Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici. Role mikroorganismů ve vinařství. Vedoucí bakalářské práce

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici Role mikroorganismů ve vinařství Vedoucí bakalářské práce Ing. Petra Bábíková, DiS. Vypracovala Lenka Zapletalová Lednice 2012

2 Zadání bakalářské práce

3 Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Role mikroorganismů ve vinařství vypracovala samostatně a použila jsem pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Zahradnické fakulty Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Lednici, dne... Podpis...

4 Chtěla bych poděkovat vedoucí bakalářské práce Ing. Petře Bábíkové, DiS. za její odborné vedení, trpělivost při konzultacích a cenné rady. Dále patří mé poděkování rodině za jejich všestrannou pomoc při studiu.

5 Obsah 1 Úvod Cíl práce Současný stav řešené problematiky Alkoholové kvašení Charakteristika nejdůležitějších kvasinek a kvasinkových mikroorganismů Systematika kvasinek Sporogenní druhy kvasinek Asporogenní druhy kvasinek Aktivní vinné suché kvasinky Přehled výrobců a druhů aktivních suchých vinných kvasinek Jablečno-mléčné kvašení Charakteristika nejdůležitějších bakterií Systematika bakterií ve víně Bakterie mléčného kvašení Bakterie octového kvašení Charakteristika nejdůležitějších mikroskopických hub ve vinařství Systematika mikroskopických hub Choroby vína způsobené mikrobiologickou kontaminací Křís Těkavé kyseliny Mléčné a manitolové kvašení vína Octění vína Máselný tón Myšina Souhrn Závěr Seznam použité literatury

6 1 Úvod Znalost vína může být radostí po celý život člověka." E. Hemingway Vinařství je po staletí chemie sama. K základnímu kameni mikroorganismů přispěl Antonius Leewenhoek ( ), jež sestrojil mikroskop. Pomocí mikroskopu Julius Meyen objevil rod kvasinek, který pojmenoval jako rod Saccharomyces ( tedy cukrová houba) a dal základ k dalšímu zkoumání a vytvoření systematiky mikroorganismů. Dalším zkoumáním toho, čemu dali základ výše zmínění vědci se postupem času zjistilo, že hlavní úlohou některých mikroorganismů je především přeměna sacharózy na ethanol a CO 2. Bez ethanolu by totiž tento výjimečný nápoj nebylo možné vyrobit. Vinařství je velice úzce spjato s mikroorganismy, protože jsou nedílnou součástí při výrobě vína. Podílejí se na výsledné kvalitě vína a jak se později dozvíme, mohou víno ovlivňovat jak pozitivně tak negativně. V technologických postupech výroby vína nalezneme spoustu mikroorganismů, které jsou s ní spjaty. V této bakalářské práci se proto budu snažit vystihnout nejzákladnější rody a druhy, se kterými se můžeme v technologickém postupu výroby vína setkat. Snahou bude tyto mikroorganismy rozdělit na základní skupiny a jejich rody a druhy a vysvětlit, jakou mají úlohu ve výrobě vína. 6

7 2 Cíl práce Jedním z cílů této bakalářské práce je prostudovat literaturu týkající se kvasinek, bakterií a plísní, které se ve vinařských provozech. Zároveň je náplní této práce je popsat rody a druhy jednotlivých mikroorganismů a zhodnotit vliv, jaký mají na kvalitu vína. Dalším cílem práce je zaměřit se na komerčně dostupné preparáty, které se využívají ve vinařských provozech při výrobě vína. 7

8 3 Současný stav řešené problematiky Systematikou mikroorganismů se již v minulosti zabývalo více autorů, jak dále uvádím. V současné době došlo u některých rodů mikroorganismů např. u rodu Botrytis cinerea, který je popsán v kapitole 3.5.1, k přehodnocení a tento rod je v současné době zařazen do jiné třídy než v minulosti. K podobné situaci došlo také u některých zástupců bakterií např. u rodu Oenococcus (dříve rod Leuconostoc). Dříve se mohli vinaři spoléhat pouze na vliv přírody, dnes však mají také možnost spoléhat se na komerčně dostupné preparáty mikroorganismů, které podporují průběh kvašení a také zajišťují jablečno-mléčné kvašení, kdy víno ztrácí ostrou kyselost kyseliny jablečné, která se přeměňuje na kyselinu mléčnou a CO Alkoholové kvašení Základním a nejdůležitějším biochemickým procesem, který se podílí na tvorbě vína, je alkoholové kvašení. Vzniká při něm alkohol ethanol a oxid uhličitý na základě přeměny cukrů. V průběhu kvašení se ale vytváří velký počet dalších sloučenin (Pavloušek, 2010). Alkoholové kvašení moštu při výrobě vína je složitý biochemický proces, na kterém se může podílet až 15 rodů kvasinek: např. Brettanomyces sp., Candida sp., Cryptococcus sp., Debaryomyces, Hanseniaspora sp., Kluyveromyces sp., Metschnikowia sp., Pichia sp., Rhodotula sp.. Saccharomyces sp., Saccharomycodes sp., Schizosaccharomyces sp., Zygosaccharomyces sp.. Kvasinky se vyskytují a rozmnožují pouze tam, kde mají vhodné podmínky. Podstatu alkoholového kvašení u vína objevil v roce 1863 Louis Pasteur a dokázal, že probíhá na základě mikrobiální aktivity (Pavloušek, 2010). Pro zahájení kvašení je zapotřebí asi 10 milionů buněk/ml. Lisy a zařízení jsou nejdůležitějšími zdroji infekce, zde se zvyšuje přirozený počet buněk v moštu z 10 až 100 jedinců/ml deseti až stonásobně (Steidl a Schödl, 2002). Na jedné bobuli se nachází až 8 milionů kvasinek. Čím je hrozen zralejší, tím je vyšší podíl kulturních kvasinek (Saccharomyces cerevisiae) (Cempírková a kol., 1997). Mošt z hroznů révy vinné obsahuje dva nejvýznamnější cukry, glukózu a fruktózu, nejčastěji v poměru 1:1, přičemž vinné kvasinky tyto dva cukry velmi dobře zpracovávají. V průběhu kvašení potom rychle využívají glukózu a pomaleji fruktózu. 8

9 Případný zbytkový cukr ve víně je častěji představován právě fruktózou, která rovněž působí chuťově sladším dojmem. Kvasinky Saccharomyces cerevisiae mají schopnost rozštěpit sacharózu na glukózu a fruktózu a následně oba tyto cukry využít k tvorbě alkoholu (Pavloušek, 2010). Alkoholové kvašení je popisováno podle následující reakce: C 6 H 12 O 6 2 C 2 H 5 OH + 2 CO 2 + energie Uvolňuje se 167,5 kj volné energie v molekule. Kvasinky využíjí část této energie k zajištění jejich životních funkcí, zejména k jejich růstu a násobení. (Ribérau-Gayon a kol., 2006) Při tomto procesu vznikají z jedné molekuly cukru dvě molekuly alkoholu (ethanolu) a dvě molekuly oxidu uhličitého (Pavloušek, 2010). 3.2 Charakteristika nejdůležitějších kvasinek a kvasinkových mikroorganismů Kvašení hroznů je systém mikrobiologických procesů, který zahrnuje interakci mezi kvasinkami, bakteriemi a vláknitými houbami. Kvasinky, které hrají centrální roli ve výrobě vína, jsou jednobuněčné houby, které se rozmnožují pomocí pučení (Carrascosa a kol., 2011). Kvasinky jsou heterotrofní eukaryotní mikroorganismy, náležící mezi houby (Fungi). Český název dostaly pro schopnost většiny druhů zkvašovat monosacharidy a některé polysacharidy, případně i trisacharidy na ethanol a oxid uhličitý (Šilhánková, 2002). Kvasinky jsou ve vinici všudypřítomné. Na keře révy vinné se dostávají z půdy. Nejvíce jich je na hroznech zrajících blízko půdního povrchu. V celkovém souboru kvasniční mikroflóry jsou ušlechtilé vinné kvasinky jen velmi slabě zastoupeny. Do moštu se dostávají v mnohonásobné převaze kvasinky divoké (Kraus a kol., 2008). Přirozený obsah kvasinek je popsán v tabulce č. 1. Izolované kvasinky lze zařadit do 4 sporogenních rodů (Saccharaomyces sp., Hansenula sp., Pichia sp., Torulospora sp.) a do 3 asporogenních (Candida sp., Kloeckera sp. a Torulopsis sp.). Ze sporogenních kvasinek převládají Saccharomyces cerevisiae a Saccharomyces bayanus a z asporogenních Kloeckera apiculata a Metschnikowia pulcherrima. Tyto dvě asporogenní kvasinky jsou počáteční mikroflórou moštů bez ohledu na ekologické podmínky vinohradnické oblasti a jsou zodpovědné za zahájení spontánního kvašení (Minárik, Švejcar, 1981). Mohou se začít rozvíjet v rámci pár hodin po naplnění nádoby (Fleet, 1992). Jejich společnou 9

10 fyziologickou vlastností je tvorba malého množství ethylalkoholu. Zejména Metschnikowia pulcherrima, díky své rychlé rozmnožovací schopnosti, je v prvních hodinách kvašení ve velké převaze nad ostatními kvasinkami. Její převaha je však krátkodobá, protože se již začíná prosazovat vitálnější Kloeckera apiculata. Obě kvasinky vytvářejí kolem 4 až 5 obj.% ethylakoholu. Při plné fermentační činnosti uvedených kvasinek se pozvolna začínají prosazovat pravé vinné kvasinky rodu Saccharomyces sp., které jednak dokáží vyprodukovat větší množství ethylalkoholu a jednak jsou proti němu také odolnější. Tak vzniká přirozená selekce ve prospěch ušlechtilých kvasinek, které zakončují kvašení (Minárik, Švejcar, 1981). V moštu je velmi vzácný výskyt rodu Brettanomyces a jeho působení na kvalitu víně ve formě animálních tonů chuti (Fleet, 1992) Systematika kvasinek Identifikací kvasinek se zabývalo mnoho autorů, kteří se pokoušeli kvasinky přehledně klasifikovat. Hansen již v roce 1904 rozdělil na sporogenní a asporogenní. U nás se klasifikací kvasinek zabývala Kratochvílová-Kocková. Klasifikaci vinařských kvasinek a kvasinkových mikroorganismů provedl Ribéreau-Gayon P. a Minárik. J. (Farkaš, 1980). Popisy jednotlivých rodů a druhů kvasinek a klíče k jejich určení (včetně postupů identifikačních testů) jsou uvedeny v mezinárodní publikaci The Yeasts, A Taxonomic Study jejímž editorem je N.J W. Kreger-van Rijová (Amsterdam, 1984) Podle způsobu sexuálního rozmnožování se zde kvasinky rozdělují do tří hlavních skupin: rody tvořící askspory; jsou zařazovány mezi Ascomycotina, a to do třídy Hemiascomycetes a řádu Endomycetales (Čeleď Saccharomycetaceae); rody tvořící bazidiospory nebo sporidie a heterokaryotní mycelium s přezkami; jsou zařazovány mezi Basidiomycotina; rody, u nichž není známa tvorba pohlavních spor; jsou zařazovány mezi Deuteromycotina, dříve byly označovány také jako nepravé kvasinky nebo kvasinkové mikroorganismy na rozdíl od sporotvorných kvasinek, nazývaných pravé kvasinky ; někteří příslušníci této skupiny zřejmě ztratili schopnost spájení v důsledku mutace, u některých pravděpodobně existuje v současné době jeden párovací typ a jsou tedy imperfektními (čili nedokonalými ) stadii 10

11 určitých sporotvorných nebo perfektních druhů, s nimiž mají společné morfologické,, biochemické i fyziologické vlastnosti; odlišné rodové a často i druhové označení sporotvorných a nesporotvorných kmenů však zůstalo zachováno. Zařazuje se sem čeleď Cryptococcaceae (Šilhánková, 2002). Z vinařského hlediska jsou významné čeledi Saccharomycetaceae a Cryptococcaceae (Farkaš, 1980). Nejdůležitějším činitelem při identifikaci kvasinek je zkvašování diagnostických cukrů. Schopnost kvasinek fermentativně odbourávat cukry je závislá na bohatství enzymatického aparátu kvasinkové buňky. Protože je to stálá vlastnost kvasinek, je fermentace cukrů opravdu vždy platnou identifikační zkouškou. Zkvašují se tyto základní cukry: glukózu, galaktózu, maltózu, sacharózu, laktózu, rafinózu (Minárik, Švejcar, 1981). Tabulka 1: Přirozený obsah kvasinek v moštu během kvašení (Steidl a Schödl, 2002). Počátek kvašení Hlavní kvašení Závěrečné dokvášení Kloeckera apiculata * Metschnikowia pulcherrima* Candida stellata Kloeckera corticis Candida crusei Hansenula anomala Pichia mermentans Pichia membranaefaciens Saccharomyces cerevisiae, subspec. cerevisiae* Saccharomyces cerevisiae, subspec. uvarum* Saccharomyces cerevisiae, subspec. bayanus Saccharomyces chevalieri Torulaspora delbrueckii Zygosacch. florentinus Zygosacch. rouxii Kluyveromyces thermotolerans Saccharomyces cerevisiae, subspec. cerevisiae* Saccharomyces cerevisiae, subspec. bayanus * nejčastější druhy kvasinek Sporogenní druhy kvasinek Rod Saccharomyces Kvasinky tohoto rodu jsou velmi rozšířené v moštech a vínech, méně v půdě a sporadicky (podle ekologických podmínek) na některých orgánech révy vinné (Minárik, Švejcar, 1981). 11

12 Buňky tohoto rodu jsou kulaté nebo oválné, někdy i protáhlé. Rozmnožují se pučením a některé druhy jsou schopné vytváří i pseudomycelium. Spóry se tvoří kulaté nebo oválné, nejsou zvláštností i fazolovité nebo dokonce i srpovité. Ve vřecku jich bývá 1 až 4. Charakteristickým znakem rodu je mohutná fermentace glukózy. KNO 3 není kvasinkami tohoto rodu využíván (Minárik, Švejcar, 1981). Druh Saccharomyces cerevisiae se vyznačuje oválnými až eliptickými buňkami, jež zobrazeno na obr. č. 1. Někdy však bývají buňky i mírně protáhlé. Na sporulačních půdách vytvářejí 1 až 4 spory, které jsou hladké, kulaté, málokdy mírně protáhlé (Minárik, Švejcar, 1981). Vytváří se rudimentární nebo stromečkovité bohatě větvené pseudomycelium. Pravé mycelium se nevytváří (Chumchalová a kol., 2008). Glukóza, galaktóza, laktóza, sacharóza a maltóza jsou zkvašovány a asimilovány plně, rafinóza je zkvašována do 1/3. Produkce alkoholu je vždy nad 10 obj. %. V praxi se kvasinky tohoto rodu používají jako čisté kultury. Vzhledem k svému přírodnímu rozšíření a ke svým dobrým technologickým vlastnostem jsou nejdůležitější pro vinařskou praxi (Minárik, Švejcar, 1981). Kvasinky druhu Saccharomyces bayanus (dříve S. oviformis) jsou kulaté nebo mírně protáhlé. Pseudomycelium zpravidla netvoří. V asku je 1 až 4 spory. Kvasinky asimilují glukózu, sacharózu, maltózu a do 1/3 rafinózu. Prokvašující schopnost je vyšší než u S. cerevisiae (16 až 18 obj. %) a jsou proto vhodné pro kvašení vín na vyšší obsah alkoholu. Používají se též jako čisté kultury ve vinařském průmyslu. Velmi často tvoří dominantní podíl mikroflóry mladých vín (Minárik, Švejcar, 1981). Buňky druhu Saccharomyces uvarum jsou oválné až protáhlé. Tvoří 1 až 4 spory ve vřecku. Tvoří dobře vyvinuté pseudomycelium. Asimiluje a zkvašuje glukózu, galaktózu, sacharózu, maltózu a kompletně rafinózu. Při fermentaci invertního cukru upřednostňuje glukózu před fruktózou. Produkuje méně alkoholu maximálně do 10 obj. %. U nás byly nalezeny na zelených letorostech, hroznech a v moštu i v mladém víně před dokvašením. Kvasí i při nižších teplotách (Minárik, Švejcar, 1981). 12

13 Obr. 1: Druh Saccharomyces cerevisiae (National collection yeast cultures, 2012) Rod Hansenula Kvasinky tohoto rodu jsou kulaté, oválné, válcovité až protáhlé, morfologicky značně podobné kvasinkám Pichia sp. se kterými mají společnou vlastnost, tvorbu dobře vyvinuté kožky (Minárik, Švejcar, 1981). Druh Hansenula anomala tvoří na moště matnou, suchou, bělavou kožku, která silně vzlíná. Tvorba pseudomycelia je dobrá. Kvasinky asimilují a zkvašují glukózu, galaktózu, sacharózu, maltózu a rafinózu do 1/3. Produkce alkoholu je velmi nízká 3 až 5 obj. %. Pozoruhodná je tvorba esterů. Největší výskyt těchto kvasinek je zejména v okrajových vinohradnických oblastech (Minárik, Švejcar, 1981). Rod Pichia Rod Pichia sp. patří mezi rody s nízkými kvasnými schopnostmi neboť jeho druhy zkvašují buď jen glukózu, nebo nezkvašují žádný cukr. Vyskytují se jako kontaminace vína, hlavně ve špatně uzavřených lahvích, kde tvoří křís, tj. křehkou vzlínavou blanku na povrchu kapaliny (Šilhánková, 2002). Buňky jsou různého tvaru od oválných až k dlouze válcovitým. Vyznačují se tvorbou bohatého pseudomycelia. Rozmnožují se pučením, spory mají kulaté, někdy polokulovité, jsou 1 až 4 ve vřecku (Minárik, Švejcar, 1981). Druh Pichia farinosa má válcovité, značně protáhlé buňky, jak je možno vidět na obr. č. 2. V tekutém prostředí vytváří silnou, zvrásnělou a suchou kožku. Pseudomycelium má stromečkovitý tvar. V málo alkoholických vínech může vytvářet křís, tak jako další druhy tohoto rodu (Minárik, Švejcar, 1981). Tento druh se 13

14 vyznačuje tzv. killerovým faktorem. Vylučuje bílkovinu, která prostupuje buněčnou stěnou citlivých kvasinek a během několika hodin je umrtvuje (Kraus a kol., 2008). Obr. 2: Druh Pichia farinosa (National collection yeast cultures, 2012) Kvasinky druhu Pichia membrenaefaciens mají buňky válcovité, až válcovitě protáhlé. Tvorba psedomycelia je velmi dobrá s chomáčkovitým uspořádáním blastospor. Kvasinky tohoto druhu nezkvašují žádný cukr. Pouze asimilují glukózu. Tento druh je velmi typickou křísotvornou kvasinkou a může se za příznivých podmínek podílet na tvorbě křísu (Minárik, Švejcar, 1981). Rod Schizosaccharomyces Většina druhů rodu Schizosaccharomyces utilizuje kyselinu L-jablečnou. Kyselina jablečná je jedna z organických kyselin v hroznech, které zhoršují organoleptické vlastnosti vína. Existují pokusy tuto kyselinu odstranit pomocí těchto kvasinek (Chumchalová a kol., 2008). Druh Sch. pombe poprvé v r.1893 popsal Lindner z izolace z afrického prosného piva "pombe". Je často izolován v tropických krajinách z palmového vína. Vytváří kulovité, elipsoidní i krátké válečkovité buňky. Velikost buněk někdy narůstá do délky až 20 μm. Pseudomycelium se nevytváří, jen krátký řetězec buněk. Vegetativně se rozmnožuje dělením přehrádkami (Chumchalová a kol., 2008) Asporogenní druhy kvasinek Rod Metschnikowia U tohoto rodu se vyskytuje druh Metschnikowia (Candida) pulcherrima. Jsou to kvasinky vyskytující se ve všech našich vinohradnických oblastech a tvoří dominantní 14

15 podíl mikroflóry hroznů. Společně s Kloeckera apiculata jsou zodpovědné za zahájení spontánního kvašení moštů. Ve vínech se nevyskytují, protože mají malou prokvašující schopnost - 1 až 2 obj. % alkoholu. Buňky jsou kulatého až oválného tvaru. V moštech při spontánním kvašení se rychle rozmnožují, ale jsou také brzy potlačeny jinými vitálnějšími kvasinkami (Minárik, Švejcar, 1981). Rod Kloeckera Buňky tohoto druhu jsou apikální, oválné, někdy až protáhlé. Nejčastěji se rozmnožují bipolárním pučením. Charakteristickým znakem je špatná tvorba více nebo méně nedokonalého, zřídka dobře vyvinutého pseudomycelia (Minárik, Švejcar, 1981). Druh Kloeckera apiculata tvoří typické apikulátní až protáhlé buňky. Kvasinky asimilují a zkvašují jen glukózu. Pseudomycelium netvoří. Kloeckera apiculata je v prvé řadě výraznou složkou mikroflóry hroznů a rozkvašených moštů. Produkuje asi 4 až 5 obj. % alkoholu. Společně s Metschnikowia pulcherrima zahajuje spontánní kvašení moštu, a proto jsou tyto kvasinky důležité z technologického hlediska. Ve vínech je výskyt Kloeckera apiculata vzácný (Minárik, Švejcar, 1981). Rod Candida Kvasinky tohoto rodu jsou z vinařského hlediska zajímavé zejména svým výskytem. Někteří zástupci rodu Candida sp. se zásadně vyskytují na hroznech a jsou zodpovědni za zahájení alkoholického kvašení, jiní např. druh Candida vini jsou zase velmi častou složkou mikroflóry mladých vín (Minárik, Švejcar, 1981). Výskyt druhu Candida krusei je u nás méně častý. Buňky jsou oválné až protáhlé, často v řetízcích. V tekutém prostředí tvoří vzlínavou šedobílou kožku a bohaté psedomycelium. Zkvašují a asimilují glukózu. Ostatní cukry nevyužívají. Tyto kvasinky podobně jako Candida vini, mohou za vhodných podmínek (méně alkoholické víno a společenství dalších kožotvorných kvasinek, např. Pichia sp.) působit na vznik křísu. Druh Candida vini tvoří oválné až válcovité buňky. Výrazným znakem tohoto druhu je tvorba silné, matné, vysoko vzlínající kožky a dokonalá tvorba bohatě vyvinutého pseudomycelia. Cukry nejsou zkvašovány, pouze je asimilována glukóza. V moštu je výskyt těchto kvasinek velmi vzácný. Naproti tomu však tvoří dominantní část kvasinkové flóry mladých vín téměř ve všech našich vinohradnických oblastech. Příliš 15

16 velké zastoupení těchto mikroorganismů v méně alkoholických vínech může vést, společně s dalšími křísotvornými druhy, ke křísovatění vína (Minárik, Švejcar, 1981). Rod Rhodotorula Kvasinky tohoto rodu se vyznačují oválnými až protáhlými buňkami. Rozmnožují se pučením. Jsou stálou mikroflórou výrobních zařízení vinařských závodů. Největší jejich výskyt je na stěnách sklepů, příp. Na jejich podlaze. Na stěnách sklepů často tvoří růžové až hnědorůžové povlaky, ve většině případech ve společenství některých slizovitých bakterií, např. Leuconostoc mesenteroideus, případně některých plísní. Rod Rhodotorula sp. bývá nejčastěji zastoupen druhy Rh. glutinia a Rh. rubra. Vzhledem k malé odolnosti vůči alkoholu se kvasinky rodu Rhodotorula sp. ve vínech nevyskytují a nemají tudíž žádný technologický význam (Minárik, Švejcar, 1981). Rod Brettanomyces Příslušníci rodu Brettanomyces sp. se vyskytují jako kontaminace kvašených nápojů. Při kvašení cukrů produkují značné množství octové kyseliny. Vzniklé velmi kyselé ph je pak velmi brzy usmrcuje. Kvašení je u nich většinou stimulováno plynným kyslíkem (tzv. Custersův efekt). Jednotlivé buňky jsou často na jednom pólu zašpičatělé (ogivální). Tvoří však i pseudomycelium až pravé mycelium, které je u jednoho druhu (Brettanomyces anomalus) bez přepážek (tj. jednobuněčné) (Šilhánková, 2002). 3.3 Aktivní vinné suché kvasinky Mezi selektovanými sušenými kvasinkami je široká škála kmenů s odlišnými vlastnostmi, které bývají popsány v katalogu firemních produktů. Jsou to například startovací kvasinky, kvasinky pro dokvášení, chladnomilné kvasinky, pro zvýraznění aroma, pro červená vína s tóny ovocných plodů nebo pro produkci zrajících červených vín, pro vína se zbytkovým cukrem, pro obnovení fermentace a další. Některé druhy se však vyznačují tzv. killerovým faktorem (Kraus a kol., 2008). Jeden z druhů vyznačující se touto vlastností je Pichia farinosa. (L ARC International, 2010). Vylučují bílkovinu, která prostupuje buněčnou stěnou citlivých kvasinek a během několika hodin je umrtvuje (Kraus a kol., 2008). V praxi se ustálilo užívání čistých kultur, které jsou v určitých vlastnostech specializované a prodávají se jako suché preparáty. Vývoj ve šlechtění kvasinek je 16

17 bouřlivý a každoročně se objevují nové kvasničné kmeny se speciálními vlastnostmi, zaměřenými na určitý typ vín (Ackermann, 2002). Pro řízené alkoholové kvašení je nutné vybrat ASVK, které se prokazují určitými technologickými vlastnostmi. Je třeba vybírat kvasinky, které jsou schopné hlubokého prokvašení, tedy takové, které umožní, aby po ukončení kvašení zůstalo ve víně 2 g.l -1, maximálně 4 g.l -1 zbytkového cukru. Při výběru vhodných ASVK musí dbát také na to, kolik použité kvasinky produkují těkavých kyselin. U bílých vín by neměly přesáhnout 0,4 g.l -1 a u červených vín 0,5 g.l -1. Další z vlastností ASVK je nízká tvorba acetaldehydu a žádná, nebo jen nepatrná tvorba sirovodíku. Dobré ASVK se vyznačují nízkou pěnivostí (Pazderková, 2011) Přehled výrobců a druhů aktivních suchých vinných kvasinek Přípravky firmy ERBSLÖH Oenoferm jsou speciální aktivní suché vinné kvasinky Saccharomyces cerevisiae LW (Proneco, 2012). Nově vyvinutou technologií výroby je dosažena neobvyklá vitalita preparátu až 25 miliard živých buněk na 1 g (Vinařský ráj, 2012). Oenoferm Bio v Klingelbergu jsou rozmnožené, vysušené čisté kvasinky vyrobené za podmínek biologické certifikace. Použité rozmnožovací médium pochází z certifikovaného biologického pěstování. Použitý kmen kvasinek zdůrazňuje charakteristické vlastnosti odrůdy hroznů, polohu vinohradu a kvalitu půdy bez ovlivnění samotného typu vína. Tyto kvasinky byly selektovány jako Saccharomyces cerevisiae izolát Klingelberg od dr. Seibicke z vinohradu Markgrafen Bádensko na zámku Staufenberg. Doporučené dávkování je 15 g.hl -1 moštu (Vinařský ráj, 2012). Oenoferm Freddo jsou chladnomilné aktivní suché vinné kvasinky na rozkvášení studených moštů od 8 C a na regulované kvašení při teplotách od 13 do 17 C za účelem zachování aromatu. Tyto kvasinky Saccharomyces serevisae kmen LW prokvašují na vysoký stupeň alkoholu i přes nízké teploty. Doporučené dávkování je 15 g.hl -1 moštu (Vinařský ráj, 2012). Oenoferm InterDry je čistá, ušlechtilá sušená kvasinka k výrobě vína. Oenoferm InterDry se výborně hodí především pro vína, u kterých je zastaveno kvašení pro zachování zbytkového cukru. Obsahy acetaldehydu jsou výrazně nižší než u srovnatelných kmenů kvasinek. Tento druh kvasinek (Saccharomyces bayanus) 17

18 pochází z renomovaného australského institutu pro výzkum vína AWRI (Australian Wine Research Institute). Tento druh produkuje alkohol v rozsahu obj. %. Oenoferm InterDry je kultura kvasinek s tvorbou vloček a na konci procesu kvašení se projevuje výrazný sklon k tvorbě sedimentu. Doporučené dávkování je g.hl -1 moštu (Vinařský ráj, 2012). Oenoferm Bouquet je čistá, aktivní, ušlechtilá sušená kvasinka, která je známa svými aromatickými vlastnostmi. Speciálními vlastnostmi enzymů jsou uvolňovány z hroznů vlastní aromatické složky. Tento druh kvasinek, Saccharomyces bayanus, byl selektován v Bordeaux. Oenoferm Bouquet se stará o stejnoměrné kvašení při nízkých teplotách okolo 15 C. Tento druh dává dobré hodnoty alkoholu v rozsahu obj. %. Dávkování je 25 g.hl -1 moštu (Vinařský ráj, 2012). Oenoferm Riesling je kmen kvasinek E 68/73 druhu Saccharomyces cerevisiae zdůrazňuje vynikajícím způsobem aromatický charakter jemného ryzlinkového vína. Doporučené dávkování je 15 g.hl -1 moštu (Vinařský ráj, 2012). Oenoferm Terra je vyroben selekcí divokého kvasinkového kmene, který nemění charakter terroir vína, nýbrž ho uvolňuje a podporuje. Současně je zajištěn kvasný výkon až do konce, bez tvorby vedlejších kvasných produktů. Doporučené dávkování je g.hl -1 moštu (Vinařský ráj, 2012). Oenoferm PinoType jsou vynikající kvasinky určené k výrobě moderních, svěžích burgundských vín při zajištění úplného prokvašení. Vhodné pro odrůdy Rulandské bílé, Rulandské šedé, Rulandské modré, Chardonnay a Svatovavřinecké. Dávkování preparátu je g.hl -1 moštu (Proneco s.r.o., 2012). Oenoferm Müller Thurgau je speciální odrůdová kvasinka, která zdůrazňuje jemné muškátové tóny odrůdy Müller Thurgau (Vinařský ráj, 2012). Oenoferm Rouge jsou speciální selektované osvědčené modré odrůdy kvasinky Oenoferm Klosterneuburg. Jsou to kvasinky Saccharomyces cerevisiae, kmen LW , u nichž byl při selekci kladen důraz na zachování červeného barviva při kvašení rmutu a moštu z modrých odrůd. Dávkování je 15 g.hl -1 moštu (Vinařský ráj, 2012). Oenoferm Structure je speciálně vybraná čistá sušená kvasinka z druhu Saccharomyces cerevisiae k výrobě červených vín s vysokou hustotou taninu. Kvasinka podporuje uvolňování látek z hroznů, důležitých pro barvu vína. Doporučené dávkování je g.hl -1 moštu (Vinařský ráj, 2012). 18

19 Oenoferm Color je produkt pro vinifikaci cuvée. Nejlépe se hodí pro výrobu barevně stabilního červeného vína se zdůrazněným ovocným charakterem. Doporučené dávkování je g.hl -1 moštu (Vinařský ráj, 2012). Oenoferm Rosé je speciálně selektovaná sušená ušlechtilá kvasinka pro přípravu rosé nebo ledového vína. Jedno z nejdůležitějších kritérií bylo rychlé nakvašení a vhodnost pro studené nakvašování. Právě při výrobě vín s ovocnou chutí je rychlé nakvašení obzvláště důležité. Tím je potlačena u cizích organismů produkce nežádoucích látek a brání jejich rozmnožování. Oenoferm rosé patří k druhu kvasinek Saccharomyces bayanus. Doporučené dávkování je g.hl -1 moštu (Vinařský ráj, 2012). Ceny přípravků společnosti ERBSLÖH se pohybují v rozmezí od 28 Kč do 61 Kč za 200 g přípravku. Přípravky firmy ESSECO Challenge AROMA WHITE druhu jsou sušené vinné kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Jsou selektovány pro produkci svěžích ovocných bílých vín. Pro aromatické a středně aromatické odrůdy (Sauvignon blanc, Riesling, Chardonnay). Pro produkci rosé vín a mladých červených vín. Pro výrobu vín studenou macerací. Doporučené dávkování je g.hl -1 moštu (BS Vinařské potřeby s.r.o, 2012). Challenge VINTAGE WHITE jsou sušené vinné kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Pro produkci komplexních bílých vín s dlouhou životností. Ideální pro produkci vín zrajících v sudech. Doporučené dávkování je g.hl -1 moštu (BS Vinařské potřeby s.r.o, 2012). Kvasinky Challenge EZFERM druhu Saccharomyces bayanus. Pro produkci bílých a červených vín s vysokým obsahem cukru. Ošetření a prevence zastaveného kvašení. Tvorba typického odrůdového aroma. Doporučené dávkování je g.hl -1 moštu (BS Vinařské potřeby s.r.o, 2012). Kvasinky Challenge RED FRUIT druhu Saccharomyces cerevisiae. Pro elegantní a harmonická červená vína s výrazným ovocným aroma - Svatovavřinecké, Frankovka, Zweigeltrebe, Modrý Portugal. Doporučené dávkování je g.hl -1 moštu (BS Vinařské potřeby s.r.o, 2012). Kvasinky Challenge VINTAGE RED druhu Saccharomyces cerevisiae. Pro elegantní a harmonická červená vína s typickým odrůdovým aroma - Cabernet 19

20 Sauvignon, Cabernet Franc, Merlot, Shiraz, Pinot Noir. Doporučené dávkování je g.hl -1 moštu (BS Vinařské potřeby s.r.o, 2012). Ceny přípravků společnosti ESSECO se pohybují v rozmezí od 1293 Kč do 1411 Kč za 500 g přípravku. Přípravky firmy AEB Fermol arôme plus jsou specifické aktivní sušené kvasinky určené na vinifikaci vysoce jakostních bílých vín. Je to zvláštní kmen selektovaných kvasinek speciálně určený pro zvýraznění aromatických látek tak, že se výrazněji projevují typické vlastnosti kultivaru. Kvasinky jsou vyšlechtěny z druhu Saccharomyces cerevisiae (Compo, 2012). Doporučené dávkování je g.hl -1 moštu. Dostupnost balení je 500 g (AEB S.p.A, 2012). Fermol rouge je vybraný kmen kvasinek, který je doporučován zvláště pro kvašení červených vín, neboť dovede uchovat obsah antokyaninových barviv extrahovaných během macerace, takže vzniklé víno má lepší barvu a vyšší obsah aromatických látek. Je také určen pro všechna primární kvašení a pro kvašení hroznů macerovaných pomocí oxidu uhličitého. Dále se doporučuje pro výrobu růžových vín. Kvasinky jsou vyšlechtěny z druhu Saccharomyces cerevisiae (Compo, 2012). Doporučené dávkování je g.hl -1 moštu. Dostupnost balení je 500 g (AEB S.p.A, 2012). Fermol reims champagne. Je doporučován zejména pro kvašení nebo opětovné kvašení šumivých vín (v láhvi nebo v tlakovych nádržích) a pro tepelně řizení kvašení. Selekce provedena z druhu Saccharomyces bayanus. Jeho schopnost kvašení při nízkých teplotách umožňuje zlepšení obecných vlastností získaného šumivého vína, zejména kvalitu pěny a jemnost a trvanlivost bublin (Compo, 2012). Doporučené dávkování je g.hl -1 moštu. Dostupnost balení je 500 g (AEB S.p.A, 2012). Fermol primeurs jsou specifické aktivní sušené kvasinky určené pro výrobu mladých vín a vín macerovaných oxidem uhličitým. Kmen kvasinek je vyšlechtěn z druhu Saccharomyces cerevisiae. Je to kmen ušlechtilých kvasinek, který je zvlášť vhodný pro primární kvašení. Je-li použit při výrobě červených vín, zdůrazňuje jejich vůni (Compo, 2012). Doporučené dávkování je g.hl -1 moštu. Dostupnost balení je 500 g (AEB S.p.A, 2012). Fermol premier cru jsou specifické aktivní sušené kvasinky určené pro výrobu vysoce jakostních červených vín. Kmen kvasinek je vyšlechtěn z druhu Saccharomyces 20

21 cerevisiae (Compo, 2012). Doporučené dávkování je g.hl -1 moštu. Dostupnost balení je 500 g (AEB S.p.A, 2012). Fermol cryoaromae jsou kvasinky, které vyšlechtěny z kmene Saccharomyces uvarum. Selektovaný kmen kvasinek určený především k výrobě vína při velmi nízkých teplotách počínaje teplotou + 6 C (Compo, 2012). Doporučené dávkování je g.hl -1 moštu. Dostupnost balení je 500 g (AEB S.p.A, 2012). Fermol bouquet jsou specifické aktivní sušené kvasinky pro zvýšení obsahu aromatických látek při kvašení. Kvasinky jsou vyšlechtěny z druhu Saccharomyces cerevisiae. Kmen kvasinek speciálně určený pro zvýraznění aromatických látek, které vznikají při kvašení červených hroznů a pro rozvinutí a zdůraznění původního odrůdového aroma během kvašení bílých vín. (Compo, 2012). Doporučené dávkování je g.hl -1 moštu. Dostupnost balení je 500 g (AEB S.p.A, 2012). Fermol associées je kombinace Saccharomyces cerevisiae a Saccharomyces bayanus. Vybrané aktivní sušené kvasinky určené pro základní a druhotné kvašení. Kvasinky jsou speciálně doporučovány pro tepelně řízený proces kvašení a pro kvašení v systému uhličité macerace. Kvasinky se dále používají pro získaní vysoce jemně aromatického profilu během výroby červených vín a pro vývoj primárních ovocných aromat (Compo, 2012). Doporučené dávkování je g.hl -1 moštu. Dostupnost balení je 500 g (AEB S.p.A, 2012). Zymasil bayanus jsou aktivní sušené kvasinky získané z čisté kultury Saccharomyces bayanus ( dříve oviformis) specificky vybrané pro použití v těch oblastech výroby vína, kde je potřebné speciální kvašení a prokvášení a kde jsou složité podmínky (Compo, 2012). Doporučené dávkování je g.hl -1 moštu. Dostupnost balení je 500 g (AEB S.p.A, 2012). Zymasil aromatic je čistá kultura zvláštního kmene ušlechtilých kvasinek Saccharomyces cerevisiae, která je schopna během kvašení zvýšit obsah původních odrůdových aromatických látek a zároveň usnadňuje tvorbu sekundárních složek, které přispívají k lepší aromatické charakteristice vína (Compo, 2012). Doporučené dávkování je g.hl -1 moštu. Dostupnost balení je 500 g (AEB S.p.A, 2012). 21

22 3.4 Jablečno-mléčné kvašení V procesu jablečno-mléčného kvašení se nesnižuje extrakt, ale víno ztrácí ostrou kyselost kyseliny jablečné, která se přeměňuje na kyselinu mléčnou a CO 2 (Kučerová a kol., 2007). Cílem tohoto kvašení je především minimalizace chuťové méně příjemné kyseliny jablečné a její přeměna na jemnější a harmonickou kyselinu jablečnou. Metabolismus kyseliny jablečné odstraňuje potencionální zdroje uhlíku pro výživu bakterií, a proto vede k mikrobiální stabilitě vína (Pavloušek, 2010). Spontánní jablečno-mléčné kvašení probíhá v našich klimatických podmínkách s nečistou mikroflórou a vede k tvorbě negativních senzorických projevů (těkavé kyseliny, těkavé sirnaté látky a negativních mléčných aromat). Vývoj spontánní mikroflóry je určený vývojem počasí v době zrání hroznů. Deštivé periody nejsou pro rozvoj kvalitní mikroflóry příhodné. Negativní je také napadení hroznů hnilobami. Divoké bakterie se mohou vyskytovat i na zařízení ve sklepě, nádobách atd. Spontánní rozvoj jablečno-mléčné fermentace podporují teploty vyšší než 22 C, kontakt s jemnými kvasničnými kaly a nízký obsah volného oxidu siřičitého (Pavloušek, 2010). Základní výhodou inokulace selektovaného kmene mléčných bakterií je možnost kontroly průběhu jablečno-mléčného kvašení, a tím pozitivní vliv na senzorické vlastnosti vína. Úplný průběh jablečno-mléčnoho kvašení je důležitý i z pohledu mikrobiální stability vína. Využití selektovaných preparátů mléčných bakterií umožňuje realizaci jabelčno-mléčného kvašení také v obtížnějších podmínkách, např. při nízké teplotě nebo nízké hodnotě ph (Pavloušek, 2010). Kyselina octová se začíná vytvářet teprve, když je spotřebovaná polovina kyseliny jablečné a bakterie začínají využívat kyselinu citronovou. Kyseliny citronová potom může vést k tvorbě kyseliny octové nebo diacetylu. Neřízené jablečno-mléčné kvašení (zejména při hodnotách ph > 3,5) může vytvářet negativní senzorické vlastnosti, jako jsou mléčné a jogurtové aroma, hořké tóny v dochuti vína, animální a octové tóny. Pro dobrý začátek a průběh jablečno-mléčné fermentace se proto zdá ideální hodnota ph kolem 3,4. Volný oxid siřičitý působí na mléčné bakterie velmi toxicky. Jeho působení zesiluje podmínky nízkého ph u moštu nebo vína. Pro dobrý rozvoj mléčných bakterií jsou vhodné anaerobní podmínky (Pavloušek, 2010). 22

23 3.4.1 Charakteristika nejdůležitějších bakterií Bakterie jsou součástí mikroflóry hroznů, moštů a vín. Z technologického hlediska se dělí na užitečné, kterými se víno zlepší, protože v něm vyvolávají jablečno-mléčné kvašení, a na škodlivé, které způsobují ve víně nežádoucí mikrobiologické změny (Pavloušek, 2010) Systematika bakterií ve víně Bakterie ve víně jsou klasifikovány podle Bergey`s Manual z roku Podle této klasifikace patří bakterie ve víně do třídy Schizomycetes, řádu Pseudomonadales, čeledi Pseudomonadaceae s rody Acetobacter a Pseudomonas. Řád Eubacteriales s čeledí Lactobacillaceae představují skupiny Atreptococceae a Lactobacillaceae s rody Streptococcus, Pedioccocus, Leuconostoc a Lactobacillus. Tato klasifikace ukazuje, že jde o bakterie octové a mléčné (Farkaš, 1980). Mléčné bakterie se rozdělují na homofermentativní a heterofermentativní. Homofermentativní bakterie (např. některé druhy rodu Pediococcus sp.) přeměňují glukózu nebo fruktózu na kyselinu mléčnou, heterofermetativní bakterie (druhy rodu Lactobacillus sp., druh Oenococcus oeni) vytvářejí naopak vedle kyseliny mléčné také další produkty kyselinu octovou, etanol a CO 2 (Pavloušek, 2010) Bakterie mléčného kvašení Bakterie mléčného kvašení, mají význam při výrobě vína. Působení bakterií ve vínech je různorodé. Téměř všechny bakterie mléčného kvašení jsou schopné rozkládat kyselinu L-jablečnou za vzniku kyseliny mléčné a současného snížení acidity vína. Všechny druhy mléčných bakterií jsou schopné rozkládat také cukry, obsažené v moštu či víně na kyselinu mléčnou a kyselinu octovou, přičemž z fruktózy vzniká nejčastěji manit, který je ve vínu málo vhodný (Minárik, Švejcar, 1981). Některé rody, resp. druhy mléčných bakterií mohou působit na kvalitu vína silně negativně, např. Lactobacillus plantarum, které jsou schopné rozkládat v červených vínech kyselinu vinnou, vinný kámen a glycerol na kyselinu octovou, kyselinu mléčnou a CO 2. Tento nežádoucí jev se nazývá zvrhnutí vína. Vína napadená mléčnými bakteriemi mají mléčnou příchuť a zvýšený obsah těkavých kyselin. Protože se rozkládá glycerol a kyselina vinná, dojde ke snížení extraktivních látek a tím se stává víno prázdnější. Dojde rovněž k rozrušení červeného barviva, což se projeví nahnědlým 23

24 odstínem vína (Minárik, Švejcar, 1981). Rody Streptococcus sp., Pediococcus sp., Lactococcus sp. a Enterococcus sp. mají pouze anaerobní katabolický metabolismus a tvoří kyselinu mléčnou jako téměř jediný produkt metabolismu cukrů. Proto se zařazují mezi homofermentativní mléčné bakterie (Šilhánková, 2002). Rod Pediococcus Je mikroaerofilní až anaerobní a jeho povrchový růst na tuhých substrátech je velmi slabý. Tvoří buňky ve dvojicích nebo tetrádách (Šilhánková, 2002). Bakterie rodu Pediococcus sp. negativně ovlivňují aromatické a chuťové vlastnosti vína díky produkci výrazně máslových tónů a hořkosti. Máslové tóny jsou vyvolané produkcí vyšších koncentrací diacetylu. Hořké chuťové tóny jsou způsobené degradací glycerolu na akrolein, který následně při reakci s fenoly vykazuje hořkou chuť. Diacetyl může vínu poskytovat výrazné máslové aroma už při koncentracích 0,02-2,0 mg.l -1, vždy v závislosti na typu vína (Pavloušek, 2010). Druh Pediococcus cerevisiae patří k homofermentativním kokům a kromě kyseliny mléčné produkuje manitol a ethanol. Ke svému růstu využívá glukózu, fruktózu, manózu, cellobiózu. Roste již při teplotě 15 C, optimální teplota pro růst a rozmnožování je 25 C, při 45 C se růst zastavuje (Farkaš, 1980). Rod Oenococcus V našich vinařských podmínkách jsou nejdůležitější heterofermentativní grampozitivní bakterie rodu Oenococcus (dříve Leuconostoc) zejména druh Oenococcus oeni. Jak tento druh vypadá ukazuje obr. č. 3. Je to zejména proto, že bakterie rodu Oenococcus vyvíjejí činnost při nižším ph (3,4 i méně), kdežto bakterie rodu Lactobacillus sp. rozkládají kyselinu L-jablečnou při ph 4,0 až 5,5. Z uvedeného vyplývá, že rod Oenococcus je značně odolnější vůči aciditě, což má pro naše severnější vinohradnictví nesmírný význam. Malé, oválné buňky se slizovitým obalem vegetují jednotlivě, případně v párech nebo krátkých řetízcích. Jejich optimální teplota je C. Rozkládají kyselinu L-jablečnou a citronovou. Glukózu zkvašují na kyselinu mléčnou, CO 2, ethanol a kyselinu octovou a fruktózu zkvašují na manitol. (Minárik, Švejcar, 1981). 24

25 Druh Oenococcus oeni se v současné době využívá jako zmrazená startovací kultura pro bezpečné zahájení biologického odbourání kyselin. Přidává se během kvašení, aby se využila teplota kvašení, a to především do vín prokvašených do sucha. Je třeba se vyhnout příliš brzkému přídavku bakterií, protože vyšší koncentrace cukru (přes 15 g.l -1 ) brzdí činnost bakterií a vzniká nebezpečí vytváření octa a jiných nežádoucích aromatických látek. Běžný počet startovacích zárodků se pohybuje mezi 3 až 4 miliony buněk.ml -1 a namnožením se pak jejich koncentrace zvyšuje desetinásobně. Tím se při vhodném ph a teplotě dosáhne plynulého odbourávání kyselin (Steidl a Schödl, 2002). Obr. 3: Druh oenococcus oeni (PBWIKI, 2011) Rod Lactobacillus Laktobacily jsou grampozitivní, mikroaerofilní, nesporulující tyčinky. Jsou známé tím, že rozkládají laktózu a jiné cukry na kyselinu mléčnou (Sládková, Hlaváčová, 2011). Z potravinářského i biotechnologického hlediska je nejdůležitější mikroaerofilní rod Lactobacillus sp., který je v přírodě velmi rozšířen. Podle produktů katabolického metabolismu rozdělujeme rod Lactobacillus na tzv. homofermentativní mléčné bakterie, které při zkvašování sacharidů produkují prakticky pouze kyselinu mléčnou (např. druhy L. delbrueckii, L. acidophilus, L. plantarum) a na tzv. heterofermentativní, které produkují vedle kyseliny mléčné ještě značné množství ethanolu a CO 2 (např. L. fermentum, L.brevis, L.buchneri) (Šilhánková, 2002). Druh Lactobacillus plantarum je také v současné době využíván jako zmrazená startovací kultura pro bezpečné zahájení biologického odbourání kyselin. Přidává se před kvašením, protože špatně snáší alkohol. Předností použití je absence 25

26 nežádoucích tónů po odbourávání kyselin. Nedostatkem je, že kyselina jablečná není zpravidla zcela odbourána, protože vznikající alkohol při zahájení kvašení činnost bakterií zastaví. Po ukončení kvašení existuje možnost zbývající kyselinu jablečnou úplně odbourat pomocí bakterií druhu Oenococcus oeni s přiměřeně intenzivní chutí po odbourání. Pokud neproběhne úplné odbourání kyseliny jablečné, může dojít k mikrobiologické nestabilitě (Steidl a Schödl, 2002) Bakterie octového kvašení Octové bakterie jsou aerobní mikroorganismy, ke svému růstu a vývoji proto potřebují kyslík. Mohou se vyskytovat na hroznech ve vinici, v moštu i víně (Pavloušek, 2010). Na zdravých hroznech se nejvíce vyskytuje druh Gluconobacter oxydans. Acetobacter sp. se na zdravých hroznech vyskytuje minimálně. Poškozené hrozny obsahují podstatně větší populace octových bakterií. Nejvíce zastoupené jsou u nich druhy Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianum. V moštu a v počátcích kvašení je dominantní Gluconobacter oxydans. Ke konci kvašení opět převažuje Acetobacter aceti (Pavloušek, 2010). Větší pravděpodobnost výskytu octových bakterií existuje, jestliže jsou hrozny mechanicky poškozené nebo napadené houbovými chorobami či šedou a bílou hnilobou hroznů révy (Pavloušek, 2010). Rod Acetobacter Tento rod z čeledi Acetobacteraceae představuje aerobní bakterie s výraznou schopností oxidovat ethanol na octovou kyselinu. Nepříznivě se tyto octové bakterie uplatňují při octovatění vína. Bakterie rodu Acetobacter mají tvar tyčinek, které však často tvoří tzv. involuční formy, tj. nepravidelné tvary (nepravidelně zduřelé až kulovité, zakřivené, vláknité apod.); vyskytují se jednotlivě, v párech nebo řetízcích. Mají přísně aerobní metabolismus, takže již krátké přerušení dodávky kyslíku vede v přítomnosti ethanolu k jejich usmrcení. Při poklesu koncentrace ethanolu oxidují vzniklou octovou kyselinu až na oxid uhličitý a vodu (tzv. přeoctění). Využívají také jiné substráty, např. vyšší jednosytné a vícesytné alkoholy, hexózy a od nich odvozené kyseliny, dále laktát atd. (Šilhánková, 2002). Druh Acetobacter aceti představuje elipsoidní tvar až tyčky, které jsou rovné nebo 26

27 mírně zakřivené. Tyčky jsou buď jednotlivé, ve dvojicích nebo v řetízcích. Jedná se gramnegativní aerobní bakterii oxidující ethanol na kyselinu octovou (Chumchalová a kol., 2008). Druh Gluconobacter oxydans je gramnegativní, obligátně aerobní bakterie. Tento druh je charakterizován neúplnou oxidací širokého spektra sacharidů (mj. oxiduje ethanol na kyselinu octovou). Tato neúplná oxidace vede k širokému využití v oblasti průmyslu (například k syntéze vitamínu C) (Evropský institut bioinformatiky, 2012). 3.5 Charakteristika nejdůležitějších mikroskopických hub ve vinařství Houby tvořící mycelium, vláknité vegetační útvary, se označují jako plísně. Jednotlivá vlákna houby označujeme jako hyfy, které mohou anebo nemusí být členěné na buňky. Systém hyf se označuje jako mycelium (Minárik, Švejcar, 1981). Plísně jsou mikroorganismy, které spolu s kvasinkami a bakteriemi tvoří mikroflóru vinné révy a hroznů během vegetace. Vyskytují se na stěnách vinných sklepů, sudů a vinařských zařízení a často také v neodborně ošetřovaných, zejména dřevěných nádobách na víno (Farkaš, 1980) Systematika mikroskopických hub Plísně se systematicky řadí do tří velkých tříd - Fungi imperfecti (Deuteromycetes), Phycomycetes, Ascomycetes. Z vinařského hlediska je nejdůležitější třída Fungi imperfecti, rod Cladosporium. V třídě Phycomycetes zejména čeleď Mucoracerae a v třídě Ascomycetes čeleď Aspergilaceae (Farkaš, 1980). Třída Fungi imperfecti Nesystematická umělá skupina mitosporních hub (Deuteromycetes), zahrnující pouze nepohlavně se rozmnožující se houby (Chumchalová a kol, 2008). Rod Cladosporium Tvoří řetízky vícebuněčných spor, které však vznikají pučením, takže jde o blastospory. Spory i starší mycelium jsou tmavě zbarveny (Šilhánková, 2002). Druh Cladosporium cellare Person je rozšířen zejména ve vinných sklepech a pokládá se za užitečnou plíseň. Má totiž schopnost vázat mikrokondenzací organické a anorganické výpary ze vzduchu. Z vodních výparů asimiluje ethanol, aldehydy, těkavé 27

28 estery a kyseliny (Farkaš, 1980). Třída Ascomycetes Mnohé plísně patří, podobně jako kvasinky do třídy vřeckatých hub Ascomycetes. Nejvýznamnější v této třídě je čeleď Aspergillaceae (Minárik, Švejcar, 1981). Rod Aspergillus Rod se rozmnožuje vegetativně konidiemi, které vznikají v řetízcích z fialid na rozšířeném konci konidioforů. Asky jsou umístěny v kulovitém kleistotheciu (nesprávně nazývaném perithecium), které má sírově žlutou barvu a je zřetelný pouhým okem jako drobné kuličky o průměru menším než 1 mm (Šilhánková, 2002). Druh Aspergillus ruber je možno najít na korkových zátkách vinných lahví. Hyfy produkují červené barvivo, které korek zbarvuje do purpurově červené barvy (Minárik,, Švejcar, 1981). Druh Aspergillus glaucus se vyskytuje všude v přírodě i ve sklepech. Vznikající mycelium je zpočátku žlutozelené, později přechází do šedohněda. Napadá korkové zátky, hadice a dřevěné sudy. Přijde-li víno do styku s nádobami, dřevěnými sudy nebo korkovými zátkami, které napadla tato plíseň, dostává nepříjemnou plísňovou příchuť, která se velmi nesnadno odstraňuje (Farkaš, 1980). Rod Penicillium Do skupiny Asymmetrica patří druh Penicillium glaucum, který je hlavní příčinou ztrát při skladování ovoce (skupina je nejrozšířenější s nesymetricky uspořádaným štětečkem konidioforu) (Šilhánková, 2002). Druh Penicillium glaucum je rozšířen prakticky všude, kde se vyskytují vhodné sloučeniny, zejména sacharidy, napadá především hrozny, jejichž bobule jsou poškozeny hmyzem nebo kroupami a vyvolává tzv. zelenou hnilobu hroznů. Spotřebuje část cukrů a kyselin, ale také část dusíkatých látek. Produkuje nepříjemné těkavé látky, které se projevují plísňovou příchutí. Vyskytuje se v neodborně ošetřených sudech, hadicích, na korkových zátkách apod. Dostane-li se do styku s vínem, dodává mu nepříjemnou plísňovou příchuť, která se těžko odstraňuje. Je nebezpečná hlavně pro modré odrůdy, protože rozrušuje třísloviny a barviva (Farkaš, 1980). Druh Penicillium purpurogenum má podobné vlastnosti jako Penicillium glaucum, 28

29 napadne-li třísloviny, vznikají purpurově zbarvené pigmenty, podle kterých je plíseň nazvána (Farkaš, 1980). Plísně rodu Penicillium sp. mohou poškozovat jakost vína i nepřímo. Ve víně se nemohou rozmnožovat, stačí však, aby víno se dostalo do styku se zátkou obrostlou plísní. Chuťové i vonné substance se rychle rozpustí a už v minimální koncentraci dodávají vínu pachuť po plísni, kterou je možno jen velmi těžko odstranit (Minárik, Švejcar, 1981). Rod Botrytis Dříve byl tento rod zařazován do třídy Fungi imperfecti (Deuteromycetes). Botryotinia fuckeliana je patogen s velice širokým okruhem hostitelských rostlin. U révy vinné může napadnout všechny části keře, kromě víceletého dřeva. Poškozeny bývají v prvé řadě květenství, třapiny a bobule. V některých letech, po dlouhém období jarních dešťů, mohou být infikovány také vrcholky výhonů a mladé listy (Šafránková, 2007). Perfektní stádium je označováno jako rod Sclerotinia, jeho druh Botryotinia fuckeliana (Botrytis cinerea) tvoří tzv. ušlechtilou plíseň na vinných hroznech, neboť poškozením slupek bobulí zvyšuje výpar vody, což je žádoucí pro přípravu vín tokajského typu (Šilhánková, 2002). Zpočátku tvoří bílé mycelium, barva poté přechází do hněda až černa. Při růstu se na slupce a pod slupkou hroznových bobulí tvoří 3-4 mm dlouhé a 2 mm široké černé sklerocia bez spor (Minárik, Švejcar, 1981). Obr. 4: Konidie druhu Botrytis cinerea zobrazené pomocí elektronového mikroskopu (Carrascosa a kol., 2011) 29

30 Významné škody způsobuje při napadení hroznů před dozráním bobulí. Napadení nezralých a zrajících bobulí tzv. kyselá hniloba. U modrých odrůd je působením houby ve slupce narušena tvorba červeného barviva a nelze již získat vysoce kvalitní červené víno. Jsou -li bílé odrůdy napadeny B. cinerea v době zralosti, může dojít k částečnému zvýšení výtěžnosti moštu. Ze zralých napadených hroznů lze získat vysoce kvalitní víno, pokud během slunečního počasí napadené bobule zaschnou ( ušlechtilá hniloba ). Typickým příznakem napadení B. cinerea je šedivý porost konidioforů s konidiemi na povrchu napadených pletiv. jež jsou zobrazeny na obr. č. 4. Od cukernatosti 19 NM se napadení může projevit jako ušlechtilá hniloba. Z napadené pokožky se za suchého počasí odpařuje voda a zvyšuje se obsah cukru. Z hroznů bílých odrůd s ušlechtilou hnilobou se získávají vysoce ceněná sladká vína (botrytický výběr). Silné srážky způsobují zředění a vytékání koncentrované šťávy (Šafránková, 2007). Třída Phytomycetes Pro vinařskou výrobu má význam čeleď Mucoraceae, která patří do podřádu Zygomycetales. Plísně této čeledě jsou rozšířené v přírodě. Žijí většinou saprofyticky na odumřelých rostlinách a živočiších. Druh Mucor racemosus napadá hrozny, hyfy se v moště rozpadají na kulatá oidia, tzv. mukorové kvasinky. Jsou schopné zkvašovat cukr, přičemž vznikají vedlejší produkty kvašení, jako je glycerol, acetaldehyd a organické kyseliny (Minárik,, Švejcar, 1981). 3.6 Choroby vína způsobené mikrobiologickou kontaminací Při vytváření a vyzrávání vína probíhají biochemické a fyzikálně chemické procesy, který mají vliv na jeho jakost. Předpokládá se, že při správném technologickém postupu budou vína zdravá a dobré jakosti. Jsou-li podmínky nepříznivé, například hrozny nahnilé, nádoby na uskladnění vína nevhodné, je-li teplota vyšší a vyskytují se chyby v technologickém postupu, mohou nastat odchylky od normálního vývoje vína, které se projeví celkovým zhoršením kvality. Toto zhoršení je patrné na chuti a vzhledu vína. Nemocná vína jsou taková, ve kterých vznikají nežádoucí změny nejčastěji účinkem mikroorganismů a která se v krátké době znehodnotí tak, že se nehodí ke konzumu (Farkaš, 1980). 30

31 3.6.1 Křís Křísovatění je způsobováno kvasinkami, které vytvářejí na povrchu vína povlak. Tvorba křísu začíná nejprve tvorbou malých skupin kvasinek na povrchu vína. Skupiny kvasinek se postupně rozrůstají a vytvářejí na povrchu vína silný povlak. Povlak je nejprve sametově bílý. Jestliže mají kvasinky neustále dobré podmínky pro svoje rozmnožování, povlak ještě zesílí a získává šedobílý nádech (Pavloušek, 2010). Křísovatění způsobují kvasinky Candida vini, Hansenula anomala, Pichia membraneafaciens (Farkaš, 1980). Výskytu křísovatění lze předcházet důslednou ochranou vína před oxidací. Zásadní je udržovat plné nádoby a dodržovat obsah volného oxidu siřičitého. Velice důležité je rovněž uložení vína při správných teplotách. Teploty nad 20 C rozvoj křísotvorných kvasinek a křísovatění podporují. Určitým způsobem ochrany před křísovatěním může být také vyšší obsah alkoholu ve vínech u bílých vín minimálně 12 obj. %, u červených vín minimálně 13 obj. % (Pavloušek, 2010). Pří výrobě některých speciálních vín se tvorba mázdry a rozvoj povrchových kvasinek dokonce podporuje, například při výrobě vín Sherry, která vlivem těchto kvasinek získávají zvláštní chuť (Farkaš, 1980). Sherry je poangličtěný název španělského města Jerez de la Frontera, které leží v jihozápadní části Španělska v oblasti zvané Andalusie. Vína se zde vyrábějí pouze z odrůd Palomíno, Moscatel a Pedro Ximénez, a to zvláštní technologií, která dává vínu specifický Sherry charakter. Vína po vykvašení se dolihují na obj. % alkoholu a dále zrají ve starých dubových sudech. Zvláštností tohoto zrání je, že sudy jsou naplněny vínem maximálně do dvou třetin objemu a na povrchu vína se vytváří tlustá vrstva kvasinek, tzv. floru, jak je ukázáno na obr. č. 5 (Vinotéka u MYDLÁŘE, 2012). Vzhledem k tomu, že tato kvasinková vrstva potřebuje nejen alkohol, ale také kyslík, nechává se v sudu určitý prostor volný. Flor, špinavě bílá, pěnu připomínající hmota, zabraňuje vínu ve styku se vzduchem a během let mu dodává speciální aroma. Tato pokrývka (flor) vzniká pouze ve speciálním klimatu v jihozápadní Andalusii, přičemž při vytváření floru sehrává rozhodující roli vlhkost mořského vzduchu (O víně nezávislý portál, 2012). 31

32 Obr. 5: Flor na hladině (POPO a POPO ) Těkavé kyseliny Původcem této choroby vína jsou jak octové, tak i mléčné bakterie. Tyto organismy jsou aerobní, žijící na vzduchu a za přítomnosti vzduchu. Rovněž jim vyhovují vyšší teploty. Optimální podmínky pro jejich vývoj se pohybují mezi C. Naproti tomu při nízkých teplotách, pod 10 C, je jejich rozmnožování obtížně. Těkavé kyseliny mohou být produkovány také divokými kvasinkami, které nepatří mezi rod Saccharomyces sp., jako jsou Hanseniaspora sp. či Kloeckera sp.. Dalším původcem mohou být kvasinky rodu Brettanomyces. Kvašení moštů, u kterých se předpokládá výskyt těkavých kyselin, probíhá za sníženého přístupu vzduchu (Pavloušek, 2010) Mléčné a manitolové kvašení vína Mléčné kvašení vzniká ve vínech s nízkým obsahem kyselin a tříslovin se zbytkovým cukrem. Nejčastěji se objevuje těsně po alkoholovém kvašení ve vínech, která byla přicukřena sacharózou. Mléčné bakterie rozkládají cukry na kyselinu mléčnou, octovou a oxid uhličitý (Farkaš, 1980). Vzniká při tom i manitol, který dává vínu nasládlou příchuť (při účasti druhu Bakterium mannitopoeum) (Pátek, 2002). Bakterie se rozmnožují nejen za přístupu, ale i bez přístupu vzduchu. Zkvašují glukózu, fruktózu, sacharózu, xylózu a kyselinu jablečnou za vzniku kyseliny mléčné a těkavých kyselin, popř. manitolu. Bakterie jsou odolné vůči ethanolu. Velmi dobře vegetují i při vyšší teplotě a při nízkém obsahu oxidu siřičitého. Objevují se nejčastěji ve vínech, která zdlouhavě kvasí (Farkaš, 1980). 32