Molekulární diagnostika infekční bronchitidy v České republice a na Slovensku. Richard J W Currie

Transkript

1 Molekulární diagnostika infekční bronchitidy v České republice a na Slovensku Richard J W Currie

2 Virus infekční bronchitidy RNA (nukleová kyselina) uvnitř Proteiny (spike proteiny S1 a S2) na vnější straně

3 Sérotyp x genotyp Viry IB jsou klasifikovány podle struktury spike proteinu S1 Sérotypy IB jsou skupiny virů, které způsobují běžné protilátkové reakce u ptáků Protilátky proti spike proteinům reagují zkříženě Genotypy jsou viry IB, které mají identický nebo velmi podobný genetický kód spike proteinu V RÁMCI JEDNOHO SÉROTYPU MOHOU BÝT RŮZNÉ GENOTYPY

4 Jak provést molekulární diagnózu?.aggtacct.. 1 Sekvenovat nukleovou kys..klinrhqhf. 2 3 Jaké jsou změny v porovnání s vakcínou? Ze sekvence nukleové kyseliny určit sekvenci aminokyseliny 4 Jaké jsou rozdíly aminokyselin ve srovnání s vakcínou? 5 Analyzovat, jak rozdíly v aminokyselinách predikují vakcinační strategie

5 Not Specified 8% Layer 41% Broiler 48% Broiler Breeder 3%

6 Untypeable 21% H120 8% Italy-02 1% 4/91 30% M41 1% QX 14% CR88 4% D274 6% Ark 15% 4/91 je dodnes nejběžnější nález následovaný variantními ARK a QX. terénní viry D274 existují, ale v Evropě jsou poměrně vzácné výsledky, které nelze klasifikovat, jsou zjištěny většinou u vzorků s velmi malým množstvím RNA, u nichž je prezentovaná kvantita pod dolním limitem detekce sekvenční reakce

7 Jak odlišit vakcínu od terénního viru? Určete sekvenci vakcíny a porovnejte sekvence nukleové kyseliny a aminokyseliny daného vzorku.

8 Terénní virus 4/91

9 Terénní virus 4/91 sekvence nukleové kyseliny XXXX SAMPLE SEQUENCE XXXX SAMPLE SEQUENCE

10 % NA pozitivní % /91 Ark CR88 D274 H120 Italy-02 M41 Ma5 QX 100% <100% Většina pozitivních výsledků na 4/91 je homologních s předpokládanou sekvencí z lahvičky s vakcínou Virus 4/91 intenzivně kolonizuje chov a je nejčastěji detekován v případě, že je aplikován více než jeden kmen živé vakcíny proti IB.

11 % NA pozitivní % /91 Ark CR88 D274 H120 Italy-02 M41 Ma5 QX 100% <100% Většina pozitivních výsledků na 4/91 je homologních s předpokládanou sekvencí z lahvičky s vakcínou Virus 4/91 intenzivně kolonizuje chov a je nejčastěji detekován v případě, že je aplikován více než jeden kmen živé vakcíny proti IB. Terénní viry 4/91 (modrá šipka) nadále cirkulují

12 % NA pozitivní % /91 Ark CR88 D274 H120 Italy-02 M41 Ma5 QX 100% <100% Většina pozitivních výsledků na ARK je heterologních (bodová mutace ARK 979) se sekvencí hlavní vakcíny. Většina výsledků pochází z chovů vakcinovaných virem ARK. ARK979 v lahvičce s vakcínou není, ale zdá se, že se jedná o konečný bod pro kolonizaci ptáků a může přervávat na farmě crop to crop

13 % NA pozitivní % /91 Ark CR88 D274 H120 Italy-02 M41 Ma5 QX 100% <100% Výsledky pozitivní na QX pochází (s jedinou výjimkou) z farem bez živé vakcíny QX. Ve vzorcích analyzovaných během posledních 2 let byl zjištěn jediný pozitivní PCR výsledek na terénní virus QX získaný z chovu vakcinovaného virem QX

14 % NA pozitivní % /91 Ark CR88 D274 H120 Italy-02 M41 Ma5 QX 100% <100% Pozitivních výsledků na D274 je méně než loni, a to kvůli klesající tendenci pořizovat vzorky z chovů vakcinovaných pouze proti D274. Počet záchytů terénního viru D274 je extrémně nízký.

15 Jsou některé genetické změny důležitější než jiné? Ano substituce nukleové kyseliny mohou být tiché (nemající vliv na sekvenci aminokyseliny), anebo vést ke změnám sekvence aminokyseliny Jsou některé změny sekvence aminokyseliny důležitější nebo jiné? Ano substituce aminokyselin mohou být tiché (nemající vliv na terciární strukturu proteinů), anebo významně mění terciární strukturu proteinů

16 Záleží na změně tvaru proteinu S1.. Tichá mutace nukleové kys. Mutace nukleové kyseliny vede k substituci stejné aminokyseliny -jiný vzhled, stejný tvar Významná změna aminokyseliny = dramatický odlišný tvar

17 Hydrofilní a hydrofobní aminokyseliny Ze sekvencí aminokyselin lze dedukovat, jak se změnil tvar proteinu po různých substitucích aminokyselin. Hydrofobní aminokyseliny častěji směřují dovnitř proteinu. Hydrofilní aminokyseliny směřují častěji k vodnímu vnějšímu prostředí. Substituce dvou aminokyselin může změnit terciární strukturu a tudíž i imunologické vlastnosti terénního viru v porovnání s virem z vakcíny.

18 Index hydrofobnosti Numerická škála, která vyjadřuje tendenci aminokyselin orientovat se vůči vnitřnímu prostředí (HYDROFOBNÍ) nebo vnějšímu prostředí (HYDROFILNÍ). Změny aminokyselin mohou být Hydrofilní na hydrofobní Hydrofobní na hydrofilní Hydrofilní na více nebo méně hydrofilní Hydrofobní na více nebo méně hydrofobní Sledováním indexu hydrofobnosti lze vyvodit relativní potenciál pohybu aminokyseliny

19 Hydrofobní Hydrofilní

20 Hydrofobní > více hydrofobní

21

22

23 Rozdíly v indexu hydrofobnosti Z výpočtu absolutního rozdílu mezi hodnotami indexu hydrofobnosti můžeme určit kvantitativní tendenci, zda substituce aminokyseliny povede k jejímu posunu. Čím větší absolutní rozdíl, tím větší posun. Větší posun může vést k významnější strukturální změně proteinu S1. Větší změna může vést k tomu, že se terénní virus etabluje v prostředí a unikne prostředkům imunitní ochrany hostitele. Tato data lze vizualizovat tak, že vypočítáme absolutní rozdíl indexu hydrofobnosti mezi jednotlivými změnami aminokyselin, seskupíme pozorování do kategorií a do grafu zaneseme procento celkových změn aminokyselin, které se vyskytují v jednotlivých kategoriích.

24 Rozdíl indexu hydrofobnosti v případě viru 4/91 % 40 Hydrophobicity Difference - 13 March

25 Závěr Tyto údaje odpovídají velkému počtu virů s relativně nízkými rozdíly hydrofobnosti vzhledem k viru 4/91 z vakcíny. Výsledná podobnost terciárních struktur S1 naznačuje, že ochranu poskytuje samotná vakcinace 4/91. Existuje také velký počet terénních virů, jejichž stupeň hydrofobnosti se v porovnání s vakcínou významně liší. Tyto viry by mohly být kandidáty rozšíření vakcinační ochrany, a to v souladu s vakcinačními strategiemi Protectotype v tomto případě se jedná o přidání Ma5 do vakcinačního programu 4/91.

26 Rozdíl v indexu hydrofobnosti v případě izolátů typu QX % 40 Hydrophobicity Difference - 13 March

27 Rozdíl v hydrofobnosti % 40 4/91-13 March 2012 % 40 QX - 13 March

28 Závěr Tyto údaje jsou v souladu s následujícími fakty: Většina terénních virů je jen vzdáleně příbuzná s vakcinačním kmenem QX. Většinová populace terénních virů vykazuje hodnoty relativní hydrofobnosti, které naznačují mimořádný potenciál změny terciární struktury S1 vzhledem k vakcinačnímu kmeni. Stupeň variability je obtížné sladit s vakcinační strategií, pokud se používají monovalentní živé vakcíny bez adjuvans Zatímco se předpokládá, že před blíže spřízněnými terénními kmeny ochrání jedna živá vakcína, početná populace vzdáleněji příbuzných kmenů je kandidátem na vakcinační program typu Protectotype

29 Česká republika a Slovensko 2012 Skladba vzorků Czech Republic - Type - 09/08/2012 Analýza výsledků Czech Republic - Results - 09/08/ % 2% 48% 36% 64% Broiler Broiler GP Layer Postive Negative

30 Genotypy detekované v České republice a na Slovensku k srpnu 2012 Genotype of Results - Czech Republic - 09/08/2012 Ma5 6% QX 10% SU 10% 4/91 39% H120 19% D274 10% CR88 6% 4/91 CR88 D274 H120 Ma5 QX SU Mezi nejčastěji detekované genotypy IBV v České republice patří 4/91, a dále H120, D274 a typ QX.

31 Česká republika a Slovensko % Homologie nukleové kyseliny % /91 CR88 D274 H120 Ma5 QX SU 100% < 100% Všechny záchyty 4/91 byly terénní viry 4/91, které se vyskytovaly pouze na farmách vakcinovaných virem 4/91 v období nejméně 30 týdnů před odběrem vzorků Možnost zavedení vakcinace typu in-lay spray Všechny výsledky typu QX jsou geneticky heterologní (tj. méně než 100% homologní) vůči sekvenci QX z lahvičky s vakcínou Terénní viry D274 byly zjištěny jen v malých počtech a byly identické s genotypy pozorovanými v dalších zemích EU

32 Proti terénním virům 4/91 v České republice a na Slovensku je třeba použít obecnou homologní vakcinaci % Hydrophobicity Difference - 4/91 Results as at 09/08/

33 Proti terénním virům typu QX v České republice je třeba použít obecnou vakcinaci typu Protectotype % Hydrophobicity Difference - QX Results as at 09/08/

34 O čem vypovídá rozdíl v hydrofobnosti Lze jej využít při předpovědi umístění a složení epitopu Část peptidového řetězce, na který se zaměřují protilátky Predikce Hopp-Woodsovy antigenní determinanty Určuje, zda změny aminokyselin vedou ke změně epitopů vzhledem k epitopům vakcinačního kmene BEZE ZMĚNY HOMOLOGNÍ VAKCINACE PRAVDĚPODOBNĚ FUNGUJE VÝZNAMNÉ ZMĚNY MŮŽE BÝT NUTNÉ POUŽÍT VAKCINAČNÍ STRATEGIE TYPU PROTECTOTYPE

35 Predikce shody epitopů epitopy jsou znázorněny červeně

36 Terénní virus QX Česká republika kloakální výtěry nosnice ve věku 64 týdnů: D274/H120 (X3) plus vakcína CR88 vše v období odchovu Sekvence aminokyseliny Pozice Sekvence z Index hydrofobnosti Sample Index hydrofobnosti Změna hydrofobní/hydrofilní lahvičky s vakcínou Sequence 88 Leucin 3.8 Histidin -3.2 Ano 92 Alanin 1.8 Threonin -0.7 Ano 96 Serin -0.8 Glutamin -3.5 NE 117 Serin -0.8 Threonin -0.7 NE 120 Serin -0.8 Alanin 1.8 Ano 121 Glycin -0.4 Lysin -3.9 NE 128 Methionin 1.9 Glutamin -3.5 Ano 131 Arginin -4.5 Asparagin -3.5 NE 140 Glutamát -3.5 Glycin -0.4 NE 141 Lysin -3.9 Arginin -4.5 NE 143 Fenylalanin 2.8 Serin -0.8 Ano 158 Fenylalanin 2.8 Valin 4.2 NE

37 Terénní aplikace údajů Trendy rozvoje terénních virů je možné sledovat průběžným vzorkováním a pořizováním dat Mezi jednotlivými zeměmi se vyskytují rozdíly co se týká terénních virů Geografické dělení Rozdíly podle různých veterinárních praxí Tyto údaje je možné použít při výběru vakcinačního programu a průběžném hodnocení jeho účinnosti Následující údaje pochází z Velké Británie z let

38

39 Praxe A Praxe B Practice D Praxe D Praxe C

40 Praxe A Practice B Praxe B Praxe D Praxe C

41 Practice Praxe A Praxe B Practice B Praxe D Practice D Praxe C

42 Shrnutí Molekulární analýza klinických vzorků na přítomnost IB může diagnostikovat terénní kmeny ve vztahu k živým vakcinačním kmenům; prokázat rozdíly v chování dvou hlavních virových genotypů; identifikovat změny aminokyselin, které souvisí s klinickou chorobou ; indikovat aplikaci vakcinačních programů typu Protectotype, pokud se aminokyselinové charakteristiky terénních virů výrazně liší od vakcinačních kmenů (což vede ke změně epitopů ve srovnání s vakcinačními kmeny).