IVD. IMMUNOZYM FSME IgG. 1. Úvod. 2. Aplikace. 3. Princip testu

Transkript

1 IMMUNOZYM FSME IgG Enzymatická imunoanalýza ke stanovení IgG protilátek proti viru klíšťové encefalitis v lidském séru, citrátové plazmě a likvoru Produkt č.: testů Skladování: 2 8 C IVD PROGEN Biotechnik GmbH Maaßstraße 30 D Heidelberg info@progen.de Tel Fax Návod k použití / Gebrauchsanweisung / Carnet d instruction / instrucciones de uso / gebruiksaanwijzing / istruzioni per l'uso / σελίδα οδηγιών / bruksanvisning / modo de emprego: 1. Úvod Mezi významná onemocnění, která jsou přenášená klíšťaty, patří v Evropě Středoevropská klíšťová meningoencefalitis (německy FSME) a Lymská borelióza. Zatímco borelióza je ubivalentní, je výskyt klíšťové encefalitis především vázán na endemické oblasti (jižní Německo, Durinsko, Rakousko, Švýcarsko, Maďarsko, Švédsko, Česko, Slovensko, Chorvatsko, Slovinsko, určité oblasti dřívějšího Sovětského svazu a další). Obě infekční onemocnění vykazují typický dvou event. více fázový průběh. Inkubační doba viremické fáze klíšťové encefalitis je od 3 do 14 dnů. První fáze onemocnění (1 8 dnů) se projevuje chřipkovými symptomy. Po klidové fázi bez teplot (cca 1 týden) může onemocnění přestoupit do druhé fáze s neurologickými symptomy různé závažnosti a může trvat několik týdnů. Na začátku druhé fáze onemocnění lze obvykle prokazovat IgM protilátky proti klíšťové encefalitidě. IgM protilátky dosahují nejvyšších hodnot po 2 6 týdnech a v některých případech teprve po 10 měsících mohou klesnout pod průkaznou hranici. IgG protilátky proti klíšťové encefalitidě lze prokazovat současně s IgM nebo o několik dní později. Po prodělané infekci je získána přirozená, většinou celoživotní imunita. Ochranu proti klíšťové encefalitidě lze získat také očkováním. Taková ochrana je omezena několika lety a musí být pravidelně obnovována (pokud možno po serologické kontrole; dáno očkovacím schématem). Specifické protilátky proti klíšťové encefalitidě v likvoru mohou být prokázány v důsledku poškození hematoencefalické bariéry, po nebo během probíhající imunitní reakce proti antigenu nebo v důsledku lokální imunitní reakce. Přičemž dynamika tvorby protilátek v likvoru může být odlišná od dynamiky protilátek v séru/plazmě). Testem IMMUNOZYM FSME IgM a IMMUNOZYM FSME IgG lze rozlišovat specifické protilátky proti klíšťové encefalitis jak třídy IgM tak IgG. Určení IgM protilátek testem IMMUNOZYM FSME IgM není ovlivněno revmatoidním faktorem nebo specifickými IgG protilátkami přidáním RF/IgG absorbentů. Kombinaci obou testů je možné využít k průkazu humorálních protilátek imunitního stavu proti klíšťové encefalitidě po očkování, nebo po infekci (IgM, IgG) nebo pro včasnou diagnozu primoinfekce (IgM) a pro monitorování hladiny IgM/IgG protilátek v séru, citrátové plazmě a likvoru. 2. Aplikace Kontrola humorálního stavu imunity a potvrzení serokonverze po očkování (schéma očkování). Důkaz aparentní resp. inaparentní infekce virem klíšťové encefalitis, obvykle spolu s průkazem IgM protilátek proti klíšťové encefalitis. Kontrola protilátek po infekci virem klíšťové encefalitis. Diferenciální diagnostika při borelioze po kousnutí klíštětem. Diferenciální diagnostika při jiných onemocněních CNS. 3. Princip testu IMMUNOZYM FSME IgG je dvoukroková ELISA. Jednotlivé jamky ELISA proužků jsou potaženy inaktivovaným virem klíšťové encefalitidy. Naředěné vzorky séra, plazmy nebo likvoru se inkubují (inkubace vzorků) v jamkách ELISA proužků. Během inkubace vzorku dochází k navázání specifických protilátek proti viru klíšťové encefalitis na pevnou fázi. Nespecifické části vzorku jsou odstraněny promytím. Ve druhém inkubačním kroku následuje reakce konjugátu (inkubace konjugátu). Anti-lidské IgG protilátky konjugátu značené peroxidázou ozřejmí navázané IgG protilátky proti klíšťové encefalitidě. V dalším promývacím kroku se nenavázaný konjugát odstraní. Ve třetím inkubačním kroku následuje reakce substrátu, peroxidáza konjugátu za použití peroxidu vodíku oxiduje TMB substrát za vzniku modré substance. Následným přidáním kyseliny sírové je reakce zastavena a je dosaženo žlutého zbarvení. Intenzita zbarvení odpovídá FSME IgG cz_v6 1/5

2 přímo koncentraci IgG protilátek proti klíšťové encefalitidě. Extinkce se měří při vlnové délce 450 nm na ELISA readru (fotometru). Pomocí referenční křivky křivky nebo bodové kalibrace lze kvantitativně prokázat IgG protilátky proti klíšťové encefalitidě ve vzorku. 4. Potřebné pomůcky, které nejsou součástí vybavení destilovaná voda zkumavky k ředění vzorků odměrný válec (1000 ml) mikropipety (5, 10, 200, 500, 1000 μl) jednokanálové pipety (10 a 20ml) vícekanálové pipety (50 a 200 μl) třepačka vzorků časový spínač čtecí zařízení ELISA-reader, filtr pro 450 nm Software IMMUNOZYM One Point Calibration pro hodnocení pomocí Microsoft Exel 5.0 nebo vyšší verze (software bude poskytnuto na požádání zdarma). 5. Materiál a reagencie dodávané v testu MTP, 12 x 8 ELISA (12 testovacích proužků s 8 odlamovacími jamkami) potažených inaktivovaným virem FSME v zataveném hliníkovém sáčku s pohlcovačem vlhkosti. Připravené k použití! WASH 10x, koncentrát promývacího roztoku (10x), 0,1 M Tris/HCl ph 7,4, obsahuje detergent, 100 ml v každé lahvičce; Před použitím nařeďte! DIL, inkubační pufr; 0,01 M Tris/HCl; ph 7,4; obsahuje detergent; zbarvený červeně; 2 x 75 ml. Připraven k použití! CAL 1, CAL 2, CAL 3, CAL 4, CAL 5, Kalibrátory 1-5; lidská séra se stabilizátory a konzervačními látkami; 1 lahvička každého kalibrá-toru, 0,35 ml. Koncentrace jsou specifické pro jednotlivé šarže, jak je vyznačeno na štítcích lahviček. Před použitím nařeďte! POS LL, POS HL, pozitivní kontrolní séra, LL, Low Level = Nízká koncentrace, HL, High Level = Vysoká koncentrace k testování přesnosti; lidská séra se stabilizátory a konzervačními látkami; 1 lahvička obsahuje 0,35 ml. Koncentrace jsou specifické pro jednotlivé šarže, jak je vyznačeno na štítcích lahviček. Před použitím nařeďte! CON, konjugát; anti-lidský IgG-peroxidázový; zbarvený modře; 1 lahvička, 0,6 ml. Před použitím nařeďte! S, Substrát; tetrametylbenzidin (TMB); 2 x 12 ml. Připraven k použití! STOP, Stop roztok (zastavuje reakci); 0,5 M kyselina sírová; 1 lahvička, 15 ml. Připraven k použití! Adhezivní fólie; pro přikrytí testovacích proužků ELISA; 2 kusy. Vyhodnocovací křivka pro sestavení referenční křivky, 2 kusy. Pacientský protokol, 1 kus. Protokol pacienta pro bodovou kalibraci IMMUNOZYM; specifický pro každou šarži; 1 ks Referenční křivka pro IMMUNOZYM bodovou kalibraci, specifická pro každou šarži, 1 ks 6. Provedení testu 6.1. Materiál vzorku a uchovávání Lidské sérum, citrátová plazma a likvor. Vzorky mohou být skladovány v mrazničce po dobu 6 týdnů [10]. Při teplotě 20 ºC mohou být skladovány po několik měsíců. Vzorky nemají být opakovaně zmrazovány/rozmrazovány Příprava Než začnete s vyšetřováním, vytemperujte všechny potřebné složky na pokojovou teplotu (20-26 ºC). Ředění kalibrátorů 1-5, pozitivního kontrolního séra a vzorků ( 1+100) Příklad: 5 μl μl inkubačního pufru. Dobře promíchejte! Pro vyhodnocení pomocí referenční křivky je nutné použít kalibrátory 1-5 a kontrolní séra. Pro bodovou kalibraci použijte místo kalibrátorů 1-5 pouze kalibrátor 4 a kontrolní séra. Ředění vzorku likvoru 1+8: Příklad: 50 μl likvoru μl inkubačního pufru. Příprava pracovního roztoku konjugátu, : Příklad pro 8 jamek: 20 μl konjugátu μl inkubačního pufru. Připravte bezprostředně před použitím. Připravený roztok je stabilní po dobu 60 min při pokojové teplotě (20-26ºC). Příprava promývacího pufru, 1+9: Příklad pro 12 x 8 proužků jamek: 30 ml koncentrátu promývacího roztoku (10x) ml destilované vody. Řádně promíchejte! Roztok připravený k použití je možno uchovávat při 2 8 C po dobu 2 měsíců Stabilita reagencií Testovací soupravu a jednotlivé komponenty uchovávejte při 2-8 C. Nenačaté reagencie jsou stabilní až do vyznačeného data expirace. Stabilita po otevření: 6 měsíců po otevření při 2-8 C (MTP v plastovém vaku s pohlcovačem vlhkosti): WASH 10x, S, MTP, DIL CAL 1, CAL 2, CAL 3, CAL 4, CAL 5, POS LL, POS HL, CON 6.4. Průběh testu Inkubace vzorku: Do každé jamky napipetujte 200 µl naředěného kalibrátoru/ kontroly/vzorku. Kalibrátory by měly být umístěny v proužku 1 a 2. Testovací proužky přikryjte fólií. Inkubujte při pokojové teplotě (20-26 C) po dobu 60 min. Promytí: Vyprázdněte mikrotitrační proužky a všechny jamky naplňte 250 µl promývacího pufru připraveného k použití. Jamky opět vyprázdněte a tento promývací krok dvakrát opakujte. Přebytečnou tekutinu odstraňte oklepnutím proužků na absorpční papír. Inkubace konjugátu: Do každé jamky napipetujte 200 µl konjugátu připraveného k použití. Přikryjte adhezívní fólií. Inkubujte při pokojové teplotě (20-26 C) po dobu 60 min FSME IgG cz_v6 2/5

3 Promytí: Vyprázdněte mikrotitrační proužky, promyjte podle postupu uvedeného výše (3x250 µl na každou jamku). Substrátová reakce: Do každé jamky napipetujte 200 µl substrátu připraveného k použití, inkubujte při pokojové teplotě (20-26 C) po dobu 30 min (BEP III 20 min). Stop reakce: Do každé jamky napipetujte 50 µl stoproztoku, třepejte po dobu 10 sekund, za 10 min změřte zbarvení při 450 nm (referenční vlnová délka nm). 7. Upozornění pro uživatele Pro odborné použití. Mikrobiologicky kontaminované vzorky mohou být příčinou chybných výsledků. Promývací pufr, inkubační pufr a stop roztok je možno vyměnit za tyto roztoky z následujících produktů IMMUNOZYM DIPHTHERIE, FSME IgM a TETANUS. Přesnost a výtěžnost (recovery) závisí na následujících důležitých faktorech: Hemolitické, lipemické, ikterické či mikrobiálně kontaminované vzorky mohou být příčinou chybných výsledků. Inkubace provádějte při pokojové teplotě (20-26 C). Dodržujte přesné pořadí pipetování. Inkubační doby by neměly být překročeny o více než 10%. Inkubační doba začíná po posledním kroku pipetování. Doba pipetování vzorků by neměla přesahovat 60 sekund pro každý jednotlivý testovací proužek ELISA. Doba pipetování konjugátu, substrátu a stop-roztoku by neměla přesahovat 10 sekund pro každý jednotlivý testovací proužek ELISA. Bezpečnostní upozornění: Stop-roztok (kyselina sírová) a složky substrátu (metylpyrolidon) mohou způsobit podráždění kůže. Pokud by kyselina či substrát zasáhly oči, okamžitě oči vypláchněte velkým množstvím vody a obraťte se na lékaře! Lidská plazma použitá v tomto produktu byla vyšetřena na virus lidské imunodeficience HIV (HIV 1 + 2), hepatitidu B a C s negativním výsledkem (ne opakovaně reaktivní). Všechny produkty z lidské krve však musí být považovány za potenciálně infekční. Dodržujte obecně platná bezpečnostní opatření týkající se manipulace s potenciálně infekčním materiálem. Některé reagencie obsahují konzervační látky. Nepolykejte! Zamezte jakémukoli styku s kůží či sliznicemi! Bezpečnostní list je k dispozici na požádání! Likvidace Produkt: Chemické látky musí být likvidovány v souladu s platnými národními předpisy. Likvidace biologických složek musí být v souladu s existující praxí likvidace, která se uplatňuje pro vzorky séra pacientů a infekční odpad. Obal: Obal musí být zlikvidován v souladu s platnými národně specifickými předpisy. S kontaminovaným obalem zacházejte stejným způsobem jako s produktem samotným. Pokud není úředně stanoveno jinak, pak je možno s nekontaminovaným obalem zacházet jako s domácím odpadem nebo je možno jej recyklovat. Opatření při poškození během přepravy Pokud je souprava vážně poškozená, kontaktujte prosím výrobce či místního distributora. Vážně poškozené složky pro provedení testu nepoužívejte. Tyto složky či sety uschovejte až do doby vyřízení reklamace. 8. Vyhodnocení testu Vyhodnocení IgG protilátek proti klíšťové encefalalitidě může být provedeno buď zhotovením referenční křivky nebo bodovou kalibrací Vyhodnocení pomocí referenční křivky Sestrojení referenční křivky Použijte přiložené vyhodnocovací křivky (linear/linear) x-osa (lin) : koncentrace v [VIEU*/ml] y-osa (lin): extinkce (optická hustota) * VIENNA UNITS (Prof. Ch. Kunz/Vienna) Průměrné hodnoty kalibrátorů naneste na vyhodnocovací křivku a body spojte křivítkem. Koncentraci kontrolního séra a vzorku přečtěte z této křivky. Při použití vyhodnocovacího softwaru se doporučuje použít počítačový program multiplikační nelineární regrese (např. pasování křivek pomocí 4 parametrů) Validita průběhu testu 1,0 < ODCAL 5 < 2,5 ODCAL 1 < 0,5 (ODCAL 5- ODCAL 1) > 1,0 Koncentrace kontrolního séra jsou uvnitř uvedené oblasti Určení koncentrace pro bodovou kalibraci Software IMMUNOZYM One Point Calibration pro hodnocení pomocí Microsoft Exel 5.0 nebo vyšší verze bude poskytnuto na požádání. Otevřete excelový modul IMMUNOZYM bodová kalibrace TBE IgG Sera. Vyplňte políčka pomocí přiložené referenční křivky pro IMMUNOZYM bodovou kalibraci, specifické pro každou šarži : Extinkce udané hodnoty kalibrátoru 4 OD toleranční hranice kalibrátoru 4 Koeficienty referenční křivky A,B,C a D a Extinkce naměřené hodnoty kalibrátoru 4 oblasti. Vložte do připravených tabulek identifikaci a extinkci (průměr) kontrolních sér a vzorků. OD korekce a výpočet koncentrace proběhne automaticky. Validita průběhu testu FSME IgG cz_v6 3/5

4 oblasti a koncentrace uvedené oblasti. kontrolního séra jsou uvnitř 8.3. Posouzení sérových/plazmových vzorků Vzorky, jejichž extinkce leží mimo referenční křivku/kalibrátor 5, se musí naředit inkubačním pufrem (1+1). Dosažená koncentrace se násobí faktorem 2. Pro přepočet hodnot citrátové plazmy na hodnoty séra se odečtené koncentrace násobí faktorem 1,1. Hodnocení IgG protilátek proti klíšťové ence-falitidě: 63 VIEU/ml negativní VIEU/ml hraniční 126 VIEU/ml pozitivní 8.4. Hodnocení vzorků likvoru Hodnocení bodové kalibrace likvor Otevřete exelový modul IMMUNOZYM bodová kalibrace FSME IgG Liquor. Vyplňte políčka pomocí přiložené referenční křivky pro IMMUNOZYM bodovou kalibraci, specifické pro každou šarži: extinkce udané hodnoty kalibrátoru 4, OD toleranční hranice kalibrátoru 4, extinkce udané prahové hodnoty 1 a 2, prahová hodnota 1 = spodní hranice hraniční zóny, prahová hodnota 2 = horní hranice hraniční zóny. Vyplňte naměřenou extinkci (průměr) kalibrátoru 4. Do připravených tabulek vložte identifikaci a extinkce vzorků likvoru.od-korekce a hodnocení vzorku likvoru probíhá automaticky. oblasti a koncentrace kontrolního séra jsou uvnitř uvedené oblasti Vyhodnocení IgG protilátek proti klíšťové encefalitidě v likvoru Korigované extinkce (OD)450nm vzorku likvoru jsou interpretovány následovně: OD udávaná prahová hodnota 1 negativní udávaná prahová hodnota 1 OD udávaná prahová hodnota 2 hraniční OD udávaná prahová hodnota 2 9. Interpretace Návod 9.1. Očkování pozitivní Průkaz serokonverze je proveden stanovením IgG protilátek proti klíšťové encefalitidě v lidském séru /plazmě. IgG protilátky proti klíšťové encefalitidě negativní. Očkování nepředcházela inaparentní infekce. Po očkování nedošlo k serokonverzi. Toto může být po 1. dávce; u vybraných případů také po 2. a 3. očkovací dávce event. po opakované dávce (booster) u nerespondentů. V případě potřeby doplnit základní očkování a úspěšnost vakcinace ověřit serologicky. IgG protilátky proti klíšťové encefalitidě hraniční. Dochází zřejmě k serokonverzi. Pokračovat v základním očkování, resp. podat booster dávku. Určení protilátek proti klíšťové encefalitidě opakujte za 2 4 týdny. Může se jednat o nespecifickou reakci. IgG protilátky proti klíšťové encefalitidě pozitivní Došlo k serokonverzi. Ověřit očkovací anamnézu a v případě potřeby doplnit základní očkování nebo booster dávku Infekce Potvrzení infekce je provedeno stanovením IgM protilátek proti klíšťové encefalitidě. Pro ověření správné diagnozy by mělo být provedeno také vyšetření IgG protilátek proti klíšťové encefalitidě. Pokud je k dispozici likvor, doporučuje se provést vyšetření IgM a IgG protilátek proti klíšťové encefalitidě ve vzorku. Při interpretaci serologických výsledků se musí přihlédnout k anamnéze pacienta (pobyt v lese, přisátí klíštěte, nedávno provedené očkování a.j.). IgM protilátky a IgG protilátky proti klíšťové encefalitidě negativní. Infekce klíšťovou encefalitidou je nepravděpodobná. Při odůvodněném podezření na infekci klíšťovou encefalitidou se dalším odběrem krve na přítomnost IgG/IgM protilátek proti klíšťové encefalitidě infekce s velkou pravděpodobností potvrdí resp. vyloučí. Diferenciálně diagnosticky se musí přihlédnout k jiným infekcím CNS po kousnutí klíštětem, zvláště k borelioze. IgM protilátky proti klíšťové encefalitidě negativní a IgG protilátky pozitvní. Došlo k inaparentní infekci nebo infekce proběhla před několika týdny či měsíci. Při odůvod-něném podezření se dalším odběrem krve a vyšetřením IgM protilátek s velkou pravděpodobností potvrdí resp. vyloučí čerstvá infekce klíšťové encefalitidy. IgM protilátky proti klíšťové encefalitidě pozitivní a IgG protilátky negativní. Došlo pravděpodobně k infekci klíšťové encefalitidy. Po infekci virem klíšťové encefalitidy se v plazmatickém komplexu tvoří nejdříve IgM protilátky a po té IgG. V rané fázi infekce mohou být nejdříve IgG protilátky negativní nebo hraniční. Opakováním vyšetření IgG protilátek z dalšího odběru krve za 7-10 dní se prokáže změna koncentrace protilátek. IgM protilátky proti klíšťové encefalitidě a IgG protilátky pozitivní. Došlo s velkou pravděpodobností k infekci virem klíšťové encefalitidy, pokud bylo vyloučeno očkování. U pacienta se projevují typické symptomy klíšťové encefalitidy s různým stupněm závažnosti. Při hraničním výsledku se musí opakovat vyšetření z dalšího odběru krve za cca 7-10 dní. Jakékoliv změny v koncentraci protilátek musí být monitorovány. Pokud je k dispozici likvor, je možné vyšetřit IgG/ IgM ze vzorku. Dodatečná serologická diagnostika má význam pokud byly v séru/plazmě prokázány IgM a IgG protilátky proti klíšťové encefalitidě. Pozitivní průkaz protilátek proti klíšťové encefalitidě v séru/plazmě a likvoru svědčí pro účast CNS na infekci. U pacienta se projevují typické symptomy klíšťové encefalitis s různým stupněm závažnosti. Pozitivní nález v likvoru musí být ověřen vyloučením poruchy hematoencefalické bariery FSME IgG cz_v6 4/5

5 10. Údaje o testu Výtěžnost (recovery) vzorků séra: odchylka od teoretické hodnoty je 8%. Pro odchylku v rámci testu (každý n = 6 pozitivní kontrolní séra HL a LL) založeném na koncentracích byl koeficient odchylky stanoven 5%. Pro odchylku mezi různými provedeními testu (n=13 vzorky; 3 různé dny) byl koeficient odchylky stanoven 3-15%. Stanovení prahových hodnot: Byly náhodně vybrány vzorky (negativní n=91, imunizované n=68, infikované n=107) za použití stratifické procedury. Empirické prahové hodnoty (prof. Ch. Kunz/Vienna) IgG protilátek proti klíšťové encefalitidě se srovnaly s hodnotami založenými na Youden-indexu [8].Díky použití tohoto přístupu se hodnoty dosahující 63 VIEU/ml označují za spodní hranici a 126 VIEU/ml horní hranici šedé zóny. Sensitivita resp. specifita testu mimo šedou zónu se pohybovala mezi 97 resp. 99% [9]. Poruchy: Hemolytické a lipemické vzorky neinterferují s testem. Nelze vyloučit zkříženou reakci protilátek proti jiným Flaviviridae (Dengue-Virus, virus Žluté horečky, West- Nile-Virus). 11. Literatura Hofmann, H. et al.; Rapid Diagnosis of Tick-Borne Encephalitis by Means of Enzyme Linked Immunosorbent Assay. J. Gen. Virol., 42, 505 (1979) Hofmann, H. et al.; Immunoglobulins of Tick-Borne Encephalitis in Cerebrospinal Fluid of Men; J. Med. Virol., 4, 241 (1979) Roggendorf, M. et al.: Serological Diagnosis of Acute Tick-Borne Encephalitis by Demonstration of Antibodies of the IgM Class, J. Med. Virol., 7, 41 (1981) Heinz, F. et al.; Comparison of Two Different Enzyme Immunoassays for the Detection of Immunoglobulin M Antibodies against Tick-Borne Encephalitis Virus in Humanserum and Cerebrospinal Fluid. J. Clin. Microbiol., 14, 141 (1981) Hofmann, H. et al.; ELISA for IgM Antibodies against Tick-Borne-Encephalitis Virus: Quantification and Standardization of Results; Zbl. Bakt. I. Orig., 255, 448 (1983) Hofmann, H. et al.; Detectability of IgM Antibodies against TBE Virus after Natural Infection and after Vaccination. Infection, 11/3, 164 (1983) Feldner, J.; RF-Absorbens: IgM-Antikörperbestimmung ohne Rheumafaktor-Interferenz; Lab. med., 14, 283 (1990) Roggendorf, M.: Frühsommer-Meningoenzephalitis - Wer soll geimpft werden? Therapiewoche, 40, 1173 (1990) Kießig, S. T. et al.: Bestimmung von Schwellenwerten (Cut-off) bei Enzymimmunoassays am Beispiel des FSME-ELISA [Problems of Cut-Off Level Determination in Enzyme Immunoassays: The Case of TBE ELISA], Klin. Lab., 39, 877 (1993) Tick-Borne Enzephalitis (TBE) and its immunprophylaxis. IMMUNO AG, Vienna (1997) Togni, G. u. a.: Präanalytik. Schweiz. Med. Forum (2002) Jääskeläinen A. et al., Diagnosis of Tick-Borne Encephalitis by a µ-capture Immunoglobulin M- Enzyme Immunoassay Based on Secreted Recombinant Antigen Produced in Insect Cells. J. Clin. Microbiol., Vol. 41, 9, (2003) PROGEN Biotechnik GmbH Maaßstraße 30, D Heidelberg Německo Datum vytvoření: FSME IgG cz_v6 5/5