UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMAKOLOGIE A TOXIKOLOGIE POVAHY S VYBRANÝMI NUKLEÁRNÍMI RECEPTORY

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMAKOLOGIE A TOXIKOLOGIE STUDIUM INTERAKCÍ PŘÍRODNÍCH LÁTEK POLYFENOLICKÉ POVAHY S VYBRANÝMI NUKLEÁRNÍMI RECEPTORY Rigorózní práce Vedoucí rigorózní práce: Prof. PharmDr. Petr Pávek, Ph.D. Hradec Králové, 2015 Michaela Dubecká

2 Děkuji Prof. PharmDr. Petru Pávkovi, Ph.D. za odborné vedení diplomové práce a poskytnutí odborných materiálů. 1

3 Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány.. 2

4 OBSAH 1. SEZNAM ZKRATEK 4 2. ÚVOD 6 3. CÍL PRÁCE 7 4. TEORETICKÁ ČÁST NUKLEÁRNÍ RECEPTORY SUPERRODINA NUKLEÁRNÍCH RECEPTORŮ TŘÍDY NUKLEÁRNÍCH RECEPTORŮ LIGANDY NUKLEÁRNÍCH RECEPTORŮ ORFANOVÉ NUKLEÁRNÍ RECEPTORY FARNESOIDNÍ X RECEPTOR (FXR) METABOLICKÁ FUNKCE FXR LIGANDY FXR ENDOGENNÍ LIGANDY ŽLUČOVÉ KYSELINY PŘÍRODNÍ LIGANDY SYNTETICKÉ LIGANDY STUDOVANÉ LÁTKY ANTHOKYANINY ANTHOKYANIDINY RESVERATROL EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST BUNĚČNÁ LINIE HEPG POMŮCKY, PŘÍSTROJE REAGENCIE METODIKA TRANSFEKCE ADHERENTNÍCH BUNĚK LIPOFEKCE METODIKA REPORTÉROVÁ GENOVÁ ESEJ REPORTÉROVÁ GENOVÁ ESEJ DUÁLNÍ-LUCIFERÁZOVÁ REPORTÉROVÁ GENOVÁ ESEJ TWO-HYBRID A ONE-HYBRID ESEJ TESTOVÁNÍ ANTHOKYANINŮ A ANTHOKYANIDINŮ TESTOVÁNÍ RESVERATROLU VÝSLEDKY INTERAKCE ANTHOKYANINŮ S FXR INTERAKCE ANTHOKYANIDINŮ S FXR INTERAKCE RESVERATROLU S FXR DISKUSE ZÁVĚR LITERATURA 66 SEZNAM OBRÁZKŮ 72 ABSTRAKT, ABSTRACT 75 PUBLIKACE 77 3

5 1. Seznam zkratek Bsep CA CAR CDCA CYIN C3OA C3OL C3OR C3OSA C3OSO DCA DEIN D3ORH D30RU D3OS FXR GW4064 IDIN KEIN KUIN LCA MLIN MYIN Exportní pumpa solí žlučových kyselin, kódován genem ABCB11 Kyselina cholová Konstitutivní androstanový receptor Kyselina chenodeoxycholová Kyanin chlorid Kyanidin-3-O-arabinosid chlorid Kyanidin-3-O-lathyrosid chlorid Kyanidin-3-O-rhamnosid chlorid Kyanidin-3-O-sambubiosid chlorid Kyanidin-3-O-sophorosid chlorid Kyselina deoxycholová Delfin chlorid Delfinidin-3-O-rhamnosid chlorid Delfinidin-3-O-rutinosid chlorid Delfinidin-3-O-sambubiosid chlorid Farnesoidní X receptor Modelový agonista FXR Ideain chlorid Keracyanin chlorid Kuromanin chlorid Kyselina litocholová Malvin chlorid Myrtillin chlorid 4

6 M3OG NAFLD OCA PL3OR PLIN PXR P3OG P3OR RIP14 SIRT-1 UDCA VDR Malvidin-3-O-galaktosid chlorid Nealkoholická steatóza jater Kyselina oxycholová Pelargonidin-3-O-rutinosid chlorid Pelargonin chlorid Pregnanový X receptor Peonidin-3-O-glukosid chlorid Peonidin-3-O-rutinosid chlorid RXR interagující protein 14 NAD + -dependentní proteinová deacetyláza; jeho selektivním aktivátorem s allosterickým mechanismem účinku je resveratrol Kyselina ursodeoxycholová Vitamin D receptor 5

7 2. Úvod V rámci této práce se zabývám studiem interakcí vybraných přírodních látek polyfenolického typu s vybranými nukleárními receptory. Jako vzorové látky jsme zvolili resveratrol, boldin a dále se zabýváme studiem vybraných anthokyaninů a anthokyanidinů. Resveratrol (trans-3,4,5-trihydroxystilben) je polyfenolická sloučenina, která se vyskytuje v hroznu, v červeném víně, v bobulích rodu Vaccinum, včetně borůvek a brusinek. V hroznech byl resveratrol nalezen ve slupce. Množství resveratrolu ve slupce hroznů se liší podle kultivaru hroznu, jeho geografického původu a expozici plísňovým infekcím. Po podání per os se resveratrol velmi dobře absorbuje z trávicího traktu, ale jeho biodostupnost je relativně malá, protože je rychle metabolizován a eliminován. Účinky resveratrolu jsou široké, mezi nejvýznamnější patří účinky protizánětlivé, angiogenetické a protirakovinné. Resveratrol by mohl mít široké uplatnění v léčbě mnoha onemocnění, např. metabolických onemocnění a rakoviny (de Cabo et al., 2015). Plody borůvek patří mezi nejbohatší zdroj anthokyaninů. Anthokyaniny jsou chemicky flavan-3-oly, přírodní barviva, nacházející se v dužnině a oplodí. Tyto látky mají velké spektrum biologických účinků, účinky antioxidační, protizánětlivé, antimikrobiální či antikancerogenní (Kašparová et al., 2009). Naším zájmem bylo zjištění interakcí výše zmíněných přírodních látek s nukleárními receptory, což by mohlo mít význam pro jejich dalším studium a následné uplatnění v prevenci a léčbě různých onemocnění. 6

8 3. Cíl práce Cílem této práce bylo nalezení interakcí vybraných přírodních látek s nukleárními receptory v buněčných liniích jaterního karcinomu. Pro naše experimenty jsme použili reportérovou genovou esej, kterou jsme pro naše měření optimalizovali. Použili jsme reportérové konstrukty luc2p a kvasinkový reportérový konstrukt pgal4. 7

9 4. Teoretická část 4.1. Nukleární receptory Superrodina nukleárních receptorů Nukleární receptory (také známé jako nukleární hormonální receptory nebo intracelulární receptory) jsou ligandem regulované transkripční faktory, které regulují expresi genů, které jsou zahrnuty v počtu fyziologických funkcí, v metabolismu, vývoji a reprodukci. Nukleární receptory (NR) představují důležité cíle pro výzkum léčiv pro terapeutické využití při léčbě zánětu, rakoviny a metabolických onemocnění. Existuje 48 genů v lidském genomu, které tvoří superrodinu nukleárních receptorů. Více než 20 těchto nukleárních receptorů jsou využívány jako cíle léčiv ( targets ). První klonovaný nukleární receptor byl lidský glukokortikoidní receptor, dále následoval estrogenní receptor, thyroidní receptor a receptor pro kyselinu retinovou (Seethala et Zhang, 2009) Třídy nukleárních receptorů Nukleární receptory mohou být klasifikovány pomocí různých metod. Nukleární receptory mohou být rozděleny do pěti tříd podle DNA vazebých a dimerizačních vlastností. Ačkoliv se některé nukleární receptory váží k DNA jako monomery a aktivují transkripci jejich cílových genů, většina ostatních nukleárních receptorů se váže jako homodimery nebo heterodimery vazbou k retinoidnímu X receptoru (RXR). Mezi cytoplazmatické steroidní receptory patří glukokortikoidní receptor (GR), estrogenní receptor (ER), androgenní receptor (AR), mineralokortikoidní receptor (MR) a progesteronový receptor (PR), tyto jsou aktivní jako homodimery a při navázání ligandu jsou translokovány z cytoplazmy. Mezi RXR heterodimerické patří receptor thyroidních hormonů (TRα,β), vitamin D receptor (VDR), ekdysonový receptor (EcR), receptory aktivované peroxyzomovým proliferátorem (PPARs), FXR (farnesoidní X receptor), LXR (jaterní X receptor), CAR (konstitutivní androstanový receptor) a receptor kyseliny retinové (RXR), které váží transkripční elementy jako heterodimery s RXR a zůstávají v jádře bez 8

10 ohledu na přítomnost ligandů. Je několik orfanových nukleárních receptorů, při jejichž identifikaci nebyly známy jejich fyziologické ligandy. Homodimerní ofranové receptory jsou RXRα,β,γ, hepatocytární nukleární faktor 4 (HNF-4) α,β,γ, transkripční faktor hormonálních jaderných receptorů (COUP-TF chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor ), GCNF ( germ cell nuclear factor ), PNR, TR2,4. Monomerní orfanové receptory jsou RORα,β,γ, ERRα,β,γ, TLX, NURR 1,77, NOR1, SF-1 (steroidogenní faktor 1), SXR (steroidní a xenobiotický receptor, také znám jako PXR, pregnanový X receptor). A orfanové receptory, které postrádají DBD (DNA vaznou doménu), jsou DAX (NR0B1) orfanový receptor a malý heterodimerní partner (SHP) (Seethala et Zhang, 2009) Ligandy nukleárních receptorů Protože jsou nukleární receptory důležitými cíly výzkumu léčiv, vyústily v objevení ligandů, které modulují aktivitu těchto receptorů. Ligandy nukleárních receptorů mohou být klasifikovány jako přírodní ligandy a syntetické ligandy. Přírodní ligandy nukleárních receptorů jsou například 17-β-estradiol pro estrogenní receptor, testosteron pro androgenní receptor (AR), progesteron pro progesteronový receptor (PR), kortisol pro glukokortikoidní receptor (GR), aldosteron pro mineralokortikoidní receptor (MR), tretinoin (kyselina all-transretinová) pro receptor kyseliny retinové, a L-3,5,3 - L -trijodothyronin (T3) pro thyroidní receptor (TR), a 1,25-dihydroxyvitamin D3 pro vitamin D receptor (VDR). Tyto přírodní ligandy jsou malé, rigidní a hydrofobní molekuly, které snadno difundují přes buněčné membrány. Ligandé (agonisté a antagonisté, kteří buď aktivují nebo potlačují transkripci v transientních reportérových genových esejích) nukleárních receptorů jsou používány v mnoha důležitých klinických oblastech v léčbě onemocnění jako např. v léčbě rakoviny, zánětu, metabolického syndromu (diabetu, dyslipidémie), atherosklerózy a osteoporózy. Ačkoliv tyto nukleární receptory mohou mít také za následek vedlejší účinky, které limitují využití těchto léčiv. Některé ligandy působí jako agonisté v určitých tkáních a jako antagonisté v tkáních jiných. Některé další ligandy se mohou vázat na nukleární receptory jako parciální (nebo smíšení) agonisté (nebo antagonisté) s nižší afinitou než plní agonisté a indukovat jedinečné konformační změny receptorů, které mají za 9

11 následek specifické biologické odpovědi. Schopnost selektivně modulovat receptory v různých tkáních vedlo k výzkumu selektivních nukleárních receptorů, jakými jsou selektivní modulátory estrogenových receptorů (SERMs), selektivní modulátory androgenových receptorů (SARMs), selektivní modulátory jaterního X receptoru (SLRMs), modulátory peroxisomového proliferátorem aktivovaného receptoru (PPAR) a selektivní modulátory thyroidního receptoru (STMs). Tyto současně činí nukleové receptory atraktivními cíly pro výzkum léčiv (Seethala et Zhang, 2009) Orfanové nukleární receptory Molekulární klonování identifikovalo několik orfanových (také tzv. sirotčích) receptorů sdílejících podobnou strukturu jako nukleární receptory. Ačkoliv přírodní ligandy pro tyto orfanové receptory v současnosti nejsou známy. Identifikace nových ligandů pro orfanové nukleární receptory povede k objevení nových léčiv. 9-cis-retinová kyselina se váže a aktivuje na tři nukleové receptory, které byly původně klasifikovány jako orfanové receptory a později pojmenovány jako receptory retinové kyseliny (RARs). Podobně fyziologické ligandy dalších orfanových nukleárních receptorů nebyly dříve identifikovány, ale hrají důležitou roli ve výzkumu léčiv v rámci PPARγ (peroxisomový proliferátorem aktivovaný receptor) v adipogenezi a pro objevení thiazolidindionových ligandů pro léčbu diabetu melitu 2. typu a při regulaci metabolismu cholesterolu prostřednictvím receptoru SF-1, LXRα a farnesoidního X receptoru (FXR) (Seethala et Zhang, 2009). 10

12 Převzato z: Nukleární receptory (2008) Obr. 1. Společná struktura jaderných hormonálních receptorů a schematické znázornění dimerizace nukleárních receptorů. A: Jaderný receptor je aktivován v N- terminální oblasti (AF-1). DNA vazná doména (DBD) sestává z dvou zinkových prstů (ZF), dále následuje nekonzervovaná ( hinge ) závěsná oblast, doména pro vazbu ligandu (LBD) a C- terminální helix AF-2. B: Vlevo je zobrazen homodimerní endokrinní receptor ( palindrome HRE palindromatické hormonálně responsivní elementy), vprostřed RXR heterodimery ( direct repeat HRE ), a vpravo pak monomerní orfanový receptor ( half site HRE ) (Pascual et al., 2001; Nukleární receptory, 2008). 11

13 Převzato z: Nukleární receptory (2008) Obr. 2. Schematické znázornění aktivace nukleárního receptoru. Obrázek vlevo nahoře znázorňuje represivní komplex nukleárního receptoru s histondeacetylázou (HDAC) přes korepresor NCOR (korepresor nukleárního receptoru nuclear receptor CoRepressor ) či SMRT (korepresor pro retinoidní a thyroidní receptory silencing mediator for retinoic acid receptor and thyroid hormone receptor ) pokud není přítomen ligand. Za přítomnosti ligandu se ligand naváže a tím indukuje disociaci korepresorů, čímž může dojít k navázání koaktivátorů (histonacetyltransferázy a dalších) a komplexů, které remodelují chromatin. Některé nukleární receptory jsou aktivovány nezávisle na přítomnosti ligandu navázáním koaktivátoru PGC-1 (koaktivátor 1α receptoru pro peroxisomový proliferátor peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α ) a následným navázáním dalších koaktivátorů (Pascual et al., 2001; Nukleární receptory, 2008) 12

14 4.2. Farnesoidní X receptor (FXR) Původně nazývaný RXR interagující protein 14 (RIP14), farnesoidní X receptor (FXR) byl přejmenován po nalezení schopnosti jeho potkaní formy vázat suprafyziologické koncentrace farnesolu. V roce 1999 bylo demonstrováno, že primární žlučové kyseliny jsou endogenními ligandy FXR a FXR byl deorphanizován (Makishima et al. 1999). FXR se také někdy říká receptor žlučových kyselin (BAR). Exprese farnesoidního X receptoru byla detekována v játrech, v ledvinách, ve střevě a v kůře nadledvin (Moschetta et al., 2010). Jsou známy dva FXR geny a tyto jsou označeny jako FXRα (NR1H4) a FXRβ (NR1H5). FXRβ je pseudogen u lidí, zatímco je exprimován u hlodavců, králíků a psů. FXR je senzor lanosterolu, ačkoliv jeho fyziologické funkce se zjišťují. Gen FXRα je konzervován od ryb po člověka, přičemž u člověka a u myší je FXRα vysoce exprimován v játrech, ve střevě, ledvinách a nadledvinách, zatímco nízká exprese byla detekována v srdeční a tukové tkáni. Gen FXRα je mapován lidským chromozómem 12q23.1 a myším chromozómem 10c.2 a je složen z 11 exonů a 10 intronů. FXRα kóduje čtyři transkripční izoformy u lidí i u myší, FXRα1 (RIP14-2), FXRα2, FXRα3 a FXRα4 (RIP14-1). Na rozdíl od FXRα2 a FXRα4, transkripty FXRα1 a FXRα3 obsahují čtyři aminokyseliny (MYTG) přiléhající k DNA-vazebné doméně (DBD) v oblasti označované jako hinge domain závěsná doména. Čtyři izoformy FXRα jsou exprimovány v tkáňově specifickém množství a několik FXRα cílových genů jsou regulovány v závislosti na množství izoforem. FXRα1 a FXRα2 jsou slabě exprimovány v nadledvinách a ve střevě, slabě v ledvinách a v nízkých hladinách v duodenu a jejunu. Některé geny, jako protein vázající žlučové kyseliny ve střevě (IBABP) a fibroblastový růstový faktor 19 (FGF19) více odpovídají izoformám FXRα2 a FXRα4 (které postrádají motiv MYTG), než izoformám FXRα1 a FXRα3 (Moschetta et al., 2010). Jako členové nadrodiny nukleárních receptorů, čtyři proteiny FXRα kódovány genem FXRα představují typickou strukturu nukleových receptorů organizovaných do vysoce konzervované DNA-vázající domény (DBD), slabě konzervované N- terminální domény a mírně konzervované C-terminální ligand vázající domény. Při absenci žlučových kyselin je FXR umístěn na pozici HRE svých cílových genů jako 13

15 heterodimer s obligátním partnerem RXR, ve spojení s korepresorovými proteiny. Heterodimer FXR/RXR váže zejména invertovaná opakování IR1 (dva základní AGGTCA invertovaná opakování s jedním nukleotidem) a může být aktivován buď prostřednictvím FXR nebo RXR specifických ligandů. Vazba ligandu indukuje konformační změny FXR, které způsobí uvolnění korepresorových proteinů jako je NCor (jaderný korepresor 1) a navázání koaktivátorových proteinů jako je steroidní receptorový koaktivátor 1 (SRC-1), PGC1α, CARM-1, PMRT-1 a DRIP-205. C- terminální oblast FXR obsahuje na ligandu závislou transaktivační doménu, AF2, která s transaktivační doménou nezávislou na ligandu, AF1, v N-terminální oblasti, interaguje s koregulačními proteiny. LBD doména FXR obsahuje hydrofobní Převzato z: Lefebvre et al. (2009) Obr. 3. Struktura a transkripty myšího FXRα genu. A: Podobnost lidského FXRα genu (mapovaného chromozomem 12 (q23.1)) a myšího FXRα genu (mapovaného chromozomem 10 (qc2)) je charakterizována 11 exony a dvěma odlišnými promotory, které iniciují transkripci buď z exonu 1 nebo z exonu 3. B: Čtyři rozličné transkripty, FXRα1, FXRα2, FXRα3, FXRα4 jsou generovány ze stejného genu jako konsekvence alternativního sestřihu (splicingu) exonu 5 prekurzorové mrna (pre-mrna) a použití dvou různých promotorů. C: Mediátorová RNA (mrna) kódující každou z izoforem FXRα. Sekvence ATG znázorňuje start translace. V modré je vyznačen alternativní splicing 12 bp exonu 5, které kódují motiv MYTG ve skrytém hinge regionu. D: Struktury proteinů FXR. Na schématu je označena doména A/B, C (DNA vazebná doména), D (skrytý region) a doména E (vazba ligandu) (Lefebvre et al., 2009; Moschetta et al., 2010). 14

16 kapsu, která váže lipofilní molekuly jako jsou žlučové kyseliny (Moschetta et al., 2010). Převzato z: Moschetta et al. (2010) Obr. 4. Příklady konvenčních sekvencí FXRE. FXRα se při navázání ligandu váže k FXR responzivním elementům (FXRE) svých cílových genů jako heterodimer s RXR (Moschetta et al., 2010). Převzato z: Calkin et Tontonoz (2013) Obr. 5. Schématické znázornění mechanismu účinku FXR. Farnesoidní X receptor (FXR) tvoří heterodimer s RXR a váže se k FXR responzivnímu elementu (FXRE), který je typicky inverzním opakováním tvořeným jedním nukleotidem (IR1), ve svých cílových genech, aby indukoval genovou expresi. AF doména je funkční aktivační doménou; C-konec je karboxy-konec; N-konec je amino-konec (Calkin et Tontonoz, 2013). 15

17 4.3. Metabolická funkce FXR Farnesoidní X receptor je senzorem xenobiotik a endobiotik a reguluje fázi I (oxidaci), fázi II (konjugaci) a fázi III (transport) metabolismu žlučových kyselin a léčiv v zažívacím systému. FXR má tedy důležitou roli v regulaci lipidového, glukózového, energetického a lékového metabolismu. FXR je aktivován primárními a sekundárními žlučovými kyselinami. Metabolismus žlučových kyselin je spřažen s lékovým metabolismem a reguluje absorpci, transport a metabolismus živin a léků, takto řídí metabolickou homeostázu (Tiangang and Chiang, 2013). Tyto rozličné účinky jsou zprostředkovány interakcí žlučových kyselin s membránovými proteiny či s intracelulárními proteiny zahrnujícími FXR (Lefebvre et al., 2014). Děje spojené s metabolismem žlučových kyselin také chrání před poškozením jater, zánětem a spřaženými metabolickými onemocněními, jako jsou nealkoholická steatóza jater, diabetes, a obezita (Tiangang and Chiang, 2013). Ve většině preklinických modelů intra- a extrahepatické cholestázy, aktivace FXR indukuje příznivé adaptační odpovědi k akumulaci žlučových kyselin. FXR je exprimován v játrech, ve kterých reguluje žlučové kyseliny, mastné kyseliny, lipoproteiny a glukózový metabolizmus. FXR je také přítomen v několika dalších tkáních, jako je střevo, ve kterém reguluje reabsorpci žlučových kyselin, a takto působí jako klíčový regulátor enterohepatického cyklu žlučových kyselin. Homeostáza žlučových kyselin závisí zejména na ileální ose FXR-FGF19/15-FGFR4-SHP (Lefebvre et al., 2014). FXR je také klíčový pro udržování vrozených imunitních odpovědí ve střevě. Deficit FXR u myší má za následek zvýšenou cholestázu, nealkoholickou steatózu (NAFLD), hepatocelulární karcinom a rakovinu střeva. Předpokládá se, že by FXR a signální dráhy FXR mohly být slibným cílem léčiv v léčbě metabolických onemocnění. Užívání syntetických ligandů FXR zatím nebylo terapeuticky povoleno (Guo et al., 2012). První identifikovaný cílový gen FXR zahrnutý do metabolismu žlučových kyselin byl protein vázající žlučové kyseliny ve střevě I-BABP (Grober et al., 1999). Dalším důležitým genem regulovaným FXR je enzym CYP7A1. Žlučové kyseliny působí represi genu CYP7A1, tímto mechanismem je snižována syntéza 16

18 žlučových kyselin v játrech v odpověď na zvýšení hladin žlučových kyselin a tedy udržování konstantních hladin žlučových kyselin. FXR je klíčovým mediátorem v tomto zpětnovazebném inhibičním mechanismu. Nejprve bylo objeveno, že jaterní FXR indukuje SHP (malý heterodimerní partner) nukleární receptor, který interaguje a potlačuje transkripční aktivátor LRH- 1 (jaterní receptorový homolog 1), který se váže k CYP7A1 genovému promotoru, a tedy inhibuje transkripci genu CYP7A1 (Goodwin et al., 2000). FXR dále indukuje intestinální fibroblastový růstový faktor 15 (FGF15), který působí jako endokrinní faktor pro potlačení genové transkripce CYP7A1 v hepatocytech (Inagaki et al., 2005). FGF19 je lidským orthologem myšího FGF15 a potlačuje expresi CYP7A1 a syntézu žlučových kyselin v lidských hepatocytech. FGF19 mrna a protein jsou detekovatelné v lidských játrech a hepatocytech. FGF19 se rovněž nachází v krevní cirkulaci člověka. Hromadění žlučových kyselin v lidských játrech může vést spíše k indukci signální dráhy FXR/FGF19, nežli k potlačení CYP7A1 v autokrinní regulací. FGF19 je vysoce exprimován v lidském žlučníku a v biliárním traktu a lidská žluč obsahuje vysoké hladiny sekretovaného FGF19, což naznačuje možnou důležitou funkci FGF19 v biliárním traktu. Významnost signalizace myšího FGF15 v hepatobiliárním transportu žlučových kyselin a jiných organických sloučenin je nadále zkoumána. FGF15 potlačuje jaterní lipo- a glukoneogenezi, stejně tak jako stimuluje jaterní syntézu glykogenu a proteinů (Tiangang and Chiang, 2013). 17

19 Převzato z: Moschetta et al. (2010) Obr. 6. Regulace metabolismu žlučových kyselin prostřednictvím FXR. Žlučové kyseliny recirkulují v enterohepatickém systému a aktivují jaterní a instestinální FXR, tím regulují geny důležé pro metabolismus žlučových kyselin. Jaterní FXR potlačuje syntézu žlučových kyselin prostřednictvím redukce exprese CYP7A1 a CYP8B1 prostřednictvím SHP a účinně podporuje konjugaci žlučových kyselin s taurinem nebo s glycinem přes BACS (koenzym A syntázu žlučových kyselin) a BAAT (enzym žlučové kyseliny-coa:n-acetyltransferáza aminokyselin, kódovaný genem BAAT). Enzym BACS aktivuje žlučové kyseliny přeměnou na CoA-thioestery a tyto se stanou substrátem pro enzym BAAT, který je zodpovědný 18

20 za jejich konjugaci s glycinem nebo taurinem (Solaas et al., 2000). Konjugované žlučové kyseliny jsou silným přírodním aktivátorem FXR, který pozitivně reguluje expresi enzymů BACS a BAAT (Parks et al., 1999; Pircher et al., 2003). FXR reguluje sekreci žlučových kyselin v tenkém střevě prostřednictvím upregulace exprece ABC transportérů jako jsou MRP2, BSEP a MDR3/Mdr2. Zatímco konjugované žlučové kyseliny jsou na luminální membráně ASBT dopraveny do bazolaterální membrány ileálních enterocytů prostřednictvím cytosolového transportéru IBABP, následně jsou sekretovány do portální krve přes transportér OSTα/β, aby cestovaly zpět do jater, dále pokračovaly transportérem NTCP (který je potlačen prostřednictvím FXR) a aby dokonaly enterohepatickou cirkulaci. Aktivace FXR prostřednictvím žlučových kyselin také indukuje FGF19/15, hormon, který je sekretován do portální cirkulace a skrze FGFR4 dochází k potlačení exprese CYP7A1. V průběhu cholestázy, když žlučové kyseliny dosáhnou vysokých hladin v játrech, FXR také indukuje OSTα/β, aby se žlučové kyseliny mohly transportovat z jater do systémové cirkulace, aby mohly být eliminovány močí. Za těchto patologických podmínek FXR také indukuje fázi I (CYP3A4/Cyp3a11) a fázi II (SULT2A1 a UGTB4), aby přeměnil žlučové kyseliny více hydrofilní a méně toxické molekuly, které jsou účinně exkretovány (Moschetta et al., 2010). 19

21 Převzato z: Moschetta et al. (2010) Obr. 7. Regulace lipidového metabolismu prostřednictvím FXR. Potlačením CYP7A1 a CYP8B1 přes SHP a FGF19 je aktivován FXR a toto může vyústit akumulací jaterního cholesterolu. Aktivace FXR v játrech má za následek zvýšenou expresi PLPT pro transport fosfolipidů a cholesterolu z LDL na HDL, SRB1 slouží jaternímu absorpci uptake HDL a lipoproteinů ApoE, ApoC-I a ApoC-IV. Aktivace FXR také vede k potlačení jaterní lipogeneze prostřednictvím redukce exprese SREBP1-c v závislosti na SHP. SREBP1-c indukuje expresi klíčových genů syntézy mastných kyselin a lipogeneze, jako jsou AceCS, FAS, ACC a GPAT. Při zvýšení exprese PPARα, FXR také podporuje katabolismus FFA přes β-oxidaci. Při potlačení exprese MTP (enzymu, který reguluje dodávku VLDL) FXR redukuje tvorbu VLDL. Aktivace FXR zvyšuje clearance TG podpořením aktivity PLP přes indukci ApoC-II a zvýšením exprese upregulací VLDL-R a syndecanu-1 pro vychytávání LDL a IDL. Aktivace FXR také redukuje clearance TG snížením exprese ApoC-III a ANGPTL3 (dvou inhibitorů PLP) (Moschetta et al., 2010). 20

22 Převzato z: Moschetta et al. (2010) Obr. 8. Glukózový metabolismus regulován prostřednictvím FXR. Aktivace jaterního FXR může zvýšit inzulinovou senzitivitu nejen v játrech, ale také v periferních tkáních (skeletální svalstvo a tuková tkáň) snížením hladin triglyceridů a FFA (volných mastných kyselin). Vysoké hladiny cirkulujících triglyceridů a volných mastných kyselin mohou zhoršit inzulinovou signalizaci a snížit inzulinovou sekreci pankreatu, což je fenomén známý jako lipotoxicita. Zvýšená inzulinová senzitivita prostřednictvím oslabení lipotoxicity a doprovodná aktivace FXR mají za následek zvýšenou syntézu glykogenu a sníženou glukoneogenezi, dva žádané děje při regulaci diabetu. Aktivace FXR indukuje expresi GSKα, a tímto podněcuje syntézu glykogenu a potlačuje tři klíčové enzymy zahrnuté v glukoneogenezi (PEPCK, FBP1 a glukóza-6-fosfatázu) v závislosti na SHP. Avšak indukce PEPCK po expozici FXR agonisty byla též zaznamenána. Glukóza a inzulin zvyšují expresi FXR (Moschetta et al., 2010). 21

23 4.4. Ligandy FXR FXR transkripční aktivita je regulována prostřednictvím ligandem regulovaných, dynamických interakcí s nukleovými receptory koregulátory, které mohou vykázat buď koaktivující nebo korepresující aktivity. In vitro studie demonstrovaly roli pro PPARγ-koaktivátoru (PGC-1α) a pro arginin-methyl transferázy PRMT1 a CARM1, stejně tak jako DRIP205/Med1 v rámci koaktivace FXR. FXR aktivita je senzitivní k extracelulárním signálům skrze posttranslační modifikace, která modifikuje jejich schopnost transaktivovat cílové geny (Lefebvre et al., 2014) Endogenní ligandy FXR byl rozpoznán za klíčový cíl žlučových kyselin v roce Kyselina cholová (CA), deoxycholová kys. (DCA) a litocholová kys. (LCA), primární chenodeoxycholová kyselina (CDCA) představují nejsilnější endogenní FXR ligandy s EC 50 hodnotami mezi 10 a 50 µm (Rollinger et al., 2011). V publikacích z roku 2011 významnost FXR jako receptoru aktivovaného žlučovými kyselinami byla objasněna s ohledem na léčbu aterosklerózy a její opačnou regulační roli v imunitě a zánětu. Agonisté FXR mají prospěšné účinky na modulaci lipidů a glukózy, stejně tak jako na hepatobiliární a gastrointestinální onemocnění. FXR na jednu stranu hraje regulační roli v mnoha endogenních signálních drahách a na druhou stranu charakterizace jeho aktivní strany je dobře charakterizována. Tato fakta přispívají k atraktivitě tohoto nukleárního receptoru jako nového potenciálního cíle pro léčiva při hledání inovativních agens s příznivými účinky v prevenci a léčbě např. metabolického syndromu, dyslipidémie, atherosklerózy a diabetu mellitu 2. typu (Rollinger et al., 2011) Žlučové kyseliny Žlučové kyseliny jsou fyziologické detergenty, které hrají důležitou roli při usnadnění hepatobiliární sekrece endogenních a xenobiotických metabolitů, stejně jako při intestinální absorpci potravních tuků, vitamínů rozpustných v tucích a léčiv. 22

24 Žlučové kyseliny jsou rovněž signálními molekulami, které regulují jaterní metabolismus a dispozici léku. Proto je udržování homeostázy žlučových kyselin důležité pro jaterní metabolickou funkci. Abnormální metabolismus žlučových kyselin má za následek cholestatická jaterní onemocnění, steatotické jaterní onemocnění, dyslipidémii, diabetes, obezitu a kardiovaskulární onemocnění (Tiangang and Chiang, 2013). Žlučové kyseliny jsou emulgátory lipidů, jsou také důležitými regulátory metabolismu cholesterolu, žlučových kyselin, trygliceridů a glukózy, a také regulátory mnoha signálních drah (Lefebvre et al., 2014). Syntézu žlučových kyselin si lze představit jako složitou signální dráhu zahrnující tři hydroxylační reakce katalyzované monooxygenázami cytochromu P450, epimerizací, izomerizací a oxidačně štěpnými reakcemi. Žlučové kyseliny jsou syntetizovány z cholesterolu výhradně v játrech, přičemž kyselina cholová a kyselina deoxycholová jsou dvě hlavní primární žlučové kyseliny syntetizované v lidských játrech. Více než 90% žlučových kyselin je syntetizováno prostřednictvím klasické signální dráhy a je produkováno přibližně stejné množství kyseliny cholové a kyseliny chenodeoxycholové (Tiangang and Chiang, 2013). Žlučové kyseliny vykazují genomický a negenomický efekt při interakci s membránovými receptory spřaženými s G proteinem, mezi které patří receptor žlučových kyselin GP-BAR1 a nukleární receptory, jako je farnesoid X receptor (FXR). Tyto receptory regulují překrývající se metabolické funkce. Při stupňování biologické odpovědi duální agonisté receptorů GP-BAR1/FXR představují inovativní strategii pro léčbu enteroendokrinních onemocnění (Limongelli et al., 2014). 23

25 Převzato z: Moschetta et al. (2010) Obr. 9. Struktura a hydrofobní/hydrofilní profil nejčastějších žlučových kyselin. Kyselina cholová (CA) a chenodeoxycholová (CDCA) jsou primárními žlučovými kyselinami. Deoxycholová kyselina (DCA) a litocholová kyselina (LCA) jsou sekundárními žlučovými kyselinami. Ursodeoxycholová kyselina (UDCA) je primární žlučová kyselina převážně produkovaná u medvědů. Hydroxylové skupiny, které mají α-orientaci, jsou umístěny pod steroidním jádrem a mají axiální polohu k rovině steroidního jádra. Hydroxylové skupiny, které mají β-orientaci jsou lokalizovány nad steroidním jádrem a jsou ekvatoriální k rovině steroidního jádra. Hydrofobicita vzrůstá následovně: UDCA, CA, CDCA, DCA LCA (Moschetta et al., 2010). 24

26 Přírodní ligandy Bylo zjištěno, že přírodní produkty regulující nukleární receptory zaujímají důležitou roli jako slibní kandidáti pro vývoj léčiv. Co se týče FXR nukleárního receptoru, nejvíce jsou prozkoumány stereoizomery E- a Z-guggulsteron, bioaktivní konstituenty z korové pryskyřice stonku z rostliny Commiphora mukul (Burseraceae), která je používaná v ayurvédské medicíně v léčbě lipidových onemocnění a obesity. Pregnanové deriváty E- a Z-guggulsteron, jak bylo sledováno u myšího modelu, působí jako antagonisté FXR, kteří regulují expresi podmnožiny cílových genů. Úsilí objevit způsob působení těchto cholesterol snižujících sloučenin odhalil FXR-antagonismus prostřednictvím potlačení exprese BSEP a zvýšení exprese (upregulace) CYP7A1. Ačkoliv, tento mechanismus je kombinován se schopností dominantně zvyšovat transaktivaci BSEP, což nepřímo vede k FXR-agonistickému účinku (Rollinger et al., 2011). Několik studií také popisuje interakci E- a Z-guggulsteronu s dalšími nukleárními receptory jako je, např. androgenní receptor (AR), estrogenní receptor (ERα), glukokortikoidní receptor (GR), mineralokortikoidní receptor (MR), progesteronový receptor (PR) a pregnanový X receptor (PXR). Navíc guggulsteron inhibuje genovou expresi inos a COX-2, mechanismus, který je předpokládán účastnit se inhibice NF-κB aktivace (Rollinger et al., 2011). Převzato z: PhytoLab (2012) Obr. 10. Struktura Z-guggulsteronu, přírodního ligandu FXR. 25

27 FXR antagonismus je předpokládán pro sesterterpeny založené na skalaranové struktuře izolované z mořské houby rodu Spongia (Nam SJ et al., 2007). Xanthohumol, prenylovaný chalkon, derivovaný z Humulus lupulus (Cannabaceae) a extrakty z dvou tradičních Čínských rostlin Salvia miltiorrhiza (Lamiaceae) a Panax notoginseng (Araliaceae) jsou příklady demonstrující FXRindukující aktivitu (Rollinger et al., 2011). Plodnice houby Ganoderma lucidum Karst. (reishi v Japonsku nebo língzhī v Číně) z rodiny Ganodermataceae, jsou široce používány v Asijské tradiční medicíně pro více než 2000 let. Farmakologické účinky jsou hlavně způsobené triterpeny a polysacharidy. Přes 200 triterpenů, hlavně definovaných s nesaturovaným lanostanovým skeletem, byly izolovány z G. lucidum a z rodu Ganoderma (Rollinger et al., 2011). Ve studii Rollingera et al. (2011) byla demonstrována aplikace silico nástrojů pro identifikaci přírodních produktů, jmenovitě Ganoderma triterpeny lanostanového typu jako potenciální agonisté FXR. Tyto výsledky by mohly být v úzkém vztahu se známými hypolipidemickými a protizánětlivými účinky objevených medicinálních hub (Rollinger et al., 2011). Cílem studie skupiny Guo et al. (2012) bylo hledání FXR modulátorů v rostlině čajovníku. Čaj je tradiční medicinální rostlina a je také nejvíce konzumovaný nápoj na světě, jen druhý po vodě. Nejčastěji konzumovaný čaj je černý čaj, zelený čaj a oolong čaj. Tyto čaje jsou derivovány z rostliny Camellia sinensis, která je členem čeledi čajovníkovité (Theaceae). Epidemiologické studie a studie na zvířatech naznačují, že pití zeleného čaje nabízí ochranu proti kardiovaskulárním onemocněním a proti rakovině (žaludku, jater, tenkého a tlustého střeva, prsních žláz, ezofagu a dutiny ústní). Katechiny jsou polyfenolické sloučeniny a jsou třídou hlavních chemických sloučenin nalezených v čaji. Příklady katechinů v čaji jsou (-)-epigallokatechin-3-galát (EGCG), (-)-epigalokatechin (EGC), (-)-epikatechin-3-galát (ECG) a (-)-epikatechin (EC). EGCG je hlavní složka a nejvíce biologicky aktivní katechin v zeleném čaji. Počet studií uvádí, že EGCG snižuje oxidační stres, atherosklerózu, zánět a cholesterol. Ačkoliv nebyla uvedena zpráva o účinku čajových sloučenin na aktivitu FXR. Proto si skupina Guo et al. (2012) dala za cíl zjistit účinek čajových katechinů, zejména EGCG, na ovlivnění aktivity FXR (Guo et al., 2012). 26

28 Převzato z: Li et al. (2012) Obr. 11. Chemická struktura čajových katechinů EGCG, EGC a ECG (Li et al., 2012). Extrakty z různých čajových vodných extraktů byly použity pro screening modulátorů FXR pomocí luciferázové eseje. Většina ze syrových extraktů aktivovala FXR, ale aktivace FXR byla slabá. Hlavními aktivními komponentami v čaji byly polyfenoly s EGCG jako hlavní komponenta následovaná EGC, ECG a EC. Guo et al. (2012) také testoval dvě chemické úpravy přírodních polyfenolů, A007 (ECG + EGC) a A009 (EGC + EGCG), aby určil, zda kombinace čistých čajových sloučenin aktivuje FXR. Tyto směsi obsahovaly ekvimolární koncentraci každé čajové sloučeniny. Porovnáno s kontrolou (vehikulem), A007 a A009, oba aktivovali FXR 2,6 až 4,8 násobně při koncentracích 10 µm a 100 µm (Guo et al., 2012). 27

29 Odpověď na dávku EGCG, EGC a ECG v rámci aktivace FXR byla stanovena luciferázovou esejí za užití vzrůstajících koncentrací EGCG, EGC nebo ECG (0,01; 0,1; 1; 10 a 100 µm). Všechny tři chemické sloučeniny zvýšily v závislosti na dávce luciferázovou aktivitu, EGCG > EGC = ECG. Maximální odpovědi bylo dosaženo při 10 µm s přibližným 7 až 9-ti násobným zvýšením luciferázové aktivity. EC 50 EGCG pro aktivaci FXR byla 2,99 µm. EGCG aktivoval FXR specificky, neboť jiné nukleární receptory včetně pregnanového X receptoru (PXR), konstitutivního androstanového receptoru (CAR), vitamín D receptoru (VDR), retinoidního X receptoru alfa (RXRα) a receptoru beta kyseliny retinové (RXRβ) nebyly aktivovány prostřednictvím EGCG (Guo et al., 2012). Autoři dále studovali, zda EGCG, EGC a ECG indukují genovou expresi klasických cílových genů FXR SHP, OSTα a BSEP v HepG2 buňkách. Exprese těchto genů je regulovaná při aktivaci FXR prostřednictvím přímé vazby FXR k jejich genovým regulačním oblastem. Podobně jako pozitivní kontrola GW4064 také všechny tři katechiny zvýšily hladiny SHP mrna a BSEP mrna při 10 µm, ale nezvýšily hladiny OSTα mrna (Guo et al., 2012). Aby bylo možné dále potvrdit, že je EGCG aktivátor FXR s antagonistickými účinky k dalším agonistům FXR, byly určeny účinky EGCG na expresi cílových genů FXR v přítomnosti GW4064 nebo CDCA měřením hladin mrna u HepG2, Hep3B a Huh7 buněk. GW4064 a CDCA silně indukovaly expresi mrna cílový genů FXR ve všech třech buněčných liniích. Když byly buňky léčeny společně se zvyšujícími se koncentracemi EGCG a GW4064 nebo CDCA, mrna hladiny cílových genů FXR, OSTβ a BSEP, byly sníženy v závislosti na dávce u HepG2 buněk v porovnání s léčbou GW4064 nebo CDCA samotnými. OSTβ byl v závislosti na dávce snížen u Hep3B a Huh7 buněk. FXR a jeho cílové geny SHP, OSTα, OSTβ a BSEP byly všechny sníženy při současné léčbě 100 µm EGCG a GW4064 nebo CDCA u HepG2 buněk. Podobné výsledky byly také nalezeny u Hep3B a Huh7 buněk (Guo et al., 2012). U WT a FXR-KO myší byla zjištěna aktivace FXR v játrech a v tenkém střevě prostřednictvím akutní léčby EGCG. Vyšší koncentrace EGCG jsou známé jako hepatotoxické, proto skupina Gua et al. (2012) použila nižší koncentrace EGCG, aby zabránila jaterní toxicitě. Nedošlo ke změně sérové aktivity ALT při léčbě 28

30 EGCG, což potvrdilo, že nedošlo k jaterní toxicitě při zvolené dávce EGCG. Léčba EGCG podaná intraperitoneálně (i.p.) nebo perorálně (p.o.) nezměnila hladiny exprese mrna cílových genů FXR SHP, BSEP nebo CYP7A1 v játrech. Naopak, intraperitoneální podání EGCG zvýšilo SHP mrna hladiny dvojnásobně, perorální podání EGCG indukovalo mrna hladiny SHP dvanáctinásobně a FGF15 dvojnásobně v tenkém střevě WT myší, ale ne u FXR-KO myší. Naneštěstí léčba syntetickými agonisty GW4064, která silně indukuje expresi všech cílových genů FXR ve střevě, EGCG selektivně indukoval expresi SHP a FGF15, ale ne IBABP. V ledvinách nezměnilo expresi hladin FXR mrna nebo jeho cílového genu SHP ani intraperitoneální podání ani perorální podání (Guo et al., 2012) Syntetické ligandy Několik syntetických ligandů FXR, kterými jsou GW-4064, 6-ECDCA, AGN-29 a AGN-31 bylo vytvořeno pro biomolekulární výzkumy. Již mohlo být ukázáno, že syntetičtí agonisté FXR chrání proti rozvoji tvorby aortálních plaků v myšších modelech charakterizováno proatherogením lipoproteinovým profilem a akcelerovanou aterosklerózou (Schuster et al., 2011). Bylo vyvinuto několik syntetických ligandů FXR odvozených od steroidů, jako např. 6-ethylchenodeoxycholová kyselina (6-ECDCA; INT-747), a nesteroidního původu, jako např. GW4064, AGN29 a AGN31. Pro identifikaci steroidních ligandů FXR byly vyvinuty deriváty žlučových kyselin pro zkoumání vztahů mezi jejich strukturou a aktivitou. Nejsilnější orálně podávaný steroidní agonista FXR 6-ECDCA (INT-747) by mohl vstoupit do klinické studie pro pacienty s diabetem mellitus 2. typu, pacientů s nealkoholickou steatózou (NAFLD) a primární biliární cirhózou. Další klinické zkoušky zahrnují steroidní ligandy FXR chenodeoxycholovou kyselinu a ursodeoxycholovou kyselinu (UDCA) (Rollinger et al., 2011). Intenzivně jsou studovány nesteroidní agonisté FXR, zvláště GW4064. Současné přístupy vedou k tvorbě účinnějších analogů GW4064 přemístěním stilbenové dvojné vazby oxymethylenovým nebo amino-methylenovým spojovacím 29

31 článkem připojujícím terminální benzoovou kyselinu se substituovaným heteroarylem uprostřed kruhu. Screening odhalil novou třídu agonistů FXR, kterou jsou benzimidazolové deriváty a azepino(4,5-b)indolové deriváty (Rollinger et al., 2011). 4-{(S)-2-[2-(4-chloro-phenyl)-5,6-difluoro-benzoimidazol-1-yl]-2-cyklohexylacetylamino}-3-fluoro-benzoová kyselina, látka benzimidazolové struktury, je velmi silným a selektivním agonistou FXR vykazující výtečné fyzikálněchemické a ADME vlastnosti a po orálním podání snižuje aktivitu lipidů u myší, kterým chybí LDL receptor (Richter et al., 2011). Farmakologické aktivátory AMPK, kam patří metformin, potlačují FXR transkripční aktivitu in vitro a in vivo. V modelu jaterního onemocnění indukovaného přetížením žlučovými kyselinami, metformin indukoval fosforylaci FXR a zvýšené plazmatické hladiny žlučových kyselin na FXR závislém množství. Metformin také zhoršil jaterní obraz v modelu chemicky indukované intrahepatické cholestázy. Výsledky studie identifikovaly AMPK jako přímého regulátora žlučovými kyselinami aktivovaného FXR (Lefebvre et al., 2014). Chronická cholestáza a hepatitida jsou dvě hlavní patofyziologické komponenty onemocnění, primární biliární cirhózy (PBC) a primární sklerotizující cholangitidy (PSC), které vedou k destrukci žlučovodu a nakonec k cirhóze a jaternímu selhání. Ursodeoxycholová kyselina, byla původně zavedena jako terapeutický přístup a působí proti komponentám PBC a PSC a vykazuje protizánětlivé a imunomodulační vlastnosti. Použití agonistů FXR a TGR5 u různých zvířecích modelů potvrdily časná pozorování naznačující, že žlučové kyseliny nejsou pouze toxikanty a inflamageny, ale také represory vrozené a získané imunity. Obeticholová kyselina kopíruje žlučové kyseliny, nemá toxické ani zánět potlačující vlastnosti, a silně aktivuje FXR proti toxickým účinkům vysokých koncentrací žlučových kyselin. Ursodeoxycholová kyselina není agonista FXR, proto její kombinace s obeticholovou kyselinou je slibná při léčbě PBC a PSC (Poupon, 2012). Nealkoholická steatóza jater (NAFLD) je vysoce prevalentní chronický jaterní stav rozvíjející se u části pacientů v nealkoholickou steatohepatitidu (NASH), která 30

32 je agresivní formou NAFLD asociovaného se zvýšenou kardiovaskulární mortalitou a signifikantním rizikem progresivního jaterního onemocnění, zahrnujícího fibrózu, cirhózu a hepatocelulární karcinom. V současnosti neexistuje žádná specifická terapie pro NASH. Studie se zabývaly použití aktivace FXR při léčbě NASH. Obeticholová kyselina (OCA; INT-747, 6α-ethyl-chenodeoxycholic acid) je semisyntetický derivát primární žlučové kyseliny u člověka, chenodeoxycholové kyseliny, jedná se o přírodního agonistu FXR první třídy (Mudaliar et al., 2013, Adorini et al., 2012). U zvířecích modelů kyselina obeticholová snižuje inzulínovou rezistenci a jaterní steatózu (Mudaliar et al., 2013). Série 29-ti oxyprenylovaných a azoprenylovaných fenylpropanoidů byly chemicky syntetizovány a testovány v transfekovaných kultivovaných HepG2 buňkách prostřednictvím duální-luciferázové eseje jako agonisté FXR receptoru, jako referenční léčivo byla použita chenodeoxycholová kyselina (CDCA). Mezi testovanými molekulami, u třech sloučenin, jmenovitě aurapten, nelumol A a nelumal A, byl ukázán potenciál srovnatelný k endogennímu ligandu, nalumal A měl aktivitu lehce vyšší než CDCA. Nelumal A je tedy zajímavý jako hodnotná potenciální nová vůdčí sloučenina při hledání FXR agonistů (Epifano et al., 2012). 31

33 Převzato z: Moschetta et al. (2010) Obr. 12. Ligandy FXR. Semisyntetickým ligandem FXR je např. 6α-ECDCA; syntetickými ligandy jsou GW4064, fexeramin, AGN-29, AGN-31, AGN-34; přírodními ligandy jsou např. Z- 4,17(20)-pregnadien-3,16-dion a E-4,17(20)-pregnadien-3,16-dion (Moschetta et al., 2010). 32

34 Studované látky Obr. 13. Schématické znázornění biosyntézy pelargonidinu, cyanidinu a delfinidinu. Převzato z: Anthocyane (2015) 33

35 Anthokyaniny Anthokyaniny jsou podskupinou flavonoidů. Jsou rostlinnými pigmenty zodpovědnými za červené, modré nebo purpurové zbarvení bobulí, grepů, jablek, červeného zelí a obilí. Jde o voděodolné sloučeniny vyskytující se v rostlinách primárně ve formě glykosidického polyhydroxylu a polymethoxylu. Anthokyaniny jsou připojené k jednomu nebo více cukerným složkám jako je glukóza, galaktóza, arabinóza, xylóza, rhamnóza a glukoronidová kyselina. Liší se počtem hydroxylových a methoxylových skupin, v pozici, kde jsou připojeny cukerné složky a v počtu alifatických a aromatických kyselin připojených k cukerným složkám v molekule. Epidemiologické studie ukazují, že potraviny obsahující anthokyaniny vykazují antioxidační, protizánětlivé účinky, účinek proti obezitě a prostřednictvím nich snižují riziko diabetu, kardiovaskulárních onemocnění, artritidy a rakoviny. Tyto doplňky jsou poskytovány v několika formách, zahrnující sušenou šťávu, sušené ovoce nebo vodné extrakty z ovoce. Hlavní zdroj pro doplňky jsou borůvky, brusinky, maliny a hroznové víno a listí. Koncentrace (obsah) anthokyaninů v jedné dávce potravních doplňků mohou být v některých případech neočekávaně vysoké. Velice vysoké koncentrace anthokyaninů jsou dosaženy v gastrointestinálním traktu a v játrech konzumenta, což může vést k interakcím potravy s léčivy (Kamenickova et al., 2013). 34

36 Anthokyanidiny Anthokyanidiny a anthokyaniny jsou přírodně se vyskytující flavonoidní sloučeniny, které jsou zodpovědné za typickou barvu (modravě-červená, oranžovo-červená, oranžová) a biologické účinky mnoha ovoce, bobulovitých plodů a zeleniny. Anthokyanidiny jsou aglykony (bezcukerná složka) anthokyaninů, které jsou konjugovány různými cukry, jako je xylóza, arabinóza, galaktóza a rhamnóza ve zmíněných sloučeninách. Nejběžněji se vyskytující anthokyanidiny ve vyšších rostlinách jsou pelargonidin, peonidin, cyanidin, malvidin, petunidin a delfinidin. Anthokyanidiny jsou uvolňovány z anthokyaninů v gastrointestinálním traktu hlavně účinkem intestinální mikroflóry. Ačkoliv biologická dostupnost anthokyaninů a anthokyanidinů je všeobecně nízká, mohou být absorbovány v gastrointestinálním traktu a byly detekovány v lidské plazmě. Anthokyaniny a anthokyanidiny mají antioxidační, protinádorový a antimutagenní vlastnosti in vivo. Lidské střevo a lidská játra jsou orgány bohaté na metabolické enzymy, které interagují s léčivy a potravními složkami (Kamenickova et al., 2013). 35

37 Převzato z: Kameníčková et al. (2013) Obr. 14. Chemická struktura anthokyanidinů. 36

38 Převzato z: Anthocyane (2015) Obr. 15. Reakce anthokyanidinů podmíněné ph-hodnotou, které vyvolávají barevné přechody Resveratrol Převzato z: Resveratrol (2015) Obr. 16. Chemická struktura resveratrolu. Resveratrol je stilbenový fytoalexin, jeho základní strukturou je trans-resveratrol (3,5,4 -trihydroxystilben), který v důsledku zvýšené teploty podléhá izomeraci na jeho méně stabilní cis-izomer. V kontextu terapeutického využití resveratrol vykazuje potíž podobnou jako u mnoha dalších potenciálních léčiv, a tím je jeho hydrofobicita, která snižuje jeho biologickou dostupnost (Neves et al., 2012; Elbarbry et al., 2015). 37

39 Převzato z: Elbarbry et al. (2015) Obr. 17. Souhrn účinků resveratrolu s potenciálními molekulárními mechanismy. 38

40 5. Experimentální část 5.1. Buněčná linie HepG2 Modelová buněčná linie HepG2 byla izolovaná biopsií z jater europoidního 15-ti letého muže s dobře diferencovaným hepatocelulárním karcinomem. Tyto buňky sekretují množství důležitých plazmatických proteinů, např. albumin, α2- makroglobulin, α1-antitrypsin, transferin a plasminogen. HepG2 je buněčná linie adherentní (přilne na dno kultivační nádoby a roste v jedné vrstvě), epiteliální morfologie (General Cell Collection: HepG2 2014, HepG2 (Cytokines & Cells Encyclopedia - COPE) 2014). HepG2 buňky byly kultivovány v DMEM médiu obahujícím 2mM glutamin, 10% fetální bovinní sérum a 1% neesenciálních aminokyselin. Byly inkubovány při teplotě 37 C a při 5% CO 2. Tyto buňky byly pasážovány při 70-80% konfluenci za použití 0,25% trypsinu. Buňky byly nasazeny v koncentraci buněk na 1 cm Pomůcky, přístroje 48jamkové destičky 96-jamkové destičky Inkubátor Kahan Kultivační lahve Laminární box Mikropipety Mikroskop Odsávačka Plastové eppendorfky 39

41 5.3. Reagencie Anthokyanidiny (Extrasynthese, Francie): Cyanidin (Extrasynthese, Francie) Delfinidin (Extrasynthese, Francie)Malvidin (Extrasynthese, Francie) Pelargonidin (Extrasynthese, Francie) Peonidin (Extrasynthese, Francie) Petunidin (Extrasynthese, Francie) CDCA (Sigma-Aldrich) DMEM Dulbecco s Modified Eagles s médium (Sigma-Aldrich) DMSO dimethylsulfoxid (Sigma-Aldrich) Fetální bovinní sérum (PAA) Glutamin (Sigma-Aldrich) Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen) Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) Luciferase Assay Reagent II (Promega): - Luciferase Assay Buffer II (Promega) - Luciferase Assay Substrate (Promega) Neesenciální aminokyseliny (Sigma-Aldrich) Opti-MEM I Reduced Serum Medium (Invitrogen) Passive Lysis Buffer (Promega); 0,25% trypsin (Sigma-Aldrich) PBS fosfátový pufr Plasmid pfxre-luc2p (Generi Biotech) 40

42 Plasmid pgal4-fxr (Generi Biotech) Plasmid pgl5-luc (Promega) Plasmid prl-tk (Promega) Plasmid psg5-fxr (Generi Biotech) Stop & Glo Reagent (Promega): - Stop & Glo Buffer (Promega) - Stop & Glo Substrate (Promega) 41

43 5.4. Metodika transfekce adherentních buněk Transfekce je proces včlenění nukleových kyselin do genetického aparátu eukaryotických buněk prostřednictvím nevirových metod (Promega Transfection, 2015) Lipofekce Lipofekce patří mezi biochemické metody transfekce. Jedná se o transfekci buněk cizorodou DNA nebo RNA. Pojem lipozóm se týká lipidové dvouvrstvy, která tvoří koloidální částice ve vodném médiu. Kolem roku 1980 byly použity syntetické lipozómy pro vložení DNA do buněk. Dalším pokrokem lipozomálních vehikul byl vývoj syntetických kationických lipidů Felgnerem a kolegy (Felgner et al., 1987). Lipozom enkapsuluje nukleovou kyselinu a transportuje ji do hostitelské buňky (Promega Transfection, 2015). Výhody lipozomy zprostředkované transfekce jsou relativně vysoká účinnost genového transferu, schopnost transfekovat určité buněčné typy, které jsou rezistentní ke kalciu fosfátu nebo DEAE-dextranu, in vitro a in vivo aplikace, úspěšná transfekce DNA všech velikostí od oligonukleotidů po kvasinkové arteficiální chromozomy, transfekce RNA a transfekce proteinů. Buňky transfekované lipozomálními technikami mohou být použity pro transientní expresní studie a dlouhodobé experimenty, které spočívají v integraci DNA do chromozomálních nebo epizomálních konců. Na rozdíl od chemických metod DEAE-dextranu nebo kalcia fosfátu může být lipozómy zprostředkované vnesení nukleové kyseliny použito pro in vivo transfer DNA a RNA do živočichů a člověka (Progema Transfection, 2015). Pro transfekci adherentních buněčných linií (buněčné linie odvozené od hepatocelulárního karcinomu HepG2 a HuH7) jsme použili transfekční činidlo Lipofectamine 2000, který může být použit v přítomnosti séra a umožňuje transfekci buněčných typů, které vyžadují kontinuální expozici sérem, jako jsou primární buněčné kultury. Nejprve jsme optimalizovali transfekční parametry a použili jsme empiricky dané podmínky pro transfekci. 42

44 Postup: 1. Den před transfekcí byly buňky nasazeny na multijamkové plato 0,5-2 x 10 5 buněk v 500 µl kultivačního média bez antibiotik, buňky jsou tedy v den transfekce konfluentní ze 70 90% (v monovrstvě pokrývají 70-90% povrchu kultivační nádobky). 2. Pro každý transfekční vzorek byla připravena směs následovně: a. DNA byla zředěna v 50 µl Opti-MEMu (tj. transfekční bezsérové médium), bylo jemně protřepáno na vortexu. b. Před použitím byl Lipofectamine 2000 jemně protřepán na vortexu, poté bylo zředěno odpovídající množství v 50 µl bezsérového média Opti-MEM. Inkubovali jsme 5 minut za pokojové teploty. c. Po 5 min inkubaci jsme napipetovali zředěnou transfekční plazmidovou DNA ke zředěnému Lipofectaminu 2000 (totální objem = 100 µl). Jemně jsme protřepali na vortexu a inkubovali 20 minut při pokojové teplotě (komplexy jsou stabilní 6 hodin při pokojové teplotě). 3. Bylo přidáno 100 µl transfekční směsi ke každé jamce obsahující buňky a čerstvé kultivační médium. Jemně jsme promíchali plato houpavým pohybem dopředu a dozadu. 4. Inkubovali jsme buňky při 37 C v CO 2 inkubátoru po dobu hodin před testováním transgenní exprese. Kultivační médium může být vyměněno po 4-6 hodinách. 43