INSTRUCTIONS FOR USE HB&L MRSA KIT

Transkript

1 Rev KIT PRO RYCHLÝ SCREENING METICILIN-REZISTENTNÍHO STAPHYLOCOCCUS AUREUS U SCREENINGOVÝCH KULTIVACÍ Z VÝTĚRU U ANALYZÁTORŮ ALFRED60, ALFRED60 / AST A HB&L UROQUATTRO METODOU LASEROVÉHO ROZPTYLU SVĚTLA REF SI IVD pouze pro použití IN VITRO NÁVOD K POUŽITÍ M rev.1.1 UK Zamýšlené použití Zkoumání přítomnosti meticilin rezistentního Staphylococcus aureus z výtěru je výkonem hojně využívaným v diagnostice mikrobiologické laboratoře pro rychlou identifikaci a izolaci pacientů s vážnými infekcemi vyvolanými agresivními patogeny, které jsou obvykle rezistentní k beta-laktamovým antibiotikům a proto je těžké je vymýtit, jsou obzvláště nebezpečné, pokud jsou přítomny u pacientů hospitalizovaných na odděleních nemocnic (zvláště na JIP) a tudíž je potřeba je preventivně izolovat. Tyto testy jsou také používány jako všeobecné screeningové programy na kontrolu nozokomiálních infekcí, které jsou v platnosti v různých zemích. Tyto metody tradičně využívané pro výzkum dlouho trvají, aby byl obdržen výsledek, což je časově velmi náročné. Tento kit nenahrazuje tradiční antimikrobiální test citlivosti. Účel testu je souprava pro rychlou detekci a bakteriální počet meticilin rezistentních Staphylococcus aureus (MRSA) z výtěru. Souprava je přizpůsobená pro analyzátory ALFRED 60, ALFRED60 / AST a HB&L UROQUATTRO, založených na technologii laserového rozptylu světla. Výsledky testu jsou reportovány jako pozitivní nebo negativní. je schopný poskytovat záznam o přítomnosti / absenci MRSA v časech významně rychlejších než u tradičních metod, což podporuje aktivní kontrolu MRSA. Aplikace je možná v částečné nebo plné automatizaci. Princip metody Systémy ALFRED 60, ALFRED60 / AST a HB&L UROQUATTRO používají výše zmíněnou technologii laserového rozptylu světla pro monitorování kultivací humánních tělních tekutin během 6 hodin inkubačního času. Laserový paprsek prochází skrz skleněnou lahvičku, která obsahuje reagencii z předtím inokulovanou výtěrovým tampónem, který byl použitý pro odběr biologického vzorku. Reagencie je kultivační bujón se solí obohacený infuzí zvířecích tkání, který umožňuje růst většiny mikroorganismů přítomných v tekutinách humánních patologických vzorků. Magnetické míchadélko v lahvičce zajišťuje homogenizaci suspenze během analýzy. Po inokulaci výtěrového tampónu je do lahvičky před začátkem analýzy přidán selektivní suplement pro MRSA. Bujón kombinovaný se suplementem MRSA inhibuje většinu gram-pozitivních a gram-negativních bakterií, které nepatří do druhu Staphylococcus. Signály rozptýleného laserového paprsku jsou detekovány a zobrazeny jako růstové křivky, vyhodnocení počtu je získáno algoritmickým výpočtem. Je-li vzorek pozitivní, tak je na konci analýzy dostatečně obohacený pro provedení dalších testů pro přímou konfirmaci přítomnosti meticilin-rezistentního Staphylococcus aureus jako je koagulační test při stanovení přítomnosti PBP2a proteinu (projev meca genu) nebo jiné metody. Popis setu Souprava se skládá z následujících čtyř položek: (A) (B) (C) (D) 1

2 (A) (B) (C) (D) 60 jednorázových lahviček s čárovým kódem obsahujících MRSA kultivační bujón (2 ml kultivačního bujónu), uzavřených odšroubovatelným plastovým víčkem. Lahvičky se používají pro inokulaci výtěrového tamponu se vzorkem a jsou vyhovující pro čtecí jednotku přístroje. Bujón je směsí solného roztoku peptonů, dextrózy a infúze zvířecích tkání zbavených mikrobiální kontaminace. Bezpečnostní list je k dispozici na vyžádání. Skleněná lahvička zajišťuje vysokou sensitivitu optického měření (rozptyl světla). 1 lahvička s regeneračním roztokem pro MRSA suplement obsahující 24 ml vody zbavené mikrobiální kontaminace. 10 lahviček s MRSA suplementem označených čárovým kódem, obsahujících lyofilizovaný prášek zbavený mikrobiální kontaminace složený ze směsi antibiotik (Cefoxitin, Aztreonam, Polymyxin B). 1 MicKartu pro umožnění provedení 60 testů. Dá se použít jen u analyzátorů s verzí (nebo vyšší) analytického systému pro Windows. Místo toho u přístrojů s předcházející verzí Windows je potřeba do programu vložit pomocí klávesnice jedinečný kontrolní kód (check code) ve chvíli, kdy je o to uživatel programem požádán. Kontrolní kód zaručuje validitu činidel a umožnění zpracování testů. Potřebný materiál, který není součástí setu - Sterilní stříkačka s permanentně zapojenou jehlou pro nadávkování objemu 2 ml. - Sterilní výtěrové tampóny pro vzorky (patří do třídy 93/42/EEC směrnice o zdravotnických prostředcích). - Mikropipeta s jednorázovými špičkami pro pipetování 200 μl regenerovaného HB&L MRSA suplementu (kromě ALFRED60 / AST). Upozornění Určeno pouze pro in vitro diagnostiku S tekutými a pevnými reagenciemi musí být zacházeno s opatrností, aby se zabránilo spolknutí, inhalací, styku s očima, kůží a oblečením. Některé součásti bujónu jsou živočišného původu. Potvrzení o původu a/nebo zdravotním stavu zvířat zcela nezaručuje nepřítomnost přenosných patogenních agens. Proto se doporučuje považovat tyto produkty za potenciálně infekční a je třeba s nimi zacházet dle běžných bezpečnostních opatření. S biologickými vzorky a bakteriální kulturou musí být zacházeno jako s potencionálním zdrojem infekce a při manipulaci s nimi je tedy třeba dbát bezpečnostních opatření dle platných zákonů, nařízení a vyhlášek příslušné země Nepoužívejte činidla po jejich datu exspirace Před použitím se každá lahvička musí zkontrolovat, zda není poškozena nebo zkažená. Kontaminace obsahu lahviček HB&L MRSA Suplement je vysoce možná, takže s reagenciemi zacházejte s maximální opatrností a postupujte striktně dle instrukcí. Lahvička obsahující MRSA Suplement je citlivá na světlo a teplotu, takže jej vyjměte z ledničky bezprostředně před použitím. HBL MRSA kit není kompatibilní s odběrovými pomůckami Eswab / Copan Itálie (flokované nylonové špičky a transportní médium) kvůli interferenci tekutého AMIES se systémem laserového rozptylu světla. Skladování Neregenerované reagencie musí být skladovány při 4 8 C až do data exspirace. Lahvička s reagencií C musí být před i po své regeneraci chráněna před světlem. Lahvičky rekonstituovaného HB&L MRSA Suplementu musí být skladovány ve tmě při 4 8 C a musí být používány ne déle než 7 dnů po rekonstituci. Nepoužívejte po datu exspirace. Postup 1. Regenerace suplementu Proveďte regeneraci suplementu v digestoři s laminárním prouděním. 1.1 Regenerujte HB&L MRSA suplement pomocí regeneračního roztoku, jednu lahvičku, právě před použitím a poté, co je dokončena regenerace přechozí lahvičky HB&L MRSA suplementu. 1.2 Pomocí stříkačky nadávkujte 2 ml regeneračního roztoku do jedné lahvičky s HB&L MRSA suplementem. Jemně kružte pro snadnější rozpuštění prášku HB&L MRSA suplementu. 1.3 Regenerovaný HB&L MRSA suplement se musí používat ne déle než 7 dní po rekonstituci. 1.4 Regenerovaný HB&L MRSA suplement musí být skladován při 4-8 C. 2

3 2 ml HB&L MRSA Suplement Regenerační roztok 2. Vzorky Souprava může být použita pro následující vzorky: nos, krk, kůže (perineum, rána, tříselná krajina) Poznámka: Je doporučeno používat výtěrové tampóny (lépe flokované) s tekutým transportním médiem k optimalizování rychlosti doby odezvy a citlivosti MRSA detekce. Pokud je použitý suchý výtěrový tampón (lépe flokovaný), musí být inokulace provedená tak rychle jak jen je to možné. Pro odběr a transport každého typu vzorku musí být zohledněna a adaptována správná laboratorní praxe. 3. Vložení vzorků a dávkování suplementu Při testování každého vzorku: 3.1 Otevřete lahvičku odšroubováním víčka v digestoři s laminárním prouděním. 3.2 Vložte výtěrový tampón do lahvičky a ponechejte ho tam minut (viz Obrázky ). 3.3 Zcela vyjměte výtěrový tampón. 3.4 Otevřete lahvičku s regenerovaným HB&L MRSA suplementem a pomocí mikropipety napipetujte 200 µl do kultivační lahvičky. 3.5 Uzavřete lahvičku šroubovacím uzávěrem. 3.6 Vložte lahvičku do zásuvky přístroje minut

4 200 µl Regenerovaný HB&L MRSA Suplement Kontrola kvality Procedury kontroly kvality se provádějí pomocí referenčních bakteriálních kmenů (ATCC). Pokud jsou použity stabilizované životaschopné mikroorganismy, tak se doporučuje pracovat s izolovanými koloniemi podle jednoho z následujících protokolů: - V případě lyofilizované pelety: Bakteriální kmen rekonstituujte, tak jak je popsáno v protokolu výrobce (Je doporučeno regenerovat bakteriální kmen v solném roztoku, TBS nebo BHI bujónu, poté jej naočkujte na Petriho misku s neselektivním médiem jako je krevní agar. - V případě želatinové vrstvy na kličce: Bakteriální kmen rekonstituujte, tak jak je popsáno v protokolu výrobce (je doporučeno použití neselektivního média v Petriho misce, jako je krevní agar). Jakmile obdržíte izolované kolonie na inokulované plotně, seberte 1 izolovanou kolonii a dejte ji do jedné lahvičky z AST McFarland Kit (kat. č. SI 912-SVR). Po zapnutí funkce McFarland Monitor vložte inokulovanou lahvičku do přístroje. Počkejte, až je dosaženo 0,3 stupně McFarlanda a poté validujte test. Vyjměte z přístroje inokulovanou lahvičku (0,3 McFarland), odeberte z ní 100µl a toto množství suspendujte do 4 ml roztoku (solný, TSB nebo BHI). Z tohoto roztoku odeberte 100µl a napipetujte je do lahvičky s MRSA kultivačním bujónem, poté přidejte MRSA Supplement (200µl). Lahvičku vložte do přístroje. Doba analýzy bude přinejmenším 6 hodin. Očekávaný počet MRSA pozitivního kontrolního kmene Staphylococcus aureus ATCC 43300) by měl být nejméně 10 5 CFU/ml. Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus ATCC29213 ATCC43300 Očekávaný výsledek Žádný růst Růst Limitace procedury Malé koncentrace MRSA (< 10 5 CFU/ml) by nemusely růst na selektivním médiu, v tomto případě by nebyly detekovány. Některé kmeny S. aureus mající meca gen mohou představovat slabý MIC k antibiotikům, které jsou obsaženy v MRSA Suplementu, takže nemohou v takovémto typu média růst. Klinické výtěrové tampóny mohou obsahovat organismy v širokém koncentračním rozpětí (od několika do miliónu kolonií), což znamená, že některé organismy citlivé na meticilin, které jsou přítomné ve velmi vysokém počtu, mohou být v testu pozitivní. Určité koaguláza-negativní stafylokoky mohou růst, protože jsou meticilin-rezistentní. Jakýkoli pozitivní výsledek musí být konfirmován. Vizualizace růstové křivky může uživateli poskytnout víc spolu s dalšími dodatečnými detaily než jen jednoduchý report s negativním nebo pozitivním bakteriálním počtem. Obdržená růstová křivka je analyzována softwarem z hlediska kompatibility s vlastnostmi organismů. Na základě detekovaného růstového algoritmu je stanoven bakteriální počet. Protože výpočty jsou čistě matematické, tak je možné že ve zvláštních případech může být interpretace abnormálního růstu mylná. Takže před reportováním negativních výsledků se na konci testu doporučuje vizuální kontrola u všech detekovaných křivek. Mikroorganismy rostou v závislosti na okolních podmínkách, může se tedy stát, že při specifických podmínkách (přítomnost antibiotik ve vzorku, vitalita, teplota, délka doby inkubace, atd.) nemusí dojít k jejich růstu. 4

5 V případě přítomnosti zprávy "turbid" může být výsledek ovlivněný abnormálními podmínkami kultivačního média uvnitř lahvičky. Abyste vyloučili přítomnost MRSA kmene, musí být na konci analýzy provedeny konfirmační testy. Doporučená procedura: koagulázový test na MRSA selektivním bujónu a pokud je to možné - PBP2a test (detekce meca genu). Alternativní procedura: Mohou být použity tradiční metody pro detekci MRSA s pomocí MRSA selektivního bujónu. Výkonnost soupravy HB&L MRSA kit pro S. aureus meticilin / oxacilin resistentní mechanismy jiné než meca nebyla posouzena. Proto není výkonnost soupravy HB&L MRSA kit pro Bordeline oxacilin rezistentní Staphylococcus aureus (BORSA) a modifikované S. aureus (MOD-SA) známá. Pokud bude proveden antimikrobiální test citlivosti, je doporučeno použití subkultury na vhodném neselektivním médiu. Očekávané výsledky Protože se profily rezistence k meticilinu u Staphylococcus aureus mění podle geografické oblasti, tak jsou očekávané výsledky přímo závislé na lokálním mikrobiologickém ekosystému (species / mechanismus rezistence). Výkonnost Výkonnost soupravy HB&L MRSA kit byla vyhodnocena pomocí studie klinické mikrobiologické laboratoře v Německu. Bylo testováno 264 vzorků humánního původu v kontextu screeningu pro nosičství MRSA. Byly použity dva typy výtěrových tampónů: suché flokované výtěrové tampóny a flokované tampóny s transportním médiem. Souprava HB&L MRSA Kit (6 hodinová inkubace) byla porovnána s výsledky obdrženými pomocí následujícího postupu: A) Inokulace Petriho misky pomocí 10 µl jednorázové plastové kličky. Petriho miska obsahuje Columbia CNA agar + 5% beraní krev, dostupné médium na trhu určené pro kultivaci gram pozitivních kmenů. Inkubace trvá přes noc. B) Poté identifikujte izoláty pozitivních vzorků na CNA Columbia plotnách pomocí MALDI TOF identifikace pro rozlišení S. aureus od jiných species. V případě nejistých výsledků na MALDI proveďte test na koagulázu nebo (Slidex Staph. Plus, Biomerieux, Francie). C) V případě identifikace S. aureus pomocí techniky MALDI, by měla být provedena konfirmace nálezu MRSA pomocí PBP2a proteinového aglutinačního testu (Slidex MRSA detekce, Biomerieux, France). Nastavení přístroje a inkubační doba Petriho misek. Výsledky a výkonnost metody jsou vypočítány s přihlédnutím k výhradně 6 hodinové inkubaci pro HB&L přístroj a přímým naočkováním na CNA Columbia plotny s jednou inkubací přes noc (výše popsaná metoda). Další výsledky získané po prodloužené inkubaci musí být použity s oběma metodami pouze pro doplnění výsledků nebo rozšířený výzkum. Kritérium pozitivity přijaté oběma metodami je absence / přítomnost MRSA. Podle výše uvedeného postupu bylo testováno 264 klinických výtěrových tampónů z různých humánních oblastí. 211 bylo negativních v obou metodách (89,40% shoda). 22 bylo pozitivních v obou metodách (78,57% shoda). 6 bylo negativních v HB&L systému a pozitivní pomocí použité metody. 25 bylo negativních po kultivaci Petriho misky ale pozitivní v HB&L systému, po dalším zkoumání bylo 7 z nich konfirmováno jako S. aureus MRSA (detekce Petriho misek po 48 hod inkubaci), 18 bylo stanoveno jako falešně pozitivní (6,81%). Skutečná citlivost HB&L kitu byla ekvivalentní nebo trochu lepší než u tradičních metod, jestliže bereme v vyšetřovanou populaci (264 vzorků), HB&L MRSA kit detekoval během 6 hodin 29 pozitivních MRSA (82,85%) z celkového počtu 35 pacientů detekovaných pomocí obou metod, pomocí postupu s Petriho miskami bylo detekováno 28 pozitivních MRSA (80,00%) z 35 pacientů. Všeobecná shoda mezi metodami byla 88,25%, VPN HB&L systému pro MRSA byla 97,23%. Skutečná specificita evidující pouze 18 konfirmovaných falešně pozitivních výsledků HB&L byla 89,40%. Likvidace odpadů Použité i nepoužité reagencie likvidujte stejně jako jakýkoli jiný kontaminovaný jednorázový materiál podle pokynů pro infekční nebo potenciálně infekční produkty. Je odpovědností každé laboratoře manipulovat s odpady a produkovanou odpadní vodou podle jejich typu a stupně nebezpeční a zacházet s nimi a likvidovat je podle dle platných zákonů, nařízení a vyhlášek příslušné země. 5

6 Seznam symbolů Symbol Význam Symbol Význam REF Katalogové číslo IVD Pro použití In vitro Výrobce Rozmezí teplot Datum exspirace LOT Číslo šarže Nahlédněte do návodu k použití Pozor, čtěte návod k použití Chraň životní prostředí Obsah dostačující pro <n> testů Chraňte před sluncem Cont. Obsah soupravy Literatura 1 L.J. Cox, D. Dooley, R. Beumer. Effect of lithium chloride and other inhibitors on the growth of Listeria spp. Food Microbiology, Volume 7, Issue 4, December 1990, Pages M.J. Bruins, P. Juffer, M.J.H.M. Wolfhagen, G.J.F.M. Rujs. Salt Tolerance of Methicillin-Resistant and Methicillin-Susceptible Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol February; 45(2): Distributor: Zmocněný zástupce výrobce v České republice: ALIFAX S.p.A. BioVendor Laboratorní medicína a.s. via Petrarca, 2/ Polverara (Padova)-Italy Tůmova 2265/60 tel Brno, Česká Republika web site: IČ: info@alifax.com SIRE Analytical Systems S.r.l. via Merano, NIMIS (UD) ITALY Tel