Metodika molekulární detekce virů peckovin pomoci RT-PCR a multiplex-rt-pcr
|
|
- Vladimíra Němečková
- před 8 lety
- Počet zobrazení:
Transkript
1 VÝZKUMNÝ ÚSTAV ROSTLINNÉ VÝROBY, v.v.i. Metodika molekulární detekce virů peckovin pomoci RT-PCR a multiplex-rt-pcr Metodika pro Státní rostlinolékařskou správu Jana Jarošová, Jaroslav Polák & Jiban Kumar Praha, 2008
2 Metodika molekulární detekce virů peckovin pomoci RT-PCR a multiplex-rt-pcr Ing. Jana Jarošová Doc. Ing. Jaroslav Polák, DrSc. Ing. Jiban Kumar, PhD. * Výzkumný ústav rostlinné výroby v.v.i. odbor rostlinolékařství, oddělení virologie Drnovská 507, Praha-Ruzyně * korespondujicí autor: jiban@vurv.cz Tato práce byla financována z projektu QG0123. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008 ISBN:
3 Anotace (česky) Metodika molekulární detekce virů peckovin pomoci RT-PCR a multiplex-rt-pcr Předkládaná metodika detekce virů peckovin pomoci RT-PCR a multiplex-rt-pcr zahrnuje takové metodické přístupy, které umožňují diagnostikovat tři nejběžnější viry peckovin (virus šarky švestky - PPV, virus zakrslosti slivoně - PDV, virus nekrotické kroužkovitosti slivoně - PNRSV) v jedné reakci, čímž snižují ekonomické i časové nároky potřebné pro detekci. Podstatou zkoušky je zjistit ve vzorku RNA přítomnost nukleotidových sekvencí specifických pro PPV, PDV a PNRSV. Metodika je využitelná pro potřeby orgánů státní správy při provádění monitoringu viróz na peckovinách i pro zprostředkované využití soukromými pěstiteli. Metodika zahrnuje přesný postup od odběru vzorku až po vyhodnocení výsledků. Anotace (anglicky) Methodology of molecular detection of stone fruit viruses by RT-PCR and multiplex RT-PCR The methodology of molecular detection of stone fruit viruses by RT-PCR and multiplex RT- PCR includes approaches, which enable to detect the most common stone fruit viruses (Plum pox virus - PPV, Prune dwarf virus - PDV, and Prunus necrotic ringspot virus - PNRSV) in one reaction and thus reduces time and money requirements. The essence of the test is to detect presence of RNA specific for each virus in the sample. The methodology is usable for state administration bodies when monitoring stone fruit viruses occurrence as well as mediated for purposes of private growers. The methodology includes exact procedure description, from collecting samples to results evaluation. Oponenti: Ing. Gabriela Červená, Ph.D. Státní rostlinolékařská správa Šlechtitelů 23/773, Olomouc Doc. Ing. Pavel Ryšánek, CsC. ČZU, FAPPZ, Katedra ochrany rostlin Kamýcká 129, Praha 6 Suchdol Metodika byla schválena odborem vědy a výzkumu, MZe ČR pod č. j.:47968/ ze dne
4 Obsah Cíl... 5 Úvod... 5 Rozšíření virů peckovin v ČR... 6 Principy ochrany... 7 Biologie a škodlivost virů peckovin... 7 Biologie vektorů PPV Zjišťování výskytu Metodika Multiplex RT-PCR pro detekci PPV, PDV a PNRSV Odběr vzorku Izolace RNA One-step-RT-PCR Two-step-RT-PCR Vizualizace PCR produktů Srovnání novosti postupů Popis uplatnění metodiky Seznam použité související literatury Seznam publikací, které předcházely metodice
5 Cíl Cílem metodiky bylo vyvinout rutinní diagnostickou metodu schopnou spolehlivě a citlivě současně detekovat tři nejběžnější viry peckovin - virus šarky švestky (PPV), virus zakrslosti slivoně (PDV) a virus nekrotické kroužkovitosti slivoně (PNRSV). Úvod Pěstování peckovin je důležitá součást zemědělství mírného a subtropického pásma, z jak ekonomického, tak i kulturního hlediska. Peckoviny jsou důležitou skupina ovoce, z nějž nejvýznamnějšími druhy jsou švestky (Prunus domestica), broskvoně (Prunus persica), meruňky (Prunus armeniaca), třešně (Prunus avium) a višně (Prunus cerasus). Světová produkce peckovin dosahuje přibližně 30 miliónů tun ročně, přičemž přes deset miliónů tun je vyprodukováno v Evropě a tun v České republice (FAOSTAT databáze). Existuje mnoho virových původců chorob infikujících peckoviny. Nejzávažnější virovou chorobou je bezesporu šarka švestky, způsobená virem šarky švestky-plum pox virus (PPV). Způsobuje významné ztráty na výnosech, které mohou dosáhnout u náchylných odrůd až 95%, a je široce rozšířena ve většině států Evropy, v řadě zemí Asie a na severu Afriky - Turecko, Egypt, Sýrie, Indie (Simon et al., 1997), pravděpodobně i Čína, v Severní i Jižní Americe - Chile, Argentina, USA a Kanada (Malinowski et al., 2006). PPV je přenášen velkým počtem mšic necirkulativním, nepersistentním způsobem. PPV virulentní mšice může tudíž strom nakazit jediným akvizičním sáním na zdroji infekce. Mezi nejzávažnější Ilarviry napadající peckoviny patří virus zakrslosti slivoně - Prune dwarf virus a virus nekrotické kroužkovitosti slivoně - Prunus necrotic ringspot virus. Tyto viry, samotné nebo v kombinaci, mohou snížit výnos, dozrávání plodů a růst stromů. Krom vegetativního přenosu jsou přenášeny i pylem a semenem, což napomáhá jejich rozšíření (Saade et al., 2000). Všechny tyto viry mohou být přítomny v pletivech stromů samostatně nebo v kombinacích. Vyšší rostliny jsou běžně napadány několika viry současně, a mnoho chorob je způsobeno interakcí dvou nebo více nezávislých virů (Pruss et al., 1997). Ochrana peckovin proti virovým chorobám spočívá v získávání a produkci zdravého množitelského materiálu, čehož se v Evropě dosahuje certifikačními programy, které jednotlivé státy samostatně vypracovávají podle certifikačního schématu EPPO. Stromy jsou pěstovány z otestovaného viruprostého množitelského materiálu v izolaci od potencionálních zdrojů choroby a před předáním pěstitelům testovány. Nejčastěji používanou metodou je 5
6 imunologická metoda ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), nicméně její výsledky by měly být brány s jistou dávkou obezřetnosti, neboť distribuce viru v rostlině není jednotná a předvídatelná (Ogawa et al., 1995). ELISA také není schopna detekovat virus přítomný ve velmi nízkém titru, což je u směsných infekcí možné (Sánchez-Navarro et al., 2005). Alternativně se dají použít klasické biologické testy na indikátorových rostlinách, jako broskvoně cv. GF 305 nebo višeň plstnatá (Prunus tomentosa) (Ogawa et al., 1995). Tyto testy jsou ovšem časově velmi náročné (od měsíců po 2-3 roky), drahé a ve většině případů musí být výsledky potvrzeny jinou detekční metodou (Sánchez-Navarro et al., 2005). Krom ELISY se v mnoha zemích používá molekulárních metod jako RT-PCR (Ogawa et al., 2005). Molekulární metody nabízí praktickou alternativu metodám předchozím, díky své vysoké specifičnosti a detekčním limitům. Multiplex polymerázová řetězová reakce (PCR) je variantou PCR, v níž dvě a více cílových míst je současně amplifikováno v jedné reakci. Od svého prvního popisu v roce 1988 (Chamberlain et al, 1998) byla tato metoda úspěšně uplatněna v mnoha oblastech molekulární biologie (Henegariu et al., 1997). Metody, které umožní simultánní detekci více virů jsou pro rutinní testování žádoucí, neboť vyžadují méně času, práce a nákladů. V tomto smyslu multiplex RT-PCR je schopna spolehlivě detekovat viry a viroidy v rutinní diagnostice (Sánchez-Navarro et al., 2005). Rozšíření virů peckovin v ČR V České republice byl výskyt viru šarky švestky prokázán v přírodě i v ovocných sadech na všech druzích peckovin vyjma třešně a višně. Je široce rozšířen ve stromech švestky a myrobalánu i v některých výsadbách meruňky a broskvoně. Onemocnění peckovin šarkou se v současné době vyskytuje plošně nejen v nížinách, ale i v podhůří a vyšších polohách, kde ještě před třiceti nebo čtyřiceti lety byly švestky zdravé. Slabší výskyt viru je pouze v jižních Čechách a na jižní Moravě. K přírodním hostitelům tohoto viru patří trnky, které byly infikovány přenosem mšicemi ze švestek, slivoní a myrobalámu a staly se sekundárním zdrojem infekce (Polák, 2006). Virus zakrslosti slivoně je v současnosti rozšířen převážně na trnkách, třešni a myrobalánu. Na třešni a myrobalánu je také rozšířen virus nekrotické kroužkovitosti slivoně (Polák, 2007). Výskyt viru chlorotické skvrnitosti jabloně (ACLSV) a viru mozaiky jabloně, které na švestce a slivoních mohou vyvolávat příznaky podobné šarce, tzv. pseudošarku, je v ČR ojedinělý. Ve výsadbách třešně se může také vyskytnout virus 6
7 svinutky třešně (Cherry leaf roll virus - CLRV), avšak i jeho výskyt je sporadický. Rozšíření virů v ČR je uvedeno v tabulce č. 1. Tab.č.1. Rozšíření virů na peckovinách v ČR, uvedeno v procentech infikovaných rostlin (Polák, 2007). Virus PPV PDV PNRSV ACLSV ApMV CLRV Švestka 74% 2% 27% 1% 1% - Myrobalán 26% 11% 18% 1,8% 0,6% - Trnka 5% 27% 4% 0% 0% - Třešně a višně 0% 25% 22% - - 1,8% Principy ochrany Základem ochrany proti virům peckovin je zdravý výsadbový materiál. Vysazení zdravého, viruprostého školkařského materiálu nám však ještě nemusí zaručit, že během několika málo let nedojde k infikování mladých stromů virem šarky švestky, který je snadno přenosný mšicemi. Virem infikované stromy nelze léčit, neexistují žádné chemické ani biologické prostředky, kterými by bylo možno stromy ošetřit a uzdravit nebo je před virovou infekcí chránit tak, jako tomu je v případě bakteriálních a houbových chorob. Jedinou možností účinné ochrany proti rostlinným virům je pěstování odolných rezistentních, nebo dokonce imunních odrůd peckovin. Problém viru šarky švestky můžeme proto vyřešit pěstováním odrůd slivoní, švestky, meruňky a broskvoně rezistentních k viru šarky švestky (Polák, 2006). Proti ostatním virům nejsou zatím známy zdroje rezistence ani naprosto rezistentní odrůdy. Biologie a škodlivost virů peckovin Všechny výše zmíněné viry jsou jednovlákné RNA viry. Existuje šest skupin viru šarky švestky: PPV-D (Dideron), PPV-M (Marcus), PPV-EA (El Amar), PPV-C (Cherry), PPV-Rec (Recombinant) a nedávno identifikovaný PPV-W (W3174) (James a Varga, 2004). PPV-D a PPV-M jsou dvě hlavní skupiny viru, obě široce rozšířené v Evropě, a vykazují závažné rozdílnosti v patogenitě a některé ve svých epidemiologických vlastnostech. Liší se hlavně v intenzitě choroby mezi jednotlivými druhy Prunus spp. a schopnosti infikovat broskvoň (P. persica) přenosem mšicemi (Quijot et al., 1995). Skupina kmenů PPV-M a konkrétně originální kmen PPV-M izolovaný ve Francii vykazuje nejvyšší patogenitu a nejsilnější 7
8 příznaky na listech i plodech peckovin. Ve střední Evropě v Polsku (Malinowski, 2003), České republice (Polák a Pívalová, 2005) i v Rakousku (Laimer et al., 2003) převládá rozšíření slaběji patogenního kmenu PPV-D, více než 90% infikovaných stromů je infikováno PPV-D. Mezi přírodními hostiteli se jiný kmen než PPV-D téměř nevyskytuje. Přesto existují sady meruněk a broskvoní infikovaných PPV-M. Ojedinělě byl zjištěn i rekombinantní kmen PPV-Rec. Jiná situace je v dalších evropských zemích a v jihovýchodní Evropě, v Bulharsku a Řecku, kde převládají kmeny ze skupiny PPV-M. Např. Kamenova et al. (2003) zjistili v Bulharsku na meruňkách a broskvoních pouze PPV-M, na švestkách dosahuje podíl PPV-M 88%. Virus zakrslosti slivoně byl pojmenován svými objeviteli v roce Jméno zůstalo, ačkoli výskyt PDV na slivoni je mnohem méně běžný než na jiných druzích rodu Prunus. Nejčastěji se vyskytuje na višni (P. avium) (Németh, 1986). Příznaky se obvykle několik let po infekci vůbec neprojeví, občas může být v prvním roce infekce zaznamenáno žloutnutí listů. Projev příznaků je nejpravděpodobnější asi dva týdny poté, co se noční teploty pohybují okolo C a denní vyšplhají nad 30 C. Napadené listy jsou zkroucené, žlutozelené, zelené podél hlavních žil. Může docházet k opadávání listů. U napadených stromů se může vyvinout vrbovitý vzhled s růstem dlouhých holých větví. Na třešních (P. cerasus) napadených PDV mají listy normální zabarvení a vigor, ale jsou užší a delší než je obvyklé. Symptomy mohou být omezeny jen na část stromu. Výnos u višní může být snížen až o 50% (Pscheidt, 2008). PNRSV je lehce přenosné očkováním a roubováním. Šíří se také přirozeně v sadech infikovaných semenem a pylem, tudíž, přirozené šíření je až do věku stromů, kdy začnou kvést, značně omezené. Virus se šíří rychleji na višních (P. avium) než na třešních (P. cerasus). Díky šíření pylem může vysoké procento semen obsahovat PNRSV (Pscheidt, 2008). Některé izoláty nejsou symptomatické, zatímco jiné vyvolávají tvorbu charakteristických chlorotických kroužků a dírek v mladých listech. U třešní byly popsány dva izoláty podle toho, zda tvoří jemné kadeřavění listů (M) nebo mozaiku (R) (Aparicio et al., 1999). Mezi klasické příznaky patří také deformace listů a zakrslost. Postiženy mohou být celé rostliny nebo jen část. Na rozdíl od PDV, příznaky jsou více viditelné při vysokých teplotách (Németh, 1986). Výnos stromů napadených běžným izolátem klesá o cca 5% (Pscheidt, 2008). Stubbs a Smith (1971) a Scott et al. (2001) zaznamenali synergickou reakci Prune dwarf virus a Prunus necrotic ringspot virus způsobující zakrslost broskvoně. Častým příznakem této směsné infekce je tvorba rozet. 8
9 Obrázek č. 1. Plody meruňky (P. armeniaca) se symptomy PPV. Zdravý plod je vpravo dole. (foto INRA Bordeaux, France). Plod meruňky (P. armeniaca) s charakteristickými kroužkovými mozaikami na pecce (foto J. Kumar, VÚRV v.v.i.). Obrázek č. 2. Kroužky a difúzní skvrny na listech meruňky (P. armeniaca)cv. Carola, infikované PPV. (foto J. Polák, VÚRV v.v.i.) Obrázek č. 3. Symptomy na listech slivoně (P. domestica) způsobené PPV. (foto J.Kumar, VÚRV v.v.i.). 9
10 Obrázek č. 4. Povrchové propadliny a vnitřní nekrózy způsobené PPV na plodech švestky domácí (P. domestica). (foto INRA Bordeaux, France). Obrázek č. 5. Symptom na listech náchylné broskvoně (P. persica). (foto J. Polák, VÚRV v.v.i.). Obrázek č. 6. Plod broskvoně cv. Catherina s typickými kroužky a difuzními skvrnami vyvolanými PPV. (foto J. Polák, VÚRV v.v.i.). Obrázek č. 7. Příznaky PNRSV na listech broskvoně (P. persica). (foto E.V.Podleckis, West Virginia University) 10
11 Obrázek č. 8. Listy třešně s příznaky chlorotické skvrnitosti a kroužkovitosti v nichž byla prokázána přítomnost PNRSV (P. cerasus) (foto a. Oregon State University; b. J. Polák, VÚRV v.v.i.) Obrázek č. 9. Příznaky PDV na listech a) višně (P. avium) (foto Oregon State University) a b) třešně (foto J. Polák, VÚRV v.v.i.). Biologie vektorů PPV V přírodě je šarka šířena mšicemi. Virus šarky švestky je přenášen mšicemi nepersistentním způsobem na stiletech mšic. Mšice je schopna virus získat nasátím již při zkusmém sání během několika minut. Po nabývacím sání je schopna jej přenést na zdravou rostlinu během několika minut inokulačního sání. Použití insekticidů je prospěšné pro hubení mšic, ale nezabrání přenosu viru v případě, že mšice již má virus na stiletech a přilétá z neošetřených stromů. V tom případě může virus přenést dříve, než se projeví působení insekticidu. PPV přenáší řada druhů mšic, proto jmenujeme jen ty nejvýznamnější a nejrozšířenější vektory: mšice broskvoňová (Myzus persicae) - obr.14, mšice chmelová (Phorodon humuli) - obr.13, a 11
12 mšice slívová (Brachycaudus helichrysi) - obr.11. Zdroji infekce pro přenos šarky mšicemi jsou nemocné stromy peckovin v sadech a zahradách. Infikované stromy švestky, meruňky, broskvoně, ale především i planě a přirozeně rostoucí stromy myrobalánu, švestky, a v oblastech se silným výskytem šarky i keře trnky, jsou zde sekundárním zdrojem infekce. Významnými rezervoáry viru jsou stará stromořadí švestky, keře a stromy myrobalánu rostoucí podél venkovských silnic a cest (Polák, 2002). Obrázek č. 10. Mšice švestková Hyalopterus pruni. (foto W.Cranshaw, Colorado State University) Obrázek č. 11. Mšice slívová Brachycaudus helichrysi. (foto H.J.Buhr, Germany) Obrázek č. 12. Mšice bodláková Brachycaudus cardui. (foto INRA Bordeaux, France) 12
13 Obrázek č. 13. Mšice chmelová Phorodon humuli (foto G. Eickelmann, Geisenfeld, Germany) Obrázek č. 14. Mšice broskvoňová - Myzus Persicae (foto University of Minnesota) Zjišťování výskytu Jediná možná spolehlivá metoda zjišťování výskytu je testování rostlin. Mnohé infikované rostliny nevykazují, alespoň ze začátku, příznaky choroby, stejné příznaky mohou být vyvolány různými viry, a je tudíž u mnoha případů nemožné chorobu diagnostikovat čistě symptomaticky. Symptomatika tedy slouží pouze jako pomocné kritérium hodnocení infekce (Pscheidt, 2008). Virus nemusí být ve stromech rovnoměrně rozšířen, je distribuován nerovnoměrně, a jeho koncentraci ovlivňují klimatické podmínky a roční období. Pro diagnostiku za pomoci testu ELISA jsou nejvhodnější listy a květy. V podmínkách ČR se provádí stanovení PPV v květech během měsíce dubna a května, a v listech koncem května a v červnu, později obsah viru v listech klesá. V diagnostice méně příznivých obdobích, jako je zima, kdy je nutno odebírat vzorky zelené kůry, by tedy neměly být výsledky dosažené metodou ELISA brány jako spolehlivé (Spiegel and Martin, 1993). Polymerázová řetězová reakce (PCR) je vysoce citlivá spolehlivá metoda, která našla uplatnění při mnoha problematických detekcích, obzvláště v diagnostice kmenů virů a stanovení přítomnosti 13
14 virů v odrůdách se zvýšenou rezistencí. Multiplex RT-PCR je schopna detekovat více virů současně a tudíž je výhodná z hlediska časového i ekonomického. Metodika Multiplex RT-PCR pro detekci PPV, PDV a PNRSV Předkládaná multiplex RT-PCR byla otestována na vzorcích odebraných ze švestky domácí (Prunus domestica L.), třešně ptačí (P. avium (L.) L.), třešně višně (P. cerasus L.), višně plstnaté (P. tomentosa Thunb.), meruňky obecné (P. armeniaca L.), broskvoně obecné (P. persica (L.) Batsch), a trnky obecné (P. spinosa L.) a na její citlivost nebyl zaznamenám vliv druhu rostliny. Dále byla otestována a potvrzena schopnost detekovat jednotlivé kmeny viru šarky švestky nacházející se na území ČR, a to PPV-D, PPV-M a PPV-Rec. U PDV a PNRSV jsme testovali dostupné izoláty z ČR a Rumunska. Diagnostická citlivost a specifičnost byla testována celkem na 80 vzorcích a porovnána s metodou simplex RT-PCR schopnou detekovat v jedné reakci pouze jeden virus (viz tabulka č. 2). Mezi oběma metodami nebyly shledány žádné rozdíly. Tabulka č. 2: Porovnání diagnostické citlivosti a specifičnosti metody simplex one-step-rt-pcr a multiplex one-step-rt-pcr. Izolát Hostitel Původ Počet vzorků Simplex one-step-rt-pcr Multiplex one-step-rt-pcr PPV PDV PNRSV PPV PDV PNRSV Peach Broskvoň CZ Cherry Třešeň CZ Sour cherry Višeň CZ Blackthorn Trnka CZ Plum1 Slivoň CZ Plum2 Slivoň Rumunsko Plum3 Slivoň CZ Nanking Cherry Višeň plstnatá Itálie Plum4 (a) Slivoň (a) CZ Plum5 (b) Slivoň (b) CZ Apple (c) Jabloň (c) CZ (a) PNRSV isolates, (b) PPV isolates, (c) ApMV isolates., CZ-Česká republika 14
15 Odběr vzorku Správný odběr vzorku je nesmírně důležitý pro úspěšnou detekci. Ideální čas k odběrům je pozdní jaro, kdy je obvykle koncentrace viru ve stromech vysoká. Odebíráme nejlépe symptomatické středně staré listy, pokud možno rovnoměrně ze čtyř míst po obvodu koruny a z jednoho místa středu koruny stromu. Odebereme 1-2 g vzorku k homogenizaci. Listy dopravíme v chladu do laboratoře, kde je buď ihned zpracujeme, nebo uchováváme při -80 C. Je také možno odebírat kůru nebo okvětní plátky, přičemž platí stejná pravidla. Izolace RNA Dalším důležitým krokem pro úspěšnost reakce je izolace kvalitní RNA v dostačující kvantitě a kvalitě. Pletiva dřevitých rostlin, obzvláště venku rostoucích, obsahují vyšší množství fenolických složek a polysacharidů, které mají inhibující vlastnosti (Nassuth et al., 2000). Tyto látky tvoří chemické vazby s nukleovými kyselinami i proteiny při homogenizaci vzorku (Newbury & Possingham, 1977). Přítomnost inhibitorů poté ovlivňuje aktivitu reversní transkriptázy anebo polymerázy a tím i spolehlivost celé reakce. Výsledek může být tedy negativní, ačkoli je virus v pletivu přítomen (Nassuth et al., 2000). Doporučujeme tedy modifikovaný postup izolace přizpůsobený pro pletiva stromů jako je popsána v Singh et al. (2002), pokud upřednostňujete izolaci fenol-chloroformem; nebo v případě používaní kolonkové metody izolace, modifikaci podle Mekuria et al. (2003). Kvalitu izolované RNA je vhodné zkontrolovat spektrofotometricky a na agarózovém gelu. Při spektrofotometrickém měření se vzorek nejprve naředí destilovanou vodou, obvykle 1:9 (RNA:H 2 O). Měří se při vlnových délkách 260, 230 a 280 nm. To umožní hodnocení čistoty vzorku, očekávané poměry 260/280 a 260/230 jsou 2.0 pro RNA. Poměr absorbancí 260/280 menší než 1.75 svědčí pro obsah kontaminujících bílkovin. Absorbance při 230 nm značí nečistoty, jako jsou karbohydráty, fenolické sloučeniny, aromatické složky. Při výpočtu koncentrace optická hustota 1 odpovídá přibližně 40 ng/µl pro RNA. Vypočtená koncentrace by se měla pohybovat mezi ng/µl. Tyto hodnoty slouží pouze k orientačnímu odhadu čistoty a koncentrace RNA, hodnoty, které nám umožní utvrdit se v konečném výsledku RT-PCR (např. v případě izolace RNA o koncentraci 700 ng/µl, poměrům 260/280 a 260/230 rovným 2 a negativního výsledku RT-PCR, kdy byl pozitivní výsledek u pozitivní kontroly, máme jistotu, že v daném vzorku virus opravdu není). Integritu izolované RNA je dále dobré zkontrolovat na denaturujícím agarózovém gelu. Většinu izolované RNA tvoří RNA rostlinná a opět z rostlinné RNA převládá ribozomální RNA. Ta se na gelu rozdělí na dva silné bandy - 18s a 28s ribozomální RNA, přičemž 15
16 intenzita bandu 28s by měla být u intaktní neporušené RNA přibližně dvojnásobná intenzitě bandu 18s. Pokud nesouhlasí poměr 2:1 nebo jsou na gelu viditelné jen šmouhy, celistvost RNA byla porušena. Protokol I. Izolace RNA modifikovanou kolonkovou metodou firmy Qiagen - RNeasy Plant Mini Kit A) Homogenizace vzorku za použití tekutého dusíku 1. Pro izolaci RNA potřebujeme 0,2 g rostlinného pletiva. Výhodnější je ovšem homogenizovat více a z homogenátu 0,2 g navážit. Vzorky homogenizujeme v tekutém dusíku, u vzorků uchovávaných na -80 C dbáme na to, aby nedošlo k jejich rozmražení, ideálně odebíráme z mrazicího boxu po každém vzorku zvlášť. Vzorek pečlivě homogenizujeme v předmražené třecí misce. 2. Homogenát vpravte do min. 3 ml sterilní zkumavky (pokud jsou uchovávány na -80 C v 2 ml mikrozkumavkách, doporučujeme celou zkumavku před začátkem izolace ponořit do tekutého dusíku a poté obsah jednoduše přesypat do větší zkumavky). 3 ml zkumavky je také možno předmrazit krátkým ponořením do tekutého dusíku. Je velmi důležité nepřesáhnout danou váhu, neboť u kolonkových metod izolace RNA dochází v tomto případě ke sníženému výtěžku i kvalitě RNA. Jakmile máme vzorky navážené, je opět nutno zabránit jejich rozmražení před samotnou izolací - vhodné je uchování v tekutém dusíku nebo v mrazicím boxu. 3. Přidejte 2 ml extrakčního RLT pufru s přídavkem PVP-40 (4,4% - hmotnost/objem) a sodium metabisulphite (1% - hmotnost/objem). 4. Krátce vortexujte. B) Homogenizace vzorku bez tekutého dusíku Bez tekutého dusíku lze homogenizovat pouze listy čerstvé. Jeho druhou nevýhodou je, že je před homogenizací nutno odvážit 0,2 g, a tedy ztrácíme možnost homogenizovat větší množství materiálu a zvýšit tím pravděpodobnost výskytu viru právě v daném odebraném materiálu. 1. Připravte si modifikovaný RLT pufr z komerční soupravy RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) - k pufru přidejte PVP-40 (4,4% - hmotnost/objem) a sodium metabisulphite (1% - hmotnost/objem). Na jeden vzorek bude zapotřebí 2 ml takto připraveného extrakčního pufru. 2. 0,2 g rostlinného pletiva vložte do homogenizačního igelitového pytlíku (stejný jako pro přípravu vzorků na ELISA test). 16
17 3. Přidejte 2 ml extrakčního RLT pufru z komerční soupravy RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) s přídavkem PVP-40 (4,4% - hmotnost/objem) a sodium metabisulphite (1% - hmotnost/objem) 4. Pečlivě homogenizujte. Izolace RNA µl homogenátu odeberte do 2 ml mikrozkumavky, přidejte 60 µl 20% sarcosylu (N-lauroyl-sarcosine, Sigma). 6. Inkubujte při 70 C po dobu 10 minut. 7. Obsah přeneste do QIAshredder mini kolonky (fialová) a centrifugujte 5 min při rychlosti rpm. 8. Do nové 2 ml mikrozkumavky odeberte supernatant (cca 350 µl) a přidejte 315 µl 95% etanolu. 9. Promíchejte a celkový obsah napipetujte do QIA spin kolonky (růžová) a centrifugujte 15 s při 8000 x g (10,000 rpm). 10. Supernatant odstraňte. 11. Přidejte 700 µl RW1 promývacího pufru. Centrifugujte 15 s při 8000 x g (10,000 rpm). 12. Supernatant odstraňte. 13. Přidejte 500 µl RPE pufru, správně rozředěného čistým etanolem. Centrifugujte 15 s při 8000 x g (10,000 rpm). 14. Supernatant odstraňte. 15. Ještě jednou přidejte 500 µl RPE pufru, správně rozředěného čistým etanolem. Centrifugujte 2 min při 8000 x g (10,000 rpm). 16. Supernatant odstraňte. 17. Vložte kolonku do nové zachycovací 2 ml mikrozkumavky a na sucho centrifugujte po dobu 1 min na nejvyšší rychlost centrifugy. 18. Kolonku přendejte do 1,5 mikrozkumavky; přímo na membránu napipetujte 40 µl RNase free vody a stočte na 10,000 rpm po dobu 1 min. Tím se uvolní RNA. 19. Kolonku odstraňte, RNA uchovávejte v -20 C nebo -80 C. One-step-RT-PCR Z hlediska rychlosti a spolehlivosti je vhodnější používat one-step-rt-pcr, neboť redukcí kroků je sníženo riziko chyby a kontaminace. Při použití kitu QIAGEN OneStep RT-PCR je protokol následující: 17
18 1) 5 µl 5x pufr (konečná koncentrace 2.5 mm MgCl 2 ), 1 µl dntps (konečná koncentrace 200 µm každý nukleotid), 1 µl Q solution, 0.6 µl každého primeru (viz tabulka č. 3) o koncentraci 10 µm, doplnit RNase a DNase free H 2 O do 23 µl a přidat 2 µl RNA. 2) Podmínky reakce jsou: I) 50 C po dobu 30 min (reverzní transkripce); II) 95 C po dobu 10 min (aktivace HotStarTaq polymerázy); III) 35 cyklů ve třech krocích: 94 C po 20 s (denaturace), 51 C po 30 s (dosedání) a 72 C po dobu 1 min (polymerizace); IV) 72 C po dobu 10 min (konečné prodlužování) a V) 10 C uchovávání. Obrázek č. 15. Schéma zpracování vzorků metodou One Step RT-PCR. 18
19 Two-step-RT-PCR Při two-step-rt-pcr v jedné reakci nejprve dojde reverzní transkripcí k tvorbě cdna a v druhé reakci (PCR) k amplifikaci daných cílových úseků nukleové kyseliny. Protokol je následující: 1) Pro reverzní transkripci použijeme I) 10 µl H 2 O, 0.6 µl reverzních primerů (viz tabulka č. 3) o koncentraci 10 µm (PPV- RR, PNcpinR, PDVdpR) a 2 µl RNA a necháme po dobu 5 minut při 70 C dosednout primery. II) Okamžitě zchladíme a III) podle návodu výrobce používané reverzní transkriptázy pokračujeme. Zde je pro ukázku protokol za použití AMV reverzní transkriptázy (Promega). V mastermixu smícháme 5μl AMV Reverse Transcriptase 5X Reaction pufru, 2 μl dntps mix (konečná koncentrace 200 µm každého nukleotidu), 40 jednotek (40mM) RNasin Ribonuclease Inhibitor sodium pyrofosfát (předehřátý na 42 C), 2.5μl AMV RT (30 jednotek) a doplníme vodou bez nukleáz tak aby celkové množství i s již předtím namíchanou směsí RNA-primer-voda bylo 25 µl, tedy v tomto mastermixu do 12.4 µl. IV) Rozpipetujeme do směsi RNA-primer-voda - při pipetování jednou špičkou pozor na možnost kontaminace! 2) Při PCR použijeme v mastermixu I) 0.6 µl každého primeru o koncentraci 10 µm (při konečném obsahu jedné reakce 25 µl) a 2 µl cdna. II) PCR podmínky se mohou lišit podle používané polymerázy, proto zde jen pro ilustraci uvedeme protokol za použití Go Taq polymerázy s 5X Green GoTaq reakčním pufrem, který v sobě již obsahuje barvivo DNA (Promega). Mastermix se v tomto případě skládá z (1) 5 µl pufru (1.5 mm MgCl 2 ), 2 µl dntps (200 µm každého nukleotidu), 0.6 µl každého primeru o koncentraci 10 µm, 0.2 µl (2,5 U) GO Taq polymerázy (Promega, Medison, USA) a doplníme RNase-free H 2 O do celkového množství 23 µl. (2) Rozpipetujeme do jednotlivé mikrozkumavky velikosti 0,5 ml nebo 0,2 ml (dle typu termocycleru) a přidáme 2 µl cdna. III) Podmínky reakce jsou 95 C po dobu 2 min (iniciální denaturace); 19
20 IV) 35 cyklů po třech krocích - 95 C po dobu 20s (denaturace), 51 C po dobu 30s (dosedání primeru neboli aneling), 72 C po dobu 1 min (polymerizace); V) 72 C po dobu 10 min (konečné prodlužování) a VI) 10 C uchovávání. Vizualizace PCR produktů Vizualizace PCR produktů probíhá za pomoci eletroforetického rozdělení fragmentů v agarózovém gelu (je doporučeno použití 1,5-2,5 % gelu pro lepší oddělení jednotlivých produktů) s předchozím označením DNA za použití etidium bromidu (0,5 µg/ml) nebo Syber Greenu (0,1 µl Syber Green/ 10 ml gel). Agarózový gel se připravuje v TAE (40 mm Trisacetát, 1 mm EDTA, ph 8) nebo TBE pufru (89 mm Tris base, 89 mm kyseliny trihydrogenborité, 1 mm EDTA, ph 8). Etidium bromid nebo Syber Green se dá používat buď přímo do gelu nebo namíchat do PCR produktu. Z hlediska bezpečnosti práce však doporučujeme používat Sybr Green, u kterého nebyl prokázán negativní dopad na lidský organismus. 5 μl produktu obarveného barvivem (6x loading dye), je nanášeno na gel a podstoupeno 3-9 V/cm po dobu min dle velikosti gelu. V případě použití zeleného pufru dodávaného k enzymu Go Taq (Promega) - viz. two step RT-PCR - již není zapotřebí produkty barvit a můžeme přímo z cykleru nanášet na gel. Produkt primerů PPV-RR a F3 je dlouhý 345 bp; PDVdpR a PDVdpuF 220 bp a PNcpR a PNcpinF tvoří 425 bp dlouhý produkt (viz. Obrázek č. 16). Tabulka č. 3 Seznam primerů Primer Sekvence 5-3 T m Target By PPV-RR CTCTTCTTGTGTTCCGACGTTTC 59 C PPV F3 GGAATGTGGGTGATGATGG 57 C PPV PDVdpR CCT TTA ATG AGT CCG T 56 C PDV PDVdpuF CCG AGT GGA TGC TTC ACG 58 C PDV PNcpR CTTTCCATTCGGAGAAATTCG 54 C PNRSV PNcpinF GAGTATTGACTTCACGACCAC 57 C PNRSV Varga & James, 2005 Varga & James,
21 Obrázek č. 16. Multiplex RT-PCR. Vzorky 1-7, postupně:1) PPV, PDV a PNRSV směsná infekce; 2) PPV a PNRSV směsná infekce; 3) PDN a PNRSV směsná infekce; 4) PPV a PDV směsná infekce; 5) PNRSV infekce; 6) PDV infekce; 7) PPV infekce; M) 100bp DNA ladder marker (Fermentas). Srovnání novosti postupů V rutinní diagnostice se běžně určuje jeden cílový organismus v jedné reakci. Metoda, umožňující detekce tří organismů současně je ekonomicky i časově výhodná. Popis uplatnění metodiky Cílem metodiky bylo vyvinout rutinní diagnostickou metodu schopnou spolehlivě a citlivě současně detekovat tři nejběžnější viry peckovin - virus šarky švestky (PPV), virus zakrslosti slivoně (PDV) a virus nekrotické kroužkovitosti slivoně (PNRSV). Metodika je určena pro Státní rostlinolékařskou správu k zjednodušení rutinních detekcí virů na peckovinách. Zprostředkovaně může sloužit i pro soukromé pěstitele peckovin. Seznam použité související literatury Al Rwahnih M., Turturo C., Minafra A., Saldarelli P., Myrta A., Pallás V., Savino V., Molecular variability of Apple chlorotic leaf spot virus in different hosts and geographical regions. J. Plant Pathol. 86 (2): Aparicio F., Myrta A., Di Terlizzi B., Pallás V., Molecular Variability Among Isolates of Prunus Necrotic Ringspot Virus from Different Prunus spp. Virology 89(11):
22 Candresse T., Lanneau M., Revers F., Macquaire G., German S., Grasseau N., Dunez J., Malinowski T., An immunocapture PCR assay adapted to the detection and the analysis of the molecular variability of the Apple chlorotic leaf spot virus. Acta Hortic. 386: Chamberlain J.S., Gibbs R.A., Ranier J.E., Nguyen P.N., Caskey C.T., Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res. 16: Desvignes, J.C., Boye R., Different diseases caused by chlorotic leaf spot virus on the fruit trees. Acta Hortic. 235: Henegariu O., Heerema N.A., Dlouhy S.R., Vance G.H., Vogt P.H., Multiplex PCR: Critical Parameters and Step-by-Step Protocol. BioTechniques 23: James D., Varga A., 2004: Preliminary molecular characterisation of plum pox potyvirus isolate W3174: evidence of a new strain. Acta Horticulturae 657: Kamenova V., Milusheva S., Borisova A., Stoev A., Myrta A., 2003: Plum pox virus strains in Bulgaria. Options Mediterranéennes, Serie B, 45: Laimer M., Mendonca D., Arthofer W., Hanzer V., Myrta A., Boscia D., 2003: Occurrence of different Plum pox virus strains in several stone fruit specias in Austria. Options Mediterranéennes, Serie B., 45: Liberti D., Marais A., Svanella-Dumas L., Dulucq M. J., Alioto D., Ragozzino A., Rodoni B., Candresse T., Characterization of Apricot pseudo-chlorotic leaf spot virus, a Novel Trichovirus Isolated from Stone Fruit Trees /PHYTO Phytopathology Virology. The American Phytopathological Society. Malinowski T., 2003: Plum pox disease in Poland: the past and current situation. Options Medirranéennes, Serie B., 45: Malinowski T., Cambra M., Capote N., Zawadzka B., Gorris M.T., Scorza R., Ravelonandro M., Field trials of plum clones transformed with the Plum pox virus coat protein (PPV- CP) gene. Plant Dis. 90: Mekuria G., Ramesh S.A., Alberts E., Bertozzi T., Wirthensohn M., Collins G., Sedgley M., Comparison of ELISA and RT-PCR for the detection of Prunus necrotic ring spot virus and prune dwarf virus in almond (Prunus dulcis). J. Virol. Methods 114: Nassuth A., Pollari E., Helmeczy K., Stewart S., Kofalvi S.A., Improved RNA extraction and one-tube RT-PCR assay for simultaneous detection of control plant RNA plus several viruses in plant extracts. J. Virol. Methods 90:
23 Nemeth M., Virus, Mycoplasma and Rickettsia Diseases of Fruit Trees. Martinus Nijhoff Publishers, The Netherlands and Akademini Kiado, Hungary, 840p. Newbury H.J., Possingham J.V., Factors Affecting the Extraction of Intact Ribonucleic Acid from Plant Tissues Containing Interfering Phenolic Compounds. Plant Physiol. 60: Ogawa J.M., Zehr E.I., Bird G.W., Plum Pox Virus. From the Compendium of Stone Fruit Diseases. APS press, 98 pp, USA. Polák J., Virus šarky švestky nejškodlivější virus peckovin v České republice II. Díl. Dostupné na Polák J., Hosts and symptoms of Plum pox virus: woody species other than fruit and ornamental species of Prunus. OEPP/EPPO bulletin 36: Polák J., Viruses of blackthorn and road-bordering trees of plum, myrobalan, sweet and sour cherries in the Czech Republic. Plant Protect. Sci. 43: 1 4. Polák J., Pívalová J., 2005: Sporadic distribution of Plum pox virus M strain in natural sources in the Czech Republic. Hort. Sci. (Prague), 32: Polák J., Zieglerová J., Bouma J., Diagnostika a rozšíření viru chlorotické skvrnitosti jabloně na jádrovinách v České republice. Hort. Sci. Prague 24: Pruss G., Ge X., Shi X.M., Carrington J.C., Vance V.B., Plant Viral Synergism: The Potyviral Genome Encodes a Broad-Range Pathogenicity Enhancer That Transactivates Replication of Heterologous Viruses. The Plant Cell.9: Pscheidt J.W., An online guide to Plant Disease Control. Oregon State University. Dostupné na Quiot J.B., Labonne G., Boeglin M., Adamolle C., Renaud L.Y., Candresse T., Behavior of two isolates of Plum pox virus inoculated on peach and apricot trees: First results. Acta Hortic. 386: Saade M., Aparicio F., Sanchez-Navarro J.A., Herranz M.C., Myrta A., di Terlizzi B., Pallas V., Simultaneous detection of the three ilarviruses affecting stone fruit trees by nonisotopic molecular hybridization and multiplex reverse-transcripton polymerase chain reaction. Phytopathology - Virology p Sanchez-Navarro J.A., Aparicio F., Herranz M.C., Minafra A., Myrta A., Pallas V., Simultaneous detection and identification of eight stone fruit viruses by one-step RT-PCR. Eur. J. Plant Pathol. 111:
24 Scott S.W., Zimmerman M.T., Yilmaz S., Zehr E.I., Bachman E., The interaction between Prunus necrotic ringspot virus and Prune dwarf virus in peach stunt disease. Acta Hortc. 550: Simon L., Saenz P., Garcia J.A., Filamentous viruses of woody plants. Chapter 7 Plum pox virus. pp Edited by P. Monnette. Trivandrum, India: Research Singspost. Singh R.P., Nie X., Singh M., Coffin R., Duplessis P., Sodium sulphite inhibition of potato and cherry polyphenolics in nucleic acid extraction for virus detection by RT-PCR. J. Virol. Methods 99: Spiegel S., Scott S.W., Bowman-Vance V., Tam Y., Galiakparov N.N., Rosner A., Improved detection of prunus necrotic ringspot virus by the polymerase chain reaction. Eur. J. Plant Pathol. 102: Spiegel S., Thompson D., Varga A., James D., An Apple chlorotic leaf spot virus isolate from Ornamental Dwarf Flowering Almond (Prunus glandulosa Sinensis ): Detection and Characterization. HortScience 40(5): Stubs L.L., Smith P.R., The association of Prunus ringspot, prune dwarf, and dark green sunken mottle viruses in the rosetting and decline disease of peach. Austral. J. Agricul. Res. 22: Varga A., James D., Detection and differentiation of Plum pox virus using real-time multiplex PCR with SYBR Green and melting curve analysis: a rapid method for strain typing. J. Virol. Methods 123: Varga A., James D., Use of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for the detection of Plum pox virus. J. Virol. Methods 138: Yoshikawa N., Apple chlorotic leaf spot virus. Dostupné na Seznam publikací, které předcházely metodice Jarošová J Interaction of Plum pox virus with Ilarviruses and Trichoviruses in stone fruit. MSc Thesis. Czech University of Life Sciences. 82pp. Polák J., Pívalová J., Kumar Kundu J., Jokeš M., Scorza R., Ravelonandro M Behaviour of transgenic Plum pox virus-resistant Prunus domestica L. clone C5 grown in the open filed under a high and permanent infection pressure of the PPV-Rec strain. Journal of Plant Pathology 90 (1, Supplement): S1.33-S
25 Polák J., Ravelonandro M., Kumar Kundu J., Pívalová J., Scorza R., Interactions of Plum pox virus strain Rec with Apple chlorotic leafspot virus and Prune dwarf virus in fieldgrown transgenic plum Prunus domestica L., clone C5, Plant Protect. Sci. 44(1): 1-5. Kumar Kundu J., Briard P., Hilly M.J., Ravelonandro M., Scorza R Role of the nt sirna in the resistance of transgenic Prunus domestica graft inoculated with plum pox virus. Virus Genes 36(1): Ravelonandro M., Kumar Kundu J., Briard P., Monsion M., Scorza R., The effect of coexisting prunus viruses on transgenic Plum pox virus resistant plums. Acta Horticulturae 738: Polák J., Viruses of blackthorn and road-bordering trees of plum, myrobalan, sweet and sour cherries in the Czech Republic. Plant Protect. Sci. 43: 1 4. Polák J., Pívalová J., Jokeš M., Svoboda J., Scorza R., Ravelonandro M., Preliminary results of interactions of Plum pox (PPV), prune dwarf (PDV), and apple chlorotic leafspot (ACLSV) viruses with transgenic plants of plum, Prunus domestica, clone C5 grown in an open field. Phytopathol. Pol. 36: Kumar Kundu J A rapid and effective RNA release procedure for virus detection in woody plants by reverse transcription-polymerase chain reaction. Acta virologica 47:
26 (foto J.Kumar, VÚRV v.v.i.) Název: Metodika molekulární detekce virů peckovin pomoci RT-PCR a multiplex-rt- PCR Autoři: Jarošová J., Polák J. & Kumar J. Vydal: Výzkumný Ústav Rostlinné Výroby, v.v.i. Drnovská 507, Praha 6 Ruzyně Tisk: CD Počet stran: 26 Vydání: první Rok vydání: 2008 ISBN: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008
Jaroslav Polák, Jiban Kumar, Boris Krška, Petr Komínek, Jana Jarošová UPLATNĚNÁ CERTIFIKOVANÁ METODIKA
Komplexní metodika hodnocení rezistence GM švestky, Prunus domestica L., klon C5 k viru šarky švestky, kvality plodů a možného přenosu transgenu do rostlin r. Prunus. Jaroslav Polák, Jiban Kumar, Boris
VíceMetodika hodnocení rezistence transgenní švestky, Prunus domestica L., klon C5 k viru šarky švestky a ke směsným infekcím s dalšími viry
Metodika hodnocení rezistence transgenní švestky, Prunus domestica L., klon C5 k viru šarky švestky a ke směsným infekcím s dalšími viry Jaroslav Polák, Jiban Kumar, Jana Jarošová UPLATNĚNÁ CERTIFIKOVANÁ
VíceZpůsob označování zdravotních tříd rozmnožovacího materiálu a vlastnosti, které takto označený rozmnožovací materiál musí mít
Způsob označování zdravotních tříd rozmnožovacího materiálu a vlastnosti, které takto označený rozmnožovací materiál musí mít Rozmnožovací materiál ovocných druhů lze uznávat ve zdravotní třídě viruprostý
VíceVizuální kontrola. 2x/rok 1x/4 roky 2x/rok 1x/7 let 1x/7 let Vein clearing and Vein nett of black currant, Goosberry Vein banding
Příloha 2 k č.j. 74248/2014-MZE-17221 Seznam virů a virům podobných škodlivých organismů, na které se testuje rozmnožovací materiál ovocných rodů a druhů, révy a chmele a četnost retestování. Juglans regia
Vícecdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2
cdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2 Obsah soupravy a její skladování Tato souprava pro reverzní transkripci obsahuje reagencie potřebné k provedení reverzní transkripce (RT)
VíceDIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU
Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální
VíceDIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU
Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální reziduální
VíceMETODIKA HODNOCENÍ REZISTENCE MERUNĚK K VIRU ŠARKY ŠVESTKY (PLUM POX VIRUS)
METODIKA HODNOCENÍ REZISTENCE MERUNĚK K VIRU ŠARKY ŠVESTKY (PLUM POX VIRUS) UPLATNĚNÁ METODIKA Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2008 Strana 2 z 22 Autoři: Doc. Ing. Jaroslav Polák, DrSc. Dr. Ing.
VíceDetekce vybraných rostlinných virů mikročipy (microarrays)
Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích Přírodovědecká fakulta Detekce vybraných rostlinných virů mikročipy (microarrays) Diplomová práce Bc. Lenka Hrabáková Vedoucí práce: Doc. RNDr. Karel Petrzik,
VíceIzolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie
Izolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie IZOLACE GENOMOVÉ DNA Deoxyribonukleová kyselina (DNA) představuje základní genetický materiál většiny
VíceDIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR
Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální reziduální choroby
VíceNárodní ozdravovací program pro ozdravení rozmnožovacího materiálu (dále jen NOPRM )
Ministerstvo zemědělství Čj.: 74248/2014-MZE-17221 V Praze, dne 9. prosince 2014 Národní ozdravovací program pro ozdravení rozmnožovacího materiálu (dále jen NOPRM ) ovocných rostlin, révy a chmele v České
VíceSure-MeDIP I. with magnetic beads and MNase. www.krd.cz
Sure-MeDIP I with magnetic beads and MNase www.krd.cz 1 Obsah soupravy a skladování MeDIP souprava obsahuje reagencie na provedení 25 reakcí. Souprava je rozdělen do dvou částí, jedna je distribuována
VíceMagPurix Viral Nucleic Acid Extraction Kit
MagPurix Viral Nucleic Acid Extraction Kit Kat. č. ZP02003 Doba zpracování: 40-55 minut pro MagPurix 12S 40-60 minut pro MagPurix 24 Použití Souprava MagPurix Viral Nucleic Acid Extraction Kit je určena
VícePCR IN DETECTION OF FUNGAL CONTAMINATIONS IN POWDERED PEPPER
PCR IN DETECTION OF FUNGAL CONTAMINATIONS IN POWDERED PEPPER Trojan V., Hanáček P., Havel L. Department of Plant Biology, Faculty of Agronomy, Mendel University of Agriculture and Forestry in Brno, Zemedelska
VíceVirus mozaiky pepina. Pepino mosaic virus (PepMV)
Virus mozaiky pepina Pepino mosaic virus (PepMV) Virus mozaiky pepina byl poprvé popsán v roce 1974, kdy byl objeven ve dvou porostech pepina (Solanum muricatum) v údolí Canete pobřežní oblasti Peru. Další
VíceMagPurix Blood DNA Extraction Kit 200
MagPurix Blood DNA Extraction Kit 200 Kat. č. ZP02001-48 Doba zpracování: 50-60 minut pro MagPurix 12S 50-70 minut pro MagPurix 24 Použití Souprava MagPurix Blood DNA Extraction Kit 200 je určena pro izolátor
VíceQH71273. Výzkum nekrotrofních patogenů z r. Phytophthora na ekonomicky významných listnatých dřevinách
QH71273 Výzkum nekrotrofních patogenů z r. Phytophthora na ekonomicky významných listnatých dřevinách Podprogram 1 Efektivní postupy v agrárním sektoru Výzkumný směr 12 - Ochrana zdraví rostlin a zvířat
VíceInovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/
I n v e s t i c e d o r o z v o j e v z d ě l á v á n í Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/07.0354 Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním
VíceCERTIFIKAČNÍ SCHÉMA PRO MANDLOŇ, MERUŇKU, BROSKVOŇ A ŠVESTKU
EUROPEAN AND MEDITERRANEAN PLANT PROTECTION ORGANIZATION ORGANISATION EUROPEENNE ET MEDITERRANEENNE POUR LA PROTECTION DES PLANTES EVROPSKÁ A STŘEDOZEMSKÁ ORGANIZACE PRO OCHRANU ROSTLIN 00/7845 (99/7214)
VíceIZOLACE DNA (KIT DNeasy Plant Mini)
17.1 Izolace DNA (kit DNeasy Plant Mini) Strana 1 IZOLACE DNA (KIT DNeasy Plant Mini) 1 Účel a rozsah Postup slouží k získání deoxyribonukleové kyseliny (DNA) ze vzorku pomocí komerčního kitu DNeasy Plant
VíceJednotné pracovní postupy zkoušení krmiv
Národní referenční laboratoř Strana KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ GENETICKÝCH MODIFIKACÍ METODOU qpcr POMOCÍ ROTOR-GENE PROBE PCR KITU Účel a rozsah Postup slouží ke kvantitativnímu stanovení genetických modifikací
VíceTkáňový homogenizátor MagNA Lyser od společnosti Roche
Izolace RNA Pracovní postup Homogenizace: Pozn. Postup homogenizace platí pouze pro izolaci RNA z nativní tkáně, v případě izolace z buněčné suspenze je tento krok vynechán a začíná se přídavkem homogenizačního
VíceMendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Inovace laboratorních úloh genetických předmětů metodikami pracujícími s ribonukleovými kyselinami pšenice Metodické návody pro laboratorní
VíceMonitoring rezistence obaleče jablečného proti CpGV v ČR
Monitoring rezistence obaleče jablečného proti CpGV v ČR Tereza Zichová 1,2, Jitka Stará 1, Vladan Falta 1, František Kocourek 1, Pavel Ryšánek 2, Jiban Kumar Kundu 1 1 Výzkumný ústav rostlinné výroby,
VíceUrčeno pro obecné laboratorní užití. Není určeno pro použití v diagnostických postupech. POUZE PRO POUŽITÍ IN VITRO.
Určeno pro obecné laboratorní užití. Není určeno pro použití v diagnostických postupech. POUZE PRO POUŽITÍ IN VITRO. PCR Nucleotide Mix Předem připravený roztok ultračistých PCR deoxynukleotidů (datp,
Víceα-globin StripAssay Kat. číslo 4-160 10 testů 2-8 C
α-globin StripAssay Kat. číslo 4-160 10 testů 2-8 C Popis stripů: Pracovní postup Izolace DNA Doporučujeme použít následující kit pro izolaci DNA z plné krve nebo jiných typů vzorků: Spin Micro DNA Extraction
VíceKatarína Mitrová, Leona Svobodová, Jaroslava Ovesná. Detekce pěti virů česneku kuchyňského metodou SYBR Green real-time PCR METODIKA PRO PRAXI
Katarína Mitrová, Leona Svobodová, Jaroslava Ovesná Detekce pěti virů česneku kuchyňského metodou SYBR Green real-time PCR METODIKA PRO PRAXI Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2017 Metodika byla
VícePolymerázová řetězová reakce. Základní technika molekulární diagnostiky.
Polymerázová řetězová reakce Základní technika molekulární diagnostiky. Kdo za to může? Kary Mullis 1983 Nobelova cena 1993 Princip PCR Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction PCR) umožňuje
VíceDNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH. Michaela Nesvadbová
DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH Michaela Nesvadbová Význam identifikace živočišných druhů v krmivu a potravinách povinností každého výrobce je řádně a pravdivě označit
VíceMetodika molekulární determinace kmenů viru žluté zakrslosti ječmene
VÝZKUMNÝ ÚSTAV ROSTLINNÉ VÝROBY, V.V.I. Metodika molekulární determinace kmenů viru žluté zakrslosti ječmene (foto Johnson & Townsend, University of Kentucky, USA) Metodika pro Státní rostlinolékařskou
VíceEGFR XL StripAssay. Kat. číslo 5-630. 20 testů 2-8 C
EGFR XL StripAssay Kat. číslo 5-630 20 testů 2-8 C Popis stripu Pracovní postup 1. Izolace DNA Pro izolaci DNA použijte vhodný izolační kit. Doporučené kity jsou následující: Pro izolaci čerstvých nebo
VíceCVD-T StripAssay. Kat. číslo 4-360. 20 testů 2-8 C
CVD-T StripAssay Kat. číslo 4-360 20 testů 2-8 C Popis stripu Pracovní postup Izolace DNA Použijte čerstvou nebo zmraženou krev s EDTA nebo citrátem, jako antikoagulans, vyhněte se krvi s obsahem heparinu.
VíceBraf V600E StripAssay
Braf V600E StripAssay Kat. číslo 5-570 20 testů 2-8 C Popis stripu: Pracovní postup 1. Izolace DNA Pro izolaci čerstvých nebo mražených biopsií použijte soupravy Qiagen QIAmp DNA Mini nebo Micro. Pro izolaci
VíceTHE CHOICE OF THE MOST SUITABLE TECHNIQUE FOR ISOLATION OF NUCLEIC ACIDS AT DEPARTMENT OF ANIMAL MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY AND GENETICS
THE CHOICE OF THE MOST SUITABLE TECHNIQUE FOR ISOLATION OF NUCLEIC ACIDS AT DEPARTMENT OF ANIMAL MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY AND GENETICS VÝBĚR NEJVHODNĚJŠÍHO ZPŮSOBU IZOLACE NUKLEOVÝCH KYSELIN NA ÚSTAVU MORFOLOGIE,
VíceVýsledky v roce 2017
Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský Oddělení mezilaboratorních porovnávacích zkoušek Poskytovatel zkoušení způsobilosti č.7005 akreditovaný ČIA podle ČSN EN ISO/IEC 17043 Mezilaboratorní porovnávací
VíceIzolace RNA. doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD..
Izolace RNA doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD.. Metodiky izolace RNA celková buněčná RNA ( total RNA) zahrnuje řadu typů RNA, které se mohou lišit svými fyzikálněchemickými vlastnostmi a tedy i nároky na jejich
VíceMetody analýzy DNA využívané ve Výzkumném a šlechtitelském ústavu Holovousy RNDr. Jana Čmejlová, Ph.D.
Metody analýzy DNA využívané ve Výzkumném a šlechtitelském ústavu Holovousy RNDr. Jana Čmejlová, Ph.D. 1951 - Výzkumný ústav ovocnářský Holovousy 1997 - Výzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský Holovousy
VíceColumn DNA Lego Kit UNIVERZÁLNÍ SOUPRAVY PRO RYCHLOU IZOLACI ČISTÉ DNA (Katalogové číslo D201 + D202)
Column DNA Lego Kit UNIVERZÁLNÍ SOUPRAVY PRO RYCHLOU IZOLACI ČISTÉ DNA (Katalogové číslo D201 + D202) Popis Column DNA Lego Kit je základ moderní stavebnicové (Lego) soupravy pro izolaci čisté DNA různého
VíceKras XL StripAssay. Kat. číslo 5-680. 20 testů 2-8 C
Kras XL StripAssay Kat. číslo 5-680 20 testů 2-8 C Popis stripu: Pracovní postup 1. Izolace DNA Musí být použity vhodné metody extrakce DNA, v závislosti na typu vzorku, který má být vyšetřován. Doporučení
VíceCENÍK. Restrikční enzymy
CENÍK obchodní divize Forenzní DNA servis, s.r.o. Budínova 2, 180 81 Praha 8, CZE tel/fax: 233 931 123, GSM: 731 503 250 e-mail: amplicon@dna.com.cz Cena chlazených a mražených produktů neobsahuje dopravné
VíceDYNEX nabízí komplexní řešení v oblasti zpracování a analýzy biologických materiálů pomocí molekulárně biologických metod.
DYNEX nabízí komplexní řešení v oblasti zpracování a analýzy biologických materiálů pomocí molekulárně biologických metod. Od 1.1.2014 DYNEX jediným OFICIÁLNÍM (autorizovaným) distributorem společnosti
VíceServisní autorizované diagnostické laboratoře
Servisní autorizované diagnostické laboratoře Servisní autorizované diagnostické laboratoře pověřené Ministerstvem zemědělství České republiky podle 71 odst. 1 písm. b) zákona č. 326/2004 Sb. o rostlinolékařské
VíceInovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/
I n v e s t i c e d o r o z v o j e v z d ě l á v á n í Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/07.0354 Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním
VíceZDRAVOTNÍ NEZÁVADNOST POTRAVIN
ZDRAVOTNÍ NEZÁVADNOST POTRAVIN Možnosti stanovení Listeria monocytogenes popis metod a jejich princip Mária Strážiková Aleš Holfeld Obsah Charakteristika Listeria monocytogenes Listerióza Metody detekce
VíceFytoplazmy na révě vinné
Fytoplazmy na révě vinné K nejvýznamnějším a nejrozšířenějším evropským fytoplazmám na révě vinné patří fytoplazma stolburu bramboru (Potato stolbur phytoplasma, syn. Grapevine bois noir phytoplasma) a
VíceDoc. Ing. Jaroslav Polák, DrSc. Ing. Alena Hauptmanová
Autoři: Název: Vydal: Doc. Ing. Jaroslav Polák, DrSc. Ing. Alena Hauptmanová Metodika ozdravování odrůd slivoně a meruňky infikovaných virem šarky švestky metodou termoterapie in vivo a chemoterapie in
VíceZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA PROJEKTU DOTAČNÍHO TITULU 3.d. za dobu řešení
ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA PROJEKTU DOTAČNÍHO TITULU 3.d. za dobu řešení 2008-2013 1. TITULNÍ LIST Podpora tvorby rostlinných genotypů s vysokou rezistencí k biotickým i abiotickým faktorům a diferencovanou kvalitou
VíceCERTIFIKAČNÍ SCHÉMA PRO TŘEŠEŇ
7EUROPEAN AND MEDITERRANEAN PLANT PROTECTION ORGANIZATION ORGANISATION EUROPEENNE ET MEDITERRANEENNE POUR LA PROTECTION DES PLANTES EVROPSKÁ A STŘEDOZEMSKÁ ORGANIZACE PRO OCHRANU ROSTLIN 00/7844 (99/7213)
VíceMolekulární diagnostika
Molekulární diagnostika Odry 11. 11. 2010 Michal Pohludka, Ph.D. Buňka základní jednotka živé hmoty Všechny v současnosti známé buňky se vyvinuly ze společného předka, tedy buňky, která žila asi před 3,5-3,8
VíceMagPurix Viral/Pathogen Nucleic Acids Extraction Kit B
MagPurix Viral/Pathogen Nucleic Acids Extraction Kit B Kat. č. ZP02012 Doba zpracování: 45-60 minut pro MagPurix 12S 45-65 minut pro MagPurix 24 Použití Souprava MagPurix Viral/Pathogen Nucleic Acids Extraction
VíceÚLOHA C Klonování PCR produktu do plasmidu
Jméno a učo: Datum: ÚLOHA C Klonování PCR produktu do plasmidu TEORETICKÝ ÚVOD Při klonování PCR produktů do plasmidů se využívá vlastnosti Taq polymerasy, a jiných non-proofreading polymeras, přidávat
VíceNRAS StripAssay. Kat. číslo 5-610. 20 testů 2-8 C
NRAS StripAssay Kat. číslo 5-610 20 testů 2-8 C Popis stripu: Pracovní postup 1. Izolace DNA Pro izolaci DNA musí být použita vhodná metoda vzhledem k typu tkáně vzorku. Pro doporučení vhodné metody kontaktujte
VíceUSING OF AUTOMATED DNA SEQUENCING FOR PORCINE CANDIDATE GENES POLYMORFISMS DETECTION
USING OF AUTOMATED DNA SEQUENCING FOR PORCINE CANDIDATE GENES POLYMORFISMS DETECTION VYUŽITÍ AUTOMATICKÉHO SEKVENOVÁNÍ DNA PRO DETEKCI POLYMORFISMŮ KANDIDÁTNÍCH GENŮ U PRASAT Vykoukalová Z., Knoll A.,
VíceBraf 600/601 StripAssay
Braf 600/601 StripAssay Kat. číslo 5-560 20 testů 2-8 C Popis stripu: Pracovní postup Kit umožňuje detekci 9 mutací v genu BRAF (kodón 600 a 601) Další informace najdete v OMIM Online Mendelian Inheritance
Více8 PŘÍLOHA A - TABULKY
8 PŘÍLOHA A - TABULKY Tabulka A - 1 Přehled reagencií a jejich koncentrací na přípravu reakční směsi PCR reagencie objem (µl) koncentrace ddh 2 O N x 7 PPP mix N x 10 5 primer N x 1 10 µm 3 primer N x
VíceNAT testování dárců krve v ÚVN Praha
Oddělení hematologie a krevní transfuze NAT testování dárců krve v ÚVN Praha Ludmila Landová Organizace laboratorního vyšetření dárců krve - OHKT ÚVN Praha Konsolidované řešení ZVÝŠENÍ bezpečnosti pro
VíceIzolace nukleových kyselin
Izolace nukleových kyselin Požadavky na izolaci nukleových kyselin V nativním stavu z přirozeného materiálu v dostatečném množství požadované čistotě. Nukleové kyseliny je třeba zbavit všech látek, které
VíceTESTOVÁNÍ GMO Praktikum fyziologie rostlin
Teoretický úvod: TESTOVÁNÍ GMO Praktikum fyziologie rostlin 1 Teoretický úvod: TESTOVÁNÍ GMO Obecně na úvod Určitě jste už slyšeli pojem geneticky modifikovaný organismus (GMO). Úprava vlastností přirozeně
VíceVýzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský Holovousy, s.r.o.
Výzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský Holovousy, s.r.o. Výzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský Holovousy, s.r.o. Výzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský Holovousy, s.r.o. Výzkumný a šlechtitelský
VíceMETODY IDENTIFIKACE VIRU HIV
Název: Školitel: METODY IDENTIFIKACE VIRU HIV Soňa KŘÍŽKOVÁ Datum: 5.12.2013 Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.4.00/31.0023 Název projektu: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu Virus
Více2) Připravte si 3 sady po šesti zkumavkách. Do všech zkumavek pipetujte 0.2 ml roztoku BAPNA o různé koncentraci podle tabulky.
CVIČENÍ Z ENZYMOLOGIE 1) Stanovení Michaelisovy konstanty trypsinu pomocí chromogenního substrátu. Aktivita trypsinu se určí změřením rychlosti hydrolýzy chromogenního substrátu BAPNA (Nα-benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid)
VíceNárodní ozdravovací program pro ozdravení RM (dále jen NOPRM )
Ministerstvo zemědělství Čj.: 64262/2017-MZE-17221 V Praze, dne 26/10/2017 Národní ozdravovací program pro ozdravení RM (dále jen NOPRM ) ovocných rostlin, révy a chmele v České republice (dále jen ČR
VíceRozsah a výsledky cíleného průzkumu výskytu škodlivých organismů v ČR za rok 2006
Rozsah a výsledky cíleného průzkumu škodlivých organismů v ČR za rok 2006 Úvod Státní rostlinolékařská správa (SRS) provedla v roce 2006 cílené detekční průzkumy, které se zaměřily na průzkum chorob a
VíceMagPurix Bacterial DNA Extraction Kit
MagPurix Bacterial DNA Extraction Kit Kat. č. ZP02006 Doba zpracování: 55-65 minut pro MagPurix 12S 55-75 minut pro MagPurix 24 Použití Souprava MagPurix Bacterial DNA Extraction Kit je určena pro izolátor
VíceInterakce viru klíšťové encefalitidy s hostitelským organismem a patogeneze infekce
Parazitologický ústav, Akademie věd České republiky Laboratoř interakcí vektor-hostitel České Budějovice Interakce viru klíšťové encefalitidy s hostitelským organismem a patogeneze infekce Daniel Růžek,
VíceUniverzita Palackého v Olomouci. Bakalářská práce
Univerzita Palackého v Olomouci Bakalářská práce Olomouc 2015 Lucie Šimková Univerzita Palackého v Olomouci Přírodovědecká fakulta Katedra buněčné biologie a genetiky Viry slivoní v kulturním a planém
VíceSure-MeDIP II. with agarose beads and Mse I. www.krd.cz
Sure-MeDIP II with agarose beads and Mse I www.krd.cz 1 Obsah soupravy a skladování MeDIP souprava obsahuje reagencie na provedení 25 reakcí. Souprava je rozdělen do dvou částí, jedna je distribuována
VíceGenerativní rozmnožování ovocných dřevin
Generativní rozmnožování ovocných dřevin Generativní množení představuje množení rostlin semenem. V rámci ovocnářství se tímto způsobem množí některé podnože pro jádroviny, červené a modré peckoviny. Generativní
Více2) Připravte si 7 sad po pěti zkumavkách. Do všech zkumavek pipetujte 0.2 ml roztoku BAPNA o různé koncentraci podle tabulky.
CVIČENÍ Z ENZYMOLOGIE 1) Stanovení Michaelisovy konstanty trypsinu pomocí chromogenního substrátu. Aktivita trypsinu se určí změřením rychlosti hydrolýzy chromogenního substrátu BAPNA (Nα-benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid)
VíceČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra ochrany rostlin
ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra ochrany rostlin Charakterizace a diagnostika latentního viru meruňky disertační práce Autor: Ing. Lenka
VíceÚSTŘEDNÍ KONTROLNÍ A ZKUŠEBNÍ ÚSTAV ZEMĚDĚLSKÝ
ÚSTŘEDNÍ KONTROLNÍ A ZKUŠEBNÍ ÚSTAV ZEMĚDĚLSKÝ Rostlinolékařská diagnostika pověřování externích laboratoří Václav Čermák Odbor diagnostiky Pověřování rostlinolékařskou diagnostikou Pověřování v rámci
VíceTéma: DEMONSTRACE SYMPTOMŮ ZPŮSOBENÝCH FYTOPLAZMAMI, PŘENOSU KOKOTICÍ A ROUBOVÁNÍ. Ing. Jana Fránová, Dr., Biologické centrum AV ČR v.v.i.
Téma: DEMONSTRACE SYMPTOMŮ ZPŮSOBENÝCH FYTOPLAZMAMI, PŘENOSU KOKOTICÍ A ROUBOVÁNÍ Ing. Jana Fránová, Dr., Biologické centrum AV ČR v.v.i. Symptomatologie Fytoplazmy vyvolávají u infikovaných rostlin různé
VícePraktický význam sledování letu mšic
Praktický význam sledování letu mšic Diagnostická laboratoř Opava Svatopluk Rychlý Monitoring letu mšic proč se provádí? omezení přímé škodlivosti sáním rostlinných šťáv snížení rizika nepřímé škodlivosti
VíceMOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY V ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGII. Martina Nováková, VŠCHT Praha
MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY V ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGII Martina Nováková, VŠCHT Praha MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE V BIOREMEDIACÍCH enumerace FISH průtoková cytometrie klonování produktů PCR sekvenování
VíceOPTIMALIZOVANÝ POSTUP PRO DETEKCI GLOMERELLA CINGULATA VE VĚTVÍCH A KMENECH JABLONÍ POMOCÍ MIKROBIOLOGICKÝCH METOD.
DAVID NOVOTNÝ, IVA KŘÍŽKOVÁ A JIŘINA KRÁTKÁ OPTIMALIZOVANÝ POSTUP PRO DETEKCI GLOMERELLA CINGULATA VE VĚTVÍCH A KMENECH JABLONÍ POMOCÍ MIKROBIOLOGICKÝCH METOD. METODIKA PRO ÚTVARY STÁTNÍ SPRÁVY Výzkumný
VíceRapid-VIDITEST Influenza A+B
Rapid-VIDITEST Influenza A+B (Jednokrokový blisterový test pro in vitro diagnostiku viru Influenzy typu A a B z nosních výtěrů, výplachů a aspirátů) Návod k použití soupravy Výrobce: VIDIA spol. s r.o.,
VíceSTANOVENÍ TRICHINELLA SPP. VE VZORCÍCH MASA JATEČNÝCH ZVÍŘAT Inovace předmětu
Název inovace STANOVENÍ TRICHINELLA SPP. VE VZORCÍCH MASA JATEČNÝCH ZVÍŘAT Inovace předmětu V1MA2 Hygiena produkce masa II. Registrační číslo projektu CZ.1.07/2.2.00/15.0063 Název projektu Inovace výuky
VíceJaroslav Polák, Petr Komínek, Boris Krška, Jana Jarošová. Pokusný sad Biotech švestky v roce 2017.
UPOZORNĚNÍ! Uvedená metodika neprošla dosud oponentním řízením a certifikací a její text není definitivní. Poskytovatel metodiky nenese odpovědnost za její užití. Metodika dlouhodobého hodnocení transgenní
VíceKvantitativní detekce houbových patogenů v rostlinných pletivech s využitím metod molekulární biologie
Kvantitativní detekce houbových patogenů v rostlinných pletivech s využitím metod molekulární biologie Leona Leišová Přírodovědecká fakulta UK, Praha 2009 Metody kvantifikace: Nepřímé metody odhad míry
VíceSerologické vyšetřovací metody
Serologické vyšetřovací metody Serologické reakce Přímý průkaz Nepřímý průkaz průkaz antigenu průkaz nukleové kyseliny průkaz protilátek Nepřímý průkaz = průkaz specifických protilátek neboli průkaz serologický
VíceTvarování a řez jabloní pěstovaných ve tvaru štíhlé vřeteno. Josef Sus a kolektiv
Česká zemědělská univerzita v Praze Výzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský Holovousy s.r.o. Tvarování a řez jabloní pěstovaných ve tvaru štíhlé vřeteno Josef Sus a kolektiv CERTIFIKOVANÁ METODIKA 2016
VíceOptimalizace metody PCR pro její využití na vzorky KONTAMINOVANÝCH PITNÝCH VOD
Optimalizace metody PCR pro její využití na vzorky KONTAMINOVANÝCH PITNÝCH VOD Dana Vejmelková, Milan Šída, Kateřina Jarošová, Jana Říhová Ambrožová VODÁRENSKÁ BIOLOGIE, 1. 2. 2017 ÚVOD Sledované parametry,
VíceSeminář izolačních technologií
Seminář izolačních technologií Zpracoval: Karel Bílek a Kateřina Svobodová Podpořeno FRVŠ 2385/2007 a 1305/2009 Úpravy a aktualizace: Pavla Chalupová ÚMFGZ MZLU v Brně 1 Lokalizace jaderné DNA 2 http://www.paternityexperts.com/basicgenetics.html
VíceCeník izolačních kitů STRATEC v mikrodestičkách
Izolace plasmidové DNA ST7010300200 Invisorb Plasmid HTS 96 Kit for 2 x 96 preps 9 229 ST7010300300 isolation of pdna from up to 2.0 ml 4 x 96 preps 15 120 bacteria suspension in a 96-well format ST7010300400
VíceMetody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin
Metody používané v MB analýza proteinů, nukleových kyselin Nukleové kyseliny analýza a manipulace Elektroforéza (délka fragmentů, čistota, kvantifikace) Restrikční štěpení (manipulace s DNA, identifikace
VíceOBSAH. PP Master Mixy... 11 PPP Master Mix 12 Plain PP Master Mix 13 Combi PPP Master Mix 14
OBSAH DNA polymerázy pro PCR a pufry.................. 3 Taq DNA polymeráza 4 Taq DNA polymeráza Unis 5 TaqPurple DNA polymeráza 6 Taq DNA polymeráza 1.1 7 Combi Taq DNA polymeráza 8 LA DNA Polymerases
VíceMetody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin
Metody používané v MB analýza proteinů, nukleových kyselin Nukleové kyseliny analýza a manipulace Elektroforéza (délka fragmentů, čistota, kvantifikace) Restrikční štěpení (manipulace s DNA, identifikace
VíceEvropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti NUKLEOVÉ KYSELINY
Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti NUKLEOVÉ KYSELINY 3 složky Nukleotidy dusík obsahující báze (purin či pyrimidin) pentosa fosfát Fosfodiesterová vazba. Vyskytuje se mezi
VíceCYCLER CHECK. Test pro validaci teplotní uniformity cyklérů. Připraveno k použití, prealiquotováno. REF 7104 (10 testů) REF (4 testy)
CZ Návod k použití CYCLER CHECK Test pro validaci teplotní uniformity cyklérů Připraveno k použití, prealiquotováno REF 7104 (10 testů) REF 71044 (4 testy) Obsah 1. Popis výrobku... 2 2. Materiál... 3
VíceSTANOVENÍ TRICHINELLA SPP. VE VZORCÍCH MASA JATEČNÝCH ZVÍŘAT Inovace předmětu V1MA1 Hygiena produkce masa I. Registrační číslo projektu
Název inovace STANOVENÍ TRICHINELLA SPP. VE VZORCÍCH MASA JATEČNÝCH ZVÍŘAT Inovace předmětu V1MA1 Hygiena produkce masa I. Registrační číslo projektu Název projektu Název příjemce podpory Termín realizace
VíceMOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE I PŘÍPRAVA TKÁNĚ K IZOLACI DNA
Cvičení 9,10,11: MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Jméno: Skupina: Cíl: Seznámení se se základními metodami, využívanými k analýze DNA 1. izolace DNA 2. amplifikace DNA pomocí PCR a elektroforéza 3. vizualizace DNA
VíceDiagnostika infekce Chlamydia trachomatis pomocí molekulárně genetické metody real time PCR nejen u pacientek z gynekologických zařízení
Diagnostika infekce Chlamydia trachomatis pomocí molekulárně genetické metody real time PCR nejen u pacientek z gynekologických zařízení Mgr. Klára Vilimovská Dědečková, Ph.D. Synlab genetics s.r.o. Molekulární
VíceAplikace molekulárně biologických postupů v časné detekci sepse
Aplikace molekulárně biologických postupů v časné detekci sepse Mgr. Jana Ždychová, Ph.D. IKEM PLM - LLG Sepse je častou příčinou úmrtí během hospitalizace. Včasné nasazení odpovídající ATB terapie je
VíceMimořádně silné výskyty škůdců řepky v podzimním období a z toho vyplývající rizika pro jaro
Mimořádně silné výskyty škůdců řepky v podzimním období a z toho vyplývající rizika pro jaro Praha seminář 30.11. 2016 Prezentovány jsou výsledky projektu MZe QJ1610217 Prof. RNDr. Ing. František Kocourek,
VíceCeník izolačních kitů STRATEC ve zkumavkách
Izolace plazmidové DNA ST1010140900 Invisorb Spin Plasmid Mini Two for 10 purifications 628 ST1010140300 isolation of pdna from 0.5-2.0 ml bacteria 250 purifications 5 498 ST1010140400 suspension 500 purifications
VíceVýzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Jaroslav Salava & Jaroslav Polák CERTIFIKOVANÁ METODIKA
Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i METODIKA FENOTYPIZACE REZISTENCE BROSKVONÍ K VIRU ŠARKY ŠVESTKY Jaroslav Salava & Jaroslav Polák CERTIFIKOVANÁ METODIKA 2014 Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i.
VíceDETEKCE VYBRANÝCH VIRŮ INFIKUJÍCÍCH JABLONĚ
DETEKCE VYBRANÝCH VIRŮ INFIKUJÍCÍCH JABLONĚ Certifikovaná metodika Ing. Lenka Grimová, Ph.D. (40 %) Ing. Lucie Winkowska, Ph.D. (40 %) Prof. Ing. Pavel Ryšánek, CSc. (20 %) Katedra ochrany rostlin, Česká
VíceMartina Havlíčková Helena Jiřincová. NRL pro chřipku, Státní zdravotní ústav
Pandemic H1N1 2009 Martina Havlíčková Helena Jiřincová NRL pro chřipku, Státní zdravotní ústav Z historie H1N1 1916-1917 pravděpodobná cirkulace viru, malá ohniska, lokální epidemie ve vojenských táborech,
VíceMagPurix Forensic DNA Extraction Kit
MagPurix Forensic DNA Extraction Kit Kat. č. ZP02010 Doba zpracování: 40-50 minut pro MagPurix 12S 40-60 minut pro MagPurix 24 Použití Souprava MagPurix Forensic DNA Extraction Kit je určena pro izolátor
Více