Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin

Transkript

1 Metody používané v MB analýza proteinů, nukleových kyselin

2 Nukleové kyseliny analýza a manipulace Elektroforéza (délka fragmentů, čistota, kvantifikace) Restrikční štěpení (manipulace s DNA, identifikace specifických sekvencí) Hybridizace (identifikace specifických sekvencí) Amplifikace DNA (PCR) klonování Sekvenace DNA

3 Elektroforeza separace o rozdělení makromolekul dle mobility v elektrickém poli o DNA záporně nabitá o vizualizace interkalační činidla, fluorofory (Et-Br excitace UV, toxický!) o Marker : DNA o známé mol. Hmotnosti o Nosič: agaroza galaktóza a 3,6-anhydrogalaktóza

4 Příklady: Barvení ET-Br Parciální štěpení PFGE

5 Hybridizace - detekce specifických sekvencí princip In situ Lokalizace genů na chromosomech

6 Northen/Southern Blotting hybridizace elektroforeticky separovaných molekul RNA/DNA

7 Proba specificky značená radioaktivně (32P), chemicky (digoxygenin), protilátkou

8 PCR (polymerase chain reaction) Namnožení specifického úseku DNA analýza genu (přítomnost, mutace) genové exprese (RT PCR) kvantifikace DNA (qpcr) 3 kroky: 1) denaturace rozpad dvoušroubovicové str. - ssdna 2) annealing - nasednutí primerů na specifická místa ssdna 3) polymerace - syntéza DNA (termostabilní DNA polymeraza) Např. 30 cyklů (z 1 původní molekuly DNA lze získat po 32 cyklech až 1 miliardu kopií)

9

10

11

12 Cycler

13 o Sledujeme expresi genu na úrovni mrna nutno mrna převést na DNA (cdna ) o Reversní transkripce (enzym reversní transkriptáza)

14 Klonování Produkce specifických proteinů Příprava knihoven (sekvenování)

15 Restrikční štěpení Restrikční endonukleásy štěpení specifické sekvence tupé/kohezní konce Figure 8-31 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

16

17 Restrikční endonukleasy - příklady

18 Basic components of a plasmid cloning vector that can replicate within an E. coli cell. Plasmid vectors contain a selectable gene such as ampr, which encodes the enzyme - lactamase and confers resistance to ampicillin. Exogenous DNA can be inserted into the bracketed region without disturbing the ability of the plasmid to replicate or express the ampr gene. Plasmid vectors also contain a replication origin (ORI) sequence where DNA replication is initiated by host cell enzymes. Inclusion of a synthetic polylinker containing the recognition sequences for several different restriction enzymes increases the versatility of a plasmid vector. The vector is designed so that each site in the polylinker is unique on the plasmid.

19 DNA cloning in a plasmid vector permits amplification of a DNA fragment. A fragment of DNA to be cloned is first inserted into a plasmid vector containing an ampicillin-resistance gene (ampr). Only the few cells transformed by incorporation of a plasmid molecule will survive on ampicillincontaining medium. In transformed cells, the plasmid DNA replicates and segregates into daughter cells, resulting in formation of an ampicillin resistant colony.

20 Sekvenování - Knihovny

21

22 Sekvenování DNA

23

24

25

26

27 Produkce specifických proteinů Rekombinantní proteiny

28 Fingerprinting Hypervariabile microsatellite sequence (VNTR)

29 Proteiny analýza a manipulace Izolace, purifikace (centrifugace, chromatografie) Elektroforéza (separace, kvantifikace) Blotting (identifikace, western blott) Strukturní analýza (MALDI-TOF, X-ray crystallography, NMR)

30 Centrifugace - frakcionace buněčných lyzátů

31 chromatografie

32

33 ELEKTROFORÉZA Princip dělení nabitých částic na základě různých elektroforetických pohyblivostí Použití analytické i preparativní

34 Parametry separace náboj velikost tvar Koncentrace gelu nižší dělení pouze podle náboje vyšší nebo gradient dělení také podle velikosti a tvaru Vliv ph - ovlivňuje náboj, stabilitu, aktivitu "kyselá" (kyselé ph): + "alkalická" (alkalické ph): + Směr migrace závisí na pi proteinů všechny nemusí "putovat gelem"

35 ELFO na PAGE v přítomnosti SDS (Sodium Dodecyl Sulphate dodecylsíran sodný) SDS se váže na proteiny, uděluje jim uniformní záporný náboj SDS-PAGE

36 Vyhodnocení

37 2D elektroforeza - Isoelektrická fokusace - SDS-PAGE

38 2D separace Kombinace isoelektrická fokusace/sds PAGE

39 WESTERN BLOTTING 1. elektroforéza rozdělení proteinů, např. SDS-PAGE 2. blotting přenos na membránu, např. elektroforeticky 3. detekce (většinou imunodetekce)

40 - Specifické protilátky - SDS PAGE - 2D elfo

41 Sekvenční analýza proteinů (primární struktura) Edmanovo odbourávání Z geno(mo)vých sekvencí (bioinformatika) Syntéza peptidů (chemická) Příprava protilátek (mono-, poly-klonální)

42 hmotnostní spektrometrie (mass spectrometry) MALDI -TOF

43

44 Struktura proteinu Rentgenostrukturní analýza (X-ray crystallography) NMR (z roztoků)

45