sekvenční mechanismus buď A, nebo B) ping-pongový pongový mechanismus Clelandova zjednodušen typické pro reakce dehydrogenas:

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "sekvenční mechanismus buď A, nebo B) ping-pongový pongový mechanismus Clelandova zjednodušen typické pro reakce dehydrogenas:"

Jana Marešová
před 5 lety
Počet zobrazení:

1 Vícesubstrátoé reakce enzymoé reakci se účastní da nebo íce substrátů,, dousubstráto toé nejčast astější sekenční mechanismus uspořádaný (napřed se áže e A, pak B) náhodný (jako prní se můžm ůže e ázat buď A, nebo B) ping-pongoý pongoý mechanismus Sekenční uspořádaný mechanismus Clelandoa zjednodušen ená znázorn zornění typické pro reakce dehydrogenas: jako prní substrát t se áže e NAD +, ethanol se na olný enzym neáže 1

Sekenční uspořádaný = A + Vmax[A][B] [A] + m,a [B] + [A][B] A ronoážná disociační konstanta pro reakci E + E = EA (znik binárn rního komplexu) m,a a Michaelisoy konstanty pro substráty ty A a B V max

2 Sekenční uspořádaný = A + Vmax[A][B] [A] + m,a [B] + [A][B] A ronoážná disociační konstanta pro reakci E + E = EA (znik binárn rního komplexu) m,a a Michaelisoy konstanty pro substráty ty A a B V max maximáln lní rychlost pro [A] a současn asně [B] 1 = m, A + A m, B Vmax m,a[b] [A] Vmax [B] inetická analýza primárn rní LB grafy pro jeden substrát t fixní (B), druhý ariabilní - sazky přímek, p pro které se určí směrnice, úseky sekundárn rní grafy - ýnosy směrnic, resp. úseků proti 1/[B] [B], získají se přímky, p z nich se pak určí příslušné konstanty (složit ité,, lze najít t literatuře) e) 2

3 Sekenční náhodný mechanismus kreatinkinasa Sekenční náhodný = m,a V + [A][B] [A] + max m,a [B] + [A][B] oba primárn rní grafy mají opět t charakter sazků protínaj najících ch se přímekp interpretace pomocí reciproké formy = m, A m, 1 Vmax [B] [A] Vmax [B] 1 B 3

4 Ping-pongoý mechanismus naázání prního substrátu tu A uolnění prního produktu P zniká pozměněná forma enzymu E' E naázání druhého ho substrátu tu B uonění druhého ho produktu Q nezniká ternárn rní komplex AST (ping-pong) pong) glutamát:aspart t:aspartátaminotransferasataminotransferasa 4

Ping- pongoý = Vmax[A][B] [A] + [B] + [A][B] m,a 1 = m, A 1 1 + 1 + m, B Vmax [A] Vmax [B] primárn rní ýnos pro prní substrát t (A) mám charakter ronoběž ěžek Jak určit typ mechanismu rychlost

5 Ping- pongoý = Vmax[A][B] [A] + [B] + [A][B] m,a 1 = m, A m, B Vmax [A] Vmax [B] primárn rní ýnos pro prní substrát t (A) mám charakter ronoběž ěžek Jak určit typ mechanismu rychlost isotopoé ýměny (iz minule) studium kinetiky reakce se substráty ty primárn rní grafy - pokud dostaneme pro jeden ze substrátů ronoběž ěžky, tak se tento substrát t áže e prní a jedná se o ping- pongoý mechanismus pokud oba prim. grafy mají tar protínaj najících ch se přímek p - jedná se o sekenční náhodný či i uspořádaný mechanismus studium liu inhibice produkty do reakční směsi si se přidp idá nadbytku jeden z produktů,, a zkoumá se jeho inhibice každému z obou substrátů formy enzymu, na které se áží substrát t a inhibitor, jsou: shodné kompetitiní inhibice různé,, oddělen lené reersibilními mi kroky směsn sná inhibice různé,, oddělen lené ireersibilními kroky akompetitiní inhibice 5

6 Možné mechanismy A EA B 1. E EAB EPQ B EB A P Q 2. E + A EA + B EAB E P Q 3. E + B EB + A EAB E A P B Q 4. E EA E' E'B B P A Q 5. E EBE E' E'A E E Rychlost isotopoé ýměny - náhodný reakce hexokinasy: glukosa + ATP == glukosa-6p + ADP rychlost ýměny rad. značen ené glukosy* * a G6P (resp. ATP* * a ADP) záislosti z na konsentraci G6P,, za ronoáhy reakce (mm/min) monotonní nárůst obou rychlostí ýměn n sědčí o náhodném sekenčním m mechanismu bez jednoho z reaktantů ýměna neprobíhá - oba jsou potřebn ebné [G6P] (mm) [G]/[G6P] = 1/19 (ronoáha ha) 6

7 Rychlost isotopoé ýměny - sekenční reakce laktátdehydrogenasy tdehydrogenasy laktát t + NAD + == pyruát t + NADH (mm/min) obě ýměny ychází z nuloého stau, prochází lokáln lním m maximem, poté se ýměna pyruát* - laktát t ustálí, ašak ak ýměna NAD + * - NADH [laktát]] (mm) prakticky ustane [pyruát]/[laktát]] = 1/35 (ronoáha ha) mechanismus je sekenčí uspořádaný daný, prní se áže e NAD +, pak laktát, t, uolní se pyruát, nakonec NADH nadbytek laktátu tu ede k tomu, že e enzym je přep eážně přítomen e formě ternárn rního komplexu (EAB resp. EPQ), a roztoku není přítomná olná forma E nutná pro azbu NAD + resp. NADH - tato ýměna poklesne Rychlost isotopoé ýměny - ping-pong pong izotopoá ýměna můžm ůže e probíhat i tom případp padě, že schází druhý substrát A <---< ---> > P [0,0] [B] 7

8 studium liu externích inhibitorů inhibitor se olí tak, aby kompetoal s jedním m ze substrátů (A a I A - jsou strukturně podobné) ) = áží se oba na stejnou formu enzymu pak se zkoumá,, jaký je proje inhibice ůč ůči i druhému substrátu tu B: akompetitiní - napřed se áže e substrát t B, pak substrát t A směsn sná,, resp. nekompetitiní - napřed se áže e substrát t A, pak substrát t B A I A B I B Příklad: E EA EAB I A kompetuje s A, nekompetitiní ůči i B I B kompetuje s B, akompetitiní ůči i A 8

Podobné dokumenty

Reversibilní inhibitory [E][I] = [EI] [ES][I] = [ESI] Inhibice enzymové aktivity. inhibitory = látky l

Reversibilní inhibitory [E][I] = [EI] [ES][I] = [ESI] Inhibice enzymové aktivity. inhibitory = látky l Inhibice enzyoé aktiity inhibitory látky l snižuj ující specificky aktiitu daného enzyu ztráta ta aktiity ůž ůže e být dočasn asná,, aktiita se obnoí odstranění inhibitoru (např.. dialysa, geloá filtrace,