Zobrazování účinků herbicidu na fotosyntézu mapováním chlorofylové fluorescence listů vyšších rostlin.

Transkript

1 Zobrazování účinků herbicidu na fotosyntézu mapováním chlorofylové fluorescence listů vyšších rostlin. Všechny děje spjaté s primárními reakcemi fotosyntézy se odehrávají na matrici tylakoidálních váčků, které v sobě uzavírají vodní fázi - tylakoidální lumen. Světelná energie zachycená trans-tylakoidálními proteinovými komplexy je přeměněna na energii chemickou ve formě ATP a NADPH, zároveň je oxidována voda a uvolňuje se kyslík. Bezprostřední produkty světelných reakcí fotosyntézy (ATP a NADPH) jsou využity v tylakoidálním stroma při fixaci CO, pohání kaskádu reakcí zvaných Benson-Calvinův cyklus, kam CO vstupuje ústřední reakcí s ribulózoubisfosfátem (RuBP) katalyzovanou enzymem RuBISCO. Konečným produktem Benson-Calvinova cyklu je molekula glukózy a regenerovaná molekula RuBP. Obrázek 1. Schéma světelných reakcí fotosyntézy. D. R. Ort. Vliv chemických látek na fyziologii rostlin byl studován od konce předminulého století. První pokusy s chloroformem v roce 1878 ukázaly, že je schopen reversibilně inhibovat fotosyntézu v koncentracích, které neovlivňovaly dýchání. Dalšími látkami, jejichž účinek na fyziologii

2 rostlin byl sledován byly alkaloidy (chinin, strychnin, morfin), dietyl éter, alkoholy, kyanid, hydroxylamin, dinitrofenol, různé plyny (H S, CO, SO, NO x ), azid sodný, o-fenantrolin a uretany. Inhibitory jako kyanid, hydroxylamin a H S byly považovány za katalytické jedy, interferující s atomy kovů (tvořící s nimi komplexy) v prostetických skupinách enzymů. Jiné, jako dinitrofenol měly reagovat se specifickými skupinami na katalyticky aktivních proteinech. Fyziologické efekty většiny látek byly již předtím zkoumány na živočiších, a tak byla známa celá řada obecných změn, které indukovaly. To platilo především pro dinitrofenoly a uretany. Chloroform a éter byly původně klasifikovány jako narkotika a usuzovalo se, že blokují aktivní povrchy. Dalšími látkami s anestetickými účinky byl uretan (etyl karbamát nebo etyl ester kyseliny karbamové) a fenyluretan (etyl ester N- fenylkarbamové kyseliny) a byly používány v veterinární medicíně pro své antineoplastické vlastnosti. Jako první použil uretan a fenyluretan ve výzkumu rostlinné fyziologie Otto Warburg. Nové technologie měření CO vyvinuté během. světové války umožnily měřit odpověď fyziologie celých rostlin na aplikaci herbicidů. Takto se potvrdily výsledky do té doby měřené inhibicí Hillovy reakce (HRA) na izolovaných chloroplastech. V šedesátých a sedmdesátých letech se směr bádání soustředil na studie inhibice HRA a její souvislosti se strukturálními, stérickými a fyzikálně chemickými vlastnostmi inhibitorů. Cílem bylo na základě těchto poznatků charakterizovat molekulární stavbu donorové strany PSII. Studium atrazin rezistentních mutantů přineslo informace o struktuře vazebného místa herbicidů. Rozeznání cíle účinku herbicidů v 3 kda membránovém proteinu, jehož primární sekvence byla později poznána pomohlo pochopit mechanismus vzniku atrazinové rezistence a zároveň přispělo k porozumění funkce D1 proteinu i celého reakčního centra. V osmdesátých letech byl již takzvaný herbicid vážící protein i celé reakční centrum poprvé charakterizováno a pochopeny základní principy přenosu a transformace energie světelných kvant ve volnou energii a cíle účinků mnoha typů herbicidů. V devadesátých letech bylo znovu využito vazby herbicidu na reakční centrum jako nástroje na rozpoznání detailní struktury Q B kapsy. Cílenými mutacemi v okolí aktivních míst na D1 proteinu se pozměňovala aktivita celého reakčního centra a hledaly se konzervované a variabilní sekvence. Dalším významným krokem v poznání funkce fotosystému bude jeho krystalizace a následná strukturální charakterizace, zatím se však nikomu krystaly reakčního centra fotosystému z vyšších rostlin nepodařilo připravit.

3 3-(3,4 -dichlorfenyl)-1,1-dimetylmočovina (DCMU, diuron) Mechanizmus účinku DCMU na rostliny spočívá v jeho vysoké afinitě k vazebnému místu pro plastochinon (Q B ) v proteinu D1, v takzvané Q B kapse. Sem za normálních podmínek difunduje z tylakoidní membrány oxidovaný plastochinon aby zde od primárního chinonu vázaného proteinem D (Q A ) postupně přijal dva elektrony. Po následné dvojí protonaci chinol opouští Q B kapsu a putuje ke komplexu cytochromu b 6 f kde oba elektrony postupně odevzdá. Jeho místo ihned obsadí nová molekula Q B a reakční centrum je tak připraveno na další dva foto-excitační cykly na jejichž konci dojde k rozštěpení dvou molekul vody v kyslík vyvýjejícím komplexu. Vazba DCMU v Q B kapse vede k zablokování přímého přenosu elektronů z Q A. Chinon Q A tak zůstává redukovaný a elektronu se zbavuje přenosem zpět na primární donor chlorofylového páru P680 a následnou re-emisí fluorescence. Q A Q B Q B H Q A Phe Q B Phe P 680 P 680 Obrázek. Schema otevřeného a zavřeného (zablokovaného) reakčního centra fotosystému II Fluorescence chlorofylu Světlo se často používá ke zkoumání specifických procesů uvnitř buňky - různé molekuly se tu liší svými absorpčními vlastnostmi, rozptylem, stejně jako emisí fluorescence a luminiscence. Měření fluorescence chlorofylu v rostlinách ale přináší informace nejen o tom, kde a v jaké koncentraci je chlorofyl, ale také o dynamických změnách výtěžku fotochemických reakcí. Fluorescence soutěží o energii excitovaných chlorofylů s fotochemií: čím efektivnější fotochemie, tím méně fluorescenční emise a naopak. Tento jednoduchý vztah je základem rozšířeného používání neinvazivních fluorescenčních technik ve výzkumu rostlinné fyziologie. Nejvýznamnější aplikace jsou zaměřeny na fluorescenci emitované z fotosystému II, kde je vazba mezi fotochemií a fluorescencí nejsilnější.

4 Ve fotosystému II je dosahováno rozdělení náboje s účinností až 80 %. Asi 3-8% energie absorbované anténou je znovu vyzařováno ve formě fluorescenční emise na červeném konci viditelného spektra světla. Zbytek energie je ztraceno ve formě tepla. Alternativní cesta deexcitace excitovaných stavů (luminiscence nebo mezisystémový přechod) je obvykle v intaktních rostlinách zanedbatelná. Při pokojové teplotě, je fluorescence chlorofylu fotosystému II tvořena z 80 % fotony s vlnovou délkou kratší než 700 nm a 50 % ze všech fotonů vyzařovaných nad 700 nm. Ostatní fotony pocházejí z fotosystému I a z chlorofylů vázaných anténními systémy. Více než 50 % změn kvantového výtěžku fluorescence PSII je řízeno redoxním stavem elektronového donoru Q A v mechanismu fotochemického zhášení. Otevřené reakční centrum PSII s oxidovaným akceptorem Q A je schopno stabilního rozdělení náboje a kvantový výtěžek fluorescence PSII je minimální, zatímco fotochemická účinnost PSII je maximální. Uzavřené reakční centrum s redukovaným Q A není schopno vykonávat primární rozdělení náboje, fotochemická účinnost PSII je nulová a kvantový výtěžech fluorescence PSII je maximální. Za předpokladu, že pravděpodobnost ostatních deexcitačních cest (např. tepla) je konstantní jak v otevřených tak uzavřených reakčních centrech, lze tedy předpokládat, že fluorescenční výtěžek PSII je nepřímo úměrný maximálnímu kvantovému výtěžku fotochemie. Kromě fotochemické kontroly redoxního stavu Q A může být fluorescenční výtěžek PSII ovlivněn i jinými mechanizmy, které jsou společně označovány jako nefotochemické zhášení. Mezi procesy, které zasahují do fluorescenčního výtěžku PSII nejvíce patří především reorganizace světlosběrných antén vedoucí k přednostní excitaci PSII nebo PSI, de-epoxidace xanthofylů vedoucí k přesměrování excitační energie na teplo, redoxní stav primárního donoru P680 +, primárního akceptoru Pheo - a kyslík vyvíjejícího komplexu a také množství dostupných molekul plastochinonu a jejich prostupnost tylakoidní membránou. Proto můžeme využít měření emise fluorescence ke studiu některého z těchto procesů, ale současně, díky množství procesů, které ovlivňují výtěžek fluorescence je interpretace těchto experimentů náročná. Je tedy třeba použít sofistikovaných protokolů, nástrojů a experimentálních podmínek, ve kterých je jen několik z těchto procesů účinných.

5 Fluorescence, relativní DCMU kontrola Čas, s Obrázek 3. Indukční křivka chlorofylové fluorescence listu tabáku (Nicotiana tabacum) s naneseným roztokem DCMU (šipka) Indukční křivka chlorofylové fluorescence Listy zdravých rostlin adaptované na tmu vyzařují při náhlém ozáření viditelným světlem chlorofylovou fluorescenci, která má typický průběh (obrázek 3 vlevo, modrá křivka). Na počátku je fluorescence nízká, rychle (během několika stovek milisekund) však roste, dosáhne lokálního maxima, které je často následováno mírným poklesem, po němž fluorescence dále roste až k maximální hodnotě (F P ) a pak již jen pomalu klesá. Průběh této takzvané fluorescenční indukce vypovídá o aktuálním stavu PSII, redoxním stavu plastochinolových molekul obklopující PSII i kapacitě dalších komponent fotosyntetického elektron transportního řetězce přijímat a přenášet elektrony. Lokální minima a maxima intenzity fluorescence chlorofylu vypovídají o existenci přechodných rovnovážných stavů které se ustavují ve fotosyntetickém aparátu adaptovaném na tmu během jeho přechodu do stavu adaptovaného na světlo. Fluorescenční indukční křivka tedy může sloužit jako neinvazivní způsob zjištění celkového fyziologického stavu listů, přestože neposkytuje specifické informace o průběhu jednoho konkrétního procesu. Úkol Pomocí kamerového systému FluorCam (PSI s.r.o., Brno) zobrazujícího chlorofylovou fluorescenci změřte indukční křivku chlorofylové fluorescence na listech tabáku. Porovnejte tvar křivky u zdravého listu a listu na který aplikujete herbicid DCMU. Graf okomentujte.

6 Obrázek 4. Schema zobrazovacího systému FluorCam (vlevo) a vlastní zařizení (vpravo) Časově rozlišené mapování chlorofylové fluorescence pomocí systému FluorCam Nejprve přineste rostlinu tabáku z fyronu (růstový inkubátor) do temné místosti, rozsviťte zelené stropní světlo a nasměrujte rostlinu tak, aby jeden zdravý list třetího patra zasahoval do měřící komory, ponechte rostlinu ve tmě nejméně půl hodiny. Zapněte napájecí zdroj a pak vlastní zařízení, spusťte ovládací program FluorCam v 6, v menu protocol otevřete měřící protokol fl_induction.p. Na horním panelu klikněte na červený blesk, kterým odstartujete měření. Po dokončení měření a načtení dat do PC označte horní a dolní mez rozsahu intenzity pixelů, které budou analyzovány a klikněnte na ikonu Analyze v dolním pravém rohu okna programu. Program samočinně vyhodnotí průběh měření a nakreslí graf závislosti průměrné hodnoty intenzity chlorofylové fluorescence označených segmentů listu na čase. Měření zopakujte poté, co jste nanesli na část listu malé množství herbicidu (10 l). Porovnejte průběh indukce na ošetřeném a neošetřeném místě listu.

7 APPENDIX 1: syntax měřícího protokolu fluorescenční indukce ;protocol body - generated by wizard ;version PK June 17, 005 include default.inc ;Includes standard options, do not remove it! ElectronicShutter=0 Sensitivity=75 Irradiance=100 f0duration=5s <0,1s..f0duration>=>mfmsub <0>=>avgstart <f0duration+40ms>=>m,avgstop <f0duration+80ms>=>actinlighton(10s+40ms) <f0duration+80ms,f0duration+80ms+40ms*..f0duration+10s+40ms>=>mfmsub <0s>=>checkPoint,"startFo" <f0duration+1500ms>=>checkpoint,"timevisual" <6s>=>checkPoint,"startFp" <10s>=>checkPoint,"endFp"

8 APPENDIX : nastínění fyzikálně-chemické podstaty závislosti míry inhibice fotosyntézy na koncentraci herbicidu, reakčních center a jejich zdánlivé vazebné konstanty Herbicidy inhibující fotochemické reakce v izolovaných chloroplastech byly běžně nazývány inhibitory Hillovy reakce. To proto, že původně byly jejich účinky zjišťovány za nefosforylujících podmínek, často s ferikyanidem jako elektronovým akceptorem. Později byly rozděleny do skupin podle místa účinku inhibice. Mějme herbicid H reagující s reakčním centrem RC za vzniku fotosynteticky neaktivního komplexu X k 1 H RC X k kde k 1 a k jsou rychlostní konstanty přímé a zpětné reakce. Rychlost vzniku komplexu X je a rychlost jeho disociace na reaktanty Pro reakci v rovnováze platí pak z rovnice vyplývá, že H RC v X k v X k X 1.3 v 1.4 X v X 1 k H RC kx H. RC k K X k kde K je rovnovážná disociační konstanta definující průběh reakce. Rovnovážná disociační konstanta však popisuje chování reakčních entit v ideálním roztoku a proto v reálných podmínkách počítáme se zdánlivou disociační konstantou K, která popisuje skutečné kinetiky reakcí v reálném prostředí. Herbicid DCMU použitý v této studii je hydrofobní povahy. Po jeho kontaktu s rostlinnou tkání se velmi rychle ustanoví rozdělovací rovnováha mezi vodnými a lipidickými fázemi přítomnými v systému buňky. Množství herbicidu dané rozdělovacím koeficientem P L/HO zůstane volně ve vodní fázi, zbytek je naabsorbován v lipidové fázi buněk (endomembránový systém) nebo na vnějších buněčných strukturách (buněčná stěna, inkrustace, vnější obaly). P c c H O 1.5 L Množství herbicidu [H] přítomného v systému se za předpokladu, že poměr objemu lipidové a vodní fáze je velmi malý pak rozděluje mezi dvě fáze podle vztahu V 1.6. L V H O c P L clvl ch OVH O clvl VH O H PcH OVL ch OVH O H 1.6.4

9 H V PVL c H 1 O VH H O O Tento složitý systém se liší od trojrozměrného ideálního modelu reakce v roztoku. Zdánlivá disociační konstanta odráží neideálnost chování reaktantů a je se skutečnou disociační konstantou ve vztahu K H. RC H RC H K X X X RC Dále platí, že Po dosazení těchto závislostí do rovnice je a po úpravě výrazu pak Tato rovnice má právě jedno řešení X K RC RC] X H H X [ H X RC X X 1.8 K RC H X RC H 0 X 1.9 K H RC K H RC 4H RC 1.10 Za předpokladu, že fotosyntetický výtěžek je funkcí koncentrace funkčních reakčních center, jež je za daných podmínek konstantní O f RC 1.11 pak mějme inhibici I způsobenou herbicidem X I 100. RC 1.1 z čehož po dosazení do rovnice 1.10 vyplývá, že míra inhibice fotosyntetickým herbicidem závisí na hodnotě zdánlivé vazebné konstanty, koncentraci reakčních center a koncentraci herbicidu podle rovnice 4. H. RC H RC K H RC. RC K I