Praktické využití serologických metod

Transkript

1 Praktické využití serologických metod Daniel Sperling Hotel Myslivna, Brno

2 Využití sérologie v diagnostice infekčních onemocnění prasat sérologie je vědecká disciplína zaměřená na detekci protilátek v tělních tekutinách- nikde v této definici nenajdete spojení protektivní imunita Dr. Ian Tizzard Využití: Detekce protilátek (IgG, IgM), dynamika humorální odpovědi s cílem demonstrovat infekci (expozici) specifickým antigenem Serologické testy detekují protilátky, není možno stanovit buňkami zprostředkovanou imunitu Levné, standardizované postupy s rychlým výsledkem Problematické využití jako metody definitivní diagnostiky (veterinární využití ASF, humánní medicína HIV)

3 Praktické využití sérologie Serologický monitoring chovného stáda, nákup chovných zvířat, zařazení do chovu Ověření infekčního statusu v rámci farmy (incidence patogenů na úrovni jednotlivých kategorií zvířat) Monitoring úrovně hladiny protilátekpasivní imunita, načasování vakcinace, imunitní okno Zdravotní programy, monitoring úspěšnosti eradikačních programů, systém test and removal Ověření vakcinace

4 Odběr vzorků Kvalita a uchování vzorků Sterilní odběr, bakteriální kontaminace, uchování při 4 C (max. 7 dnů) Delší uchování- využití vysráženého sera a následné zamražení Optimální počet vzorků Odběr reprezentativního množství vzorků, při vysoké míře spolehlivosti výsledku: confidence value (95%) - hodnota konfidenčního intervalu spolehlivosti daného testu Obecné pravidlo Počet testovaných vzorků by měl se spolehlivostí minimálně 95% detekovat časnou infekci s nízkou prevalencí (ø 10% prevalence) Obecně zhruba 30 odebraných vzorků zajištuje detekci při 10% prevalenci při 95% jistotě

5 Výpočet dle aktuálních parametrů n= [1- (1-a)1/D] x [N- (D-1)1/2] n nutný počet vzorků a - confidence value- hodnota spolehlivosti daného testu N množství všech zvířat v dané skupině (věk, sekce...) D množství pravděpodobně pozitivních zvířat prevalence Praktický příklad aplikace výpočtu Stádo 5000 prasnic, nízká serologická prevalence endemická infekce App zhruba 10%, předpoklad 500 pozitivních prasnic ve stádě Po dosazení a kalkulaci 47 náhodně vybraných prasnic je třeba odebrat a vyšetřit Při pozitivním záchytu je farma považována za infikovanou, v případě negativního výsledku je z 95% jistotou negativní

6 Počet vzorků ve vztahu k prevalenci a confidencí 95% (Segales et al., 2013)

7 Vývoj humorální imunitní odpovědi Fáze virémie bakteriémie Vývoj IgG doprovázený odstraněním patogenu z cirkulace Charakter vývoje jednotlivých typů Ig (stimulace antigenem- vakcinace, nebo infekce) Zdroj:UTEXAS Edu

8 Dynamika onemocnění Aplikace vývoje onemocnění (fází infekčního procesu) na diagnostiku- kombinace serologických metod s přímým průkazem patogenu Prof. José M. Sánchez- Vizcaíno OIE

9 Charakteristika testu (ELIZA)- důležité parametry testu Diagnostická citlivost (sensitivita) schopnost testu korektně určit infikované zvířata jako pozitivní s minimem falešně negativních Analytická citlivost- minimální množství Ig detekovatelné danou metodou Diagnostická specifita- schopnost (pravděpodobnost) daného testu korektně určit negativní zvířata s minimem falešně pozitivních Analytická specifita- schopnost minimalizovat zkříženou reaktivitu daného testu

10 Charakteristika testu (ELIZA)- důležité parametry testu Stanovení citlivosti/specifity testu na základě referenčního testu- zlatého standartu např. Mycoplasma hyopneumoniae kultivace, virové infekce SNT Praktické hledisko- nižší hodnoty výsledku = vyšší pozitivita např. u metody blocking ELISA (testy používané na PRRS) Perfektně citlivé a specifické testy neexistují v praxi! Na individuální bázi sérologie na virové patogeny Požadavky na obě vlastnosti se liší v praxi Vysoká sensitivita dovoz do chovů SPF, import na úrovni státu- minimalizace rizika zavlečení infekce Ochrana zdraví a patogeny- Salmonella, Trichinella Vysoce specifické testy (minimalizace falešně pozitivních)- eradikace (test and removal)

11 M. hyopneumoniae - příklad volby serologického testu Volba vhodného testu- praktické limitace a senzitivita daného testu DAKO ELISA- proteinový epitop terénních kmenů + monoklonální Ig G Vakcíny proti M. hyo indukují pouze velmi slabou imunologickou odpověď nevhodnost pro post-vakcinační monitoring DAKO Elisa- monitoring infekčního statusu, Tween 20 Elisa monitoring/kontrola vakcinace Delší doba pro indukci specifických IgG, IgM v porovnání s dalšími respiračními infekcemi

12 Detekce specifických IgG Pieters M.

13

14 Praktické využití sérologie Využití predikce klinického onemocnění a jeho závažnosti na základě prevalence v době odstavu (Pijoan, 2006) M. hyopneumoniae Pieters M.

15 Serologie Actinobacilus pleuropneumoniae

16 Sérologie App Detekce Apx 4 toxinu- princip DIVA, 99.8% specificita, 80.8% sensitivita ELISA Problematika sérologie App obecně- častý status nosičství, kolonizace epitelu (lymfatická tkáň tonzil)- špatná humorální odpověď bez možnosti detekce u některých zvířat U některých infikovaných zvířat nedochází k vývoji protilátek vůbec ELISA testy jsou založené: 1. na specifickém LPS (serotypovém určení) 2. detekce společného antigenu (sérotypově nespecifická)- dobrá korelace 3. detekce toxinů (APX1 a APX2)- zde pozor na nespecifické reakce (A. suis) Konfirmace vakcinačních protilátek- problematická pokud komerční kyty nebyly již dříve validovány ne detekci post-vakcinačních protilátek!

17 App sérologie Počet infikovaných/sérologicky pozitivních zvířat je velmi závislý na sérotypu subklinické infekce a infekce některými vysoce virulentními sérotypy (1,5) nízká nebo žádná séro-konverze Důležitá vlastnost- korelace kontagiosita (infektivity) se schopností produkovat optimální množství Ig Sérotypy vysoce virulentní s nízkou kontagiositou (1,5) x vysoce kontagiózní (3,6,8,12)

18 Sérokonverze a výběr vhodných zvířat Serologický status chovu Multi-site production- pro monitoring nejlépe zvířata z finální fáze výkrmu Obdobně možno postupovat i u farow to finish uspořádání- serokonverze ovšem nastává dříve Sérokonverze po ústupu mateřských protilátek (4-8 týden) zhruba 4 týdny až týdnů- počet infikovaných v době odstavu, typ chovu Typická sérokonverze dle uspořádání chovu Farow to finish Multi site

19 Postup v případě pozitivity bez klinické manifestace onemocnění Vhodná kombinace s další diagnostickou metodou- PCR, kultivace hlubokých stěrů tonzil Přednostně zvířata označena sérologicky jako pozitivní Vyšetření tonzil x plíce bez patologického nálezu nevhodné i přes séropozitivitu daného jedince Seškrab x vyšetření celé mandle (ekonomická hodnota daného zvířete) Zejména důležité- nákup chovných zvířat v mladém věku z nedávno ozdravených chovů SPF Odběr tonzil (AASV)

20 Využití sérologie v diagnostice Ileitis prasat Metoda nepřímé imunofluorescence (IFAT), ELIZA Vysoká senzitivita (přibližně 90 %) a specifita (téměř 100 %) Sérokonverze 2 týdny po infekci, IgG přetrvávají od 3-13, typ infekce (PHE nebo PIA) Vyšší a déle přetrvávající titry protilátek jsou zjišťovány především u PHE formy infekce U prasat s chronickou formou infekce L. intracellularis jsou titry většinou nízké (1: 30) a jsou zjistitelné pouze několik týdnů Seroprofil- inherentní variabilita, všechny vzorky nutno vyšetřit najednou

21 % sero-positive Typ farmy- farow to finish (přítomnost reprodukce a výkrmu, kontinuální systém chovu, příklad využití stanovení serologického profilu, semikvantitativní stanovení Imunofluorescencí

22 Séro-profil- Lawsonia Multi-site produkce, oddělená reprodukce od produkčních jednotek, pozdní typ nástupu infekce po naskladnění do výkrmu

23 Děkuji za pozornost!