Titrace autoprotilátek detekovaných metodami nepřímé imunofluorescence. Jan Martinek Ivo Lochman

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Titrace autoprotilátek detekovaných metodami nepřímé imunofluorescence. Jan Martinek Ivo Lochman"

Anna Křížová
před 8 lety
Počet zobrazení:

1 Titrace autoprotilátek detekovaných metodami nepřímé imunofluorescence Jan Martinek Ivo Lochman

2 OSNOVA ÚVOD TITRACE DLE EUROIMMUN DATA SEKK STANDARTIZACE ANA STANDARTIZACE ICA HOOK EFEKT ZÁVĚR

3 Titrace autoprotilátek detekovaných metodami nepřímé imunofluorescence Alergie 4/2010

4 ÚVOD I. IIFA (Indirect ImmunoFluorescence Assays) patří stále ještě k základním a nenahraditelným metodám pro detekci a stanovení koncentrace mnoha autoprotilátek. I když koncentrace autoprotilátek asociovaných a využívaných k diagnostice nejrůznějších onemocnění nemá často korelaci s aktivitou těchto onemocnění, může klinikovi někdy přinést zjištění jejich koncentrace zajímavou doplňující informaci. Řada autorů doporučuje při prvním pozitivním nálezu vzorek séra titrovat (Bradwell et.al. 2006). Tozzoli a Feldkamp doporučují vyšetřovat vzorek séra vždy paralelně ve dvou základních ředěních (Feltkamp 1996).

5 ÚVOD II. Budeme-li používat dostatečně citlivou metodu, nalezneme autoprotilátky v sérech prakticky všech jedinců. Pro screeningová vyšetření je proto velmi důležité stanovit optimální ředění séra tak, aby bylo možno rozlišit koncentrace zvýšené, nacházející se u pacientů s onemocněním, jehož diagnózu se pokoušíme potvrdit jejich průkazem, od koncentrací fysiologických a je-li to možné i od koncentrací nacházejících se u pacientů s jinými onemocněními. Screeningové ředění séra (screeningový titr protilátek) u dané IIFA by měl být nastaven tak, aby 95% zdravých kontrol dávalo negativní nález (Feltkamp 1996).

pacientů s onemocněním, jehož diagnózu se pokoušíme potvrdit jejich průkazem, od koncentrací fysiologických a je-li to možné i od koncentrací

6 ÚVOD III. Obecně se dá říci, že orgánově-specifické autoprotilátky se nacházejí v sérech v nižších koncentracích, a proto bývá v IIFA voleno pro jejich detekci ředění séra 1:10 nebo i nižší, zatímco pro orgánověnespecifické autoprotilátky, které se nacházejí ve vzorcích sér nemocných obvykle v koncentracích vyšších, bývá výchozí screeningové ředění sér vyšší (1:40 až 1:100).

koncentracích, a proto bývá v IIFA voleno pro jejich detekci ředění séra 1:10 nebo i nižší,

7 ÚVOD IV. Stanovení koncentrace autoprotilátek pomocí IIFA se provádí obvykle titrací dvojkovou řadou (Bradwell 2006). Je nutno si uvědomit, že obecně uváděná chyba titračních metod používajících dvojkovou řadu ředění je ± jeden titr. Tzn., že nalezneme-li titr 1:320, může se reálně pohybovat skutečná koncentrace v rozmezí titrů 1:160 až 1:640. Tato skutečnost je také zohledňována při hodnocení výsledků kontrolních cyklů EQA organizovaných včr společností SEKK s.r.o. ve spolupráci se SLI ČSAKI, kdy toleranční rozmezí IFA metod pro stanovení autoprotilátek je právě ± jeden titr.

, že nalezneme-li titr 1:320, může se reálně pohybovat skutečná koncentrace v rozmezí titrů 1:160 až 1:640.

8 ÚVOD V. Je nutno si uvědomit, že obecně uváděná chyba titračních metod používajících dvojkovou řadu ředění je ± jeden titr. Tzn., že nalezneme-li titr 1:320, může se reálně pohybovat skutečná koncentrace v rozmezí titrů 1:160 až 1:640. Proto lze podle našeho názoru, doporučit jako modelový, ekonomický způsob titrace a jejího hodnocení schéma vypracované firmou Euroimmun, a to s ohledem na výchozí titr protilátek uváděný k dané metodě.

10 TITRACE - EUROIMMUN pozitivita fluorescence při ředění titr protilátek 1:100 1:1 000 slabě pozitivní negativní 1:100 silně pozitivní negativní 1:320 pozitivita fluorescence při ředění titr protilátek 1: : negativní negativní 1:320 slabě pozitivní negativní 1:1 000 silně pozitivní slabě pozitivní 1:1 000 silně pozitivní negativní 1:3 200 silně pozitivní pozitivní 1:3 200 silně pozitivní silně pozitivní 1: silně pozitivní silně/slabě poz. 1:10 000

negativní 1:320 slabě pozitivní negativní 1:1 000 silně pozitivní slabě pozitivní 1:1 000 silně pozitivní negativní

11 1: :320 1:320

12 1:320 1:320 1:1 000

13 1: :320 1:1 000

14 1: :320 1:1 000

15 1: : :320 1:320??? 1:1 000

16 STANDARTIZACE Udání titru však samo o sobě nestačí, srovnáváme-li včase výsledky získané v různých laboratořích vybavených různou mikroskopickou technikou a na byť stejně pojmenovaných, ale různých substrátech. V reálu se potom mohou vzorky vyhodnocované pomocí dvou různých mikroskopů lišit až o dva titry stanovované dvojkovou řadou. Proto je velmi důležité, aby laboratoře udávaly také citlivost jimi používaných metod vůči dostupným standardům (Bradwell 2006, Feltkamp , Lightfoote et.al. 2006, Tozzoli et.al. 2002).

V reálu se potom mohou vzorky vyhodnocované pomocí dvou různých mikroskopů lišit až o dva titry stanovované dvojkovou řadou.

18 STANDARTIZACE ANA I. ZDŮRAZŇUJEME, že IIFA je stále metodou první volby pro detekci a základní stanovení koncentrace autoprotilátek proti strukturám nejen jader, ale i cytoplasmy buněk u řady onemocnění. Mezi taková onemocnění patří i revmatická onemocnění, pro která jsou doporučeným substrátem pro screeningové vyšetření autoprotilátek HEp-2 buňky a vyšetření prováděno na tomto substrátu se označuje poněkud nepřesně jako vyšetření ANA (Anti-Nuclear Antibodies).

strukturám nejen jader, ale i cytoplasmy buněk u řady onemocnění.

19 STANDARTIZACE ANA II. Takovým standardem je pro stanovování ANA např. standard WHO 66/233 poskytující homogenní jadernou fluorescenci na HEp-2 buňkách. Při použití tohoto standardu pak např. může laboratoř konstatovat, že stanovuje ANA protilátky na HEp-2 buňkách s citlivostí 0,4 IU/ml zjištěnou vůči standardu WHO 66/233. A to je již údaj, který může být použit při mezilaboratorních srovnáváních kvantifikace ANA nezávisle na používané mikroskopické technice a diagnostických soupravách. Při screeningovém ředění séra 1:100 pro ANA, které je např. potom v laboratoři aplikováno, pak slabě pozitivní nález odpovídá přibližně koncentraci ANA 40 IU/ml.

může laboratoř konstatovat, že stanovuje ANA protilátky na HEp-2 buňkách s citlivostí 0,4 IU/ml zjištěnou vůči standardu WHO 66/233.

20 STANDARTIZACE ANA III. NÁVRH na vydávání výsledků ANA: výsledky vyšetření neudávaly v titrech, ale v IU/ml i s tím vědomím, že různé typy autoprotilátek mohou mít rozdílnou afinitu a analytické vlastnosti než protilátky standardu 66/233

21 STANDARTIZACE ANA IV. Dle zkušenosti z diagnostiky ANA u revmatických onemocnění se nedoporučuje provádět vyšetření autoprotilátek bez podezření na autoimunitní onemocnění (Tozzoli et.al. 2002). Co se týká kvantifikace ANA u revmatických onemocnění, je si znovu zapotřebí připomenout, že titr většiny ANA protilátek není použitelný k monitoringu léčby těchto onemocnění (Schur 2009, Tozzoli et.al. 2002), poněvadž jejich koncentrace nekorelují s aktivitou onemocnění.

22 STANDARTIZACE ANA V. Často diskutovaný screeningový titr ANA protilátek pro tyto účely je nyní nastavován nejčastěji na hodnotu 1:80 nebo 1:100 (Dellavance et.al. 2009, Ghosh et.al. 2007, Sack et.al. 2009). Stále ještě používaný titr ANA 1:40 (Schur 2009) vede dnes, vzhledem k citlivosti používaných fluorescenčních mikroskopů, pouze k produkování falešně pozitivních výsledků. I při diagnostice ANA platí, že vyšší senzitivita vyšetření je většinou vykoupena jeho nižší specifitou. Dvojí ředění séra v rámci screeningu ANA protilátek doporučuje také Tan s uvedením procenta pozitivních zdravých dárců v daném titru (Tan 1997). Dvojí ředění řeší také doporučení kředění pozitivních vzorků (Recommnedations Dutch EASI team).

23 STANDARTIZACE ICA. ICA: Ještě zásadnější je návaznost na mezinárodní standardy v případě stanovení protilátek proti ostrůvkovým buňkám pankreatu (ICA) v rámci diagnostiky diabetu 1. typu (1T DM). Dle doporučení SLI ČSAKI a ČES by citlivost metody stanovení ICA měla být nejméně 10 JDFU (Lochman et.al. 2009) a pozitivní výsledky by měly být vydávány v JDFU (Hagopian, Lernmark 1996).

24 HOOK EFEKT U silně pozitivních vzorků sér se může uplatnit tzv. háčkový efekt (prozónový efekt, hook efekt), který způsobuje, že při nižším ředění séra pozorujeme slabší až negativní fluorescenci těchto sér, nebo se nám naopak nepodaří (kvůli splývání struktur) rozlišit typ fluorescence. Proto bývá experty doporučováno výše zmíněné screeningové vyšetření sér ve dvou ředěních (Bradwell et.al. 2006, Tan 1997).

25 Hook efekt při diagnostice ICA substrát: opičí pankreas, konjugát IgG, BioSystems 5 JDFU 2,5 JDFU 1 JDFU IDDM1/11 B 1:4 IDDM1/11 B 1:40 IDDM1/11 B 1:400 Odhad koncentrace ICA: odečtený titr cca 1:126, vypočtená koncentrace cca 300 JDFU Lochman I., Martinek J.: Titrace autoprotilátek detekovaných metodami nepřímé imunofluorescence (IIFA). Alergie, 2010, 12(4):

26 ZÁVĚR???

27 DĚKUJI ZA POZORNOST

Podobné dokumenty

IMUNOFLUORESCENČNÍ SOUPRAVA K DIAGNOSTICE AUTOIMUNITNÍCH ONEMOCNĚNÍ JATER A ŽALUDKU

IMUNOLOGIE Autoimunitní onemocnění jater a žaludku IMUNOFLUORESCENČNÍ SOUPRAVA K DIAGNOSTICE AUTOIMUNITNÍCH ONEMOCNĚNÍ JATER A ŽALUDKU Mitochondrie Hladké svalstvo Mikrosomy jater a ledvin Parietální buňky