky, pekařské kvasnice, fermentovaný rostlinný materiál, kravský hnůj, intestinální trakt a ústní dutina lidí L. reuteri masné výrobky, lidské a zvířecí fekálie 13

13 Bifidobacterium Charakteristiku tohoto rodu uvádějí MAXA, RADA (2002), GÖRNER, VALÍK (2004), TAMIME (2005). Bifidobakterie byly izolovány ze stolice kojenců již v roce 1900 v Německu a byly označeny jako Bacillus bifidus. Jsou to grampozitivní tyčinky vyskytující se jednotlivě, v řetízcích nebo v hvězdicovitém, palisádovitém či nepravidelném uspořádání, o velikosti 0,5-1,3 1,5-8 µm, nesporulující, striktně anaerobní. Některé druhy tolerují O 2 v přítomnosti CO 2 a v mléce, když rostou spolu s přirozeným střevním partnerem Lactobacillus acidophilus. Jsou heterofermentativní, ze 2 molů hexosy produkují 3 moly kyseliny octové a 2 moly kyseliny mléčné. Kyselina mléčná je převážně v L(+) formě a je tudíž snadno metabolizovatelná dětským organismem, optimální teplota růstu je C, ph 6,5-7,0. Bifidobakterie produkují zejména thiamin a laktoflavin, jakož i některé další vitamíny ze skupiny B a K. Mají antikancerogenní a anticholesterolemický účinek. Základním médiem pro bifidobakterie je trypton agar (TPY), na kterém rostou všechny doposud identifikované kmeny a to nejlépe ve vpichu za anaerobních podmínek. Bifidobakterie jsou podle japonských studií daleko důležitější než laktobacily. Jsou relativně odolnější proti kyselému prostředí žaludku, alkalické reakci tenkého střeva a zejména proti žlučovým kyselinám. Tolerance bifidobakterií závisí na jednotlivých druzích. B. longum ukázal lepší schopnost přežívat za kyselých podmínek a žluči než B. infantis, B. adolescentis a B. bifidum. Nepřítomnost bifidobakterií v trávícím traktu člověka indikuje jeho nenormální stav a pravděpodobné zdravotní problémy. Bifidobakterie se nacházejí v ústech, ve střevním traktu teplokrevných obratlovců včetně člověka, u hmyzu a v odpadních vodách. Nejvyšší počty jsou nalézány ve výkalech kojenců krmených mateřským mlékem (bifidus faktor), kde se nacházejí převážně druhy B. infantis, B. breve, zatímco u dospělých převládají B. adolescentis a B. longum Enterococcus Zástupci tohoto rodu jsou grampozitivní koky, někdy mírně oválné, o velikosti 0,6-2 0,6 2,5 µm, nesporulující, fakultativně anaerobní. Optimální teplota pro růst je 14

14 37 C, snáší vyšší koncentraci NaCl, jsou odolné i vůči nízké aktivitě vody, přežívají záhřev 60 C po dobu 30 minut. Význam v potravinářství je na první pohled protichůdný. Původním místem výskytu je intestinální trakt zvířat a lidí. Sekundárně se vyskytují v mléce a mléčných výrobcích, v potravinách s vyšším obsahem soli. Potraviny po fermentaci často obsahují velké množství enterokoků jako složky přírodního společenstva (v tomto případě je mylné je považovat za indikátor fekálního znečištění), ve fermentovaných potravinách se enterokoky podílejí na tvorbě senzoricky aktivních látek ovlivňujících chuť a vůni výrobku (GÖRNER, VALÍK, 2004). E. faecium se vyskytuje ve stolici člověka i živočichů, u hmyzu, na rostlinách, v potravinách (mléčných), je to klinický materiál (SEDLÁČEK, 2007) Streptococcus Jsou to grampozitivní koky o velikosti menší než 2 µm, oválné nebo vejčité buňky vyskytující se po dvojicích nebo v řetízcích, nesporulující, fakultativně anaerobní, homofermentativní. Fermentují laktosu na kyselinu mléčnou, v alkalickém prostředí produkují z glukosy významné množství ethanolu, kyseliny octové a mravenčí, optimální teplota růstu je 37 C a nižší mimo S. salivarius ssp. thermophilus. Streptococcus salivarius ssp. thermophilus fermentuje zejména glukosu, laktosu, manosu a fruktosu. Optimální teplota pro růst je C, minimálně C, maximálně 52 C. Roste dobře i při 37 C. Vyskytuje se v mléce a mléčných výrobcích přirozeně i jako složka čistých mlékařských kultur používaných k výrobě jogurtů, tvarohů, sýrů. Může se vyskytovat jako nežádoucí kontaminace výměníků tepla - pasterů a odparek na mléko. Divoké kmeny působí chyby při zrání sýrů (GÖRNER, VALÍK, 2004) Lactococcus Tento rod byl vyčleněn z rodu Streptococcus. Laktokoky jsou grampozitivní ovoidní buňky vyskytující se v párech nebo v řetízcích, o velikosti 0,5-1,2 0,5-1,5 µm, nesporulující, fakultativně anaerobní, homofermentativní. Optimální teplota růstu je 30 C. Jsou součástí čistých mlékařských kultur používaných při výrobě smetany, másla, kysaného mléka, tvarohů a sýrů. 15

15 Některé kmeny L. lactis ssp. lactis tvoří bakteriocin nisin (GÖRNER, VALÍK, 2004) Propionibacterium Rod Propionibacterium je představitelem grampozitivních bakterií. Jsou to morfologicky proměnlivé tyčinky, někdy větvené (X, Y), o velikosti 0,5-0,8 1-5 µm, nesporulující, anaerobní až aerotolerantní, optimální teplota růstu je C. Sacharidy fermentují za produkce kyseliny propionové, CO 2 a H 2 O a menšího množství ostatních kyselin (mléčné, mravenčí ). Byly navrženy na přípravu vitaminu B 12, který uvolňují do prostředí. P. freudenreichii se vyskytuje v sýrech s vysokodohřívanou sýřeninou (ementál), vytváří oka v těstě (GÖRNER, VALÍK, 2004) Symbióza mezi probiotickými mikroorganismy Jednotlivé druhy mohou mít mezi sebou symbiotický vztah. Např. v jogurtech, kdy Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus uvolňuje aminokyseliny, kterých využívá Streptococcus salivarius ssp. thermophilus. Streptococcus salivarius ssp. thermophilus vytváří kyselinu mléčnou, která snižuje ph prostředí na optimum pro růst bakterie Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus a kyselinu mravenčí, která stimuluje její růst. Streptococcus salivarius ssp. thermophilus spotřebovává kyslík, čímž podporuje růst bifidobakterií. Protože bifidobakterie vykazují pouze nízkou proteolytickou aktivitu, závisí jejich růst na přítomnosti dalších bakterií. Doporučuje se například kombinace Bifidobacterium bifidum a Lactobacillus acidophilus. Lactobacillus acidophilus potlačuje růst některých laktobacilů (L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. casei, L. helveticus, L. jogurti) tvorbou bakteriocinu acidophilinu LA-1, zatímco na ostatní bakterie mléčného kvašení nemá tento bakteriocin vliv. Souhrnně lze říci, že velice vhodná je kombinace (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium bifidum, Streptococcus salivarius ssp. thermophilus) (ČURDA et al., 2004). 3.3 Význam probiotik Pozitivní účinky probiotik V odborné literatuře se nejčastěji setkáváme s následujícími pozitivními účinky probiotik na lidské zdraví. 16

16 Antagonistické účinky proti pathogenním bakteriím Hnilobné bakterie, jako jsou například Helicobacter pylori, Salmonella, Listeria monocytogenes, Clostridium difficille mají na zdravotní stav hostitele nepříznivý efekt. Tvoří látky, o kterých se předpokládá, že mohou být kancerogeny (biogenní aminy, fenoly), respektive konvertují prokancerogeny v trávícím traktu na kancerogeny (nitrosaminy, sekundární žlučové kyseliny), případně látky s jinými nepříznivými efekty (amoniak) (KOHOUT, TUČEK 2002, RADA, 2006). Podstatou antimikrobiálního působení laktobacilů je tvorba organických kyselin, peroxidu vodíku, antibiotik, nízkomolekulárních inhibičních látek či bakteriocinů (MAXA, RADA, 2002). Bakteriociny jsou antimikrobiální látky peptidového charakteru produkované bakteriemi, které neinhibují růst producenta (CHUMCHALOVÁ et al., 2004). Nejznámějším příkladem bakteriocinu je nisin produkovaný bakterií Lactococcus lactis subsp. lactis (TAMIME, 2005). Lactobacillus acidophilus má široké antimikrobiální spektrum účinnost. Působí jak proti grampozitivním, tak proti gramnegativním bakteriím, jako jsou např. Bacillus sp., streptokoky, sarciny, Proteus sp., koliformní bakterie, salmonely, shigely, pseudomonády, stafylokoky, klebsiely, vibria a mikrokoky. Bifidobakterie neprodukují peroxid vodíku a antibiotika, avšak tvoří kyselinu mléčnou a větší množství kyseliny octové. Zvýšením kyselosti intestinálního obsahu se snižuje produkce fenolů, amoniaku, steroidních metabolitů, bakteriálních toxinů jako jsou biogenní aminy např. histamin, tyramin, kadaverin a agmatin (MAXA, RADA, 2002) Protinádorová aktivita Střevní mikroflóra je schopna ovlivňovat tvorbu karcinomu produkcí enzymů, které mění ve střevě prekarcinogeny v karcinogen. Tyto enzymy jsou beta-glukuronidáza, azoreduktáza, nitroreduktáza. Některé mikroorganizmy jsou schopny chránit hostitele tím, že tyto enzymatické aktivity tlumí. Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus a Bifidobacterium bifidum významně snižují množství těchto enzymů ve stolici (NEVORAL, 2005). 17

17 Pokles hladiny cholesterolu v krvi Při zvýšené hladině cholesterolu mohou hrát probiotika důležitou roli. Jejich působením dojde k přeměně cholesterolu na neúčinný koprostanol a ten přechází do stolice. Tím mohou snížit hladinu sérového cholesterolu (KOHOUT, TUČEK, 2002) Vliv na průjmová onemocnění Podle Kokešové (KOKEŠOVÁ, 2003) mohou probiotika ovlivňovat: Rotavirový průjem Rotavirus způsobuje zvýšení amoniaku ve střevě a relativní nárůst patogenních bakterií. Nejpoužívanějšími druhy, které je vhodné při tomto onemocnění podávat jsou Lactobacillus casei ssp. rhamnosus a Lactobacillus reuteri. Zejména Lactobacillus casei ssp. rhamnosus potencuje imunitní odpověď na rotavirou infekci tak, že stimuluje buňky produkující imunoglobulin IgA. Průjem způsobený Clostridium difficile Clostridium difficile při kolonizaci střeva uvolňuje dva enterotoxiny, toxin A a B, které způsobují průjem a kolitidu. Při terapii antibiotiky je nejvhodnější podávat Saccharomyces boulardii, což vede k nastolení rovnováhy střevního ekosystému. Průjem spojený s používáním antibiotické terapie Pokud jsou probiotika podávána během antibiotické terapie, klesá výskyt průjmového onemocnění až na jednu třetinu. V případě, že se již průjem objevil, snižují probiotika jeho délku i intenzitu. Průjem cestovatelů Příčinou je nejčastěji Escherichia coli. V této souvislosti bylo vyzkoušeno několik probiotik včetně rodů Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus a Saccharomyces. Výsledky jsou závislé na zemi původu, způsobu cestování a cíli cesty sledované skupiny cestovatelů, jsou tedy velmi variabilní Laktózová intolerance Laktóza obsažená v mléce může způsobit zažívací obtíže u lidí, kteří nemají endogenní laktázu (10 15% dospělé populace) (MAXA, RADA, 2002). Někteří jedinci proto musí omezit konzumaci mléka a mléčných výrobků. Streptococcus salivarius ssp. thermophilus a Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus štěpí laktózu pomocí beta-galaktosidázy a zlepšují tak toleranci laktózy (NEVORAL, 2005). 18

18 Atopické onemocnění Schopnost probiotik preventivně bránit v rozvoji atopického onemocnění byla demonstrována ve studii, ve které se ukázalo, že u dětí s vysokým rizikem atopického onemocnění, kterým byla probiotika podávaná po dobu šesti měsíců se prevalence onemocnění zmenšila na polovinu v porovnání se skupinou s placebem (NEVORAL, 2005) Nespecifická zánětlivá střevní onemocnění Probiotika byla úspěšně zkoušena v léčbě Crohnovy nemoci tlustého střeva. Počet relapsů onemocnění se zmenšil na polovinu ve srovnání s placebem, pokud se probiotikum podávalo během remise. V jiné studii byl popsán šestkrát nižší výskyt relapsů Crohnovy nemoci u pacientů, kteří byli léčeni kombinací mesalazinu se Saccharomyces boulardii ve srovnání s pacienty, kteří byli léčeni samotným mesalazinem (NEVORAL, 2005) Vliv na vstřebávání minerálů a produkci vitamínů STANĚK (2001), KOHOUT, TUČEK, (2002), TAMIME, (2005) uvádějí, že probiotika zlepšují vstřebávání vápníku a produkují vitamíny B (B 1, B 2, B 6, B 12, niacin, kyselina listová, kyselina pantotenová) a K. Vitamín B 12 produkují zejména bifidobakterie Stimulace imunity Laktobacily a bifidobakterie mohou zlepšit imunitní odpověď hostitele. To zejména platí o B. longum, L. acidophilus, L. casei ssp. rhamnosus a L. helveticus. Příznivý efekt má i současné podávání některých vitamínů, které zvyšují proteosyntézu a buněčné dělení, jako je vitamin C, pyridoxin, kyselina listová a vitamin B 12 (MAXA, RADA, 2002) Negativní účinky probiotik Mikroorganismy užívané jako probiotika jsou nepatogenní, ale za určitých okolností se může každý mikroorganismus stát patogenem. Takou situací může být hluboká imunosuprese. To jsou však ojedinělé případy a probiotika se užívají bez komplikací i u mnohých nemocných s HIV infekcí (VACEK, 2002). 19

19 3.3.3 Vlastnosti probiotických bakterií Aby mohly být jmenované mikroorganismy využívané jako probiotika, musí splňovat určitá hlediska Zdravotní hledisko - musí být humánního původu (KVASNIČKOVÁ, 2000), například dle Rady (RADA, 2006) bifidobakterie animálního původu Bifidobacterium animalis Bb 12 (firmy Chr. Hansen) a Bifidobacterium animalis Activia (firmy Danone) mají sice výbornou schopnost přežívat v jogurtech a to během celé záruční doby, ale schopnost kolonizovat trávící trakt lidí a prokazatelné probiotické účinky nebyly u těchto kultur jednoznačně prokázány, - při průchodu trávícím traktem musí odolat nepříznivým podmínkám, kterým jsou vystaveny (rezistence vůči působení kyseliny chlorovodíkové v žaludku a žlučových kyselin, proteolytických enzymů slinivky břišní a lysozymu v tenkém střevě) (KOHOUT, TUČEK, 2002), - nesmí být patogenní ani toxické. Hostiteli nesmí škodit samotné bakterie ani látky, které produkují (KOHOUT, TUČEK, 2002), - použité kmeny musí prokazatelně pozitivně ovlivňovat zdravotní stav člověka (KOHOUT, TUČEK, 2002), - musí být schopné kolonizace a adherence (NEVORAL, 2005), - musí mít antagonistický vliv na patogenní flóru a to tvorbou antimikrobiálních substancí nebo schopností jí konkurovat (KVASNIČKOVÁ, 2000) Technologické hledisko Technologická hlediska, která musí probiotika splňovat uvádí KOHOUT, TUČEK (2002): - musí být technicky využitelné, což znamená, že bakterie musí zůstat živé při potravinářské výrobě, - výrobky s přídavkem probiotické flóry nesmí být chuťově ani jinými vlastnostmi horší než konvenční výrobky bez přítomnosti probiotických bakterií, - probiotická účinnost musí být zachována do konce záruční doby. Potahování je nejvhodnější metoda k ochraně bakterií, je však třeba se zaměřit na stabilitu potahu za různých podmínek společně s uvolňováním bakterií ve správný okamžik. 20

20 První generací probiotik byly nepotažené neboli obnažené bakterie. Uvedené bakterie dobře fungují v kulturách a ve fermentovaných potravinách, nejsou však schopné přežít působení žaludeční kyseliny a žluči, a tak je nepravděpodobné, že by se ve střevech projevoval jakýkoliv jejich účinek. Druhou generaci představují potažená probiotika, která se uvolňují až ve střevech ( enteric couted ). Dodávají se v tvrdých kapslích nebo tabletách. Jsou vhodná jako doplňky stravy, neumožňují však, aby byla přidávaná do potravin (KVASNIČKOVÁ, 2004). Vhodná je i výroba bifidogenních neutralizovaných preparátů, kdy se sušené kultury tabletují nebo balí do kapslí a vkládají se navíc do vnějších obalů. Kapsle se ještě postřikují různými přípravky tak, aby se zamezilo přístupu vzduchu. Povlakové materiály bývají želatinové, z rostlinných gum, modifikovaných škrobů apod. Lze použít i takovou povlakovou látku, která odolá kyselému prostředí žaludku a rozpustí se až v alkalickém prostředí tenkého střeva. Tím se bifidogenní preparát probiotikum ochrání před kyselým prostředím žaludku a více bifidobakterií se dostane do tenkého a tlustého střeva (MAXA, RADA, 2002). Žaludeční kyselina při kontaktu s želatinovým obalem tobolky způsobuje rozpuštění tohoto obalu v průběhu 5 15 minut. Při následné rehydrataci polysacharidové matrix dochází ke změně povrchu matrix do podoby gelu, který je odolný vůči kyselému prostředí žaludku a chrání v něm uložené probiotické bakterie. V prostředí dvanáctníku (ph 6,5) dochází k rozpuštění gelu, rehydrataci lyofilizovaných bakterií a jejich následnému uvolnění do střeva (MIKUŠ, 2006). Třetí generací jsou mikrozapouzdřená probiotika, která jsou vhodná pro potravinářské účely, avšak vzhledem k nerovnoměrnosti potahu a použitému materiálu dochází k tomu, že se bakterie uvolňují v ne zcela správný okamžik. Čtvrtou generaci probiotik vyvinula firma Cell Biotech (Korea). Technologie spočívá v ochraně bakterií při vymrazování bílkovinou a polysacharidem. Takto získané produkty jsou velmi stabilní vůči žaludeční šťávě a žlučovým solím. K dispozici jsou ve formě jemného prášku, přičemž velikost částic závisí na požadavku zákazníka (KVASNIČKOVÁ, 2004). Terapeutické minimum probiotik Dle DE CHAMPS et al. (2003) minimální účinná dávka není přesně známá, ale obvykle doporučovaný příjem probiotických bakterií je více než 10 9 KTJ (kolonie tvořící jednotky) za den. Dle Čurdy (ČURDA et al., 2004) někteří autoři uvádějí, že 21

21 probiotický produkt by měl obsahovat terapeutické minimum živých buněk 10 6 KTJ/ml, jiní požadují dokonce KTJ/ml. Tyto počty se musí udržet během celé doby trvanlivosti výrobku. Dle TAMIME (2005) by probiotika měla být přítomna ve stravě v koncentraci minimálně 10 6 KTJ/g a denní příjem by měl být asi 10 9 KTJ. Dle Kvasničkové (KVASNIČKOVÁ, 2000), aby se projevily kladné účinky u lidí, je nezbytné denně zkonzumovat živých buněk. FRIČ (2006) uvádí, že fyziologický nebo terapeutický účinek probiotik lze očekávat při minimální denní dávce KTJ. V ČR je legislativní požadavek na kysané mléčné výrobky s bifidokulturou 10 6 KTJ/g bifidobakterií (VYHLÁŠKA 77/2003) Mechanizmus působení probiotik Hlavní mechanismy působení probiotik uvádí NEVORAL (2005) a jsou uvedeny v příloze 1, obr.3: - stabilizace střevní flóry kompeticí s patogenními mikroorganizmy o vazebná místa na receptorech a o živiny - produkce mastných kyselin s krátkými řetězci - pokles ph střevního obsahu - zvýšení rozpustnosti minerálních látek - omezení zpětné resorpce žlučových kyselin - stabilizace střevní slizniční bariéry, úprava střevní permeability - produkce antimikrobiálních substancí - modifikace toxinů a toxinových receptorů - stimulace imunitní odpovědi na patogeny (zvýšená produkce sekrečního IgA, IgG, IgM, protizánětlivě působících cytokinů) 3.4 Střevní mikroflóra Vývoj střevní mikrofóry od narození Zažívací trakt novorozence neobsahuje žádné bakterie. Situace se mění hned poté, co začne být dítě kojeno. Mateřské mléko vede díky svému složení k osídlení střeva bifidobakteriemi (KUNOVÁ, 2002). Uvádí se, že v tomto prvním vývojovém období je ve střevě zdravých dětí 90% bifidobakterií z celkového počtu bakterií. V 1g výkalů jsou tyto bakterie ve vysoké koncentraci buněk. Později počet bifidobakterií podstatně klesá a ve střevě 22

22 začínají dominovat anaerobní bakterie rodů Bacteroides, Eubacterium, Peptostreptococcus, Fusobacterium, Clostridium aj., přičemž doplňkovou mikroflóru tvoří laktobacily, enterokoky, koliformní a ostatní bakterie (obr.1, 2). Bifidobakterie tvoří v pozdějším věkovém stadiu jen 5-10% z celkové střevní mikroflóry. Děti krmené z láhve mají buněk bifidobakterií v 1g výkalů, tj. méně než kojené děti. Bifidobakterie bezesporu lépe rostou v mateřském mléce než v kravském. To je způsobeno větším obsahem proteinů a snad i tuků a zvláště přítomností růstových faktorů a hormonálních látek v mateřském mléce (MAXA, RADA, 2002). "Velmi podstatně ovlivňuje správné složení střevní mikroflóry už způsob porodu. Větší rizika jejího narušení hrozí dětem narozeným pomocí císařského řezu. Velký význam má i způsob výživy novorozence. To, co dnes víme o rozdílech mezi střevní mikroflórou kojeného a nekojeného dítěte například vysvětluje, proč mají kojené děti méně infekcí a jsou lépe chráněny před nepříznivými vlivy zevního prostředí." říká doktor Petr Tláskal (VESELÝ, 2004). Stomach - žaludek velmi málo bakterií předpoklad Helicobacter pylori Duodenum / Jejunum dvanáctník / lačník Streptococcus, Lactobacillus, Bacteroides a Bifidobacterium Ileum tenké střevo (dolní část) Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacteroides, Enterococcaceae, Clostridium Colon tlusté střevo Striktní anaeroby: Bacteroides, Eubacterium, Bifidobacterium, Peptostreptococcus Fakultativní anaeroby: Enterobacteriacea, Streptococcus, Lactobacillus Obr.1 Osídlení gastrointestinálního traktu mikroorganismy (KVASNIČKOVÁ, 2000,VALENTA, 2006) 23

23 Škodlivé účinky Prospěšné účinky a, b, c, d e, f, g, h, i Bakterie trávícího traktu Bacteroides b, d, e, f, h, i reducenti sulfátů c Eubakterie Methanogenní bakterie g Anaerobní grampozitivní bakterie a, b, e Enterobacteriaceae a, e E. coli a, b, d, f Lactobacillus f, h, i Bifidobacterium e, f, h,i Veillonella a Clostridium a Micrococcaceae a Vibrionaceae a Pseudomonas aeruginosa a škodlivé prospěšné a: patogenní účinky e: omezení růstu škodlivých bakterií b: produkce karcinogenů f: posilování imunity c: produkce toxického H 2 S g: snižování plynatosti d: střevní hnití h: zlepšení vstřebávání a trávení i: syntéza vitamínů Obr.2 Mikroorganismy trávícího traktu zařazeny do kategorií na základě škodlivosti a prospěšnosti (KLAENHAMMER, 2001) 24

24 3.4.2 Složení střevní mikroflóry Složení střevní mikroflóry je u zdravých jedinců poměrně stabilní, působením řady endogenních a exogenních faktorů se však může měnit. Jde např. o poruchy peristaltiky, rakovinu, chirurgické zákroky, onemocnění jater, ledvin, radioterapii, emocionální stres, stárnutí, poruchy imunity, aplikaci antibiotik a jiné. U lidí s poruchami imunitních funkcí a u lidí starších mohou bifidobakterie ze střeva zcela vymizet. Gastrointestinální (GI) mikroflóra představuje vysoce složitý ekosystém, přičemž současné znalosti o tomto systému jsou stále omezené. Povrch GI systému je asi m 2, čímž je poskytnut nezbytný prostor pro interakce během trávícího procesu a pro adhezi ke stěně mukózy i kolonizace, která ji provází. GI trakt u dospělých lidí obsahuje asi živých bakterií, tj. desetinásobek celkového počtu eukaryotických buněk ve všech tkáních lidského těla (KVASNIČKOVÁ, 2000). Růstovým substrátem pro střevní mikroorganismy jsou složky potravy, které nebyly absorbovány výše v gastrointestinálním traktu. Jedná se zejména o rezistentní škrob, vlákninu, cukry, oligosacharidy, bílkoviny, peptidy a aminokyseliny. Produkty metabolismu sacharidů (např. mastné kyseliny s krátkým řetězcem) jsou ve vztahu k lidskému zdraví prospěšné nebo neutrální, produkty proteolýzy jsou toxické a tudíž nežádoucí (ČURDA et al., 2004). 3.5 Faktory ovlivňující činnost probiotik a střevní mikroflóru Prebiotikum Takto se označuje nestravitelná složka potravy, jejíž pozitivní účinek na zdravotní stav člověka spočívá ve stimulaci růstu či aktivity příznivě působících bakterií mikroflóry tlustého střeva. Prebiotika většinou tvoří oligosacharidy. Jsou více obsaženy v mateřském než kravském mléce, kde tvoří třetí kvantitativně největší složku (TLÁSKAL, 2002). Existují rovněž pozorování, že oligosacharidy v mateřském mléce podporují růst bifidobakterií a omezují růst nevhodných bakterií. Hovoříme o jejich bifidogenním účinku (NEVORAL, 2005). Názory na doporučovanou denní dávku prebiotik se liší. Nejširší rozmezí se udává pro oligofruktózu 1-18 g /den. Negativním projevem prebiotik při nadměrné konzumaci může být např. břišní nevolnost, pocit plnosti, zvuky ze střev, plynatelnost, průjem (KVASNIČKOVÁ, 2000). 25

25 Vlastnosti prebiotik - procházejí horní částí trávicího ústrojí v nezměněné formě, kde se nehydrolyzují ani nevstřebávají - slouží selektivně určitým bakteriím tlustého střeva jako substrát, který zvyšuje metabolickou aktivitu těchto bakterií nebo podporuje jejich růst - pozitivně ovlivňují složení střevní mikroflóry tlustého střeva - mají celkově pozitivní vliv na zdraví a pohodu jedince Tab.4 Přehled prebiotik a jejich vliv na střevní mikroflóru (KLAENHAMMER, 2001) Prebiotika Původ Podpora mikroorganismů Oligosacharidy cibule, česnek, kořen čekanky, lopuch, chřest, slunečnice hlíznatá, sojové boby, pšeničné otruby Fruktooligosacharidy (inulin, oligofruktosa) stejně jako pro oligosacharidy 26 Účinek Bifidobacterium ssp. růst bifidobakterií, potlačení hnilobných bakterií, prevence proti zácpě průjmu Bifidobacterium ssp., L. acidophilus L. casei, L. plantarum podpora růstu Fruktany slunečnice hlíznaté Bifidobacterium ssp. podpora růstu bifidobakterií Lidský kappa kasein lidské mléko B. bifidum podpora růstu bifidobakterií Stachyosa a rafinosa extrakt ze sójových Bifidobacterium ssp. růstový faktor bobů Kasein kravské mléko Bifidobacterium ssp. podpora růstu bifidobakterií Laktitol (4-O-β-Dgalaktopyranosyl) D- glucitol syntetický cukerný alkohol z laktosy Bifidobacterium ssp. podpora růstu bifidobakterií Lactulosa(4-O-β-Dgalaktopyranosyl) D- fruktosa Symbiotikum syntetický derivát z laktosy Bifidobacterium ssp. podpora růstu bifidobakterií V symbiotiku je probiotikum kombinováno s prebiotikem, které je pro něj specifické (NEVORAL, 2005), např. fruktooligosacharidy + bifidobakterie, laktitol + laktobacily, galaktooligosacharidy + bifidobakterie (KOKEŠOVÁ, 2003). Tato kombinace přispívá k prodloužení přežití probiotika, pro které je prebiotikum specifickým substrátem (NEVORAL, 2005). Tab.5 Nejdůležitější výhody a nevýhody probiotik, prebiotik a symbiotik (KVASNIČKOVÁ, 2000)

26 PROBIOTIKUM PREBIOTIKUM SYMBIOTIKUM problém se stabilitou bakterií ve výrobku během skladování problém se stabilitou bakterií během průchodu horní částí trávícího traktu bakterie, které přežijí, projeví v tlustém střevu své probiotické účinky Antibiotikum dobrá stabilita oligosacharidů během zpracování a skladování výrobku stabilita oligosacharidů během průchodu horní částí trávícího traktu oligosacharidy se dostávají do tlustého střeva, kde podporují endogenní pozitivní mikroflóru problém stability bakterií ve výrobku během skladování, určité zlepšení přináší bifidogenní sacharid problém stability bakterií během průchodu horní částí trávícího trakt bakterie, které přežijí, projevují v tlustém střevě své probiotické účinky, dodatečná podpora probiotických nebo endogenních mikroorganismů pomocí prebiotik Látka, která působí proti bakteriím, které usmrcuje nebo brání jejich růstu a množení (baktericidní, respektive bakteriostatické antibiotikum) (KOHOUT, TUČEK, 2002). Eubiotikum Látka, která hubí patogenní bakterie a přitom nepůsobí na bakterie prospěšné hostiteli (KOHOUT, TUČEK, 2002). 3.6 Formy probiotik - doplňky stravy (jde nejčastěji o lyofilizované kultury, které se mohou sestávat z jednoho nebo více druhů probiotických bakterií a které jsou samostatně nebo s dalšími látkami vyráběny ve formě kapslí, tobolek, tablet, dražé) (ŠPELINA, 2006), - součást specifických mléčných výrobků, zakysané mléčné výrobky s obsahem probiotické mikroflóry bývají nejčastěji vyráběny jako speciální nápoje a jogurty a jejich různé formy (jogurtové nápoje, krémy, deserty aj.) (ŠPELINA, 2006), - součást zmrzlin a mražených mléčných krémů (TAMIME, 2005), - součást kojenecké a dětské výživy (mléčná a cereální dětská výživa jsou dodávány jako dehydrované produkty) (ŠPELINA, 2006), - probiotické šťávy (firma Chr. Hansen ve spolupráci s Tetra Pakem vyvinula nový systém pro přidávání probiotik do chlazených šťáv) (ANONYM, 2007), 27

27 - součást trvanlivých masných výrobků - fermentované suché ušlechtilé salámy tzv. uherského typu, u nichž se však většinou jedná o startovací kultury (PETR, 2006, ŠPELINA, 2006 ), - doplňky krmných směsí pro domácí zvířata např. krmné směsi pro prasata (VALENTA, 2006). 3.7 Legislativa V rámci EU dosud neexistuje žádný legislativní předpis, který by upravoval uvádění potravin s cíleně přidanými mikroorganismy na trh, a to ani v případě kojenecké a dětské výživy, kde jsou relativně často probiotické bakterie výrobci mléčné náhradní výživy používány. Na probiotika lze částečně aplikovat Nařízení Evropského parlamentu a Rady o nových potravinách a nových složkách potravin 258/97/ES. Jen v Dánsku musí úřední autorita souhlasit s použitím nových probiotických kmenů bakterií (obdobná praxe probíhá i v ČR) (ŠPELINA, 2006) Zdravotní tvrzení a značení Ve většině zemí jsou povolena pouze obecná zdravotní tvrzení o potravinách obsahujících probiotika. Pracovní skupiny FAO (Organizace pro potraviny a zemědělství) a WHO (Světová zdravotní organizace) doporučily, aby specifická tvrzení byla umožněna tam, kde je k dispozici dostatečný vědecký důkaz o jejich deklarovaných účincích a má být zodpovědností výrobce, aby taková tvrzení byla pravdivá a nebyla zavádějící. Tato pracovní skupina doporučila, aby na obalu byly vyznačeny následující informace: - označení rodu, druhu a kmene probiotického mikroorganismu - minimální množství živých buněk na konci doby trvanlivosti - doporučená dávka obsahující efektivní množství probiotika ve vztahu k tvrzení - zdravotní tvrzení - správné podmínky úchování - kontaktní údaje pro detailní informace spotřebitele Tato doporučení si vzala za své Mezinárodní vědecká asociace pro probiotika a prebiotika (ISAPP). Přesto podle hodnocení z různých zdrojů byly zjištěny poměrně podstatné odchylky od těchto pravidel: - počet živých mikrobů ke konci doby trvanlivosti je v mnoha případech nižší než deklarovaný 28

28 - mikroorganismy nejsou pojmenovány v souladu s platnou vědeckou nomenklaturou - tvrzení o účinnosti produktu nejsou adekvátně odůvodněna - termín probiotický je užíván neoprávněně, tj. i v případech, kdy není žádný záznam o příznivých účincích na lidské zdraví Tyto prohřešky se týkaly produktů řady evropských zemí, Kanady, Austrálie, jižní Afriky a lze předpokládat, že při průzkumu v ČR by byly zjištěny obdobně (ŠPELINA, 2006). V případě probiotických preparátů dochází také k odchylkám od deklarovaného množství. Proklamovaná množství jsou přitom často o tři až čtyři řády vyšší než jsou skutečná množství. Počty probiotických bakterií v 1 gramu by se měly pohybovat v hodnotách 10 9 (MAXA, RADA, 2002). KILLER et al. (2006) zkoumali 10 zahraničních a 2 tuzemské preparáty (Biopron, Probioflora). U Biopronu se setkali s relativně vysokými počty bifidobakterií (9,2 log KTJ/g a laktobacilů 9,7 log KTJ/g), ovšem u Probioflory zaznamenali velmi nízké počty bifidobakterií (3 log KTJ/g) a obsah laktobacilů se nepotvrdil. Počty bifidobakterií (KTJ/g) byly u příslušných preparátů stanoveny kultivační metodou na modifikovaném TPY agaru s přídavkem mupirocinu po 48 hodinách kultivace za anaerobních podmínek, počty laktobacilů na de Man, Rogosa a Sharpe (MRS) agaru po hodinách kultivace za mikroaerofilních podmínek. HAMILTON et al. (1996) zjistili u 11 z 13 studovaných anglických preparátů méně než 1/10 deklarovaného množství životaschopných buněk probiotických bakterií. GILLILAND (1981) testoval 15 komerčně dostupných preparátů a zjistil, že pouze 2 obsahovaly více než 10 6 živých buněk laktobacilů v 1 gramu Definice pojmů Doplňky stravy a) jsou potraviny určené k přímé spotřebě, které se odlišují od potravin pro běžnou spotřebu vysokým obsahem vitaminů, minerálních látek nebo jiných látek s nutričním nebo fyziologickým účinkem a které byly vyrobeny za účelem doplnění běžné stravy spotřebitele na úroveň příznivě ovlivňující jeho zdravotní stav (ZÁKON 456/2004), b) jsou potraviny, jejichž účelem je doplňovat běžnou stravu a které jsou koncentrovanými zdroji živin nebo jiných látek s výživovým nebo fyziologickým účinkem, samostatně nebo v kombinaci. Jsou uváděny na trh ve formě dávek, a to ve 29

29 formě tobolek, pastilek, tablet, pilulek a v jiných podobných formách, dále ve formě sypké, jako kapalina v ampulích, v lahvičkách s kapátkem a v jiných podobných formách kapalných nebo sypkých výrobků určených k příjmu v malých odměřených množstvích (SMĚRNICE 2002/46/ES). Potravní doplňky jsou nutriční faktory (vitamíny, minerální látky, aminokyseliny, specifické mastné kyseliny a další látky) s významným biologickým účinkem (ZÁKON 456/2004). Příloha vyhlášky č. 446/2004 Sb. uvádí nejvyšší přípustná množství potravních doplňků v doplňcích stravy. Množství vitálních kultur mikroorganismů jako jsou Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus lactis, Streptococcus salivarius ssp. thermophilus, Saccharomyces cerevisiae není v denní dávce omezeno. 30

30 4 MATERIÁL A METODY 4.1 Materiál Bylo analyzováno pět probiotických preparátů (tuzemských a zahraničních) dostupných v naší obchodní síti. Jednalo se o tři doplňky stravy a dva potravní doplňky. Laktobacily 5 (Swiss Herbal Remedies, Kanada) - potravní doplněk, enterický povlak zaručuje bezpečný průchod účinné látky do střev bez narušení žaludečními kyselinami - počet bakterií v 1 tabletě: bakterií - doporučené dávkování: 1 3 tablety denně - složení 1 tablety: Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum, Streptococcus faecium Lactomax (Maxus World Wide Nutrition, USA) - doplněk stravy - počet bakterií v 1 tabletě: bakterií - doporučené dávkování: 1 tableta denně - složení 1 tablety: Lactobacillus bifidus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus caucasicus, Lactobacillus rhamnosus, niacin, vitamín B 6, riboflavin, thiamin Probiotic (Herb Pharma AG, Švýcarsko) - potravní doplněk - počet bakterií v 1 tabletě: bakterií - doporučené dávkování: 2 3 tablety denně - složení 1 tablety: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus lactis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, vitamín C, magnesium, stearan hořečnatý, škrob Probioflora (Goldim, ČR) - doplněk stravy - počet bakterií v 1 tabletě: bakterií - doporučené dávkování: 1 tableta denně - složení 1 tablety: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, 31

31 Streptococcus thermophilus, suchý extrakt artyčoku, citrusová vláknina, stearan hořečnatý Biopron 9 (Valosun a.s., ČR) - doplněk stravy - počet bakterií v 1 tabletě: bakterií - doporučené dávkování: 1 2 tablety denně - složení 1 tablety: Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus lactis ssp. lactis, Streptococcus thermophilus, fruktooligosacharidy, kyselina askorbová, stearan hořečnatý, bramborový škrob 4.2 Metody analýzy Příprava laboratorního skla Sklo bylo sterilováno v horkovzdušné sušárně typu HS 62 A (výrobce ZPA Dukla Prešov) při teplotě 160 ºC po dobu 1 hodiny. Pipety (1 a 2 ml) byly zazátkovány kouskem vaty a vysterilizovány v hliníkové folii. Petriho misky byly během sterilace uzavřeny. Zkumavky s destilovanou vodou pro přípravu ředících řad byly uzavřeny víčky, umístěny do umělohmotných kádinek, překryty hliníkovou fólií a následně sterilovány v autoklávu typu PS 20 A (výrobce Chirana) při teplotě 121 ºC po dobu 20 minut Živné půdy DE MAN, ROGOSA A SHARPE (MRS): Oxoid, Anglie - pro stanovení mléčných bakterií rodu Lactobacillus Složení: Pepton 10,0g Masový extrakt 10,0g Kvasničný extrakt 5,0g Glukóza 20,0g Tween 80 1,08g Hydrogenfosforečnan didraselný 2,0g Octan sodný 5,0g 32

32 Citran amonný 2,0g Síran horečnatý 0,2g Síran manganatý 0,05g Agar 15,0g Destilovaná voda 1000 ml ph při 25 ºC 5,7 ± 0,1 Navážka 70,3g přípravku TRYPTON AGAR (TPY): výrobce Scharlauchemia s.a., Španělsko - pro stanovení rodu Bifidobacterium Složení: Trypton 6,0g Kvasničný extrakt 3,0g Agar 15,0g ph 7,2±0,2 Navážka: trypton 24g Navážka: pepton 10g NUTRIENT AGAR NO.2 (MPA): výrobce Himedia, Indie - pro stanovení sporotvorných bakterií rodu Bacillus cereus Složení: Masový extrakt 10,00g Hovězí extrakt 10,00g Chlorid sodný 5,00g Agar 5g ph 7,2±0,2 Navážka 40g Příprava živných půd spočívala v navážení požadovaného množství přípravku do 1000 ml destilované vody, upravení ph a zahřívání až do úplného rozpuštění. Tekutá půda byla rozlita do menších 400 ml Erlenmayerových baněk a následně sterilizována v autoklávu při teplotě 121 ºC po dobu 15 minut. Po ztuhnutí byly živné půdy uchovány v lednici pro další použití. Před vlastní mikrobiologickou analýzou byly živné půdy rozvařeny 5 minut v autoklávu a poté zchlazeny na teplotu přibližně 45 ºC. 33

33 4.2.3 Vlastní provedení mikrobiologického rozboru Stanovení počtu probiotických bakterií Ke stanovení počtu probiotických bakterií na živných půdách byla použita metoda zalití vzorku agarovou půdou o teplotě asi 45 ºC. Protože převážnou část mikrofóry tvořily rody Lactobacillus a Bifidobacterium, byla provedena kultivace pouze těchto rodů. Použilo se několik ředění. Ředění se provádělo tak, že se nejprve navážilo 0,1g preparátu, který se přidal do zkumavky s 9 ml destilované vody. Poté se odebral sterilní pipetou 1 ml rozpuštěného preparátu z předchozí zkumavky a přidal se opět do zkumavky s 9 ml destilované vody. Obdobně se postupovalo při přípravě všech ředění. Na každé ředění se brala nová sterilní pipeta. Od určitého ředění byly současně naočkovány 3 misky, které se označily číslem prepátu a příslušnou živnou půdou. Očkování se provedlo tak, že se do každé z misek sterilní pipetou přenesl 1 ml požadovaného ředění. Při pipetování se víčko Petriho misky jen mírně nadzvedlo z důvodu minimalizování vzdušné kontaminace. Misky s inokulem se nejpozději do 15 minut zalily příslušnou živnou půdou. Množství půdy bylo takové, aby došlo k rovnoměrnému rozptýlení vzorku (asi ml). Vše se pečlivě krouživými pohyby promíchalo. Po ztuhnutí půdy se Petriho misky obrátily dnem vzhůru, aby nedocházelo ke kontaminaci kondenzující vodou a vložily se přímo do termostatu nebo do speciálních nádob (Anaerocult, výrobce Merck, Německo), kde byly nastoleny anaerobní podmínky a následně byly vloženy do termostatu. Jako kontrola sterility se použily kontrolní misky naplněné živnou půdou bez inokula. Antimikrobiální působení Jednotlivé preparáty se nechaly několik týdnů rozpustit ve zkumavkách s destilovanou vodou a ve zkumavkách, v nichž bylo upraveno ph na 3,7 kyselinou chlorovodíkovou. Předem se připravily korkovrtem z filtrovacího papíru terčíky, které se vysterilizovaly. Každému preparátu bylo přiřazeno číslo a napsáno na spodní stranu sterilní Petriho misky po obvodu tak, že na každé misce bylo pět čísel. Do misek se nalilo ml příslušné živné půdy, která se nechala ztuhnout. Dobře vyžíhanou kličkou se několika stěry odebral ze zkumavky Bacillus cereus a byla připravena suspenze pro následné povrchové očkování (roztěr 0,5 ml sterilní skleněnou hokejkou). Terčíky se pomocí pinzety namočily do zkumavky s probiotickým preparátem 34

34 rozpuštěným buď v destilované vodě nebo v destilované vodě s přídavkem kyseliny chlorovodíkové a vložily se na Petriho misku k příslušnému číslu. Poté byly misky vloženy do termostatu a inkubovány za aerobních a anaerobních podmínek Kultivace MRS agar kultivace v termostatu 3 dny při teplotě 37 ºC. TPY agar kultivace v termostatu 3 dny při teplotě 37 ºC. MPA agar kultivace v termostatu 4 dny při teplotě 37 ºC Způsob vyhodnocování výsledků Při stanovování počtu probiotických bakterií byly po uplynutí doby potřebné ke kultivaci odečteny na jednotlivých miskách počty KTJ. Kolonie byly spočítá pouhým okem nebo pomocí lupy o šestinásobném zvětšení. Při větším počtu vyrostlých kolonií byly spočteny jen kolonie na části plotny s průměrným zastoupením mikroorganismů a zjištěný počet byl přepočten na celou plochu Petriho misky. Kontrolou u všech stanovení byly počty bakterií vypěstované na Petriho miskách, které nebyly očkovány suspenzí. Konečný výsledek počtu bakterií byl vyjádřen v KTJ na 1 tabletu, případně na 1 gram. Při zjišťování antimikrobiálního působení byla změřena inhibiční zóna probiotických bakterií Chemické složení obalů jednotlivých preparátů Obaly jednotlivých preparátů (kromě Probioflory, která neměla obal), byly analyzovány ve spolupráci se společností Polymer Institute Brno, spol. s r.o. FTIR analýzou byla zjišťována jejich difúzně rozptylová spektra a na základě porovnání s knihou spekter identifikováno jejich chemické složení. Byl použit FTIR spektrometr Nicolet Nexus, difúzně rozptylová spektra byla měřena na SiC sampleru, počet scanů 64, rozlišení 4 cm