(Test pro stanovení přítomnosti bakterií kmene Chlamydiaceae (CF) s využitím technologie amplifikované DNA)

Transkript

1 B ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay (Test pro stanovení přítomnosti bakterií kmene Chlamydiaceae (CF) s využitím technologie amplifikované DNA) /1 U 44 Česky Č. patentů (USA): 5,27,184; 5,547,861; 5,648,211; 5,712,124; 5,744,11; 5,846,726; 5,851,767; 5,866,6; 5,919,6; 5,928,869; 5,958,7; 6,54,279; 6,9,552; 6,117,65; 6,16,2; 6,656,68; 6,682,889; 6,74,582. ÚČEL POUŽITÍ Test BD ProbeTec ET pro stanovení přítomnosti bakterií kmene Chlamydiaceae (CF) s využitím technologie amplifikované DNA, který je určen k použití se systémem BD ProbeTec ET, využívá technologii amplifikace s vytěsňováním řetězce (SDA) pro přímé kvalitativní prokázání DNA organizmů patřících ke kmeni Chlamydiaceae (včetně, avšak bez omezení na bakterie Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci). Test je určen pro použití při testování výtěrů z hrdla (s přepravním médiem i bez něj) od pacientů s klinickými příznaky a symptomy, jakož i dalšími diagnostickými důkazy pneumonie. Test lze použít jako pomůcku při stanovení pravděpodobné diagnózy pneumonie související s bakteriemi kmene Chlamydiaceae. SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ Bakterie Chlamydophila pneumoniae způsobují přibližně 5 15 % případů nákazy komunitní pneumonie (CAP). 1 Jediným známým zdrojem nákazy jsou lidé. Přenos z člověka na člověka je možný prostřednictvím respiračních sekretů a většinou vyžaduje těsný kontakt, 2 přičemž inkubační doba je několik týdnů. Většina případů pneumonie vyvolané bakteriemi C. pneumoniae vykazuje relativně mírný průběh a nízkou úmrtnost. Často však dochází k opakované infekci a často se vyskytuje u starších pacientů, kteří vyžadují hospitalizaci. Kultivační metody bakterií C. pneumoniae jsou pomalé a velmi náročné na provedení, proto se v diagnostice běžně nepoužívají. Jsou nicméně důležité pro zdokumentování životnosti organizmů a poskytnutí vzorků pro test citlivosti. K nejběžnějším sérologickým testům používaným pro diagnózu, které umožňují rozlišit primární infekci od opakované infekce, patří mikroimunofluorescenční (MIF) test na protilátky IgM a IgG. Akutní infekce je vymezena čtyřnásobným zvýšením titru protilátek IgG při porovnání akutního a rekonvalescentního séra nebo titru protilátek IgM 16. Dřívější vystavení je indikováno titrem protilátek IgG 16. Použití samostatného zvýšeného titru protilátek IgG při diagnóze se nedoporučuje. Sérologická diagnóza je tedy užitečná spíše jako retrospektivní epidemiologická pomůcka než z hlediska léčby pacienta. Význam stanovení diagnózy pneumonie a její ETiologie se zvyšuje vzhledem k rostoucímu problému nadměrného užívání antibiotik. Při stanovení diagnózy mohou být nápomocné rychlé diagnostické techniky využívající amplifikaci nukleové kyseliny umožňující včasné zahájení vhodné cílené léčby. ZÁSADY POSTUPU Test BD ProbeTec ET pro stanovení přítomnosti bakterií kmene Chlamydiaceae (CF) s využitím technologie amplifikované DNA je založen na současné amplifikaci a detekci cílové DNA pomocí amplifikačních primerů a fluorescenčně značené detekční sondy. Činidla SDA jsou vysoušena ve dvou samostatných jednorázových mikrojamkách. Zpracovaný vzorek se přidá do mikrojamky s primery, která obsahuje amplifikační primery, fluorescenčně značenou detekční sondu a jiná činidla potřebná pro amplifikaci. Primery jsou určeny k amplifikaci 6 základních zachovaných párových oblastí genu RNAse P patřícího ke kmeni Chlamydiaceae včetně Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis a Chlamydophila psittaci. Po inkubaci se směs činidel přenese do amplifikační mikrojamky, která obsahuje dva enzymy (DNA polymerázu a restrikční endonukleázu) nezbytné pro SDA. Amplifikační mikrojamky se utěsní, aby nedošlo ke kontaminaci, a posléze jsou inkubovány v termálně regulované fluorescenční čtečce, která sleduje jednotlivé reakce z hlediska vytváření amplifikovaných produktů. Na každou reakci navazuje následná amplifikace a zároveň se detekuje interní kontrola amplifikace (IAC), jejímž účelem je ověřit, zda jsou vytvořeny vhodné podmínky pro amplifikaci, a minimalizovat možnost hlášení mylně negativního výsledku z důvodu přítomnosti inhibitorů testu. Přítomnost nebo nepřítomnost DNA bakterií kmene Chlamydiaceae se stanoví výpočtem výsledků PAT (vyhovělo hraniční hodnotě) vzorků s předem stanovenými hraničními hodnotami. Přístroj automaticky hlásí výsledky jako pozitivní, negativní nebo neurčité. ČINIDLA A MATERIÁL Každé balení činidel testu BD ProbeTec ET pro stanovení přítomnosti bakterií kmene Chlamydiaceae (CF) s využitím technologie amplifikované DNA obsahuje: mikrojamky s primery bakterií kmene Chlamydiaceae (CF), (1 x 24); 6 oligonukleotidů 7,5 pmol, dntp 15,2 nmol, 2 detekční sondy 22,5 pmol; syntetické oligonukleotidy 75 kopií; amplifikační mikrojamky s bakteriemi kmene Chlamydiaceae (CF), (1 x 24); restrikční enzym: jednotek, DNA polymeráza 14 jednotek; 1 uzávěrů mikrojamek s primery, 16 uzávěrů amplifikačních mikrojamek (1/2), 8 likvidačních vaků. Sada respiračního diluentu, diluentu média a kontrol BD ProbeTec ET (CF/LP*/MP**): Obsah: Respirační diluent a diluent média: bicin, fosforečnan draselný, hydroxid draselný, DMSO a Proclin; 1 (CF/LP/MP) pozitivních kontrol: 1 5 ng DNA spermatu lososa, 47, µg Tris, 9, µg EDTA, 6 kopií plasmidu CF, 4 8 kopií plasmidu LP, 5 4 kopií plasmidu MP; 1 (CF/LP/MP) negativních kontrol: 1 5 ng DNA spermatu lososa, 47, µg Tris, 9, µg EDTA; 1 2 ml zkumavek se zaklapávacím uzávěrem * Odkazuje na test BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) s využitím technologie amplifikované DNA. ** Odkazuje na test BD ProbeTec ET Mycoplasma pneumoniae (MP) s využitím technologie amplifikované DNA.

2 Sada diluentu výtěrů a kontrol BD ProbeTec ET (tcf/tmp)*: Obsah: diluent výtěrů: bicin, fosforečnan draselný, hydroxid draselný, DMSO a Proclin; 1 (tcf/tmp) pozitivních kontrol: 1 75 ng DNA spermatu lososa, 78,8 µg Tris, 15, µg EDTA, 6 kopií plasmidu CF, 8 kopií plasmidu LP, 9 kopií plasmidu MP; 1 (tcf/tmp) negativních kontrol: 1 75 ng DNA spermatu lososa, 78,8 µg Tris, 15, µg EDTA * Označení t označuje činidla, která jsou určená pouze pro použití s výtěry z hrdla (bez přepravního média). Přístroje, zařízení a spotřební materiál: přístroj a přístrojová deska BD ProbeTec ET, ohřívač pro lyzaci BD ProbeTec ET, ohřívač pro plnění a ohřev BD ProbeTec ET, stojan pro lyzaci BD ProbeTec ET, pipetor BD ProbeTec ET, podstavec a zdroj napájení, sada s příslušenstvím BD ProbeTec ET, 2 ml a 4 ml zkumavky se vzorky a uzávěry BD ProbeTec ET, špičky na pipety ProbeTec ET. Potřebný materiál, který není součástí dodávky: biologicky zabezpečená místnost třídy II (BSC), vířivé míchadlo, teplotně necyklická mraznička zajišťující teplotu -2 ºC nebo -7 ºC (nebo nižší), mikroodstředivka s výkonem 16 x g, vodní lázně, digitální teploměr, stojan pro vodní lázeň se šroubovacím dolním víčkem, stojan na 2 ml zkumavky se vzorky a další vhodné stojany na zkumavky se vzorky, tampony BBL CultureSwab EZ, jednorázové rukavice, mikropipety pro objem 2 1 µl, špičky na pipety odolné vůči nanesení aerosolu, destilovaná voda, voda o čistotě podle standardů pro molekulární biologii, 1% (obj./obj.) chlornan sodný s přípravkem Alconox*. * Rozpusťte 7,5 g přípravku Alconox v 1 L 1% roztoku (obj./obj.) chlornanu sodného a promíchejte. Denně připravujte čerstvý. Požadavky pro skladování a manipulaci: Sady činidel testu BD ProbeTec ET CF lze skladovat při teplotě 2 ºC. Nepoužívejte neotevřené sady činidel po uplynutí data exspirace. Po otevření balení jsou mikrojamky stabilní po dobu 12 týdnů, pokud jsou řádně utěsněny, nebo do data exspirace (podle toho, která událost nastane dříve). Nezmrazujte. Sadu respiračního diluentu, diluentu média a kontrol BD ProbeTec ET (CF/LP/MP) lze skladovat při teplotě 2 ºC. Činidla nepoužívejte po uplynutí data exspirace. Nezmrazujte. Sada diluentu výtěrů a kontrol (tcf/tmp) testu BD ProbeTec ET lze skladovat při teplotě 2 ºC. Činidla nepoužívejte po uplynutí data exspirace. Nezmrazujte. Varování a bezpečnostní opatření: Pro diagnostiku in vitro. 1. V klinických vzorcích se mohou nacházet patogenní mikroorganizmy včetně virů hepatitidy a virů lidské imunodeficience (HIV). Proto dodržujte při práci s veškerým materiálem kontaminovaným krví a jinými tělními tekutinami Standardní bezpečnostní opatření 4-7 a předpisy vaší instituce. 2. Diluent výtěru, respirační diluent a diluent média testu BD ProbeTec ET obsahují dimetylsulfoxid (DMSO). DMSO je zdraví škodlivý po vdechnutí, při styku s pokožkou a po požití. Dbejte, aby nedošlo k zasažení očí. Při manipulaci vždy používejte rukavice. V případě zasažení očí je ihned vypláchněte velkým množství vody a vyhledejte lékařskou pomoc. Při styku s kůží okamžitě omyjte velkým množstvím vody.. Přestože není nutné vyhradit v laboratoři zvláštní pracovní plochy, jelikož způsob použití testu BD ProbeTec ET snižuje možnost kontaminace amplikonem v prostředí, v němž test probíhá, je zapotřebí dodržovat bezpečnostní opatření týkající se regulace kontaminace, a to zvláště za účelem zabránění kontaminace vzorků během zpracování nebo přenosu. 4. Obaly s nepoužitými mikrojamkami s primery a amplifikačními mikrojamkami je NUTNÉ po otevření znovu řádně utěsnit. Před opětovným utěsněním obalů činidel zkontrolujte, zda se zde nachází vysušující látka. 5. Před přesunutím desky z ohřívače pro plnění a ohřev BD ProbeTec ET do přístroje BD ProbeTec ET je NUTNÉ desku s amplifikačními mikrojamkami řádně utěsnit amplifikačními uzávěry. Utěsnění zajišťuje uzavření reakce pro amplifikaci a detekci a je nezbytné z hlediska ochrany přístroje a pracovní plochy před kontaminací amplifikačními produkty. V žádném případě neodstraňujte těsnicí materiál z mikrojamek. 6. Mikrojamky s primery se zbytkovou tekutinou (po přenosu tekutiny z mikrojamek s primery do amplifikačních mikrojamek) jsou zdrojem cílové kontaminace. Mikrojamky s primery před likvidací řádně utěsněte uzávěrem. 7. Aby nedošlo ke kontaminaci pracovního prostředí amplifikačními produkty, použijte likvidační vaky dodané v sadě s činidly pro likvidaci testovaných amplifikačních mikrojamek. Před likvidací vaků se ujistěte, že jsou správně uzavřeny. 8. Při stanovených krocích procesu zpracování a testování si MĚŇTE RUKAVICE, aby nedošlo ke zkřížené kontaminaci vzorků. Pokud rukavice přijdou do kontaktu se vzorky, okamžitě je vyměňte, aby nedošlo ke kontaminaci jiných vzorků. 9. V případě kontaminace pracovní plochy nebo zařízení se vzorky či kontrolami pečlivě očistěte kontaminovanou plochu 1% (obj./obj.) chlornanem sodným s přípravkem Alconox a důkladně ji opláchněte vodou. Počkejte, dokud plochy zcela neuschnou, a teprve poté pokračujte v dalším testování. 1. Pro přenos zpracovaných vzorků do mikrojamek s primery a pro přenos vzorků z mikrojamek s primery do amplifikačních mikrojamek používejte pouze pipetor BD ProbeTec ET a špičky na pipety BD ProbeTec ET. 11. Při likvidaci použitých špiček na pipety, zkumavek se vzorky, mikrojamek s primery a jiného jednorázového materiálu dodržujte stanovené předpisy laboratoře. Zlikvidujte je jako biologicky nebezpečný odpad. Odpadní nádoby uzavřete a zlikvidujte, když jsou ze ¾ plné nebo denně (podle okolností). 12. Mikrojamky, kontroly a činidla pro zpracování ze sad s různými čísly šarží nezaměňujte a nepoužívejte je společně. 1. V případě neobvyklých událostí, například při rozlití tekutiny do přístroje BD ProbeTec ET nebo při kontaminaci DNA, jejichž následky nelze odstranit vyčištěním, se obraťte na pracovníky technické podpory. odběr a PŘEPRAVA vzorků 1. Odběr vzorků Vzorky odebírejte a přenášejte v souladu s pokyny v publikaci Clinical Microbiology Procedures Handbook 8 (Příručka postupů v klinické mikrobiologii) nebo s postupy vaší laboratoře. Tampony BBL CultureSwab EZ (BD kat. č ) je potřeba použít pro odběr výtěrů z hrdla uložených bez přepravního média. 2. Skladování a přeprava vzorku Výtěry z hrdla (bez přepravního média): Vzorky lze uchovávat a přepravovat při teplotě 18 ºC po dobu maximálně 2 dnů. 2

3 Vzorky lze uchovávat v chladničce při teplotě 2 8 ºC po dobu maximálně dnů. Vzorky lze uchovávat při teplotě -2 ºC nebo nižší po dobu maximálně 14 týdnů. Výtěry z hrdla v médiu 2SP: 8 Vzorky je ihned potřeba ochladit na teplotu 2 8 ºC. Bude-li přeprava trvat déle než několik minut, umístěte je na vlhký led nebo chladicí sáčky. Vzorky lze uchovávat v chladničce při teplotě 2 8 ºC po dobu maximálně 2 dnů. Vzorky, které budou skladovány po delší dobu, musí být uchovávány při teplotě -7 ºC. PROVEDENÍ TESTU Podrobné pokyny týkající se údržby a provozu jednotlivých částí systému naleznete v návodu k obsluze systému BD ProbeTec ET. A. Příprava přístroje: 1. Před zahájením testu musíte zapnout přístroj a nechat jej zahřát. a. Ohřívač pro lyzaci a ohřívač pro plnění a ohřev vyžaduje k zahřátí a stabilizaci přibližně 9 minut. Požadovaná teplota ohřívače pro lyzaci je 114 ºC. Požadovaná teplota plnicí části ohřívače pro plnění a ohřev je 72,5 C. Požadovaná teplota ohřívací části ohřívače pro plnění a ohřev je 54 C. b. Přístroj BD ProbeTec ET je ovládán softwarem a k rozehřátí vyžaduje přibližně minut. 2. Před zahájením testu je nutné zkontrolovat teploty ohřívačů. Zjištěné teploty zaznamenejte do protokolu údržby systému BD ProbeTec ET. a. Ohřívač pro lyzaci Sejměte plastový kryt a počkejte asi 15 minut, než se teplota ustálí. Teploměr musí ukazovat hodnotu C. b. Ohřívač pro plnění a ohřev Teploměr ohřívače pro plnění musí ukazovat hodnotu 72 7 C. Teploměr ohřívače pro ohřev musí ukazovat hodnotu 5,5 54,5 C.. Zkontrolujte teplotu zobrazenou na obrazovce přístroje BD ProbeTec ET. Teplota musí být v rozmezí 47,5 55, C. Zjištěné teploty zaznamenejte do protokolu údržby systému BD ProbeTec ET. B. Pipetor: Podrobné vysvětlení funkcí tlačítek pipetoru přístroje BD ProbeTec ET naleznete v návodu k obsluze systému BD ProbeTec ET. Kromě toho je potřeba pipetor BD ProbeTec ET po každém použití vyčistit. Správný postup čištění pipetoru BD ProbeTec ET vám sdělí příslušný zástupce technického servisu. K provedení testu BD ProbeTec ET CF je zapotřebí použít tyto programy: Program 1 přenese tekutinu ze zpracovaných vzorků do mikrojamek s primery CF. Program 5 přenese tekutinu z mikrojamek s primery CF do amplifikačních mikrojamek CF. Pipetor naprogramujete následujícím způsobem: Program 1: 1. ZAPNĚTE pipetor. Pipetor vydá jeden zvukový signál, zobrazí NULU, číslo verze softwaru a znovu vydá zvukový signál. 2. Stiskněte modré tlačítko Prog (Program). Pro výběr programu 1 stiskněte tlačítko Vol (Volume Objem), dokud se nezobrazí číslo 1. Stiskněte tlačítko Enter (Zadat).. K zadání programovacího režimu stiskněte a podržte tlačítko Prog (Program). Podržte stisknuté tlačítko Prog (Program) a stiskněte speciální funkční tlačítko špičkou na pipetu nebo koncem sponky na papír. 4. Stiskněte tlačítko Fill (Naplnit). Tiskněte tlačítko se šipkou směřující nahoru, dokud se nezobrazí hodnota 2. Stiskněte tlačítko Enter (Zadat). 5. Stiskněte tlačítko Disp (Aplikovat). Tiskněte tlačítko se šipkou směřující nahoru, dokud se nezobrazí hodnota 15. Stiskněte tlačítko Enter (Zadat). 6. Opětovným stisknutím tlačítka Enter (Zadat) uložte a ukončete program. Přístroj vydá zvukový signál, jímž signalizuje dokončení programování. 7. Zkontrolujte program stisknutím spouštěče projděte všechny kroky. Při procházení jednotlivých kroků nastavte rychlost aspirace nebo aplikace pomocí tlačítka Vol (Objem). U každého kroku se zobrazí indikátor rychlosti. Pomocí tlačítka Vol (Objem) upravte indikátor rychlosti tak, aby zobrazoval 2 čtverečky pro funkci Fill (Naplnit) a Disp (Aplikovat). Program 5 1. Stiskněte tlačítko Prog (Program). Pro výběr programu 5 stiskněte opakovaně tlačítko Vol (Objem), dokud se nezobrazí číslo 5. Poté stiskněte tlačítko Enter (Zadat). 2. K zadání programovacího režimu stiskněte a podržte tlačítko Prog (Program). Podržte stisknuté tlačítko Prog (Program) a stiskněte speciální funkční tlačítko špičkou na pipetu nebo koncem sponky na papír.. Stiskněte tlačítko Fill (Naplnit). Tiskněte tlačítko se šipkou směřující nahoru, dokud se nezobrazí hodnota 1. Stiskněte tlačítko Enter (Zadat). 4. Stiskněte tlačítko Disp (Aplikovat). Tiskněte tlačítko se šipkou směřující nahoru, dokud se nezobrazí hodnota 1. Stiskněte tlačítko Enter (Zadat). 5. Stiskněte tlačítko Mix (Promíchat). Tiskněte tlačítko se šipkou směřující nahoru, dokud se nezobrazí hodnota 5. Stiskněte tlačítko Enter (Zadat). 6. Opětovným stisknutím tlačítka Enter (Zadat) uložte a ukončete program. Přístroj vydá zvukový signál, jímž signalizuje dokončení programování.

4 7. Zkontrolujte program stisknutím spouštěče projděte všechny kroky. Při procházení jednotlivých kroků nastavte rychlost aspirace nebo aplikace pomocí tlačítka Vol (Objem). U každého kroku se zobrazí indikátor rychlosti. Pomocí tlačítka Vol (Objem) upravte indikátor rychlosti tak, aby zobrazoval 2 čtverečky pro funkci aspirace a aplikace. Pomocí tlačítka Vol (Objem) upravte indikátor rychlosti pro promíchání tak, aby zobrazoval čtverečky. Kontrola programu Programy je nutné zkontrolovat před zahájením postupu. Chcete-li zkontrolovat program, ZAPNĚTE pipetor. Stiskněte modré tlačítko Prog (Program). Tiskněte tlačítko Vol (Objem), dokud se nezobrazí číslo příslušného programu (1 nebo 5). Stiskněte tlačítko Enter (Zadat). Pomocí spouštěče pipetoru projděte jednotlivé kroky programu. Program 1: Tento program aspiruje 2 µl a aplikuje 15 µl do mikrojamky CF. Na displeji pipetoru by se měly zobrazit následující údaje: Fill (Naplnit) 2 µl S (Rychlost) II Dispense (Aplikovat) 15 µl S (Rychlost) II Program 5: Tento program aspiruje 1 µl, aplikuje 1 µl a promíchá 5 µl třikrát. Na displeji pipetoru by se měly zobrazit následující údaje: Fill (Naplnit) 1 µl S (Rychlost) II Dispense (Aplikovat) 1 µl S (Rychlost) II Mix (Promíchat) 5 µl S (Rychlost) III Nula (bliká) C. Rozvržení desky: Po zaprotokolování typu testu (testů), identifikačního čísla vzorku, čísel šarží kontrol a čísel šarží sad do systému vygeneruje přístroj BD ProbeTec ET hlášení o rozvržení desky. V hlášení o rozvržení desky je uvedeno fyzické rozvržení vzorků a kontrol pro každou testovanou desku. Tento způsob se používá pro desku s mikrojamkami s primery i pro desku s amplifikačními mikrojamkami. U testu CF jsou mikrojamky s primery vyznačeny světle modrou barvou. Amplifikační mikrojamky jsou světle modře pruhované. D. Zpracování vzorků výtěru z hrdla (bez přepravního média): POZNÁMKY: Diluent výtěru BD ProbeTec ET (tcf/tmp) nechte před použitím ohřát na pokojovou teplotu a opatrně obraťte, aby se promíchal. Oddělte potřebné množství diluentu výtěru BD ProbeTec ET (tcf/tmp) do čisté nádoby. Při odhadu potřebného množství použijte 1 ml na každý vzorek a přidejte další 1 2 ml pro usnadnění pipetace. Aby nedošlo ke kontaminaci diluentu, nevlévejte zbylý diluent zpět do láhve. 1. Označte 4 ml zkumavku se vzorkem pro každý výtěr z hrdla, který má být zpracován. 2. Vzorky se musí ustálit na pokojovou teplotu.. Do každé zkumavky se vzorkem napipetujte 1 ml diluentu výtěru (tcf/tmp). 4. Vložte tampon s výtěrem. Promíchávejte diluent vířivými pohyby po dobu 5 1 sekund. 5. Vymačkejte tampon s výtěrem u vnitřní stěny zkumavky tak, aby tekutina stekla zpět na dno zkumavky. 6. Opatrně vyjměte tampon, aby nedošlo k vystříknutí. POZNÁMKA: Kapičky by mohly znečistit pracovní plochu. 7. Vložte tampon zpět do přepravní zkumavky a zlikvidujte. 8. Zkumavku řádně uzavřete. 9. Obsah každé zkumavky důkladně míchejte ve vířivém míchadle po dobu 5 sekund. 1. Zopakujte kroky 9 pro ostatní výtěry z hrdla. 11. Připravte si kontroly. Viz část Příprava kontrol pro výtěry z hrdla (část F). 12. S pomocí hlášení o rozvržení desky umístěte vzorky a kontroly ve správném pořadí do stojanu pro lyzaci. 1. Ve stojanu pro lyzaci BD ProbeTec ET vzorky zajistěte. 14. Vložte stojan pro lyzaci do ohřívače pro lyzaci BD ProbeTec ET. 15. Vzorky ohřívejte po dobu 1 minut. 16. Po 1 minutách vyjměte stojan pro lyzaci BD ProbeTec ET z ohřívače pro lyzaci BD ProbeTec ET a nechte jej asi 15 minut chladit. Opatrně poklepejte na horní část stojanu, aby se na dně zkumavky usadilo co největší množství kondenzátu. POZNÁMKA: Vzorky po lyzaci: a. Můžete je uchovávat při teplotě 18 ºC po dobu až 6 h a testovat bez opakované lyzace. b. Můžete je uchovávat až dny při teplotě 2 8 ºC. Před testováním musíte vzorky promíchat ve vířivém míchadle a provést opakovanou lyzaci. c. Můžete uchovávat až 14 dnů při teplotě -2 ºC. Před testováním musíte vzorky nechat rozmrazit při pokojové teplotě, promíchat ve vířivém míchadle a provést opakovanou lyzaci. 17. Vzorky jsou připraveny pro provedení testu BD ProbeTec ET CF (část G). E. Zpracování vzorků výtěru z hrdla (médium 2SP) Poznámky k postupu: Mezi přenosy jednotlivých tekutin vyměňte špičky na pipety. Doporučujeme použít špičky na pipety odolné proti nanesení aerosolu. Respirační diluent a diluent média BD ProbeTec ET (CF/LP/MP) nechte před použitím ohřát na pokojovou teplotu a opatrně jej obraťte, aby se promíchal. 4

5 Oddělte potřebné množství respiračního diluentu a diluentu média vzorku BD ProbeTec ET (CF/LP/MP) do čisté nádoby. Při odhadu potřebného množství použijte,4 ml na každý vzorek a přidejte další 1 2 ml pro usnadnění pipetace. Aby nedošlo ke kontaminaci diluentu, nevlévejte zbylý diluent zpět do láhve. 1. Vzorky se musí ustálit na pokojovou teplotu. 2. Označte 2 ml zkumavku pro každý vzorek, který má být testován.. Do každé zkumavky se šroubovacím uzávěrem přeneste 4 µl respiračního diluentu a diluentu média (CF/LP/MP). Následující kroky 4 6 kroky provádějte v biologicky zabezpečené místnosti (BSC): 4. Nechte vzorky důkladně promíchávat po dobu 5 15 sekund. 5. Napipetujte 2 µl vzorku do označené zkumavky. POZNÁMKA: Je-li objem vzorku menší než 2 µl (vzorek musí mít minimální objem 1 µl), doplňte jej do 2 µl vodou o čistotě podle standardů pro molekulární biologii. 6. Po přidání vzorků si vyměňte rukavice. POZNÁMKA: Než budete pokračovat krokem č. 7, naplňte vodní lázeň destilovanou vodou a uveďte ji do varu. 7. Míchejte ve vířivém míchadle po dobu 5 sekund. 8. Připravte si kontroly. Viz část Příprava kontrol pro médium 2SP (část F). 9. Přeneste vzorky a kontroly do stojanu s vodní lázní. 1. Umístěte stojan s vodní lázní do vroucí vodní lázně na dobu 1 minut. 11. Stojan s vodní lázní vyjměte po uplynutí 1 minut a zkumavky nechte zchladnout na pokojovou teplotu po dobu 15 minut. VAROVÁNÍ: Dbejte, aby nedošlo k popálení vroucí vodou, stojanem s vodní lázní nebo povrchy vodní lázně, které mohou být horké. 12. Vzorky po ochlazení odstřeďujte (16 x g) po dobu přibližně 5 sekund. POZNÁMKA: Povařené vzorky: Můžete je uchovávat při teplotě 18 ºC po dobu až 6 h a testovat bez opakovaného povaření. Můžete je uchovávat až dny při teplotě 2 8 ºC. Před testováním musíte vzorky promíchat ve vířivém míchadle a provést opakovanou lyzaci. Vzorky lze uchovávat až 14 týdnů při teplotě -2 C. Před testováním musíte vzorky nechat rozmrazit při pokojové teplotě, promíchat ve vířivém míchadle a provést opakované povaření. 1. Vzorky jsou připraveny pro provedení testu BD ProbeTec ET CF (část G). F. Příprava kontrol: Příprava kontrol pro výtěry z hrdla 1. Pro každou analýzu (testovanou desku) si připravte jednu zkumavku s negativní kontrolou (tcf/tmp) a jednu zkumavku s pozitivní kontrolou (tcf/tmp). Pokud se na desce nachází několik sad činidel různých šarží, je nutné kontroly otestovat pro každou šarži zvlášť. 2. Sejměte uzávěr ze zkumavky s negativní kontrolou (tcf/tmp).. Novou špičkou na pipety aplikujte 1 ml diluentu výtěru. 4. Řádně zkumavku uzavřete. 5. Sejměte uzávěr ze zkumavky s pozitivní kontrolou (tcf/tmp). 6. Novou špičkou na pipety aplikujte 1 ml diluentu výtěru. 7. Řádně zkumavku uzavřete. 8. Míchejte obsah zkumavek s kontrolami ve vířivém míchadle po dobu 5 sekund. 9. Zkumavky s kontrolami jsou připraveny k lyzaci. Viz část Zpracování vzorků výtěru z hrdla (část D). Příprava kontrol pro médium 2SP: 1. Pro každou analýzu (testovanou desku) si připravte jednu zkumavku s negativní kontrolou (CF/LP/MP) a jednu zkumavku s pozitivní kontrolou (CF/LP/MP). Pokud se na desce nachází několik sad činidel různých šarží, je nutné kontroly otestovat pro každou šarži zvlášť. 2. Respirační diluent a diluent média před použitím opatrně převraťte.. Sejměte uzávěr ze zkumavky s negativní kontrolou (CF/LP/MP): 4. Pomocí nové špičky na pipetu pro každou zkumavku s kontrolou přidejte 2 µl vody o čistotě podle standardů pro molekulární biologii. 5. Pomocí nové špičky na pipetu pro každou zkumavku s kontrolou přidejte 4 µl respiračního diluentu a diluentu média. 6. Řádně zkumavku uzavřete. 7. Sejměte uzávěr ze zkumavky s pozitivní kontrolou (CF/LP/MP): 8. Pomocí nové špičky na pipetu pro každou zkumavku s kontrolou přidejte 2 µl vody o čistotě podle standardů pro molekulární biologii. 9. Pomocí nové špičky na pipetu pro každou zkumavku s kontrolou přidejte 4 µl respiračního diluentu a diluentu média. 1. Řádně zkumavku uzavřete. 11. Míchejte obsah zkumavek s kontrolami ve vířivém míchadle po dobu 5 sekund. 12. Kontroly jsou připraveny k provaření. Viz část Zpracování vzorků s médiem 2SP (část E). G. Postup testu BD ProbeTec ET CF: POZNÁMKA: Před provedením testu uspořádejte zpracované vzorky a zpracované kontroly do stojanu, ve kterém lze zpracovávat 2 ml nebo 4 ml zkumavky se vzorky, například stojan pro 2 ml zkumavky se vzorky BD ProbeTec ET nebo stojan pro lyzaci BD ProbeTec ET, které jsou kompatibilní s pipetorem BD ProbeTec ET. 1. Sejměte a zlikvidujte uzávěry ze zchlazených zkumavek se vzorky a kontrolami. 5

6 2. Než budete pokračovat, VYMĚŇTE SI RUKAVICE.. Pomocí hlášení o rozvržení desky si připravte desku s mikrojamkami s primery viz část Rozvržení desky (část C). 4. Obaly na mikrojamky uzavřete následujícím způsobem: a. Položte obal na rovný povrch. Jednou rukou naplocho přidržujte otevřený konec. b. Prstem uhlazujte vnější stranu těsnění od jednoho okraje obalu na druhý a mírně tlačte. c. Zkontrolujte, zda je obal utěsněný. 5. Na pipetoru BD ProbeTec ET vyberte Program Připravte si špičky na pipety. Roztáhněte pipetor BD ProbeTec ET úplným vytažením ovladače. POZNÁMKA: Ujistěte se, že jsou špičky bezpečně připevněny k pipetoru, aby nedošlo k netěsnostem. 7. Aspirujte 2 µl z prvního sloupce vzorků. 8. Opatrně sklopte pipetor, špičkami na pipety se dotkněte stran jamek a aplikujte 15 µl do příslušného sloupce mikrojamek s primery (1 A H). POZNÁMKA: Nesklápějte pipetor přes vzorky nebo mikrojamky, mohlo by dojít ke kontaminaci. Prudkými pohyby se mohou vytvořit kapky nebo aerosoly. 9. Zlikvidujte špičky na pipety. Stlačením spouštěče znovu nastavte pipetor. POZNÁMKA: Při likvidaci špiček postupujte opatrně, aby se nevytvořily kapky nebo aerosoly, které by mohly kontaminovat pracovní plochu. 1. Připravte si nové špičky, roztáhněte pipetor a aspirujte 2 µl z druhého sloupce vzorků. 11. Opatrně sklopte pipetor, špičkami na pipety se dotkněte stran jamek a aplikujte 15 µl do příslušného sloupce mikrojamek s primery (2 A H). 12. Zlikvidujte špičky na pipety. 1. Pokračujte v přenosu zbývajících vzorků pro analýzu. 14. Překryjte desku s mikrojamkami s primery krytem a nechejte ji inkubovat při pokojové teplotě po dobu minimálně 2 minut (inkubace může probíhat maximálně 6 hodin). POZNÁMKA: Uzavřete zpracované vzorky novými uzávěry. VYMĚŇTE SI RUKAVICE. 15. Na konci inkubace mikrojamek s primery si připravte desku s amplifikačními mikrojamkami. Uspořádejte amplifikační mikrojamky na desce tak, aby se shodovaly s hlášením o rozvržení desky (stejné jako u mikrojamek s primery). Utěsněte obal s mikrojamkami podle pokynů v kroku č Sejměte kryt z desky s mikrojamkami s primery a přeneste desku ohřívače pro plnění. IHNED umístěte desku s amplifikačními mikrojamkami do ohřívače pro ohřev, aby se nahřála. 17. Nastavte časovač na 1 minut. (POZNÁMKA: U tohoto kroku je čas velmi důležitý.) 18. Na konci 1minutové (± 1 minuta) inkubace vyberte na pipetoru Program Připravte si špičky na pipety a přeneste 1 µl z prvního sloupce desky s mikrojamkami s primery do prvního sloupce desky s amplifikačními mikrojamkami. Špičky na pipety se dotkněte stran jamek a aplikujte tekutinu. Po aplikaci počkejte, dokud pipetor automaticky nepromíchá tekutinu v jamkách. Opatrně odtáhněte pipetor z desky. Nedotýkejte se jamek. 2. Zlikvidujte špičky na pipety. Připravte si nové špičky a po jednotlivých sloupcích pokračujte v přenosu reakční směsi z mikrojamek s primery do amplifikačních mikrojamek pro každý sloupec použijte novou špičku. 21. Po přenosu posledního sloupce odstraňte zadní část amplifikačního uzávěru. (Jeden amplifikační uzávěr (1/2) zakryje až 6 sloupců. Pokud deska přesáhne 6 sloupců, bude NUTNÉ použít celoplošný uzávěr.) Uchopte okraje uzávěru a položte je přes mikrojamky. Při pokládání uzávěru vám pomohou vodicí lišty na ohřívači pro ohřev. Zatlačte na uzávěr, aby byly všechny mikrojamky řádně utěsněné. 22. Pomocí uživatelského rozhraní přístroje BD ProbeTec ET vysuňte nosič, otevřete dvířka a nadzvedněte kryt desky. IHNED (do sekund) přeneste utěsněnou desku s amplifikačními mikrojamkami do přístroje BD ProbeTec ET a spusťte analýzu. (Podrobné pokyny naleznete v návodu k obsluze systému BD ProbeTec ET.) 2. Po zahájení analýzy proveďte následující část postupu čištění: a. Utěsněte desku s mikrojamkami s primery amplifikačním uzávěrem a vyjměte desku z ohřívače pro plnění a ohřev. VAROVÁNÍ: Při vyjímání desky použijte rukavice odolné vůči nadměrnému teplu teplota přesahuje hodnotu 7 C. b. Ponechejte zkumavky chladnout v této poloze 5 minut. c. Vyjměte uzavřené mikrojamky s primery z desky tak, že podržíte uzávěr na obou stranách, a zvedněte jamky přímo jako jeden celek. Uložte utěsněné mikrojamky do likvidačního vaku a uzavřete jej. d. Vyčistěte kovovou desku: Opláchněte desku 1% (obj./obj.) chlornanem sodným s přípravkem Alconox. Opláchněte desku vodou. Zabalte desku do čisté papírové utěrky a nechejte ji před opětovným použitím důkladně vyschnout. 24. Po dokončení analýzy systém vygeneruje výtisk s výsledky testu. 25. Odstraňte nosič desky z plošiny, otevřete dvířka a vyjměte desku. Zavřete dvířka a vraťte plošinu pro desku do přístroje. 26. Vyjměte z desky utěsněné amplifikační mikrojamky. UPOZORNĚNÍ: Neodstraňujte z mikrojamek těsnicí materiál. Utěsněné mikrojamky lze jednoduše odstranit jako jeden celek uchopte uzávěr nahoře a dole a zvedněte jej přímo nahoru a ven z desky. Uložte utěsněné mikrojamky do likvidačního vaku. Utěsněte vak. 27. Vyčistěte kovovou desku: Opláchněte desku 1% (obj./obj.) chlornanem sodným s přípravkem Alconox. Opláchněte desku vodou. Zabalte desku do čisté papírové utěrky a nechejte ji před opětovným použitím důkladně vyschnout. 28. Po poslední analýze daného dne proveďte tyto postupy čištění: a. Namočte papírové utěrky nebo gázové tampony 1% (obj./obj.) v chlornanu sodném s přípravkem Alconox a vyčistěte jimi desky pracovních stolů a vnější povrch ohřívače pro lyzaci, ohřívače pro plnění a ohřev, stojanu na zkumavky 6

7 se vzorky, vodní lázně, odstředivky a přístroje BD ProbeTec ET. Roztok ponechte na povrchu působit 2 minuty. Namočte papírové utěrky nebo gázové tampony ve vodě a čisticí roztok odstraňte. Při použití čisticího roztoku a oplachování vodou utěrky a gázové tampony často měňte. Rukojeť pipetoru (POUZE RUKOJEŤ) očistěte papírovými utěrkami nebo gázovými tampony navlhčenými 1% (obj./obj.) chlornanem sodným s přípravkem Alconox. Nechte 2 minuty působit a poté rukojeť utřete papírovou utěrkou nebo gázovými tampony navlhčenými vodou. b. Ponořte stojan pro lyzaci, podstavec a kryt stojanu pro lyzaci a desky nebo stojan pro vodní lázeň do 1% (obj./obj.) chlornanu sodného s přípravkem Alconox na dobu maximálně 1 2 sekundy. Poté je důkladně opláchněte vodou a nechejte volně oschnout. c. Dobijte pipetor. d. Zlikvidujte utěsněný likvidační vak a biologický odpad v souladu se stanovenými postupy pro likvidaci kontaminovaného odpadu. 29. Minimálně jednou týdně proveďte následující postupy: a. Vylijte vodu z vodních lázní. b. Očistěte vodní lázně 1% (obj./obj.) chlornanem sodným s přípravkem Alconox. Opláchněte vodou a nechte oschnout. c. Znovu naplňte destilovanou vodou. Kontrola kvality Požadavky na kontrolu kvality musí být splněny v souladu s platnými místními, státními a/nebo federálními předpisy nebo požadavky na akreditaci a se standardními postupy kontroly kvality vaší laboratoře. Doporučujeme, aby si uživatel prostudoval informace o správném provádění kontroly kvality v příslušných směrnicích CLSI (dříve NCCLS) a předpisech CLIA. Diluent výtěru a kontroly jsou baleny společně v sadě diluentu výtěrů a kontrol (tcf/tmp). Respirační diluent, diluent média a kontroly jsou baleny společně v sadě respiračního diluentu, diluentu média a kontrol (CF/LP/MP). Součástí každého typu vzorku, každé analýzy na desce a každé sady činidel s novým číslem šarže musí být jedna pozitivní a jedna negativní kontrola. Kontroly lze umístit libovolně. Pozitivní kontrola sleduje zásadní selhání činidel. Negativní kontrola sleduje kontaminaci činidel a pracovního prostředí. Aby bylo možné generovat výsledky vzorků, musí být výsledek pozitivní kontroly pozitivní a výsledek negativní kontroly negativní. Pokud kontrola kvality nedopadne podle očekávání, bude přístroj analýzu považovat za neplatnou a výsledky pacientů nenahlásí. Pokud výsledky kontroly kvality nebudou takové, jaké byste očekávali, zopakujte celou analýzu pomocí nové sady kontrol, nových mikrojamek a zpracovaných vzorků. Jestliže neadekvátní zpracovaný vzorek získáte i pro opakovaný test, znovu zpracujte další poměrný díl primárního vzorku. Pokud ani opakované kontroly nepřinesou uspokojivé výsledky kontroly kvality, obraťte se na pracovníky technické podpory (viz část Interpretace výsledků). Do mikrojamky s primery je zabudována interní kontrola amplifikace (IAC). IAC obsahuje kyselinu nukleovou, která se v přítomnosti matrice vzorku amplifikuje. Účelem IAC je ověření platnosti amplifikační reakce a identifikace potenciální inhibice ze zpracovaných vzorků. Kontroly zpracování vzorků Kontroly zpracování vzorků lze testovat v souladu s požadavky příslušných akreditačních organizací. Pozitivní a negativní kontroly by měly testovat celý systém analýzy. K tomuto účelu mohou známé pozitivní vzorky posloužit jako kontroly, a to tak, že budou zpracovány a testovány souběžně s neznámými vzorky. Vzorky použité jako kontroly zpracování je nutno skladovat, zpracovávat a testovat v souladu s návodem k produktu. Pozitivní a negativní kontroly jsou určeny ke kontrole účinnosti postupů zpracování vzorků při testování výtěrů z hrdla (s přepravním médiem nebo bez něj, kontroly výtěru z hrdla, respirační kontroly a kontroly média, v uvedeném pořadí), protože kontroly jsou zpracovány podobným způsobem jako samotné vzorky. Monitorování kontaminace DNA: Alespoň jednou měsíčně je nutno provést následující test na přítomnost kontaminace DNA na pracovní ploše a povrchu přístroje. Monitorování prostředí je nezbytně důležité k tomu, aby byla kontaminace detekována, než dojde k potížím. 1. Pro každou plochu* určenou k testování použijte tampon BBL CultureSwab EZ. 2. Označte zkumavku se vzorkem pro každou plochu, kterou budete potírat tamponem, a do každé zkumavky se vzorkem napipetujte 1 ml diluentu výtěru (tcf/tmp).. Namočte první tampon do diluentu a dlouhými pohyby potřete první plochu. 4. Promíchejte tampon v diluentu, vymačkejte jej, uzavřete zkumavku a protřepávejte ji ve vířivém míchadle po dobu 5 sekund. Tampony zlikvidujte. 5. Stejný postup zopakujte u každé potřené plochy. 6. Umístěte zkumavky do stojanu pro lyzaci a ohřívejte je v ohřívači pro lyzaci po dobu 1 minut. Vyjměte stojan z ohřívače, a než budete pokračovat, nechejte vzorky 15 minut chladnout. 7. Zatímco se zkumavky nahřívají, odstraňte čistými utěrkami namočenými ve vodě zbytky směsi pufrů z potřených ploch. 8. Jakmile vzorky zchladnou, pokračujte provedením testu BD ProbeTec ET CF (část G). * K plochám doporučeným pro testování patří: povrchy stojanu pro lyzaci, ohřívač pro lyzaci, stojan pro vodní lázeň, mikroodstředivka, zahřívač pro plnění a ohřev, černé desky s mikrojamkami, rukojeť pipetoru, tlačítka přístroje, klávesnice přístroje, suchý povrch vodních lázní, povrch stojanu pro zkumavky se vzorky a pracovní stůl včetně míst pro zpracování vzorků. Pokud výsledek testu některé plochy bude pozitivní, vyčistěte plochu čerstvým 1% (obj./obj.) chlornanem sodným s přípravkem Alconox. Zkontrolujte, zda je celá plocha potřena čisticím roztokem, a nechejte čisticí roztok na povrchu působit alespoň 2 minuty, nebo do té doby, než uschne. V případě potřeby odstraňte nadbytečné množství čisticího roztoku čistou utěrkou. Otřete plochu čistou utěrkou namočenou ve vodě a nechejte uschnout. Otestujte danou plochu znovu. Postup opakujte tak dlouho, dokud nezískáte negativní výsledky. Pokud kontaminaci nelze vyřešit, obraťte se na pracovníky technické podpory, kteří vám poskytnou další informace. 7

8 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ TESTU Přítomnost nebo nepřítomnost DNA bakterií kmene Chlamydiaceae se stanoví výpočtem výsledků PAT (vyhovělo hraniční hodnotě) vzorků s předem stanovenými hraničními hodnotami. Výsledek PAT je metrická hodnota, která slouží k vyhodnocení velikosti signálu vygenerovaného jako výsledek reakce. U této hodnoty znamenají větší čísla dosažení hraniční hodnoty v rané fázi amplifikace, zatímco nižší čísla znamenají, že bylo hraniční hodnoty dosaženo později v průběhu reakce. Velikost výsledku PAT není měřítkem pro stanovení hladiny DNA bakterií kmene Chlamydiaceae ve vzorku. Nejsou-li výsledky kontrol testu v souladu s očekáváními, výsledky pacientů nebudou hlášeny. Očekávané hodnoty kontrol najdete v části Kontrola kvality. Výsledky uvedené v hlášení jsou určeny takto: Výsledek PAT Cíl CF Cíl IAC Výsledek Interpretace Hlášení > > nebo = Pozitivní SDA zjistila DNA kmene Chlamydiaceae. = > Negativní SDA nezjistila DNA kmene Chlamydiaceae. 8 Pozitivní na organizmy patřící do kmene Chlamydiaceae, naznačuje aktuální infekci. Je potřeba provést další test pro určení zjištěného druhu. Předběžně negativní na organizmy patřící do kmene Chlamydiaceae. Infekci bakteriemi kmene Chlamydiaceae nelze vyloučit, neboť zjištěná hladina DNA může být pod detekčním limitem testu. = = Nejasné Amplifikace kontroly inhibována. Pro interpretaci výsledků je potřeba provést dodatečný test. a a Zopakujte test BD ProbeTec ET CF ze zpracované zkumavky se vzorkem. Pokud ze zpracovaného vzorku zbývá nedostatečný objem, podle potřeby zopakujte test pomocí původního vzorku nebo požádejte o nový vzorek. Pokud je opakovaný výsledek pozitivní nebo negativní, interpretujte jej podle výše uvedené tabulky. Pokud se výsledek zopakuje jako neurčitý, měli byste požádat o nový vzorek. Stanovení hraniční hodnoty CF a IAC: Hraniční hodnoty cílové DNA a IAC pro kmen Chlamydiaceae byly původně stanoveny pomocí analýz křivky charakteristiky operátoru příjemce dat získaných z pozitivních a negativních kontrol. Tyto hraniční hodnoty byly ověřeny a potvrzeny klinickými studiemi. omezení postupu 1. Test BD ProbeTec ET CF je specifický pro členy kmene Chlamydiaceae (tj. C. trachomatis, C. muridarum, C. suis, C. abortus, C. percorum, C. caviae, C. pneumoniae, C. felis a C. psittaci), avšak nerozlišuje je. 2. Test BD ProbeTec ET CF byl hodnocen pouze u výtěrů z hrdla (s přepravním médiem 2SP i bez něj). Účinnost testu s jinými typy vzorků nebyla stanovena.. Test BD ProbeTec ET CF byl hodnocen pouze u pacientů starších jednoho roku. 4. Podobně jako u mnoha diagnostických testů je výsledky testu BD ProbeTec ET CF potřeba interpretovat v kontextu dalších laboratorních a klinických dat, které má lékař k dispozici. Indikací pneumonie související s bakteriemi kmene Chlamydiaceae je pozitivní výsledek pro tento test ve spojení s dalšími klinickými příznaky, symptomy a diagnostickými důkazy pneumonie. 5. Negativní výsledek testu nelze použít k vyloučení pneumonie související s bakteriemi kmene Chlamydiaceae, neboť výsledky testu mohou být ovlivněny nesprávným odběrem vzorků, technickou chybou, smícháním vzorků, souběžnou léčbou antibiotiky nebo přítomností množství DNA bakterií kmene Chlamydiaceae ve vzorku, které je pod hranicí analytické citlivosti testu. Proto může být nutné provést další diagnostické testovací postupy, např. kultivaci, sérologii nebo ověřený test amplifikace nukleové kyseliny dle doporučení ve zveřejněných předpisech Test BD ProbeTec ET CF nelze použít k vyhodnocování léčebných úspěchů nebo nezdarů, poněvadž kyseliny nukleové z organizmů kmene Chlamydiaceae mohou antimikrobiální léčbu přežít. 7. Optimální účinnost tohoto testu vyžaduje správné provedení odběru vzorku a správné zacházení se vzorkem. 8. Použití testu BD ProbeTec ET CF mohou používat pouze osoby vyškolené k provádění testu a práci se systémem BD ProbeTec ET. 9. Test BD ProbeTec ET CF poskytuje kvalitativní výsledky. Mezi hodnotou výsledku PAT a množstvím DNA kmene Chlamydiaceae ve vzorku nelze hledat souvislost. OČEKÁVANÉ VÝSLEDKY A: Prevalence Míra pozitivity pozorovaná při testování Chlamydiaceae se bude lišit v závislosti na použité testovací metodě, věku pacienta, přítomnosti základních rizikových faktorů, geografické poloze a především prevalenci místní nemoci včetně možného vystavení při výkonu povolání. B: Frekvenční rozložení výsledků PAT Prospektivní studie Poznámka: Všechny výsledky testu BD ProbeTec ET CF byly porovnány s výsledky kultivace výtěru z hrdla vymačkaného do přenosného média 2SP. Podrobný popis designu klinické studie najdete v části Specifické vlastnosti účinnosti. Testem BD ProbeTec ET CF bylo analyzováno celkem 54 výtěrů z hrdla (skladovány bez přepravného média) odebraných prospektivně od 54 pacientů na sedmi klinikách v USA a Kanadě. Frekvenční rozložení počátečních výsledků CF PAT ve srovnání s kultivačními výsledky je uvedeno na obrázku 1. Sedmdesát pět výtěrů z hrdla, které byly odebrány prospektivně a vymačkány do přepravního média 2SP pro testování kultivace, bylo testováno také testem BD ProbeTec ET CF. Frekvenční rozložení počátečních výsledků CF PAT ve srovnání s kultivačními výsledky je uvedeno na obrázku 2.

9 Retrospektivní studie Dvacet pět retrospektivních výtěrů z hrdla, které byly vymačkány do přepravního média 2SP a uloženy v mrazničce, bylo testováno testem BD ProbeTec ET CF na klinikách v Evropě. Frekvenční rozložení počátečních výsledků CF PAT ve srovnání s původním výsledkem kultivace je uvedeno na obrázku. Frekvenční rozložení počátečních výsledků CF PAT ve srovnání s původním výsledkem PCR ze stejných vzorků je uvedeno na obrázku 4. Obrázek 1: Frekvenční rozložení výsledků CF PAT Výsledky prospektivních výtěrů z hrdla (bez přepravního média) ve srovnání s kultivací Frekvence (-) (+) Výsledek CF PAT Kultivace ( ) Kultivace (+) Výsledek kultivace Celkem Negativní Pozitivní Celkem Obrázek 2: Frekvenční rozložení výsledků CF PAT Výsledky prospektivních výtěrů z hrdla (médium 2SP) ve srovnání s kultivací Frekvence (-) (+) 1 Výsledek CF PAT Kultivace ( ) Kultivace (+) Výsledek kultivace Celkem Negativní Pozitivní Celkem

10 Obrázek : Frekvenční rozložení výsledků CF PAT Výsledky retrospektivních výtěrů z hrdla (médium 2SP) ve srovnání s kultivací (médium 2SP) Frekvence,5 2,5 2 1,5 1,5 (-) (+) Výsledek CF PAT 1 Kultivace ( ) Kultivace (+) Výsledek kultivace Celkem Negativní Pozitivní Celkem 1 4 Obrázek 4: Frekvenční rozložení výsledků CF PAT Výsledky retrospektivních výtěrů z hrdla (médium 2SP) ve srovnání s PCR (médium 2SP) 1 4 Frekvence (-) (+) Výsledek CF PAT Kultivace ( ) Kultivace (+) Výsledek PCR Celkem Negativní Pozitivní 4 Celkem C. Kontroly Během klinického hodnocení bylo provedeno 45 analýz s použitím respiračních kontrol a kontrol médií (CF/LP/MP). Všechny analýzy dosáhly přijatelných kontrolních výsledků. Bylo provedeno celkem 78 analýz s použitím kontrol výtěrů z hrdla (tcf/tmp). U dvou z analýz došlo k selhání kontrol. Jedno selhání bylo zapříčiněno chybou postupu, druhé nebylo možné přiřadit ke specifické příčině. Výsledky PAT pro kontroly CF/LP/MP a tcf/tmp jsou shrnuty v tabulkách 1 a 2 (v uvedeném pořadí). Tabulka 1: Souhrn výsledků CF PAT pro respirační kontroly a kontroly médií (CF/LP/MP) Kontrola N Rozsah 5. percentil Průměr Medián 95. percentil Negativní CF 45 Pozitivní CF 45 9,5 52, 41,4 49, ,

11 Tabulka 2: Souhrn výsledků CF PAT pro kontroly výtěrů z hrdla (tcf/tmp) Kontrola N Rozsah 5. percentil Průměr Medián 95. percentil Negativní CF 77 Pozitivní CF 76 28, 52,7 48,5 51,1 51,8 52,5 SPECIFICKÉ VLASTNOSTI ÚČINNOSTI Prospektivní studie Test BD ProbeTec ET CF byl hodnocen prospektivně v sedmi klinických střediscích v USA a Kanadě během respirační sezóny Pro testování testem BD ProbeTec ET CF byl odebrán výtěr z hrdla (CultureSwab EZ skladován bez přepravního média). Jeden polyesterový tampon s odebraným výtěrem byl uložen do přepravního média 2SP (fosfát sacharózy) pro testování kultivace a druhý polyesterový tampon s výtěrem byl uložen do pufru Tris-EDTA (TE) pro testování polymerázové řetězové reakce (PCR). Poté byly výsledky BD ProbeTec ET CF ze všech prospektivně odebraných vzorků porovnány s výsledky kultivace výtěrů z hrdla z média 2SP. Všechny referenční testy kultury Chlamydiaceae provedlo jedno ze sedmi klinických středisek. Přítomnost minimálně jedné inkluze po označení monoklonální protilátkou specifickou pro členy rodu byla považována za příznak toho, že vzorek byl pozitivní na druh kmene Chlamydiaceae. Přítomnost minimálně jedné inkluze po označení monoklonální protilátkou konjugovanou s FITC specifickou pro C. pneumoniae byla považována za příznak toho, že vzorek byl pozitivní na C. pneumoniae. Všechna testování PCR pro prospektivní vzorky provedlo jedno ze sedmi klinických středisek. Test PCR byl proveden na výtěrech z hrdla vymačkaných do pufru TE od všech pacientů, kteří v testu BD ProbeTec ET CF dosáhli pozitivního výsledku, jakož i u části shodných negativních vzorků a všech vzorků s nesouhlasnými výsledky (tj. vzorků s neshodou mezi testem BD ProbeTec ET CF a referenční metodou). Analýza PCR byla specifická pro C. pneumoniae a je jedním ze čtyř zveřejněných protokolů, které splňují optimální kritéria pro ověřenou analýzu PCR.,9 Celkem 54 výtěrů z hrdla (uložených bez přepravního média), které byly odebrány od 54 pacientů, splnilo kritéria zahrnutí do studie (tj. radiologické potvrzení pneumonie, pacienti ve věku 1 rok, délka trvání léčby antibiotiky 14 dnů, odběr platných typů vzorku, použití vhodných referenčních metod apod.). Pro zhodnocení výkonových charakteristik analýzy BD ProbeTec ET CF byly porovnány výsledky výtěrů z hrdla (bez přepravního média) s výsledky kultivace paralelních výtěru z hrdla vymačkaných do přenosného média 2SP. Vzorek byl pokládán za pozitivní, byl-li výsledek kultivace pozitivní. Vzorek byl pokládán za negativní, byl-li výsledek kultivace negativní. Výsledky výtěrů z hrdla (bez přepravního média) jsou shrnuty v tabulce. Nebyly pozorovány žádné neurčité výsledky. 11

12 Tabulka : Výsledky prospektivních výtěrů z hrdla testu BD ProbeTec ET CF (bez přepravního média) ve srovnání s kultivací Kultivace Středisko Výsledek CF Pozitivní Negativní Celkem 1 Pozitivní Negativní 2 a Celkem Pozitivní Negativní Citlivost (95 % CI) % (/2) ( % 84,2 %) Specificita (95 % CI) 1 % (89/89) (95,9 % 1 %) Celkem NA 1 % (26/26) (86,8 % 1 %) Pozitivní 1 b 1 Negativní Celkem NA 99 % (97/98) (94,4 % 1 %) 4 Pozitivní Negativní Celkem NA 1 % (24/24) (85,8 % 1 %) 6 Pozitivní Negativní 4 4 Celkem 4 4 NA 1 % (4/4) (89,7 % 1 %) 7 Pozitivní Negativní 1 c 8 81 Celkem Souhrnně Pozitivní 1 1 Negativní 5 5 Celkem % (/1) ( % 97,5 %) % (/) ( % 7,8 %) 1 % (8/8) (95,5 % 1 %) 99,7 % (5/51) (98,4 % 1 %) a Výsledky kultivace pro oba vzorky vykázaly postupný růst 1+ (1 inkluze na jamku nebo 5 inkluzí na ml média 2SP). Výsledky PCR pro oba vzorky byly negativní. b Výsledek PCR byl pozitivní. c Kultivace vykázala postupný růst 2+ (72 inkluzí na jamku nebo 6 inkluzí na ml média 2SP). Výsledek PCR byl negativní. NA = Nelze použít. POZNÁMKA: Analýza PCR je specifická pro C. pneumoniae a je jedním ze čtyř zveřejněných protokolů, které splňují optimální kritéria pro ověřenou analýzu PCR.,9 Sedmdesát pět výtěrů z hrdla (vymačkaných do média 2SP), které byly odebrány prospektivně a vymačkány do přepravního média 2SP pro testování kultivace, bylo testováno také testem BD ProbeTec ET CF. Výsledky výtěrů z hrdla vymačkaných do média 2SP byly porovnány s výsledkem kultivace stejného vzorku. Vzorek byl pokládán za pozitivní, byl-li výsledek kultivace pozitivní. Vzorek byl pokládán za negativní, byl-li výsledek kultivace negativní. Výsledky výtěrů z hrdla uložených v přepravním médiu 2SP jsou shrnuty v tabulce 4. Nebyly pozorovány žádné neurčité výsledky. 12

13 Tabulka 4: Výsledky prospektivních výtěrů z hrdla testu BD ProbeTec ET CF (médium 2SP) ve srovnání s kultivací Kultivace StŘedisko Výsledek CF Pozitivní Negativní Celkem 2 Pozitivní Negativní 1 a 6 7 Citlivost (95 % CI) Specificita (95 % CI) Celkem % (/1) ( % 97,5 %) 1 % (6/6) (9, % 1 %) Pozitivní 1 c 1 Negativní 2 b 5 7 Celkem % (/2) ( % 84,2 %) 97,2 % (5/6) (85,5 % 99,9 %) Souhrnně Pozitivní 1 1 Negativní Celkem % (/) ( % 7,8 %) 98,6 % (71/72) (92,5 % 1 %) a Kultivace vykázala postupný růst 2+ (72 inkluzí na jamku nebo 6 inkluzí na ml média 2SP). Výsledek PCR byl negativní. b Výsledky kultury pro oba vzorky vykázaly postupný růst 1+ (1 inkluze na jamku nebo 5 inkluzí na ml média 2SP). Výsledek PCR pro oba vzorky byl negativní. c Výsledek PCR byl pozitivní. POZNÁMKA: Analýza PCR je specifická pro C. pneumoniae a je jedním ze čtyř zveřejněných protokolů, které splňují optimální kritéria pro ověřenou analýzu PCR.,9 Jeden z výtěrů z hrdla odebraného od každého pacienta zahrnutého do prospektivní studie pro analýzu BD ProbeTec ET CF byl odložen do pufru Tris-EDTA pro testování PCR. Všechny pozitivní nesouhlasné vzorky (pozitivní analýza BD ProbeTec ET CF, kultivačně negativní nebo naopak) a přibližně 1 % shodných negativních vzorků bylo testováno uznávanou metodou PCR specifickou pro C. pneumoniae. Všechny testy PCR byly provedeny v jednom klinickém zařízení. Celkem 27 pacientů mělo vzorky, které byly testovány testem C. pneumoniae PCR (tj. 21 pacientů se shodnými negativními výsledky a šest pacientů s neshodnými výsledky). Tabulka 5 shrnuje celkovou kombinaci výsledků kultivace, testu BD ProbeTec ET CF a analýzy PCR. Tabulka 5: Souhrn výsledků metod testování prospektivních pacientů a testu BD ProbeTec ET CF Výsledek kultivace Výsledky testu BD ProbeTec ET CF Výsledek PCR c Počet pacientů Výtěr z hrdla Médium 2SP + a Nevyhovělo b + N/A N/A 65 N/A 17 N/A N/A 26 N/A N/A 1 Vysvětlivky: N/A = Není k dispozici. + označuje pozitivní výsledek. označuje negativní výsledek. a Dvě kultivace vykázaly postupný růst 1+ (1 inkluze na jamku nebo 5 inkluzí na ml média 2SP). Jedna kultivace vykázala postupný růst 2+ (72 inkluzí na jamku nebo 6 inkluzí na ml média 2SP). b Vzorek byl na místo testování doručen v rozmraženém stavu. Přesto byla provedena kultivace a byla negativní. Protože byl vzorek narušený, výsledek kultivace nebyl použit při hodnocení výkonnostních charakteristik testu BD ProbeTec ET CF. c Analýza PCR je specifická pro C. pneumoniae a je jedním ze čtyř zveřejněných protokolů PCR, které splňují optimální kritéria pro ověřenou analýzu PCR.,9 Retrospektivní studie Z důvodu nízkého počtu pozitivních vzorků zjištěných v prospektivní studii společnost BD určila kliniku v Evropě, která vymačkala 25 výtěrů z hrdla do přepravního média 2SP, které byly posléze zmraženy. Tyto retrospektivní vzorky byly uskladněny v mrazničce až osm let, přičemž většina vzorků (84 %; 21/25) byla uskladněna méně než šest let. 25 retrospektivních vzorků charakterizovala kombinace kultivace a PCR nebo pouze PCR. Z 25 vzorků vykázaly všechny 1