fokusaci v Úvod objemů vzorku. separaci nachází ve stavu nazývá Amfolyty jsou tedy Obrázek

Transkript

1 Protokol pro laboratorní úlohu: Separace směsi proteinů na zařízení pro izoelektrickou rozbíhavém toku fokusaci v Úvod Přirozeně se proteiny se vyskytují ve velmi složitých směsích. Pro jejich analýzu je třeba využívat moderní separační metody, které umožní vyčlenit ze vzorku pouze ty proteiny, jež chceme studovat. Rozšířenou technikouu pro purifikaci proteinů je izoelektrická fokusace. Klasický mód kapilární izoelektrické fokusace však není vhodný pro separaci větších objemů vzorku. Použití módu izoelektrické fokusace f vee volném toku (Obr č. č 1) umožňuje vstupní směs proteinůů kontinuálně separovat a získávat tak jednotlivéé frakce koncentrovaných a přečištěných proteinů. Tato metoda umožňuje materiálově a instrumentálně nenáročnou a velmi levnou frakcionaci proteinů před jejich další analýzou. Obrázek 1 IEF ve volném toku Teorie k cvičení Izoelektrická fokusace (IEF) spadá s do podmnožiny elektroforetických separací. Všechny tyto separační metody mají společného jmenovatele ve využití elektrického pole pro pohyb a separaci analytů. V případě IEF I jde o pohyb analytu v elektrickém poli skrz ph gradient (vytvořený ze směsi amfolytů). Pomocí IEF je možno separovat pouze látky, které jsou amfolyty (zpravidla peptidy, proteiny ale i aminokyseliny). Tyto T látky mají dvě nebo více disociujících skupin s různými disociačními konstantami a v určité oblasti ph se látka nachází ve stavu amfionu ( obojetného iontu) s celkovým nábojem rovným nule. Tato oblast se nazývá izoelektrický bod. Amfolyty jsou tedy nabity v závislosti na ph ve kterém se nacházejí. Přii aplikaci vysokého napětí se na základě náboje začnou amfolyty pohybovat k anodě nebo ke katodě. Při aplikaci 1

2 vysokého napětí se zároveň začne formovat ph gradient z tzv. nosných amfolytů. Jak se amfolyt pohybuje k elektrodě skrze ph gradient, mění se i jeho náboj. V okamžiku, kdy dosáhne ph oblasti, která je rovna jeho izoelektrickému bodu, změní se jeho celkový náboj na nulu a elektroforetický pohyb ustane. Tento efekt se nazývá fokusace neboli zaostření. Pokud se amfolyt pohne z fokusované zóny (např. difúzí), nabyde opět náboj různý od nuly a fokusační pohyb ho vrátí zpět do zóny. Nejčastěji využívané formáty pro IEF jsou gel a kapilára. U těchto formátů se rovněž dosahuje nejvyšších účinností. Existuje ovšem i řada dalších formátů IEF. Může to být například fokusace v komůrkách oddělených polopropustnými membránami, případně fokusace v různých průtočných zařízeních. Právě posledně zmíněné se týká této laboratorní úlohy. Izoelektrická fokusace v rozbíhavém toku (DF-IEF) Jedná se o průtočné zařízení (vzorek je kontinuálně dávkován, separován a odebírán), kde probíhá separace na principu IEF. Bližší informace o konstrukci zařízení jsou dohledatelné pod referencemi [1-4]. Prostor vymezený pro průtok kapaliny má lichoběžníkový tvar pro zvýšení účinnosti separace viz Obr. č. 2 a 3. Dávkování vzorku probíhá na nejužší straně, zatímco separované frakce jsou odebírány ze strany nejširší. Tento separační prostor je tvořen netkanou nasákavou textilií (hydrofilizovaný polyethylen). Netkaná textilie má oproti tkaným textiliím výhodu v redukci elektroosmotického toku, který negativně ovlivňuje účinnost separace. Dále je pro redukci elektroosmotického toku do separované směsi přidáván neionogenní tenzid. Netkaná textilie se rovněž netřepí při řezání do požadovaného tvaru a působí jako filtr pokud se ve vzorku nacházejí pevné částice. Úzký profil separačního prostoru na začátku separace umožňuje aplikaci vyšších proudů při snížení odpadního tepla generovaného elektroforetickým pohybem molekul. Postupným rozšiřováním separačního prostoru se fokusované zóny vzdalují a zároveň jsou, díky aplikaci gradientu napětí ve směru toku, dále zaostřovány. Gradientu napětí je docíleno připojením jednotlivých párů elektrod k elektroforetickému zdroji přes rezistory s různými hodnotami odporu. Pro zachování stejného délkového průtoku (cm min -1 ) se s úspěchem využívají další vrstvy netkané textilie, vrstvené směrem k úzkému konci. Toho opatření zabraňuje tvorbě vírů a dalších dynamických jevů v kapalině, které vznikají při využití pouze jedné vrstvy netkané textilie. 2

3 Celé separační lože se nachází v horizontální, nebo mírně nakloněné rovině a dále na tuto rovinu navazuje vertikální část, kde je netkaná textilie rozdělena do proužků, které slouží pro sběr jednotlivých frakcí a anodického a katodického odpadu. Odpadní proužky mají větší šířku pro sběr celých oblastí s extrémním ph. Proužky pro sběr s frakcí i odpadní proužky fungují zároveň jako hydrodynamická pumpa. Jelikož sloupec kapaliny k neustále nutí kapalinu protékatt směrem ke konci proužků, kde se kapalina hromadí vee formě kapky než odkápne do připravených sběrných nádobek. Sběrný prostor je tvořen otvorem, který pojme mikrotitrační destičku na šířku. Díky tomu je možné sbírat 12 frakcí buď do komůrek mikrotitrační destičky, nebo do těchto komůrek zasunout 0,5 ml mikrozkumavky. Celý systém je ovšem velmi variabilní díky využití netkané textilie a proto je možné počet frakcí dle potřeby změnit. Zařízení lze využít především pro preparativní separaci proteinů a peptidů ze surových s roztoků ů díky jeho schopnosti kontinuálně zpracováva t velké množství vzorku. V separovaných frakcích je pak možné získat zakoncentrovaný a odsolený protein/peptid, který lze následně přečišťovat pomocí dalších sofistikovanějšíchh metod. Obrázek 2 - schéma zařízení pro DF-IEF (A - anody, K - katody) 3

4 Obrázek 3 3D schéma DF-IEF zařízení Praktická část Materiály a metody Chemikálie: 10 mm NaCl 0,1 M NaOH 0,1 M KHSO4 SIGMA-AL LDRICH (St. Louis, MO, USA) SIGMA-AL LDRICH (St. Louis, MO, USA) SIGMA-AL LDRICH (St. Louis, MO, USA) 10 % (m/v) Brij 58 (neionogenní tenzid) SIGMA-ALDRICH kovalentně obarvené standardy proteinů (kat. číslo C1992) lyofilizovaný cytochrom-c (izolovaný z hovězího srdce) SIGMA-ALDRICH SIGMA-ALDRICH Směs DF 100x obsahující koncentrovanou směs jednoduchých pufrů Směs barevných markerů izoelektrického bodu (kompletní ph gradient) Směs dvou barevných markerů izoelektrického bodu (okraje ph gradientu) - všechny tři směsi jsou předem připraveny v zásobních lahvích a uchovávány dlouhodobě v lednici pro potřebu IEF v rozbíhavém toku 4

5 - složení všech směsí viz literatura [5-7] Materiály a pomůcky: Netkaná textilie (polyetylen, tloušťka 0,1 mm, Pegatex, Znojmo) Šablony pro řezání netkané textilie Skalpely, nůžky, podložka pro řezání, šablony, pravítka Kádinky, odměrné baňky, vialky Pipety, špičky Mikrotitrační destičky s 12 podélnými komůrkami a 96 čtvercovými komůrkami 0,5 ml mikrozkumavky Zubní zrcátko Přístrojové vybavení: Přístroje zapínejte vždy jen v přítomnosti vyučujícího! Zařízení vytvořené pro DF IEF se třemi páry elektrod (vyrobeno v laboratoři) Zařízení vytvořené pro DF IEF se dvěma páry elektrod (vyrobeno v laboratoři) 2x Peristaltická pumpa (ISMATEC, Glattbrugg, Švýcarsko) Hadičky do peristaltické pumpy s vnitřním průměrem 0,38 mm 2x Programovatelný elektroforetický zdroj* EV232 (Consort bvba, Turnhout, Belgie) *Před zapnutím zdroje se je vždy třeba ujistit, že vodiče jsou všude správně zapojené a nikde není volně přístupná neizolovaná část vodiče! 2x Izolované dráty na propojení zdroje se zařízením + banánky Teploměr s automatickým záznamem teploty (COMET SYSTEM, s.r.o., Rožnov pod Radhoštěm, Česká Republika) 2x Chladicí box (Guzzanti GZ 48 G, Guzzanti, Praha, Česká Republika) Pracovní postup Na začátku cvičení je třeba připravit obě zařízení a separační lože. Pod vedením cvičícího nařežte pomocí skalpelu, pravítka a podložky na řezání separační lože z plátna netkané textilie podle poskytnutých šablon. Takto připravené separační lože poté přiložte na obě zařízení. Při přikládání je výhodné lehce textilii navlhčit, aby lépe přilnula na podklad. Po položení první vrstvy navrstvěte všechny ostatní vrstvy (celkem 10 vrstev od největší po nejmenší) 5

6 Takto připravené zařízení připojte pomocí drátů s banánky k elektroforetickému zdroji!pozor na správnou polaritu červená k červené, černá k černé! a umístěte do chladicího boxu (chlazeného na 10 C). Dále umístěte hadičky do držáků na zařízení a následně zaklapněte tyto hadičky do kazet peristaltických pump. Následně spusťte peristaltické pumpy - u tříelektrodového zařízení nastavte průtok 0,45 ml min -1 a u dvouelektrodového nastavte průtok 0,22 ml min -1. Nasávající konce hadiček ponořte do kádinek s 10 mm roztokem NaCl a celý separační prostor nechte promýt 30 minut pro dokonalou kondicionaci separačního lože. Po počáteční kondicionaci vyměňte u každého proplachovaného zařízení 10 mm roztok NaCl za 50 ml vstupní směsi, kterou namícháte dle následujícího návodu: Odměrná baňka 50 ml na 3-elektrodové z.: 2 ml 0,1 M NaOH 0,8 ml 0,1 M KHSO 4 0,5 ml DF 100x 0,5 ml 10% (m/v) Brij 0,8 ml barevných pi markerů Odměrná baňka 50 ml na 2-elektrodové z.: 2 ml 0,1 M NaOH 0,8 ml 0,1 M KHSO 4 0,5 ml DF 100x 0,5 ml 10% (m/v) Brij 0,5 ml okrajových barevných pi markerů Po výměně 10 mm NaCl za namíchanou směs následuje kompletní popis celého zařízení včetně důležitých aspektů této separační metody. Jakmile je objem netkané textilie kompletně nasycen separační směsí (cca min), zapněte za asistence vedoucího cvičení elektroforetický zdroj s hodnotami limitovanými na 250 V, 12 ma, 6 W (6 ma a 3 W pro 2 elektrodové z.). Následuje kontrola kontaktu elektrod se separačním ložem pomocí vizuální kontroly příslušných diod na zařízení. Z důvodu jejich špatné přístupnosti je třeba využít zubní zrcátko. Pokud některá z diod nesvítí, není příslušná elektroda v kontaktu se 6

7 separačním ložem. Oznamte tuto skutečnost vyučujícímu, který vzniklou situaci vyřeší. Po aplikaci elektrického pole je možné pozorovat počínající tvorbu ph gradientu a fokusaci barevných markerů izoelektrického bodu. Následuje asi 20 minut, ve kterých pozorujeme postupné ustavení ph gradientu na celé délce separačního prostoru. Poté zvyšte napětí na 300V a nechte dalších asi 10 minut proběhnout nové ustavení ph gradientu. Během této doby sledujte zahřívání separačního lože pomocí teploměru s automatickým záznamem teploty. Teplota by neměla vzrůst na více než 15 C během celého cvičení. V posledním kroku přidejte 2 ml 0,1 M NaOH a 0,8 ml 0,1 M KHSO 4 do směsi pro 3 elektrodové zařízení - ilustrace vzorku s vysokou koncentrací solí (1x zvýšení celkové koncentrace). Následuje konzultace se cvičícím na téma vliv vysoké koncentrace soli ve vzorku na separaci. U zařízení se dvěma elektrodami přikápněte na začátek separačního lože 4 µl roztoku barevných standardů proteinů. Opět ponechte cca 10 minut na stabilizování gradientu a opět následuje konzultace pozorované kvality separace proteinů (šířka jednotlivých zón). Poté pomocí špičky skalpelu přidejte na vstup separačního lože malý krystal lyofilizovaného cytochromu c. Tento se postupně rozpustí a opět vytvoří fokusovanou zónu, která postupně migruje až do sběrných proužků. Na závěr celého cvičení si vyzkoušejte podle pokynů cvičícího možné techniky sběru frakcí. Během celé doby cvičení, Vám bude v jednotlivých prolukách prezentována teorie týkající se IEF spolu s ukázkou počítačové simulace IEF pomocí programu SIMUL 5 COMPLEX. Následně budou diskutovány separační metody, které se mohou podílet na další separaci frakcí získaných z IEF spolu s vysvětlením principu ortogonality. Podle časových možností bude dále prezentován další z módů IEF IEF v proužku z netkané textilie. Literatura [1] Šlais, K. (2008). Divergent flow isoelectric focusing. Electrophoresis, 29(12), [2] Štastná, M., & Šlais, K. (2008). Single-input divergent flow IEF for preparative analysis of proteins. Electrophoresis, 29(22),

8 [3] Mazanec, K., Bobalová, J., & Šlais, K. (2009). Divergent flow isoelectric focusing: fast and efficient method for protein sample preparation for mass spectrometry. Analytical and bioanalytical chemistry, 393(6-7), [4] Štastná, M., & Šlais, K. (2010). Preparative divergent flow IEF without carrier ampholytes for separation of complex biological samples. Electrophoresis, 31(3), [5] Stastná, M., & Slais, K. (2005). Colored pi standards and gel isoelectric focusing in strongly acidic ph. Analytical and bioanalytical chemistry, 382(1), [6] Štastná, M., Trávníček, M., & Šlais, K. (2005). New azo dyes as colored isoelectric point markers for isoelectric focusing in acidic ph region. Electrophoresis, 26(1), [7] Štastná, M., & Šlais, K. (2005). Colored pi standards and gel isoelectric focusing in strongly acidic ph. Analytical and bioanalytical chemistry, 382(1),