Doc. Ing. Jaroslav Polák, DrSc. Ing. Alena Hauptmanová

Transkript

1

2 Autoři: Název: Vydal: Doc. Ing. Jaroslav Polák, DrSc. Ing. Alena Hauptmanová Metodika ozdravování odrůd slivoně a meruňky infikovaných virem šarky švestky metodou termoterapie in vivo a chemoterapie in vitro kultur. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, Praha 6 Ruzyně Vydáno v elektronické podobě. Vyšlo v roce: 2008 Vydáno bez jazykové úpravy. Kontakt na autora: Odborný oponent: Oponent ze státní zprávy: Autoři fotografií: Polak@vurv.cz prof. Ing. Vladimír Táborský, CSc., Česká zemědělská universita, FAPPZ, Kamýcká 129, Praha 6 Suchdol, Ing. Ivan Branžovský, CSc., Ministerstvo zemědělství, Těšnov 17, , Praha 1 Ing. Alena Hauptmanová, Doc. Ing. Jaroslav Polák, DrSc. Fotografie na úvodní straně: Plody meruňky sklizené ze zdravého stromu meruňky (nahoře). Plody meruňky sklizené ze stromu infikovaného virem šarky švestky (dole). Metodika vznikla za finanční podpory Ministerstva zemědělství České republiky a je výstupem řešení projektu NAZV 1B Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008 ISBN:

3 Obsah: 1. Cíl metodiky Vlastní popis metodiky... 2 A. In vivo termoterapie... 2 B. Chemoterapie viru šarky švestky v in vitro kulturách peckovin Příprava MS média Příprava a sterilizace vzorků, založení in vitro kultur: Pěstování a pasážování in vitro kultur: Chemoterapie:... 7 C. Použité diagnostické metody Stanovení PPV pomocí ELISA Stanovení PPV pomocí RT-PCR Ověření zdravotního stavu ozdravených rostlin pomocí biologického testu Srovnání novosti postupů Popis uplatnění metodiky Seznam použité související literatury Seznam publikací, které předcházely metodice

4 1. Cíl metodiky Česká republika zavádí funkční systém certifikace zdravotního stavu výsadbového materiálu ovocných dřevin a révy vinné, který je v souladu s doporučenými certifikačními schématy EPPO a závaznými předpisy Evropské unie. Již v 80. letech byly závažné problémy se zdravotním stavem udržovacího šlechtění peckovin v důsledku jeho infekce virem šarky švestky. Základy nového systému byly položeny vybudováním technického izolátu ve VŠÚO Holovousy v roce 1989, kde byly udržovány šarkyprosté odrůdy slivoně. V roce 2001 byly vybudovány technické izoláty jako základní předpoklad pro zavedení komplexního certifikačního systému. V rámci výzkumného projektu NAZV Výzkum a vývoj komplexních postupů diagnostiky hospodářsky významných a karanténních fytopatogenních organismů pro systém certifikace ovocných dřevin (doba řešení ) byly vypracovány základní metodické postupy stanovení karanténních patogenů, viroidů, virů a fytoplazem ovocných dřevin pomocí biologických (dřevinné a bylinné indikátory), sérologických (ELISA) a molekulárních metod (PCR) v primárních zdrojích pro získání výchozího materiálu odrůd do technického izolátu. Dílčí výsledky výzkumu ukazují, že některé odrůdy ovocných dřevin jsou infikovány několika hospodářsky škodlivými viry, viroidy a fytoplazmami, z nichž některé jsou karanténní. Zdravé rostliny českých odrůd nelze získat v zahraničí. Je evidentní, že některé české tržně významné odrůdy bude nutno ozdravit, jinak hrozí zánik jejich pěstování. Proto byl po projednání s bývalým odborem zemědělských komodit MZe navržen a v současné době je řešen výzkumný projekt NAZV Výzkum a vývoj standardních metod ozdravení pomocí termoterapie a in vitro kultur odrůd ovocných dřevin a révy vinné od virů, fytoplazem a karanténních patogenů pro systém certifikace zdravotního stavu výsadbového materiálu (doba řešení ). V rámci tohoto projektu byla modelově řešena problematika eliminace viru šarky švestky. Cílem předkládané metodiky jsou dostupné a aplikovatelné efektivní postupy ozdravování peckovin od viru šarky švestky pomocí termoterapie in vivo a chemoterapie in vitro kultur. 4

5 2. Vlastní popis metodiky A. In vivo termoterapie In vivo termoterapii můžeme použít pro ozdravení slivoní a meruněk. Pro ozdravování jsou nejvhodnější jednoletí až dvouletí šlechtěnci (dále jen šlechtěnec) v počtu 5-10ks od jedné odrůdy. Pokud ozdravujeme odrůdu peckoviny infikovanou virem šarky švestky a máme k dispozici starší nemocný strom, nebo jsme získali odrůdu ze zahraničí, která je infikovaná PPV, naroubujeme nebo naočkujeme takovou odrůdu na viruprostou podnož (například: GF677, myrobalán, st. Julien pro slivoň; GF-677, MVA-1, MVA-2, myrobalán pro meruňku; GF-677, BVA-1, BVA-2 pro broskvoň) a získáme 5-10ks šlechtěnců, které vysadíme do kontejnerů.přítomnost PPV ve šlechtěncích ověříme pomocí DAS-ELISA a RT-PCR (popis metod viz kapitola 2.C.1. a 2.C.2.). Šlechtěnce vysadíme do kontejnerů o minimální velikosti 19x19cm (dle velikosti stromů). Do termokomory umístíme alespoň 5ks šlechtěnců jedné odrůdy nebo klonu. Teplotu postupně zvyšujeme z 20 C na 37 C. Termoterapii při 37 C provádíme 21 dní. Po ukončení termoterapie teplotu snižujeme postupně na 25 C. (obr.č.1) Přítomnost PPV ve šlechtěncích po ukončení termoterapie a přemístění rostlin do skleníku ověříme pomocí ELISA. Ve šlechtěncích v nichž nebyla přítomnost PPV prokázána znovu testujeme pomocí molekulárního testu RT-PCR. Šlechtěnce po termoterapii je nutno znovu testovat v průběhu následujícího vegetačního období a přesvědčit se, zda termoterapie byla účinná a eliminace viru úplná. Šlechtěnci jsou vyléčení, pokud se na nich ani v následujícím vegetačním období neobjeví příznaky šarky a výsledky ELISA i RT-PCR jsou i v dalším vegetačním období negativní. Popis diagnostických metod viz kapitola C. Na obr. č. 2je šlechtěnec meruňky cv. Velkopavlovická po ozdravení pomocí in vivo termoterapie. 5

6 Obr. č. 1: Průběh termoterapie in vivo. 6

7 Obr. č. 2: Šlechtěnec meruňky cv. Velkopavlovická po termoterapii in vivo. 7

8 B. Chemoterapie viru šarky švestky v in vitro kulturách peckovin Pro chemoterapii použijeme pupeny ze stromů odrůd slivoně a meruňky infikovaných virem šarky švestky, v nichž byla přítomnost viru prokázána pomocí ELISA a RT-PCR. 1. Příprava MS média Pro in vitro kultury použijeme Murashige-Skoog medium (1962) (dále jen MS medium) jehož složení je uvedeno v tabulce č. 1. Smícháním odpovídajícího množství makroelementů, mikroelementů, vitamínů, sacharózy, myo-inositolu a fytohormonů s destilovanou vodou získáme roztok základních elementů, jehož ph upravíme na 6,4 (pro úpravu ph použijeme 1M roztok KOH). Zvlášť rozmícháme 7g agaru v 500 ml destilované vody, za stálého míchání vaříme, agar je třeba nechat třikrát přejít varem. Vždy, když agar začne vřít, sundáme jej z plotýnky, dokud nepřestane vřít, poté ho vrátíme na plotýnku a znovu přivedeme k varu. Takto připravený agar je čirý. Poté smícháme roztok základních elementů spřevařeným agarem tak, abychom získali jeden litr média. Připravené medium rozléváme do erlenmayerových baněk v množství cca 25 ml/baňku (z jednoho litru média připravíme cca 40 baněk). Baňky překryjeme jednotlivě hliníkovou fólií. Médium v baňkách sterilizujeme v autoklávu při teplotě 100 C, 121kPa po dobu 20 minut. Takto připravené medium necháme odstát při laboratorní teplotě minimálně 2 dny. Klony vsazené do čerstvě vychladlého media odumírají. Nespotřebované medium uchováváme v chladničce při 4 C, přičemž před každým použitím je třeba jej nechat aklimatizovat na laboratorní teplotu. 8

9 Tab. č. 1: Složení MS media používaného pro přípravu in vitro kultur. množství v mg na 1l Sloučenina media Makroelementy NH4NO KNO H3BO3 6,20 KH2PO4 170 MgSO4 180,54 CaCl2 332,02 Mikroelementy KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CoCl2.6H2O 0,025 MnSO4.H2O 16,90 ZnSO4.7H2O 8,6 CuSO4.5H2O 0,025 Chelate solution Na2EDTA 36,70 Vitamíny Thiamin (B1) 10 Pyridoxin (B6) 1 Kyselina nikotinová 1 Glycin 1 myo-inositol 100 Fytohormony BAP 1,2 2,4 D 0,1 Další součásti MS média Sacharosa 20 g Agar 7g 9

10 2. Příprava a sterilizace vzorků, založení in vitro kultur: Letorosty odebíráme z matečné rostliny na délku jednoho až dvou pupenů. Takto zkrácené řízky převedeme do erlenmayerovy baňky s 20% savem (složení sava: min. 5% NaClO + min. 2% NaOH) a přídavkem několika kapek smáčedla Tween 20 (nejlépe se osvědčilo smáčedlo od firma Duchefa). Na třepačce sterilizujeme při 180 otáčkách po dobu 15 minut. Poté je třikrát propláchneme sterilní destilovanou vodou ve flow-boxu (sterilizace destilované vody probíhá v autoklávu při teplotě 100 C a tlaku 121kPa 20 minut). Pro vsazení do média odebíráme vegetační vrcholy ve velikosti 0.5 0,7mm. Do jedné baňky vsazujeme čtyři vegetační vrcholy a baňku překryjeme hliníkovou fólií nebo sterilizovanými zátkami z lisované buničité vaty. Práce probíhá vždy ve sterilním prostředí flow-boxu. 3. Pěstování a pasážování in vitro kultur: Po vsazení sterilních vegetačních vrcholů do MS media explantáty uchováváme v kultivační místnosti se stálou teplotou 22 C a světelným režimem 14 hodin světlo/10 hodin tma. Po třech až čtyřech týdnech začínají regenerovat a jsou schopny pasážování. Namnožením jednoho pupenu se získá klon, se kterým je možno dále pracovat (ozdravovat). Pro pasážování vzorků se osvědčil flow-box. Před každým použitím je třeba jej sterilizovat UV zářením minimálně 20 minut. Pro růst vzorků v baňkách se osvědčily zátky z lisované buničité vaty (od firmy P- lab), které zajišťují dostatečnou výměnu vzduchu v baňkách a při tom zajišťují dostatečně sterilní prostředí. Zátky jsou před každým použití sterilizovány v autoklávu. Výhodou je snadná manipulace, sterilizace a lepší výměna plynů u explantátů, což vpřípadě dřevitých řízků vede k lepšímu fyziologickému stavu. Každé čtyři týdny je třeba vzorky pasážovat do čerstvě připraveného média z důvodu zachování koncentrace živných látek v médiu nutných k dobré výživě rostlin v explantátové kultuře. 4. Chemoterapie: Pro chemoterapii používáme MS médium s přídavkem ribavirinu, který přidáváme v množství 10mg do jednoho litru základního roztoku elementů.při použití nižší koncentrace ribavirinu, 5mg/l dochází podle našich výsledků k eliminaci viru šarky švestky během 12 až 20 týdnů podle použité odrůdy, eliminace viru je úplná a přítomnost viru nelze prokázat ani rok po ukončení chemoterapie. 10mg ribavirinu na litr média doporučujeme proto, že při této koncentraci může dojít u některých odrůd k ozdravení rychleji než při použití koncentrace 5mg/l. Označené klony pasážujeme ve sterilním prostředí do média s přídavkem ribavirinu tak, aby byly v každé variantě alespoňčtyři rostliny. Klony čerstvě pasážované do ribavirinového média zastavují svůjrůst a přibližně po jednom týdnu začínají regenerovat, některé však mohou odumírat. Po čtyřech týdnech rostliny pasážujeme do čerstvého média, ale vždy o stejné koncentraci ribavirinu. Chemoterapii ukončíme přesazením klonů do MS média bez přídavku ribavirinu. 10

11 C. Použité diagnostické metody 1. Stanovení PPV pomocí ELISA. ELISA (z angl. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) je sérologickou, imunoenzymatickou metodou stanovení přítomnosti rostlinných virů. Tato metoda je však méně citlivá než níže uvedená molekulární metoda RT-PCR. V případě negativních výsledků získaných ELISA testem je nutno ověřit je pomocí RT- PCR. Ke stanovení PPV pomocí ELISA použijeme komerční polyklonální protilátky (IgC + IgG konjugované alkalickou fosfatázou) fy Loewe (Německo). Z různých výhonů nebo větví testovaného šlechtěnce, stromu odebereme 6 listů apřipravíme průměrný vzorek. 1g listů průměrného vzorku homogenizujeme ve 4ml extrakčního pufru pomocí ručního homogenizátoru. Pro diagnostiku PPV pomocí ELISA v in vitro pěstované rostlině odebereme část lístků nebo seřízneme část in vitro kultury o hmotnosti 0,2g a homogenizujeme ve 4ml extrakčního pufru. Získaný homogenát pipetujeme po 0,2ml do dvou jamek mikrotitrační desky. Ke stanovení viru použijeme metodu dvojitého sendviče protilátek podle Clark a Adams (1977). Výsledky vyhodnotíme na fotometru (např. Dynatech MR 5000) při 402 nm. Šlechtěnce pomocí ELISA testujeme před ozdravením, dva týdny po ozdravení a následující sezónu po ozdravení. 2. Stanovení PPV pomocí RT-PCR RT-PCR je metoda stanovení přítomnosti ribonukleové kyseliny rostlinných virů pomocí polymerázové řetězové reakce po předchozí reverzní transkripci RNA. Pomocí molekulárního postupu nejprve získáme z ribonukleové kyseliny (RNA) deoxyribonukleovou kyselinu (DNA). Zrůzných částí rostlin odebíráme vzorky listů o celkové hmotnosti minimálně 0,1g, které homogenizujeme v tekutém dusíku. RNA izolujeme pomocí komerčně dostupného kitu RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) podle přiloženého návodu. cdna vytvoříme za pomoci reversního primeru P1 (Wetzel et al., 1991) a reversní transkriptázy AMV. K PCR amplifikaci použijeme GO Taq polymerázu (fy Promega) a primery P1 a P2 (Wetzel et al., 1991). PCR produkt analyzujeme v elektroforéze s 1% agarózovým gelem. DNA barvíme SYBR Green (Invitrogen). 5µl produktu nanášíme na gel a podstoupíme 80V po dobu 60 minut. Produkt primerů P1 a P2 je 249bp dlouhý. 11

12 3. Ověření zdravotního stavu ozdravených rostlin pomocí biologického testu Po ozdravení rostlin příslušné odrůdy, vpřípadě ozdravování in vitro kultur po převedení rostlin do ex vitro podmínek je nutno ověřit zdravotní stav ozdravených rostlin pomocí biologického testu. Očka z ozdravených rostlin naočkujeme na biologický indikátor viru šarky švestky Prunus tomentosa nebo k PPV náchylnou odrůdu švestky (např.: Prunus domestica L. cv. Požegača). Vpřípadě ozdravení zůstanou indikátorové rostliny bez příznaků šarky, vpřípadě neúplného ozdravení reagují během dvou až třech měsíců silnými příznaky šarky švestky. K otestování jedné ozdravené rostliny je třeba použít tři rostliny biologického indikátoru. 12

13 3. Srovnání novosti postupů. Virus šarky švestky je možno v rostlinách jednotlivých druhů peckovin eliminovat klasickou in vivo termoterapií, termoterapií nebo chemoterapií in vitro kultur. Dosud bylo publikováno jen několik původních sdělení zabývajících se ozdravováním peckovin od viru šarky švestky, přičemž publikované postupy jsou rozdílné, nejednoznačné a zpravidla nereprodukovatelné. V žádné z publikovaných prací také nebyl specifikován kmen viru, kterým byly nemocné stromy infikovány. Pro aplikaci předložené metodiky lze vycházet ze zjištěné zkušenosti, že použitý kmen viru nemá na proces ozdravování prokazatelný vliv. Do 80. let minulého století se převážně používaly postupy in vivo termoterapie, kdy nemocné rostliny byly po několik málo týdnů vystavovány vyšší teplotě. Minoiu (1975, 1976) použil pro eliminaci PPV ze slivoní kolísavé teploty 36 C, 46 C a 60 C po dobu 37 dní. Kegler (1967, 1977) použil teplotu 37 C po dobu 2-3 týdnů a poté vrcholy ozdravených výhonů rouboval za zelena na bezvirózní podnože. Janečková (1993) použila pro eliminaci komplexu virů PPV, PNRSV a PDV ze čtyř odrůd slivoní termoterapii roubovanců in vivo ve dvou cyklech: 1. cyklus (podzim) 3 týdny 34,5 C, 1 týden 37,5 C, 2. cyklus (jaro) postupné zvyšování teploty ze 20 C během 8 dní na 34 C, pak 4 týdny 36,5 C a 2 dny 37,5 C. Poté odebrala z výhonů roubovanců vrcholy, založila in vitro kultury a pokračovala chemoterapií in vitro kultur pomocí ribavirinu. Další publikované práce jsou založeny na eliminaci viru šarky švestky v peckovinách pomocí in vitro kultur. Mosella-Chancel et al. (1980) tak eliminovali PPV a PNRSV z broskvoní. Vertesy (1981) eliminovala PPV a PNRSV pomocí in vitro kultur ze dvou slivoňových podnoží a Isac (1985) PPV ze třech slivoňových odrůd. Významné metodické poznatky o eliminaci virů v ovocných stromech, včetně PPV byly uveřejněny v původním sdělení Knapp et al. (1995), a rovněž ve sdělení Spiegel et al. (1995). Souhrn poznatků a využití termoterapie pro eliminaci virů, viroidů a fytoplazem ve vytrvalých rostlinách publikovali Mink et al. (1998). Při ověřování možnosti použití termoterapie in vitro kultur pro eliminaci PPV jsme zjistili odumírání značné části in vitro kultur v průběhu termoterapie. Proto jsme se zaměřili na vypracování postupu ozdravování in vitro kultur peckovin od viru šarky švestky pomocí chemoterapie. Výzkum ozdravování zemědělských plodin od rostlinných virů pomocí chemoterapie započal Schuster v 70. letech 20. století v Německu (Schuster, 1979). Cassells a Long (1980) použili virazol (syn. ribavirin) k ozdravování in vitro kultur tabáku od viru mozaiky okurky a Z-viru bramboru. Klein a Livingston (1983) eradikovali X-, a S-virus bramboru pomocí in vitro kultur bramboru a ribavirinu. Deogratias et al. (1989) eliminovali virus nekrotické kroužkovitosti třešně a virus chlorotické skvrnitosti jabloně vtřešni kombinací in vitro kultur s chemoterapií a termoterapií. Chemoterapie pomocí analogů purinových a pyrimidinových bází byla účinnější než termoterapie a kromě toho některé odrůdy třešně termoterapii nepřežívaly. Další metodické poznatky o uplatnění termoterapie a chemoterapie pro získání viruprostých peckovin prezentoval Howell et al. (2001). Pomocí chemoterapie byly získány např. viruprosté kultury bramboru, jahodníku, jabloně nebo třtiny cukrové. Původní poznatky o využití chemoterapie k ozdravování peckovin od viru šarky švestky nebyly až donedávna známy. Původní sdělení z poslední doby ze Srbska (Paunovic et al., 2007), uvádí, že se podařilo pomocí ribavirinu ozdravit odrůdu švestky Čačanská Lepotica od viru šarky švestky při použití koncentrace ribavirinu 40 mg/l. Vyšší koncentrace (60 až 100 mg/l) byly fytotoxické, zatímco při nízkých koncentracích (10 20 mg/l) došlo jen k částečné eliminaci pro krátkou dobu působení (6 týdnů). Výsledky ale byly nejednoznačné, přítomnost PPV nebyla pomocí DAS-ELISA prokázána v 75% in vitro kultur ošetřovaných 10 mg ribavirinu v 1l média a v 50% kultur ošetřovaných 20 mg ribavirinu /l. Přítomnost PPV však byla zjištěna pomocí IC-RT-PCR ve všech in vitro kulturách. 13

14 V pokusech s termoterapií a chemoterapií peckovin infikovaných virem šarky švestky byly v zahraničíav České republice dosud získány pouze dílčí metodické poznatky, které nebylo možno bez dalšího výzkumu aplikovat. Na základě výsledků projektu NAZV 1B44051 jsme vypracovali a předkládáme první metodické postupy eliminace viru šarky švestky v peckovinách pomocí in vivo termoterapie a in vitro chemoterapie ribavirinem. 14

15 4. Popis uplatnění metodiky Metodika ozdravování odrůd slivoně a meruňky infikovaných virem šarky švestky metodou termoterapie in vivo a chemoterapie in vitro kultur je určena pro uplatnění v technických izolátech systému certifikace a produkce viruprostého výsadbového materiálu realizovaného Ministerstvem zemědělství v České republice. Metodika bude užívána v těch případech, kdy dojde k infekci odrůdy peckoviny virem šarky švestky a nebude k dispozici šarky prostý výchozí materiál dané odrůdy, bude infikován cenný klon udržovacího šlechtění a podobně. 15

16 5. Seznam použité související literatury Cassells, A.C., Long R.D., 1980: The regeneration of virus-free plants from cucumber mosaic virus and potato virus Y infected tobacco explants cultured in the presence of virazole. Z. Naturforsch. 35C: Clark, M.F. and Adams, A.N : Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of plant viruses. J.Gen.Virol. 34: Deogratias, J.M., Dosba, F., Lutz, A., 1989: Eradication of prune dwarf virus, prunus necrotic ringspot virus, and apple chlorotic leaf spot virus in sweet cherries by a combination of chemotherapy, thermotherapy, and in vitro culture. Canadian Journal of Plant Pathology. 11: Howell W.E., Eastwell K.C., Li T.S.C., 2001: Heat treatment, chemo-therapy and hydroponic culture for obtaining virus-free trees of sweet cherry. Acta Horticulturae 550: Isac M., 1985: Eliberarea de virusuri se micropropagarea unor soiuri de prun prin utilizarea tehnicii in vitro. Productia vegetala -Horticultura 8: Janečková M., 1993: Elimination of virus complex (PPV, PNRSV, PDV) from plum varieties using combination of in vivo and in vitro cultures. Vědecké ovocnářské práce 13: (in Czech). Kegler H., 1967: Eine einfache Apparatur zur Warmebehandlung viruskranker Obstpflanzen. Arch. Gardenbau 15: Kegler H., 1977: In Klinkowski M. (Ed.) Pflanzliche Virologie. Vol. III. Akad. Verlag Berlin: Klein, R.E., Livingstone C.H., 1983: Eradication of potato viruses X and S from potato shoot-tip cultures with ribavirin. Phytopathology. 73: Knapp E., Hauzer V., Weiss H., dacamara Machado A., Weiss B., Wang Q., Katinger H., Laimer da Camara Machado M., 1995: New aspects of virus elimination in fruit trees. Acta Horticulturae 386: Mink G. I., Wample R., Howell W.E., 1998: Heat treatment of perennial plants to eliminate phytoplasmas, viruses, and viroids while maintaining plant survival. Plant Virus Disease Control. Am. Phytopathological Soc.: Minoiu N., 1975: New investigations on plum pox (sharka) virus. Acta Phytopathol. Pflanzenschtz, Berlin 11: Minoiu N., 1976: Essais chemotherapie du virus de la sharka sur prunier. Bull. Inform. Sharka 2:

17 Murashige, T. and Skoog, F., : A revised medium for rapid groxth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 : Mosella-Chancel L., Signoret P.A., Jonard J., 1980: Sur la mise au point de techniques de microgreffage d apex en vue de deux types de particules virales chez le pecher (Prunus persica Batsch.). CR Acad. Sci. Ler. D 290: Paunovic S., Ruzic D., Vujovic T., Milenkovic S., Jevremovic D., In vitro production of plum pox virus free plums by chemotherapy with ribavirin. Biotechnol.&Biotechnol. Eq. 21: Schuster, G., 1979: On some interactions of 1-ß-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3carboxamide (virazole) and plant hormones in virus-infected plants. Phytopathol. Z. 94: Spiegel S., Stein A., Tam Y., 1995: In vitro thermoterapy of Rosaceous fruit trees. Acta Horticulturae 386: Vertesy J., 1981: Elimination of Plum pox virus (prunus domestica L.) rootstocks by meristem culture. Plant Virology. Proceedings of the 9th Conference of the Czechoslovak Plant Virologist, Brno , Czechoslovakia. Wetzel, T., Candresse, T., Ravelonandro, M., Dunez, J. 1991: A polymerase chain reaction assay adapted to Plum pox potyvirus detection. J. Virol. Methods 33,

18 6. Seznam publikací, které předcházely metodice Polák J., Jokeš M., Ducháčová M., Hauptmanová A., Komínek P., 2008: Electron microscopy of structures present in embryonic cells of plants infected with Plum pox virus. Plant. Protect. Sci.: in press. Polák J., Hauptmanová A., 2008.: Preliminary results of in vivo thermotherapy of plum, apricot and cultivars artificially infected with PPV-M and PPV-D strains of Plum pox virus. Horticultural Science (Prague): in press. Hauptmanová A., Polák J., 2008: The elimination of Plum pox virus in plum cv. Bluefree and apricot cv. Hanita using chemotherapy of in vitro cultures. In preparation. 18