Gelová elektroforéza ve výuce analytické chemie. Bakalářská práce. Eliška Kožuszniková

Transkript

1 Gelová elektroforéza ve výuce analytické chemie Bakalářská práce Eliška Kožuszniková Vedoucí práce: RNDr. Marta Farková, CSc. Brno 2014

2 Bibliografický záznam Autor: Eliška Kožuszniková Přírodovědecká fakulta, Masarykova Univerzita Ústav Chemie Název práce: Gelová elektroforéza ve výuce analytické chemie Studijní program: Chemie Studijní obor: Analytický chemik manažer chemické laboratoře Vedoucí práce: RNDr. Marta Farková, CSc. Akademický rok: 2013 / 2014 Počet stran: 51 Klíčová slova: gelová elektroforéza, nukleové kyseliny, agarózový gel, polyakrylamidový gel

3 Bibliographic entry Author: Eliška Kožuszniková Faculty of Science, Masaryk University Department of Chemistry Title of Thesis: Gel electrophoresis in teaching analytical chemistry Degree Programme: Chemistry Field of Study: Analytical Chemist Manager of Chemical Laboratory Supervisor: RNDr. Marta Farková, CSc. Academic Year: 2013 / 2014 Number of Pages: 51 Keywords: gel electrophoresis, nucleic acids, agarose gel, polyacrylamide gel

4

5 Poděkování Tímto bych ráda poděkovala vedoucí mé bakalářské práce RNDr. Martě Farkové, CSc. za její pomoc a cenné rady, které mi poskytla. Rovněž bych chtěla poděkovat Ing. Heleně Zavadilové za pomoc při řešení problematiky gelové elektroforézy a především za čas, který mi věnovala. V neposlední řadě děkuji Mgr. Miroslavě Bittové, Ph.D. za to, že mi umožnila práci s polyakrylamidovou gelovou elektroforézou. Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Gelová elektroforéza ve výuce analytické chemie vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. V Brně dne Eliška Kožuszniková

6 Abstrakt Tato bakalářská práce se zabývá metodou gelové elektroforézy a jejím využití ve výuce analytické chemie. Teoretická část je zaměřená na popis struktury a funkce nukleových kyselin a objasnění principu gelové elektroforézy. V experimentální části práce byly zkoumány vzorky plazmidové DNA z komerčního kitu firmy Bio-Rad a vzorky DNA izolované z banánu. Tyto vzorky byly separovány metodou horizontální elektroforézy na agarózovém gelu a metodou vertikální elektroforézy na polyakrylamidovém gelu. Praktická část práce zahrnuje popis přípravy vzorků, roztoků, optimalizace metody a výsledky separace. Abstract This work deals with the method of gel electrophoresis and its use in teaching analytical chemistry. The theoretical part focuses on the structure and function of nucleic acids and clarifies the principle of gel electrophoresis. In the experimental part of the study were examined the samples of plasmid DNA from a commercial kit from Bio-Rad and DNA samples, which were isolated from banana. These samples were separated by horizontal agarose gel electrophoresis and by vertical polyacrylamide gel electrophoresis. In the practical part of this work are included descriptions of sample preparation, making solutions, optimalization of method and separation results.

7 OBSAH I. ÚVOD... 9 II. TEORETICKÁ ČÁST Nukleové kyseliny Složení nukleových kyselin Nukleosidy Nukleotidy Struktura nukleových kyselin Typy nukleových kyselin Gelová elektroforéza Historie Princip metody Nosiče v elektroforéze Pufry v elektroforéze Faktory ovlivňující průběh elektroforézy III. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Přístrojové vybavení Použité chemikálie Příprava vzorků Enzymový mix EcoRI/Pstl Vzorky DNA z forenzního kitu Vzorky DNA izolované z banánu Vzorky oligonukleotidů Příprava roztoků TAE pufr TBE pufr % APS... 31

8 6.4 Roztok barviva Stains-All Roztok barviva Fast Blast Postup při elektroforéze na agarózovém gelu Příprava agarózového gelu Příprava a nanesení vzorků na gel Průběh separace Vizualizace DNA fragmentů Postup při polyakrylamidové gelové elektroforéze Příprava polyakrylamidového gelu Příprava a nanesení vzorků na gel Průběh separace Vizualizace oligonukleotidů a DNA fragmentů IV. VYHODNOCENÍ A DISKUZE Vyhodnocení separované DNA z forenzního kitu Optimalizace agarózové gelové elektroforézy Úprava koncentrace vzorků Optimalizace koncentrace agarózového gelu Výběr napětí a doby separace Vyhodnocení gelu Polyakrylamidová gelová elektroforéza V. ZÁVĚR VI. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK VII. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY VIII. PŘÍLOHY... 47

9 I. ÚVOD Nukleové kyseliny patří mezi nejdůležitější složky živých organismů. Jsou to látky biomakromolekulární povahy, které ve své struktuře uchovávají genetickou informaci. Ta zajišťuje přenos dědičných znaků na potomstvo. Genetický materiál musí podléhat změnám, aby se organismy mohly přizpůsobit odlišnostem v prostředí a mohla tak probíhat evoluce. Poznatky získané studiem DNA umožnily prozkoumat procesy v živých organismech a rozvinout mnoho oborů, mezi které patří například lékařská diagnostika, genové inženýrství, zemědělství či kriminalistika. Pomocí metod molekulární biologie byl učiněn velký průlom v diagnostice genetických onemocnění. Dnes již běžně dostupné diagnostické testy umožňují informovat rodiny o riziku, že se jim narodí postižené dítě. I kriminalistika dosáhla značného vývoje- díky srovnávání vzorků DNA je možno předejít chybám v justičním systému. Molekuly DNA, RNA nebo proteinů lze separovat pomocí gelové elektroforézy. Tato elektromigrační metoda umožňuje oddělení jednotlivých fragmentů podle velikosti. Gelová elektroforéza je vhodná jak pro preparativní, tak pro analytické účely. Elektroforetická separace je ovlivňována řadou faktorů, mezi které patří například napětí, doba separace, použitý gel či koncentrace vzorků. Těmto faktorům je nutno věnovat pozornost, aby separace byla co nejefektivnější. 9

10 II. TEORETICKÁ ČÁST 1 Nukleové kyseliny Nukleové kyseliny nebo také polynukleotidy jsou klíčové látky pro správnou funkci buněčného jádra. Ačkoli je jejich význam jiný než význam ostatních složek cytoplazmy, patří k zásadním složkám živé hmoty. Nukleové kyseliny obsahují záznam o morfologické a funkční struktuře živých organismů, čímž určují to, jak bude fungovat buňka a nepřímo i celý organismus. [1] 1.1 Složení nukleových kyselin Nukleové kyseliny jsou v podstatě složeny ze tří částí. Kyselá část je tvořena kyselinou fosforečnou, zásaditou část nukleových kyselin tvoří purinové a pyrimidinové báze, zatímco cukerná část je tvořena β-d-ribosou nebo 2 -deoxy-β-dribosou. Jedinečnost nukleových kyselin vyplývá ze sekvence bází v polynukleotidovém řetězci. [2] Kyselá část Kyselina fosforečná se v organismech vyskytuje nejen ve formě solí, ale je přítomna hlavně ve formě organofosfátů. Nejvýznamnější organofosfáty v živých organismech jsou nukleotidy a z nich složené nukleové kyseliny. [3] Kyselina fosforečná je součást nukleových kyselin nezbytná pro jejich existenci. [4] V polynukleotidech se kyselina fosforečná vyskytuje jako zbytek, který je od této kyseliny odvozen odštěpením dvou atomů vodíku. [5] Zásaditá část V nukleových kyselinách DNA a RNA jsou významnými heterocyklickými bázemi pyrimidiny cytosin, thymin a uracil a puriny adenin a guanin. [2] Tyto heterocyklické sloučeniny umožňují nukleovým kyselinám uchovávat a předávat informace. Mezi nejdůležitější vlastnosti purinových a pyrimidinových bází patří komplementarita jejich struktur. Mezi bází a její příslušnou doplňkovou strukturou vzniká vodíková vazba, což umožňuje čtení genetického kódu. [3] 10

11 Purinové báze Purin je aromatická heterocyklická sloučenina sestávající z kondenzovaného imidazolového a pyrimidinového kruhu. V čistém stavu je purin zásaditá, krystalická látka. Nukleové báze jsou purinové deriváty, které mají obrovský biologický význam. [3][6] Struktura purinových bází je znázorněna na obrázku 1. [7] Syntetické purinové deriváty se v medicíně používají jako léčebné prostředky při onemocnění dnou, zatímco syntetické analogy přírodních bází lze použít k zastavení dělení nádorových buněk. [2] Obr. 1: Purinové báze Pyrimidinové báze Pyrimidin je aromatická organická sloučenina, která obsahuje dva atomy dusíku v pozicích 1 a 3 pyrimidinového heterocyklu. V nukleových kyselinách můžeme najít pyrimidinové deriváty cytosin, thymin a uracil. [3] Struktura pyrimidinových bází je vyznačena v obrázku 2. [7] Obr. 2: Pyrimidinové báze 11

12 Komplementarita bází Doplňkové neboli komplementární báze jsou dvojice jedné purinové a jedné pyrimidinové báze, které do sebe v prostoru dokonale zapadají. Díky optimální vzdálenosti a orientaci vznikají mezi bázemi vazebné interakce (vodíkové vazby). Komplementární báze jsou adenin s thyminem nebo uracilem, které spolu vytváří dvě vodíkové vazby a guanin s cytosinem, mezi kterými vznikají tři vodíkové vazby. [3] Vazby mezi komplementárními bázemi jsou znázorněny na obrázku 3. [8] Obr. 3: Párování bází Cukerná část Nukleové kyseliny se dělí podle sacharidové složky na ribonukleové kyseliny (RNA) a deoxyribonukleové kyseliny (DNA). Odlišnost v chemickém složení se odráží na jejich funkci v organismu, která je pro DNA a RNA jiná. [4] Deoxyribonukleová kyselina v sobě uzavírá genetický materiál, zatímco ribonukleová kyselina se přímo účastní biosyntézy bílkovin. [9] V ribonukleové kyselině se nachází β-d-ribosa, která se řadí mezi monosacharidy. Deoxyribonukleová kyselina obsahuje 2 -deoxy-β-d-ribosu, což je monosacharid odvozený od β-d-ribosy. Ve struktuře β-d-ribosy je hydroxylová skupina nahrazena atomem vodíku a tím vzniká 2 -deoxy-β-d-ribosa. Oba tyto monosacharidy 12

13 patří do skupiny aldopentóz. [3] Chemická struktura sacharidových složek nukleových kyselin je popsaná na obrázku 4. [10] Obr. 4: Strukturní vzorec cukerné složky nukleových kyselin 1.2 Nukleosidy Nukleosidy patří mezi heteroglykosidy, které vznikají spojením nukleové báze a cukerné složky. Poloacetalová hydroxylová skupina sacharidu na uhlíku 1 je obzvláště reaktivní. Reaguje s atomem N 9 u purinových a s atomem N 1 u pyrimidinových bází za vzniku glykosidické vazby. [3] Chemické a fyzikálně-chemické vlastnosti nukleosidů odpovídají vlastnostem jejich částí- bází a sacharidů. Nukleosidy jsou bílé krystalické látky, které mají hydrofilní charakter, jsou poměrně dobře rozpustné ve vodě. [3] Nukleosidy mají triviální názvy, které jsou odvozené od názvu bází. Pyrimidinové nukleosidy nesou názvy končící na idin, zatímco purinové nukleosidy mají koncovku osin. [1] Ve schematických vzorcích se pro báze používá systém třípísmenových zkratek, pro nukleosidy se používá častěji systém zkratek jednopísmenových. Názvy bází, jejich nukleosidů a příslušné zkratky jsou uvedeny v tabulce 1. [4] Pokud nukleosid obsahuje deoxyribosu, předřazuje se před značku nukleosidu písmeno d (např. da, dg). [4] Tabulka 1: Přehled nukleových bází a jejich nukleosidů 13

14 1.3 Nukleotidy Nukleotidy jsou základními stavebními kameny nukleových kyselin. Jsou to látky složené z pyrimidinové nebo purinové nukleové báze, pětiuhlíkatého monosacharidu ribosy nebo deoxyribosy a jednoho či více zbytků kyseliny fosforečné. Mezi kyselinou fosforečnou a OH skupinou na uhlících C 2, C 3 a C 5 v případě ribosy a C 3 a C 5 u deoxyribosy v nukleosidech vzniká esterová vazba. [3] Připojením fosfátu jednoho nukleotidu na monosacharid dalšího nukleotidu vznikají nukleové kyseliny. [11] Mezi vlastnosti nukleotidů lze uvést jejich kyselý charakter, který nukleotidy mají díky zbytku kyseliny fosforečné. Při ph 7 proto mají dva i více záporných nábojů. Nukleotidy jsou dobře rozpustné ve vodě a kvůli přítomnosti purinových a pyrimidinových bází výborně absorbují ultrafialové záření v oblasti okolo 260 nm, čehož lze využít v analýze nukleových kyselin i nukleotidů. Separace nukleotidů probíhá snadno jak chromatograficky, tak i elektroforeticky. [3] Nukleotidy nejsou pouze složkou nukleových kyselin, ale jsou také důležitou součástí koenzymů jako je FAD, NAD +, NADP + nebo koenzymu A. Syntetické analogy nukleotidů jsou využívány i v lékařství jako inhibitory dělení buněk tumorů a množení některých druhů virů. Takové léky inhibují určité enzymy nebo mohou nahrazovat přírodní nukleotidy při syntéze DNA a RNA. [2] 1.4 Struktura nukleových kyselin Mezi podstatné vlastnosti nukleotidů patří i schopnost polymerace. Nukleotidy se spojují v místech pentosových zbytků pomocí kyseliny fosforečné za odštěpení molekul vody. Mezi 3 -hydroxylovou skupinou jednoho nukleotidu a 5 -hydroxylovou skupinou následujícího nukleotidu vzniká fosfodiesterová vazba. Opakovaným napojováním nukleotidů se tvoří polynukleotidový řetězec s lineární strukturou, který má dva různé konce. Polynukleotidový řetězec má tedy směr, ve kterém je zapsaná informace čtena, a to vždy od 5 -konce k 3 -konci. [3] Pořadí nukleotidů v polynukleotidovém řetězci udává primární strukturu nukleových kyselin. Toto pořadí nukleotidů je pro každý živý organismus charakteristické. [12] Sekundární struktura je jedna ze zásadních odlišností RNA a DNA. Ribonukleová kyselina má sekundární strukturu jednodušší, má buď podobu šroubovice (mrna, rrna) nebo jetelového listu (trna). Struktura jetelového listu může 14

15 vzniknout mnohonásobným ohybem polynukleotidového řetězce a zdvojením některých úseků. Sekundární struktura deoxyribonukleové kyseliny má vždy podobu dvojité šroubovice, která je tvořena dvěma polynukleotidovými řetězci. [13] Dvojšroubovicové struktury se mnohdy stáčejí do šroubovic vyšších řádů a tvoří tak terciární strukturu. S terciární strukturou se můžeme setkat u molekul DNA, molekuly RNA vytvářejí spíše složité nesymetrické struktury. [3] 1.5 Typy nukleových kyselin Nukleové kyseliny mohou být rozlišeny na dva hlavní typy podle jejich chemického složení. Prvním typem je deoxyribonukleová kyselina (DNA), jejíž cukernou částí je 2 -deoxyribosa, a druhým typem je ribonukleová kyselina (RNA), která obsahuje sacharid ribosu. DNA a RNA se neliší pouze cukernou složkou, ale liší se ještě v jedné z pyrimidinových bází: zatímco ribonukleová kyselina obsahuje uracil, v deoxyribonukleové kyselině se vyskytuje jeho methylderivát, thymin. [3] Ribonukleová kyselina (RNA) RNA je z chemického hlediska značně podobná DNA, ale na rozdíl od ní nevykazuje tak vysokou stabilitu. [4] RNA, podobně jako DNA, je dlouhý nerozvětvený polymer složený z ribonukleotidů, které jsou připojovány fosfodiesterovými vazbami ve směru 3 5. Ribonukleová kyselina obsahuje místo 2 -deoxyribosy sacharid ribosu, který má navíc jednu hydroxylovou skupinu. Další odlišnost je v nukleové bázi, v RNA se vyskytuje uracil namísto thyminu. Uracil se, podobně jako thymin, páruje s adeninem, ale neobsahuje methylovou skupinu přítomnou v thyminu. [14] Molekuly RNA mohou být jednovláknové nebo dvouvláknové. Ribonukleová kyselina nemůže vytvořit dvojitou šroubovici jako DNA kvůli přítomnosti 2 -hydroxylových skupin ve struktuře ribosy, dihelikální struktury tedy vznikají svinutím odlišných částí řetězce za vzniku vlásenkových smyček. Párování v těchto smyčkách není tak perfektní jako v molekule DNA, může se tedy stát, že některé z protilehlých bází nejsou komplementární. [3][14] Ribonukleové kyseliny jsou v buňce přítomny ve formě několika typů, lišících se velikostí, strukturou molekuly a funkcí. Nejběžnějším typem buněčné RNA je ribozomová RNA (rrna), která představuje přibližně 80 % ribonukleové kyseliny v buňce. Ribozomová RNA je základním stavebním materiálem buněčných organel ribozomů. Tvoří kostru jejich dvou podjednotek (malé a velké), které mají kulovitý tvar 15

16 a mají schopnost vázat bílkovinné složky ribozomů. [3] Transferová RNA (trna) tvoří zhruba 15 % celkové buněčné RNA. Funkce trna spočívá v přenosu aminokyselinového zbytku do ribozomu, kde probíhá biosyntéza proteinu a v jeho zařazení na správné místo v pořadí aminokyselin ve vznikající bílkovině. Dalším typem ribonukleové kyseliny je mediátorová RNA (mrna), jejíž biologickou funkcí je transfer genetické informace o určitém pořadí aminokyselinových zbytků v bílkovině z DNA, obsažené v jádře buňky, do místa proteosyntézy. [4] Deoxyribonukleová kyselina (DNA) Mezi základní charakteristické znaky živých systémů patři jejich schopnost předávat dispozice pro strukturní znaky, funkční projevy a zvláštnosti vývoje budoucím generacím. Tato vlastnost umožňuje různým druhům organismů zachování rysů, které jsou pro ně charakteristické. Zkušenosti získané za miliardy let jejich vývoje nazval H. Spencer v roce 1863 dědičností. [15] Genetická informace veškerých živých organismů je uložena v DNA, s výjimkou některých virů, jejichž genetickou informaci nese RNA. [16] Historie Nukleové kyseliny byly objeveny v roce 1869 švýcarským chemikem Friedrichem Miescherem. Miescher založil svou práci na výzkumu bílých krvinek extrahovaných z hnisu ulpělého na obvazech, které získával z místní nemocnice. K vymytí hnisu z obvazů používal solných roztoků a po přidání slabě alkalického roztoku došlo k rozpadu buněk a vysrážení jader z roztoku. Z buněčného jádra poté izoloval chemickou sloučeninu, kterou nazval nuclein. Nukleové kyseliny objevil i ve spermatu ryb a jiném biologickém materiálu, vyjádřil tedy jako první domněnku, že nukleové kyseliny by mohly být základem dědičnosti. Ještě před ním získal z vinných kvasinek frakci bohatou na nukleové kyseliny francouzský lékárník H. Braconnot, ale o tuto látku se pak již blíže nezajímal. [3][17] Existence polynukleotidových řetězců, které byly hlavní složkou kyselého materiálu v Miescherově nucleinu, byla prokázána až v roce 1944 a struktura dvojité šroubovice byla objevena teprve v roce Mnoho genetiků v roce 1953 pořád ještě odmítalo fakt, že genetickou informaci nesou spíše nukleové kyseliny než proteiny, vzhledem k menší strukturní variabilitě nukleových kyselin. [16] 16

17 Struktura DNA Deoxyribonukleová kyselina má strukturu pravotočivé dvojité šroubovice, v níž se dva polynukleotidové řetězce obtáčí vzájemně kolem sebe ve spirále. Každý polynukleotidový řetězec je tvořen sekvencí nukleotidů navzájem spojených fosfodiesterovými vazbami, které propojují sacharidové skupiny. Mezi bázemi opačných vláken jsou vytvořeny vodíkové vazby. Párování bází je velice specifické, guanin tvoří s cytosinem tři vodíkové vazby, zatímco adenin se vždy páruje s thyminem za vzniku dvou vodíkových vazeb. Po analýze složení DNA různých organismů bylo zjištěno, že koncentrace thyminu je vždy rovna koncentraci adeninu a koncentrace cytosinu se rovná koncentraci guaninu. [16] Specifická struktura DNA nese určité rysy, které umožňují její funkci. Mezi tyto rysy patří i hydrofilní charakter vnější části dvojité šroubovice, která je záporně nabitá. Na povrchu molekuly DNA je vytvořen velký a malý žlábek, které umožňují interakci DNA s bílkovinnými složkami nukleoproteinových komplexů nebo s antibiotiky. Důležitou vlastností je také schopnost dvojšroubovice rozvíjet se a zpřístupnit tak genetickou informaci, která je v ní obsažená. [3] Struktura dvojité šroubovice DNA je znázorněna v obrázku 5. [18] Stejně jako proteiny i DNA může denaturovat vlivem zvýšené teploty, organických rozpouštědel nebo tenzidů či působením extrémního ph. Nativní struktura DNA se zhroutí, dojde k oddělení komplementárních řetězců a vytvoření neuspořádané struktury. [11] Obr. 5: Struktura dvojité šroubovice 17

18 Izolace a purifikace nukleových kyselin Izolace nukleových kyselin z biologického materiálu je možná po dokonalém rozrušení jeho struktur. Nukleové kyseliny mohou být z biologického systému extrahovány do vodného roztoku, který obsahuje pufr s přísadou tenzidů, jejichž účinkem dochází k uvolnění nukleových kyselin z vazby s proteiny. Jako deproteinační činidla slouží nejčastěji fenol, chloroform nebo chloristan sodný. Běžně se také aplikují inhibitory enzymů štěpících nukleové kyseliny, které se nazývají nukleasy. [3][11] Frakce DNA a RNA lze od sebe oddělit již během extrakce, RNA se extrahuje do roztoků s nízkou koncentrací solí a při hodnotě ph 6,0, zatímco DNA se lépe extrahuje do roztoků s vyšší koncentrací solí při vyšším ph roztoku fenolu 7,4. K purifikaci nukleových kyselin z jejich surových preparátů, které jsme získali extrakcí, se používá nejčastěji gelová či afinitní chromatografie, centrifugace v hustotním gradientu anebo je použita frakcionace elektroforézou na polyakrylamidovém gelu. [3] Sekvenování DNA Historie určování sekvence nukleotidů v nukleových kyselinách nesahá daleko do minulosti. Teprve v roce 1965 R. Holley prezentoval sekvenci kvasničné trna složené ze 76 nukleotidů a to po sedmi letech výzkumu. Techniky sekvenace DNA byly prudce rozvinuty až po roce 1975, kdy byly objeveny restrikční endonukleasy. [11] Restrikční endonukleasy jsou enzymy, které umožňují štěpit dvouvláknovou DNA v místě se specifickou symetrickou sekvencí. Tuto rozpoznávací sekvenci tvoří určité pořadí čtyř až osmi bází, restrikční endonukleasy II v tomto místě DNA rozštěpí na restrikční fragmenty. Fragmenty mohou být separovány podle velikosti gelovou elektroforézou. [9][11] DNA lze štěpit i chemicky. 5 -konec DNA je označen radioaktivním fosforem navázáním značeného fosfátu reakcí s γ- 32 P-ATP katalyzovanou polynukleotidkinasou. DNA je označena tak, aby každá její molekula byla štěpena pouze jednou. Štěpení řetězce DNA právě před konkrétními bázemi můžeme ovlivnit výběrem činidla a postupu. Po chemickém štěpení mohou být fragmenty DNA separovány gelovou elektroforézou. [11] Funkce genetického materiálu DNA je nositelkou genetické informace a jejím úkolem je plnit tři základní funkce. Genetický materiál se musí replikovat a předávat tak genetickou informaci 18

19 z rodičů na potomstvo po celé generace. Druhou funkcí genetického materiálu je řízení růstu a vývoje organismu od jednobuněčné zygoty až po dospělého jedince. Musí také plnit evoluční funkci neboli mutaci. Genetický materiál musí podléhat změnám, aby se organismy mohly přizpůsobit odlišnostem v prostředí a mohla probíhat evoluce. [16] Využití DNA Poznatky získané studiem DNA se uplatnily v různých oborech, mezi které patří například lékařská diagnostika, genové inženýrství, zemědělství nebo také kriminalistika. Molekulární diagnostika onemocnění člověka umožnila velký průlom v novodobém lékařství. Mutantní alely, které způsobují dědičná onemocnění, mohou být často detekovány díky testům DNA. Testy mohou být prováděny i s minimálními objemy DNA, neboť využívají metody pro namnožení konkrétního úseku DNA. Tato metoda amplifikace DNA je nazvána PCR neboli polymerázová řetězová reakce a má zásadní význam nejen při detekci genetických poruch, ale také pro diagnostiku patogenních mikroorganismů. Dostupnost diagnostických testů pomohla rozvoji genetického poradenství, které umožňuje informovat rodiny o riziku, že budou mít postižené děti. Genová terapie, kdy dochází ke vnášení funkční kopie genu do organismu pacienta se dvěma defektními kopiemi určitého genu, je možným nástrojem léčby dědičných onemocnění člověka, ale současné výsledky genové terapie nejsou zatím velmi uspokojivé. [11][16] Čím dál častější je i testování otcovství. V minulosti byly případy sporného otcovství často rozhodovány na základě srovnávání krevních skupin dítěte, matky a možných otců. Porovnání krevních skupin může vyloučit otce s určitou krevní skupinou, neumožňuje však pozitivní identifikaci otce. Profil DNA slouží k identifikaci jedince, a proto je používán jako účinný nástroj nejen při testování otcovství, ale i v soudním vyšetřování. Spory ohledně využívání metody zkoumání profilu DNA při soudních šetřeních pramení zejména z nedůvěry v kompetenci výzkumných laboratoří, které toto vyšetření provádějí. Existují zde rizika lidské chyby při tvorbě profilů DNA a metod pro výpočet pravděpodobnosti, že dva lidé mají stejný profil DNA. [16] Genové inženýrství má uplatnění v mnoha oborech, od lékařství až po průmysl a zemědělství. Nejkontroverznějším tématem poslední doby jsou geneticky modifikované organismy, známé také pod zkratkou GMO. Mezi geneticky modifikované organismy patří takové organismy, jejichž genetická informace byla 19

20 úmyslně pozměněna přidáním nebo vyjmutím nějakého genu. V zemědělství se metodou genetické modifikace upravují rostliny, aby byly odolnější vůči škůdcům, což snižuje znečištění způsobené herbicidy a pesticidy. Modifikované rostliny mohou mít vyšší nutriční hodnotu, větší odolnost proti chladu i vyšší rychlost růstu. Geneticky modifikované rostliny jsou ale často odsuzovány kvůli neprozkoumanému vlivu na organismus, vyvolávání alergických reakcí nebo kvůli snižování biodiverzity a negativnímu vlivu na užitečný hmyz. [19] Plazmidová DNA Genetický materiál bakterií je uložen v jednom hlavním chromozomu, stejně jako v extrachromozomových molekulách DNA nazvaných plazmidy. Plazmidy mají tvar kruhové dvojšroubovice DNA. Většina plazmidů není nezbytná pro přežití buňky, avšak za určitých podmínek mohou být plazmidy pro buňku nepostradatelné, například pokud je v růstovém prostředí přítomno antibiotikum a plazmidy nesou geny pro rezistenci vůči tomuto antibiotiku. [11][16] 2 Gelová elektroforéza Molekuly DNA, RNA nebo proteinů lze separovat metodou gelové elektroforézy a poté rozdělené fragmenty dále analyzovat různými postupy. Elektroforéza patří mezi metody, které se využívají jak pro analytické, tak pro preparativní účely. Tato metoda je vysoce účinným nástrojem pro rozdělování makromolekul s různou velikostí a nábojem. [16][20] 2.1 Historie V roce 1892 byl poprvé popsán pohyb anorganických částic koloidního roztoku v elektrickém poli. Zanedlouho bylo prokázáno, že podobným způsobem putují i proteiny ve vodných roztocích. [21] Ve dvacátém století byl dále rozvíjen koncept elektroforézy jako techniky, která aplikuje elektrické pole na částice v matrici a tím způsobuje jejich migraci. [22] První aparaturu pro elektroforézu sestavil v roce 1930 švédský chemik Arne W. Tiselius, který za vyvinutí této metody obdržel Nobelovu cenu. Tiselius je právem označován za otce elektroforézy. [23] 20

21 2.2 Princip metody Elektroforéza patří do skupiny elektromigračních separačních metod. Tyto metody využívají rozdílné pohyblivosti nabitých částic v elektrickém poli k jejich oddělení. [24] Princip elektroforézy spočívá v migraci elektricky nabitých částic v elektrickém poli. Toto elektrické pole je stejnosměrné a je vytvořeno vložením konstantního stejnosměrného napětí mezi dvě elektrody. Velikost částic se může lišit, lze separovat jednoduché ionty i makromolekuly. Elektroforéza je často využívaná k separaci biologických vzorků v biochemii, například bílkovin či nukleových kyselin. [24] Elektroforéza je často provedena na vhodném typu nosiče, nejčastěji tedy na gelu. Běžně se používají dva typy gelů, agarózový a polyakrylamidový, na které je nanesen vzorek. Celý gel je poté ponořen do pufru, který zde funguje jako vodivostní médium a udržuje také stabilní ph během celé separace. [25] Rychlost pohybu nabité částice v elektrickém poli o jednotkové intenzitě je vyjadřována pomocí elektroforetické pohyblivosti μ. Částice mají rozdílnou pohyblivost. Pokud všechny částice na začátku separace vychází ze stejné pozice, pak se během dělení dostávají dopředu nabité částice s větší pohyblivostí, zatímco částice s menší pohyblivostí se opožďují a tím dochází k jejich oddělení. V elektrickém poli o intenzitě E působí na částici o náboji Q dvě síly: první je elektrická síla F 1 = QE, která uvádí částici do pohybu, a druhá je odpor viskózního prostředí F 2 = kv, který částici zpomaluje. Koeficient k závisí na tvaru a velikosti částice a na viskozitě prostředí η. V počátečním okamžiku je rychlost v nulová a částice je silou F 1 uvedena do pohybu. S rostoucí rychlostí v se zvyšuje síla F 2, obě síly se po čase vyrovnají a nastane stacionární stav. Nabité částice se pak pohybují v elektrickém poli konstantní rychlostí. [24] [25] Elektroforetická pohyblivost μ je dána vztahem: Rychlost částice může být v koncentrovaných roztocích často omezována dvěma jevy: elektroforetickým efektem a relaxačním efektem. Nabité částice kolem sebe tvoří solvatační obal. Pokud je v roztoku vysoká koncentrace iontů, které se pohybují ve viskózním prostředí, dochází pohybem iontů ke strhávání okolní kapaliny jejich 21

22 solvatačním obalem a vytvoření hydrodynamického toku kapaliny. Tento jev byl popsán jako elektroforetický efekt. Relaxační efekt má elektrostatickou povahu. Ion se nachází ve středu svého solvatačního obalu, ale pohybem se nabitá částice dostává mimo jeho střed. Než se vytvoří nový obal, je nabitá částice přitahována původním obalem v opačném směru zpět do svého středu, ve kterém je náboj odlišný od náboje iontu. [24] [26] [27] 2.3 Nosiče v elektroforéze Je-li elektroforéza prováděna ve volném roztoku, separaci znesnadňuje difúze ve snaze vyrovnat koncentraci složek v celém objemu. Separované látky jsou proto fixovány na vhodném nosiči, který je napuštěn elektrolytem. Gelová elektroforéza používá často jako nosič agarózový nebo polyakrylamidový gel. [24] Agarózový gel Agar je extrahován z červené mořské řasy. Při jeho získávání mohou být odděleny dvě frakce, první z nich, s vysokým obsahem sulfátových a karboxylových skupin, nese název agaropektin, zatímco druhá frakce nazvaná agaróza je téměř neutrální. [28] Agaróza je lineární polysacharid tvořený D-galaktosovými a 3,6-anhydro-L-galaktosovými podjednotkami, které se v její struktuře pravidelně střídají. Průměrná molekula agarózy obsahuje základních jednotek. [29] Techniky, jako je elektroforéza na agarózovém gelu s efektem molekulárního síta, jsou velmi důležité zejména v biochemii. Koncentrace agarózového gelu udává velikost pórů a je tak důležitým faktorem mobility. DNA fragmenty o různé velikosti se pohybují na agarózových gelech o různé koncentraci odlišnou rychlostí. Čím koncentrovanější je agarózový gel, tím je separace pomalejší a je zajištěna lepší separace krátkých fragmentů. [28] [30] [31] Výhody a nevýhody agarózového gelu Mezi nesporné výhody agarózového gelu patří jeho snadná příprava. Ta spočívá ve smíchání práškové agarózy s pufrem, celý roztok se uvede do varu a po mírném vychladnutí je nalit do formy. Agarózový gel je netoxický, bezpečný pro práci a jeho likvidace je zcela bezproblémová. [29] Velkou nevýhodou je přírodní původ agarózy, jednotlivé šarže se od sebe mohou lišit, byť jsou dodány stejným výrobcem. To může zapříčinit mírnou odlišnost výsledků 22

23 získaných z tohoto gelu. DNA izolovaná z agarózového gelu může být znečištěna určitými látkami, jako jsou sacharidy nebo ionty kovů. Ty mohou inhibovat další reakce, kupříkladu restrikční štěpení. [29] Průběh elektroforézy na agarózovém gelu Pohyb molekul DNA v elektrickém poli závisí na velkém množství faktorů, ať už je to konformace molekuly DNA, složení použitého pufru nebo koncentrace agarózového gelu. Koncentrace agarózového gelu je udávána v procentuálním množství agarózy na objem použitého pufru (w/v), obvykle se tato koncentrace pohybuje v rozmezí 0,3 3 %. [32] Pro vizualizaci DNA se často používá ethidium bromid, který je možno nanést přímo do vzorku, do elektroforetického pufru anebo v nejběžnějším případě přimíchat do agarózového gelu, na kterém je separace prováděna. Ethidium bromid (EtBr) patří mezi interkalační činidla, váže se dovnitř dvojité šroubovice vmezeřením mezi jednotlivé báze. Po ozáření ultrafialovým světlem (UV) oranžově fosforeskuje. Ethidium bromid je karcinogen, takže gely s jeho přídavkem musí být uskladněny ve speciálních nádobách. Proto se často používají místo EtBr zdravotně nezávadné náhražky. [33] [34] Pro agarózový gel bylo vyvinuto mnoho různých aparatur, elektroforéza může probíhat jak horizontálně, tak i vertikálně. Agarózový gel se nanáší na podpůrnou destičku, která je potom i s gelem ponořena do vany obsahující vhodný elektroforetický pufr. Jamky jsou v gelu vytvořeny pomocí tzv. hřebenu, který je umístěn do chladnoucí agarózy ještě předtím, než agaróza zgelovatí. Do těchto jamek je poté nanesen analyzovaný vzorek, který je smíchán s ukládacím barvivem, jehož úkolem je zvyšovat hustotu, aby vzorky klesly na dno jamky. [32] Výsledkem separace molekul DNA jsou oddělené zóny. Přítomnost konkrétní zóny může sloužit k identifikaci či kvantifikaci určité molekuly, popřípadě stanovení její molekulové hmotnosti. [35] Sestrojení aparatury pro gelovou elektroforézu Aparatura pro elektroforézu obsahuje čtyři základní části: zdroj stejnosměrného napětí (s napětím nejméně 100 V a proudem od 100 ma výše), elektroforetickou vanu, destičku pro vytvoření gelu a hřeben pro tvorbu jamek. [32] Gelová elektroforéza je jednou z nejdůležitějších molekulárně-biologických technik, ale bohužel je často příliš nákladná, aby bylo možné ji vyučovat ve školních laboratořích. Aparaturu pro gelovou elektroforézu lze ale sestrojit i za pomocí běžného 23

24 materiálu zakoupeného v železářství, prodejnách chovatelských potřeb, lékárně či supermarketu. Separace DNA a její vizualizace s tímto vybavením bohužel neposkytuje tak přesné výsledky jaké poskytují přístroje používané ve výzkumných laboratořích, ale zcela postačí pro hlubší pochopení této techniky ve výuce chemie a biologie. Elektroforetická vana používaná v laboratořích má na každém konci elektrodu z platinového drátu a gel je umístěn na vyvýšené místo, které od sebe odděluje komory s elektrolytem. Jako jednodušší varianta může být použita plastová nádoba o takové velikosti, aby se do ní bez problému vešel připravený gel. Nádoba musí být dostatečně široká, aby se gel nedotýkal stěn a dostatečně dlouhá, aby anoda umístěná v nádobě byla vzdálená od gelu alespoň 2 cm. Platinový drát může být nahrazen obyčejným drátem z mědi či oceli, ty ale během delší elektroforetické separace praskají a snadno korodují. Jako elektroda může posloužit i několikrát přeložená hliníková fólie na šířku 1 cm. Zdroj stejnosměrného napětí je často nejnákladnější požadovanou položkou pro elektroforézu. Jako zdroj lze využít pět 9V baterií, které jsou sériově zapojeny. Tím získáme napětí 45 V, které je zcela bezpečné. Pomocí drátů s koncovými svorkami jsou baterie napojeny na elektrody. Místo agarózy může být pro přípravu gelů použit agar, který je snadno dostupný na internetu nebo v obchodě s potravinami. Zahřátím agaru v mikrovlnné troubě se připraví 1% nebo 2% gel. Jako formu pro nalití gelu lze použít zapékací misku. Jamky v gelu se utvoří pomocí hřebenu, hřeben musí být ale umístěn tak, aby pod jeho zuby zůstal gel. V gelové elektroforéze se používá stejný pufr jak pro vytvoření gelu, tak pro naplnění elektroforetické vany. Pro pufr je kritická hodnota ph, aby nedocházelo k denaturaci DNA. Ve výzkumných laboratořích se jako pufr používá TAE pufr nebo TBE pufr. Pro výuku ve školách postačí pufr vytvořený smícháním 2 g sody a 0,05 g NaCl v litru vody. Ke vzorkům lze přidat potravinářské barvivo, které umožní sledovat celou separaci již v elektroforetické vaně. Po hodinové separaci při napětí 45 V, může být gel obarven roztokem methylenové modři, který se běžně používá v akvaristice jako přípravek proti parazitům. Při barvení by studenti měli pracovat v rukavicích a ochranných brýlích. Oddělené fragmenty DNA jsou viditelné při běžném osvětlení. [36] Polyakrylamidový gel Velkým pokrokem na poli separačních technik makromolekul bylo zavedení syntetických molekulových sít na bázi polyakrylamidu. [37] Polyakrylamidová gelová 24

25 elektroforéza (PAGE) je všestranná, citlivá metoda s vysokým rozlišením. Její pomocí lze separovat molekuly nukleových kyselin či proteinů na základě jejich velikosti nebo konformace. [38] Výhody a nevýhody polyakrylamidového gelu Mezi velké výhody polyakrylamidových gelů patří zejména jejich vysoká rozlišovací schopnost. Umožňují od sebe odlišit i molekuly DNA o velice malém velikostním rozdílu (např. DNA o velikosti 500 bp od DNA velké 501 bp). Jejich kapacita je mnohem větší než u agarózových gelů, dokážou pojmout větší množství vzorku DNA bez zhoršení celkového rozlišení. Na rozdíl od agarózových gelů nekontaminují DNA. DNA izolovaná z polyakrylamidového gelu je vysoce čistá a ihned použitelná k dalším molekulárně-biologickým technikám, proto se těší velké oblibě biochemiků a biologů. [29] Ve srovnání s agarózovým gelem je polyakrylamidový gel náročnější na přípravu. Po smíchání všech přísad gel rychle tuhne, proto je nutné jej okamžitě nalít do formy. Polyakrylamidový gel obsahuje vysoce toxické složky, proto je důležité nosit při práci rukavice a ochranné brýle. Akrylamid je v monomerním stavu neurotoxický, mutagenní a patří mezi nepotvrzené karcinogeny. [29] Průběh elektroforézy na polyakrylamidovém gelu Polyakrylamidový gel vzniká polymerací akrylamidu s příměsí N,N -methylenbisakrylamidu, který zabezpečuje zesíťování lineárních vláken do prostorové struktury a utvoří tak efekt molekulárního síta. Aby reakce měla správný průběh, je potřeba do roztoku přidat polymerační činidlo APS a katalyzátor TEMED, který polymeraci urychlí. Výsledkem reakce je průhledný, inertní a mechanicky pevný gel, který je schopen efektivního dělení proteinů i nukleových kyselin. Dělení různých makromolekul je možné i díky snadné volbě pórovitosti. [29] [39] [40] Polyakrylamidový gel je často používán při vertikální elektroforéze. Existuje zde opět mnoho proměnných, které musíme při elektroforéze zvážit. Patří mezi ně velikost pórů, použitý pufr a vlastnosti zkoumané molekuly. Vzorky jsou nanášeny do jamek se sledovacím barvivem, díky kterému můžeme pozorovat průběh separace již v elektroforetické vaně. Po skončení separace je gel obarven a vyhodnocen. [41] 25

26 2.4 Pufry v elektroforéze Elektroforetická mobilita DNA je do značné míry ovlivněna volbou elektroforetického pufru. Ten může mít rozdílné složení a iontovou sílu. Často je používaný tris-acetátový pufr (TAE) nebo tris-borátový pufr (TBE). [29] TBE pufr má vyšší iontovou sílu a tedy i lepší elektrickou vodivost, díky které má tendenci se přehřívat. Proto je tris-borátový pufr používán zejména pro dlouhé separace s nižším napětím, kde nedochází k přehřívání pufru, k poškození gelu a případné denaturaci vzorků. V nepřítomnosti iontů, kdy je elektrická vodivost velice nízká, je migrace DNA na gelu pomalá a fragmenty jsou rozmazané. Z tohoto důvodu poskytuje TBE pufr lepší rozlišení fragmentů. [29] Tris-acetátový pufr je z historického hlediska nejčastěji používaný pufr pro gelovou elektroforézu na agarózovém gelu. Tento pufr má nízkou iontovou sílu i pufrační kapacitu. TAE je nejvhodnější pro separaci velkých fragmentů DNA (nad 20 kb). [42] 2.5 Faktory ovlivňující průběh elektroforézy Jedním z nejdůležitějších faktorů, který má vliv na průběh elektroforézy, je napětí. Je-li napětí nízké, snižuje se i mobilita DNA na gelu. Pokud dělíme fragmenty o větší velikosti než 2 kb, napětí by nemělo přesáhnout hodnotu 5 V/cm. Separace, která probíhá s takto nastaveným napětím, může poskytovat maximální rozlišení fragmentů DNA. Mezi další faktory patří například složení bází a teplota, které mají vliv převážně v polyakrylamidové gelové elektroforéze. Mobilita DNA může být snížena až o 15 %, pokud je k ní přidáno interkalační barvivo, kupříkladu ethidium bromid. Tyto faktory by měly být zohledněny při každé elektroforetické separaci. [29] 26

27 III. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3 Přístrojové vybavení o Elektroforetická souprava Mini-PROTEAN 3 Cell Bio-Rad, USA Obr. 6: Souprava pro vertikální polyakrylamidovou elektroforézu o Mini ReadySub-Cell GT Cell Bio-Rad, USA Obr. 7: Souprava pro horizontální agarózovou elektroforézu o Injekční stříkačka Hamilton o objemu 10 μl HAMILTON Bonaduz AG, Švýcarsko 27

28 o Váhy OHAUS Pioneer PA 114 Ohaus Corp. Pine Brook, USA o Termostat TK-1c KEVA, Česká Republika o Zdroj stejnosměrného napětí Basic Power Supply Bio-Rad, USA o Laboratorní třepačka 3005 GFL, Německo o Ultrazvuková čistička Sonorex RK 100 H Bandelin, Německo o Mikropipeta μl, mikropipeta μl Vitrum, Valašské Meziříčí 4 Použité chemikálie o 30% akrylamid/bis 37,5:1 Bio-Rad Laboratories, USA o Peroxodisíran amonný (APS) 98%, (NH 4 ) 2 S 2 O 8 M r = 228,2 g.mol -1 Sigma-Aldrich, Německo o N,N,N,N -tetramethylethylendiamin (TEMED) 99% C 6 H 16 N 2 M r = 116,21 g.mol -1 Bio-Rad Laboratories, USA o Tris(hydroxymethyl)aminomethan 99,8% C 4 H 11 NO 3 M r = 121,14 g.mol -1 Bio-Rad Laboratories, USA o Kyselina boritá p.a. H 3 BO 3 M r = 61,83 g.mol -1 Lachema, Česká Republika 28

29 o Chelaton 3 p.a. C 10 H 14 O 8 N 2 Na 2. 2 H 2 O M r = 372,24 g.mol -1 ONEX, Česká Republika o Stains-All 95% C 30 H 27 N 2 S 2 Br M r = 559,6 g.mol -1 Sigma-Aldrich, Německo o Formamid HCONH 2 M r = 45,04 g.mol -1 Merck, Německo o Oranž GG C 16 H 10 N 2 Na 2 O 7 S 2 M r = 452,38 g.mol -1 Lachema, Česká Republika o Kyselina octová 99% CH 3 COOH M r = 60,05 g.mol -1 Lach-Ner, Česká Republika o Fast Blast DNA Staining Solution Bio-Rad, USA o 50 TAE, Electrophoresis buffer Bio-Rad, USA o Prášková agaróza Bio-Rad, USA o Restrikční enzymový mix EcoRI/Pstl Bio-Rad, USA 5 Příprava vzorků 5.1 Enzymový mix EcoRI/Pstl Restrikční enzymy umožňují štěpení DNA v určitých místech za vzniku mnoha rozdílných fragmentů. Restrikční enzymový mix byl dodán v lyofilizovaném stavu, proto bylo nutné k němu přidat 750 μl sterilované vody a nechat jej rehydratovat na ledu po dobu 5 minut. Poté byly z enzymové směsi odebrány alikvotní podíly o objemu 80 μl, které byly přeneseny do mikrozkumavek označených ENZ a následně zamrazeny. 29

30 Aby restrikční enzym neztrácel svou účinnost, musí být použit do 12 hodin od rozmrazení. 5.2 Vzorky DNA z forenzního kitu Forenzní kit byl zakoupen u firmy Bio-Rad, USA. Vzorky byly dodány v lyofilizovaném stavu, proto bylo nutné je nejprve rehydratovat. Forenzní kit obsahoval šest neznámých vzorků DNA. Do každé ze šesti vialek s lyofilizovanou DNA bylo přidáno 200 μl sterilované vody. Směs byla lehce protřepána. Je důležité, aby se veškerý vzorek rozpustil a ani na zátce nezůstaly zbytky prášku. Poté byly vzorky ponechány při pokojové teplotě po dobu 15 minut, aby se důkladně rehydratovaly. Z každého vzorku bylo odebráno 10 μl DNA, které bylo nutno smíchat s 10 μl enzymové směsi. Restrikční štěpení probíhalo v termostatu po 45 minut při teplotě 37 C. 5.3 Vzorky DNA izolované z banánu DNA může být izolovaná z ovoce pomocí jednoduchého postupu. Čtvrtina banánu byla rozmělněna v hmoždíři, následně přemístěna do 150ml kádinky a přelita 1 lžící gelového pracího prášku. Celá směs byla promíchána a přelita malým množstvím destilované vody. Během pěti minut je nutné směs několikrát dobře promíchat. Po přefiltrování směsi přes analytickou nálevku byl filtrát přelit vychlazeným ethanolem, který umožní vysrážení DNA z roztoku. V mikrozkumavce o objemu 1,5 ml se rozpustilo přibližně 100 mg banánové DNA v 600 μl destilované vody. Vzorek byl temperován při 37 C po dobu 20 minut, aby se DNA důkladně rozpustila. Poté bylo ke vzorku přidáno 60 μl enzymové směsi a vzorek byl opět vložen do termostatu na 45 minut. 5.4 Vzorky oligonukleotidů Vzorky oligonukleotidů byly zakoupeny u firmy VBC-Genomics. Oligonukleotid s kratším řetězcem o sekvenci AGATG byl naředěn dvakrát, zatímco oligonukleotid o sekvenci 7GAA-1TTT byl naředěn desetkrát. 30

31 6 Příprava roztoků 6.1 TAE pufr Tris-acetátový pufr se používá pro přípravu gelu i jako elektrodový pufr po vhodném zředění. 50 koncentrovaný TAE lze připravit smícháním 242 g trisu, 57,1 ml ledové kyseliny octové a 100 ml 0,5M roztoku Chelatonu 3. Ten je připraven rozpuštěním 93,05 g Chelatonu 3 ve 400 ml destilované vody. Celý roztok je hodinu ponechán v ultrazvukové lázni, poté je jeho ph upraveno na hodnotu 8,0. Roztok je následně doplněn na objem 500 ml. Forenzní kit pro analýzu DNA obsahoval i TAE pufr v koncentrovaném stavu. Pro přípravu gelu byl použit 1 koncentrovaný TAE pufr, který byl získán přidáním 10 ml 50 TAE pufru k 490 ml destilované vody. Jako elektrodový pufr byl použit 0,25 koncentrovaný TAE pufr. Ten byl získán smícháním 12,5 ml 50 TAE s ml destilované vody. 6.2 TBE pufr Tris-borátový pufr je používán pro přípravu gelu a po zředění také jako vodivostní pufr. 10 TBE může být připraven rozpuštěním 27 g trisu, 13,75 g kyseliny borité a 2,33 g Chelatonu 3 ve vodě, celý roztok je nakonec doplněn na 250 ml. Není nutné upravovat ph roztoku, to odpovídá přesně hodnotě 8,3. Elektrodový pufr je připraven zředěním 50 ml 10 TBE pufru se 450 ml vody. [43] % APS Polymerační činidlo APS používané pro přípravu polyakrylamidových gelů se připraví rozpuštěním 100 mg APS v 1 ml destilované vody. [43] 6.4 Roztok barviva Stains-All Pracovní roztok Stains-All se připraví rozpuštěním 50 mg Stains-All ve 250 ml destilované vody spolu s 250 ml formamidu. Roztok se nechá půl hodiny míchat při laboratorní teplotě, celá odměrná baňka je přitom obalena alobalem, aby se zamezilo přístupu světla. Připravený roztok je uchováván ve tmě. [43] 31

32 6.5 Roztok barviva Fast Blast Barvivo Fast Blast je bezpečnou náhražkou barviva ethidium bromid. Barvicí roztok lze připravit smícháním 100 ml 500 Fast Blast se 400 ml destilované vody. Tímto postupem získáme roztok 100 Fast Blast, který může být opakovaně použit k barvení gelů. 7 Postup při elektroforéze na agarózovém gelu Metoda gelové elektroforézy zahrnuje několik důležitých kroků, od přípravy gelu a vzorků, přes nanesení vzorků do jamek a spuštění celé separace, až po konečnou vizualizaci fragmentů DNA. 7.1 Příprava agarózového gelu Agarózový gel je na přípravu celkem nenáročný. 1% gel vznikne smícháním 250 mg práškové agarózy s 25 ml 1 TAE pufru. Celá směs je uvedena do varu a po mírném vychladnutí (asi na 50 C) se nalije do formy. Ve formě musí být zasunut hřeben, který vytvoří v gelu jamky pro nanesení vzorku. Gel se nechá chvíli tuhnout při laboratorní teplotě a na závěr je umístěn do lednice. Vychlazený gel je přenesen do elektroforetické vany, která je naplněna 0,25 TAE pufrem. Elektrodový pufr musí překrývat gel umístěný ve vaně. 7.2 Příprava a nanesení vzorků na gel Aby byly splněny ideální podmínky pro restrikční štěpení, musí být vzorky DNA z forenzního kitu temperovány na 37 C po dobu 45 minut. Po vytažení vzorků z termostatu je do každé mikrozkumavky přidáno 5 μl ukládacího barviva, které má vyšší hustotu než vzorek a tím zajistí, že vzorek klesne na dno jamky. Je důležité zkontrolovat správnou orientaci jamek vůči elektrodám. Vzorky se vždy nanáší směrem ke katodě, která je označena černou barvou. Pomocí μl pipety jsou do jamek umístěny vzorky DNA. Do první jamky je naneseno 10 μl DNA standardu (neboli velikostního markeru), který umožní odhadnout velikost fragmentů vzorků DNA. Druhá jamka je naplněna analyzovaným vzorkem DNA. Následujících pět jamek obsahuje vzorky DNA, které jsou použity pro srovnání s analyzovaným vzorkem DNA. Vzorky DNA jsou do jamek naneseny v objemu 20 μl. 32

33 Vzorky banánové DNA jsou po ukončení restrikčního štěpení vyjmuty z termostatu. DNA je smíchána s 80 μl ukládacího barviva a poté je celá směs nanesena na gel. 7.3 Průběh separace Po nanesení vzorků do jamek gelu je opatrně nasazeno víko elektroforetické vany. Víko musí být správně nasazené a orientované. Poté se elektrody zapojí do zdroje napětí. Dělení vzorků DNA z forenzního kitu probíhá při 200 V po dobu 20 minut, zatímco separace banánové DNA probíhá při 50 V po dobu 60 minut. 7.4 Vizualizace DNA fragmentů Po ukončení elektroforetické separace se odpojí zdroj napětí a z vany je opatrně sejmuto víko. Agarózový gel byl vyjmut z elektroforetické vany a přesunut do plastové nádoby, kde byl přelit barvicím roztokem Fast Blast a ponechán 2 minuty na třepačce. Po dokončení barvení byl použitý barvicí roztok opět uschován. Gel byl ponořen do teplé vody (40 55 C), aby mohlo dojít k vymytí barvy z gelu a tím se zvýšila viditelnost oddělených fragmentů. Po vizualizaci došlo k oskenování gelu, jeho vyhodnocení a následné likvidaci. 8 Postup při polyakrylamidové gelové elektroforéze Polyakrylamidová gelová elektroforéza zahrnuje stejné kroky jako elektroforéza na agarózovém gelu. Tyto dvě metody se liší přípravou gelu, podmínkami separace i vizualizací vzorků. Zatímco pro agarózový gel byla použita horizontální elektroforetická vana, polyakrylamidový gel byl umístěn do aparatury pro vertikální elektroforézu. 8.1 Příprava polyakrylamidového gelu Nejprve byly separovány vzorky krátkých oligonukleotidových řetězců, a proto byl použit 20% polyakrylamidový gel. Gel byl připraven smícháním 6,7 ml 30% akrylamidu s příměsí bisakrylamidu, 1 ml 10 TBE a 2,3 ml destilované vody. Nakonec bylo k roztoku přidáno 82 μl 10% APS a 5 μl TEMED, které společně zahájí polymeraci gelu. Doba tuhnutí gelu je minimálně 60 minut. [43] 33

34 8.2 Příprava a nanesení vzorků na gel Vzorky oligonukleotidů byly naředěny a naneseny do jamek spolu s barvivem Oranži G. Toto barvivo umožňuje sledovat separaci již v elektroforetické vaně. Do jedné jamky bylo vždy dávkováno 9 μl oligonukleotidu smíchaného s 2 μl barviva. [43] Na 20% polyakrylamidový gel byly naneseny i vzorky banánové DNA, připravené stejným způsobem jako pro separaci na agarózovém gelu. Část vzorků banánové DNA byla smíchána se sledovacím barvivem Oranži G a další část s ukládacím barvivem použitým při separacích na agarózovém gelu. 8.3 Průběh separace Polyakrylamidový gel byl ponořen do elektroforetické vany zalité vychlazeným 1 TBE pufrem. Vana byla přikryta víkem a připojena ke zdroji napětí. Elektroforetická separace proběhla při 50 V po dobu téměř 4 hodin. 8.4 Vizualizace oligonukleotidů a DNA fragmentů Po skončení separace byl polyakrylamidový gel vyjmut z vany a ponořen do barvícího roztoku Stains-All. V tomto roztoku byl gel ponechán na třepačce k barvení po dobu 30 minut. Po celou dobu byla barvící nádoba chráněna před světlem pomocí alobalu. Roztok byl po ukončení barvení přelit do lahve a uchován pro další použití. Polyakrylamidový gel byl ponořen do vody, aby se z něj vymyla barva a tím došlo k zesvětlení pozadí. Po vizualizaci byl gel oskenován, vyhodnocen a zlikvidován. [43] 34

35 IV. VYHODNOCENÍ A DISKUZE 9 Vyhodnocení separované DNA z forenzního kitu Forenzní kit vyrobený firmou Bio-Rad je určen pro výuku chemie. Aby tato výuka probíhala zajímavou formou, řeší se zde fiktivní zločin, kde je porovnáván vzorek DNA odebraný na místě činu se vzorky DNA pěti podezřelých ze spáchání zločinu. Vzorky DNA byly rozštěpeny pomocí restrikčního enzymu, dále zpracovány dle návodu a separovány na 1% agarózovém gelu. Po dostatečném vymytí barviva Fast Blast z gelu a zesvětlení pozadí mohly být vzorky vyhodnoceny. Abych byla schopna potvrdit správnost separace, zpracovala jsem vzorky ze dvou kitů, které vystačily na 40 gelů. Obr. 8: Oddělené fragmenty DNA na agarózovém gelu Do první jamky byl nanesen velikostní standard (S), druhá jamka obsahuje vzorek odebraný z místa činu (MČ) a následujících pět jamek bylo zaplněno vzorky podezřelých (P1, P2, P3, P4, P5). Vzorky DNA migrují směrem k anodě díky záporně nabité fosfátové skupině a jsou zachycovány na gelu podle různé velikosti jejich 35

36 fragmentů. Z Obr. 8 lze vidět, že vzorek odebraný na místě činu se shoduje se vzorkem DNA odebraným podezřelému č. 3. Standard umožňuje odhadnout velikost separovaných fragmentů DNA. Stanovení velikosti fragmentů DNA v jednotlivých vzorcích bylo provedeno po sestrojení grafu standardu Lambda/HindIII (Graf 1). Pro kvantitativní analýzu musela být nejprve změřena vzdálenost (v mm), kterou urazil každý fragment od jamky, do které byl vzorek DNA nanesen. Naměřená data byla zaznamenána do tabulky (Tabulka 2) a následně vynesena do grafu standardu, ze kterého byla odečtena velikost fragmentů DNA z místa činu a pěti podezřelých. Velikost fragmentů DNA ve vzorcích je pouze odhadnutá, jelikož nebyl k dispozici skener na gely pro přesnější vyhodnocení. Graf 1: Závislost vzdálenosti fragmentů DNA od jamky na jejich velikosti 36

37 Tabulka 2: Vzdálenost fragmentů DNA od jamek a jejich přibližná velikost Lambda/HindIII standard Místo činu Podezřelý 1 Podezřelý 2 Fragment Vzdálenost (mm) Skutečná velikost (bp) Vzdálenost (mm) Přibližná velikost (bp) Vzdálenost (mm) Přibližná velikost (bp) Vzdálenost (mm) Přibližná velikost (bp) 1 11, , , , , , , , , , , , , , , Fragment Vzdálenost (mm) Lambda/HindIII standard Skutečná velikost (bp) Vzdálenost (mm) Podezřelý 3 Podezřelý 4 Podezřelý 5 Přibližná velikost (bp) Vzdálenost (mm) Přibližná velikost (bp) Vzdálenost (mm) Přibližná velikost (bp) 1 11, , , , , , , , , , , , , ,

38 10 Optimalizace agarózové gelové elektroforézy Agarózová gelová elektroforéza se běžně používá pro separaci makromolekul, jako jsou například proteiny nebo fragmenty nukleových kyselin DNA a RNA. Pro jejich analýzu je vždy nutné správně nastavit určité parametry, které separaci do značné míry ovlivňují. Mezi tyto parametry lze zařadit pórovitost gelu, vložené napětí, dobu separace, ale i samotnou přípravu vzorků Úprava koncentrace vzorků Ze všeho nejdříve se musela upravit koncentrace vzorků tak, aby bylo možné pozorovat separované fragmenty DNA na gelu. Zpočátku byla do jamek nanesena banánová DNA v nezředěném stavu. Molekuly vzorku DNA byly ale příliš velké a proto se na použitém 0,5% gelu vůbec neoddělily. Izolovaná banánová DNA má sama o sobě rosolovitou povahu, proto bylo potřeba ji důkladně rozpustit ve vhodném rozpouštědle. Byla tedy sestavena řada rozpouštědel od nejméně polárních (hexan) až po polární rozpouštědla (destilovaná voda). Mezi použitými rozpouštědly byl hexan, toluen, chloroform, aceton, acetonitril a destilovaná voda. Malé množství banánové DNA bylo v mikrozkumavce smícháno s příslušným rozpouštědlem. Se všemi rozpouštědly, kromě vody, vznikla bílá sraženina, která signalizovala pravděpodobnou denaturaci vzorku, a proto byla tato rozpouštědla vyřazena. Vzorek banánové DNA se nejlépe rozpustil v nadbytku destilované vody při zahřátí v termostatu na 37 C po dobu 20 minut. Úplné rozpuštění vzorku DNA ve vodě bylo pro další práci ideální, vzhledem k tomu, že byl ke vzorku následně přidán enzymový mix EcoRI/Pstl a přítomnost ostatních rozpouštědel by mohla rušit jeho účinek. DNA izolovaná z banánu obsahovala pořád zbytky tekutého pracího prášku, proto zde byla možnost, že restrikční enzym nebude mít dobré podmínky pro správné fungování Optimalizace koncentrace agarózového gelu Na agarózovém gelu byly děleny vzorky DNA izolované z banánu. Vzhledem k tomu, že nebyla známá velikost separovaných molekul, jsem musela vyzkoušet dělení na gelech o různé koncentraci. Aby byla zajištěna optimální pórovitost gelu pro vzorky banánové DNA, byly připraveny gely o koncentraci 0,3 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,9%, 1,0 % a 2,0 %. Na 2% gelu se vzorky vůbec nerozdělily a po obarvení byl gel naprosto čistý, proto byla tato vysoká koncentrace gelu vyřazena. Separace na 1% gelu rovněž neproběhla nejlépe, vzorky se držely převážně u jamek, kde byly naneseny. 38

39 Vzdálenost (mm) Nejlépe byla vyhodnocena separace na 0,7% gelu, kdy byly oddělené fragmenty v optimální vzdálenosti od jamek a v přijatelném rozlišení. Mobilita molekul DNA na různých gelech byla vynesena do Grafu 2. Na ose x je vynesena koncentrace připravených gelů a na ose y je uvedena vzdálenost fragmentů od jamky v mm. 40,0 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Koncentrace gelu (%) Graf 2: Pohyb molekul DNA na gelech o různé pórovitosti 10.3 Výběr napětí a doby separace Mezi parametry gelové elektroforézy, které vyžadovaly optimalizaci, patří i hodnota vloženého napětí a doba separace. Správné nastavení napětí a doby dělení je pro účinnou separaci klíčové. První nastavení vycházelo z podmínek pro forenzní kit, kdy separace probíhala při napětí 200 V po dobu 20 minut. Toto napětí bylo ale příliš vysoké a došlo k deformaci gelů a denaturaci vzorků. Napětí bylo tedy sníženo na 100 V, aby nedocházelo k poškozování vzorků. Vzhledem k tomu, že se s nižším napětím snižuje i pohyblivost částic v gelu, musela být zvýšena doba separace na 45 minut. Napětí bylo ale pořád vysoké a proto došlo k jeho dalšímu snížení. Separace menších fragmentů DNA by neměla probíhat při vyšším napětí než 5 V/cm. Vzhledem k délce použitého gelu bylo napětí nastaveno na 50 V. Doba separace byla zvýšena na 60 minut. 39

40 10.4 Vyhodnocení gelu Na 0,7% gel byly do osmi jamek naneseny vzorky DNA izolované z banánu, které byly rozštěpeny pomocí restrikčního enzymu. Po hodinové separaci při napětí 50 V byly na gelu separovány fragmenty DNA. V první jamce není nanesen velikostní standard jako u forenzního kitu. Kvůli nedostupnosti standardu proto nemůžou být fragmenty DNA kvantitativně vyhodnoceny jako u plazmidové DNA z forenzního kitu. Obr. 9: Oddělené fragmenty DNA izolované z banánu na 0,7% gelu 11 Polyakrylamidová gelová elektroforéza Gelová elektroforéza na polyakrylamidovém gelu je vhodná pro separaci proteinů i oligonukleotidů. Opět je nutné upravit podmínky separace tak, aby byl její průběh co nejefektivnější. Na optimalizaci polyakrylamidové gelové elektroforézy by bylo zapotřebí hodně času, proto jsem použila již odzkoušené nastavení této metody popsané v diplomové práci K. Dosoudilové. [43] Vzorky oligonukleotidů byly vhodně naředěny, oligonukleotid o sekvenci AGATG byl naředěn 2 a oligonukleotid o sekvenci 7GAA-1TTT byl naředěn 10. Na jeden gel (obrázek 10) byly naneseny vzorky oligonukleotidů a na druhém gelu (obrázek 11) byly odzkoušeny vzorky banánové DNA připravené podle postupu pro agarózovou elektroforézu. Vzorky oligonukleotidů i banánové DNA byly separovány 40

41 na 20% polyakrylamidovém gelu při 50 V po dobu 240 minut. Ke každému vzorku bylo přidáno barvivo Oranž G, které umožňuje sledovat separaci již v elektroforetické vaně. Po proběhnutí separace byly oba gely obarveny komerčním barvivem Stains-All. Ve chvíli, kdy došlo k zesvětlení pozadí vymytím barviva, byly gely vyhodnoceny. Po vyhodnocení bylo zjištěno, že ani jeden gel nezachytil separované vzorky. Na gelech bylo obarveno pouze sledovací barvivo. Vzorky oligonukleotidů byly s největší pravděpodobností nevhodně naředěny a z toho důvodu se na gelu nezachytily. Vzorky DNA izolované z banánu se na gelu neoddělily nejspíš kvůli malé velikosti pórů polyakrylamidového gelu. Aby bylo možné na tomto gelu separovat DNA izolovanou z banánu, musela by se upravit jak koncentrace vzorku, tak koncentrace gelu a pravděpodobně i nastavení vloženého napětí a doby separace. Obr. 10: Polyakrylamidový gel s nanesenými vzorky oligonukleotidů Obr. 11: Polyakrylamidový gel s nanesenými vzorky banánové DNA 41