Certifikovaná metodika

Transkript

1

2

3

4

5 Certifikovaná metodika OBSAH str. I. Cíl metodiky 4 II. Vlastní popis metodiky 4 III. Srovnání novosti postupů 11 IV. Popis uplatnění certifikované metodiky 11 V. Ekonomické aspekty 12 VI. Seznam použité související literatury 12 VII. Seznam publikací, které předcházely metodice 13 Přílohy 14 3

6 I. CÍL METODIKY Cílem této metodiky bylo vyvinout efektivní markerovací systém, kvalitativně vyšší úrovně, na základě sekvencí genů a genetických elementů, získaných skríningem genomových a expresních knihoven, pro šlechtění a management chmele (Humulus lupulus). Metodika je výsledkem řešení výzkumného projektu QH Národní agentury pro zemědělský výzkum. II. VLASTNÍ POPIS METODIKY Chmel patří v České republice k plodinám s tisíciletou pěstitelskou minulostí a jeho pěstování vždy znamenalo vysoký ekonomický podíl na celkovém hospodářství státu. Žatecký chmel, který je chráněn Chráněným označením původu EU Dossier Number: CZ/PDO/005/0402, byl do roku 1990 jedinou povolenou odrůdou chmele k pěstovaní v ČR. V druhé polovině 20. století bylo vyšlechtěno a zavedeno do komerčního pěstování ve světě několik desítek nových odrůd chmele. Trend rychlé obměny pěstovaných odrůd chmele, který pružně reaguje na potřeby pivovarského průmyslu, pokračuje i v současné době. V ČR je tak nyní registrováno už 12 odrůd chmele: Žatecký chmel (ŽPČ), Sládek, Bor, Premiant, Agnus, Harmonie, Vital, Rubín, Kazbek, Bohemie, Saaz Late a Saaz Special (Nesvadba et al., 2012). S rozšířením pěstování nových odrůd chmele vyvstala potřeba identifikace a vzájemné determinace jednotlivých odrůd chmele. Hodnocení odrůd chmele na základě morfologických znaků (tvar listu, délka pazochů, velikost a tvar hlávek, atd.) je velice nepřesné a výrazně ovlivněno ontogenetickým vývojem rostliny, pěstebními podmínkami a povětrnostními vlivy. Jako standardní je používána chemotaxonomie, která vychází ze složení sekundárních metabolitů (chmelových pryskyřic, silic a polyfenolů) obsažených v hlávkách chmele (De Coo-man et al. 1998). Hlavním omezením této identifikace odrůd chmele je nutná produkční zralost rostliny a tvorba hlávek, jež nastává druhým rokem pěstování. Obsahy jednotlivých složek sekundárních metabolitů však též podléhají meziročníkovým vlivům prostředí a posklizňovým změnám při sušení, zpracování a skladování chmelových hlávek a výrobků. V posledních letech proto bylo vyvinuto několik metod identifikace chmelových odrůd na základě analýzy DNA. Na rozdíl od chemotaxomických analýz nejsou genetické metody ovlivněny stářím rostlin ani různými vlivy prostředí. DNA lze izolovat z libovolných částí rostlin, jsou proto aplikovatelné již u mladých rostlin, a to nejen k identifikaci odrůdy, ale také např. k určení pohlaví v juvenilním stadiu růstu. Nejpoužívanější molekulárně- biologické metody využívají amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR), mimo RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Jednotlivé metodické aplikace PCR, jako jsou RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), STS (Sequence-Tagged Sites), SSR (Simple Sequence Repeat), ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) a AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), byly úspěšně použity pro identifikaci odrůd chmele (Patzak 2001). Nejspolehlivějším postupem pro molekulárně-genetickou determinaci odrůd chmele, hodnocení jejich variability a biodiversity je metoda SSR. Pro chmel již bylo specifikováno více jak sto SSR markerů (Hadonou et al. 2004, Jakše et al. 2002, Štajner et al. 2005). Podařilo se nám využít SSR markery pro determinaci českých odrůd chmele (Krofta a Patzak 2011) a kontrolu odrůdové čistoty chmele (Nesvadba et al. 2008). Nevýhodou dosud používaných kombinací SSR sad primerů je jejich nízká úroveň genetického polymorfismu v českých odrůdách chmele a nespecifická sekvenční informace, pokud se nacházejí v nekódujících oblastech genomu chmele. Metodika tak vychází z molekulárně-genetických markerů odvozených od genetických elementů a sekvencí genů kodeterminujících metabolom chmele. Tyto markery byly získány v rámci experimentální činnosti Chmelařského institutu s.r.o. v Žatci a BC AVČR v.v.i. v Českých Budějovicích, kde byly ověřeny desítky sad kombinací primerů v systému EST-SSR (Expressed Sequence Tag-Simple Sequence Repeat) detekující jednotlivé alely strukturních genů v genomu chmele (Patzak a Matoušek 2001). Na základě statistického hodnocení úrovně genetického polymorfismu ve světovém sortimentu chmele, byly vybrány nejvhodnější primerové kombinace pro české odrůdy chmele a jejich spolehlivou determinaci. Primerové kombinace byly odvozeny ze sekvencí následujících genů: 3 UTR (UnTranslated Region) oblasti WRKY transkripčního faktoru 1 (FR751557), intronu 2 a CDS (CoDing Sequence) ispf genu pro 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate syntázu (HQ734721), intronu 3 leucoanthocyanidin reduktázy (HQ734722), CDS genu pro calcium-binding EF hand family protein (ES654725) a 5 UTR oblasti Myb1 transkripčního faktoru (AJ876882). Pomocí softwaru (PrimerSelect, LASERGENE system v. 7.1, DNAStar, Madison, WI, USA) byl navržen spolehlivý set specifických primerových kombinací, který lze použít pro detekci genetického polymorfismu českých odrůd chmele a jejich determinaci pomocí PCR, kdy stanovení jednotlivých odrůd chmele je jednoznačné, rychlé a specifické CÍL METODIKY / 2. Vlastní popis METODIKY

7

8 Obrázek 1. Analýza amplifikovaných produktů EST-SSR reakcí sady primerů LAR1 pro různé české genotypy chmele v 5% polyakrylamidovém denaturačním gelu. Pro separaci získaných amplifikovaných produktů lze využít vertikální polyakrylamidovou nebo kapilární elektroforézu. Vertikální denaturační PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) probíhá v 5% polyakrylamidovém gelu (1xTBE pufr, 8M močovina, 5% akrylamid + bis-akrylamid 24:1, 0,1% TEMED, 0,02% persíran amonný) v gradientu TBE pufru při výkonu zdroje 45W (např. OSP-3000LP, Thermo Owl Scientific, Asheville, NC, USA). Amplifikované PCR produkty jsou poté vizualizovány v gelu barvením stříbrem podle protokolu SILVER SEQUENCE (Promega, Madison, WI, USA). Gel je vysušen na vzduchu a vysušený může být přefotografován pomocí negatoskopu (např. View Master 101D, Pehamed, Sulzbach, SRN) na duplikační fotografický film (Typon TR-DO 18, Promega, Madison, WI, USA). Obrázek 1 ukazuje příklad takovéto analýzy. Pro kapilární elektroforézu je nutné fluorescenčně označit jeden primer sady (např. 6-FAM, HEX, TET). Vzorky jsou pak separovány kapilární elektroforézou sekvenátorem (např. ABI PRISM 310, Applied Biosystems, Lincoln, CA, USA) a amplifikované PCR produkty jsou vizualizovány softwarem GeneScan a Genotyper (Applied Biosystems, Lincoln, CA, USA) (Ovesná a Hodek 2007). Obrázek 2 ukazuje příklad takovéto analýzy. PCR produkty jsou na vertikální elektroforéze vizuálně analyzovány na přítomnost jednotlivých fragmentů alel genů v jednotlivých vzorcích na základě molekulární velikosti odečtené pomocí molekulárních standardů 20 bp DNA Markeru (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), pgem DNA markeru a 100 bp ladderu (Promega, Madison, WI, USA) a v kapilární elektroforéze automatickou softwarovou detekcí na základě molekulárního standardu ROX 500 (Applied Biosystems, Lincoln, CA, USA). Sada primerů WRKY1 amplifikuje celkem 11 fragmentů alel genů (Příloha 1a), sada primerů CMPS amplifikuje celkem 5 fragmentů alel genů (Příloha 1b), sada primerů LAR amplifikuje celkem 6 fragmentů alel genů (Příloha 1c), sada primerů CaEFh amplifikuje celkem 5 fragmentů alel genů (Příloha 1d) a sada primerů Myb1 amplifikuje celkem 8 fragmentů alel genů (Příloha 1e) ve světovém sortimentu chmele. V Příloze 2 je pak shrnut genetický polymorfismus fragmentů alel genů v českých odrůdách chmele, umožňující jejich přesnou a spolehlivou determinaci. Obrázek 2. Analýza amplifikovaných produktů EST-SSR reakcí sady primerů WRKY1 pro různé české genotypy chmele kapilární elektroforézou Vlastní popis METODIKY

9

10 růdy obsahují zpravidla 3 až 7 % hm. alfa kyselin. Vysokoobsažné chmele obsahují 15 až 17 % alfa kyselin. Obsah beta hořkých kyselin v komerčních odrůdách chmele se většinou pohybuje v intervalu 3 až 7 % hm. Na rozdíl od pryskyřic jsou chmelové silice směsí několika set, více či méně těkavých organických látek, převážně terpenického charakteru, odpovědné za aroma chmele a piva. Chmel obsahuje 0,5 až 3 % hm. silic. Složky chmelových silic je možno rozdělit do tří skupin látek na frakci uhlovodíkovou, která převažuje v čerstvě sklizeném chmelu, na frakci kyslíkatou tvořící se během zrání, zpracování a skladování chmele a frakci sirných sloučenin. Třetí, a z farmakologického hlediska patrně nejdůležitější, skupinu sekundárních metabolitů chmele tvoří polyfenoly. Patří sem jednoduché fenolové kyseliny (gallová, hydroxyskořicová, kávová, kumarová aj.) a jejich deriváty, dále polycyklické struktury nazývané flavonoidy (chalkony, flavanoidy, flavonoly a anthokyanidiny). Chmel obsahuje poměrné velké množství polyfenolů, 2 až 6 % hm. Nejvyšší obsah polyfenolů mají jemné aromatické odrůdy. Pro pivovarnický průmysl jsou nejdůležitější chmelové pryskyřice, i když se uplatňují i ve farmacii svými protizánětlivými, antibakteriálními a protiosteoporótickými vlastnostmi (Tobe et al. 1997, Yamamoto et al. 2000). Hlavní skupinou pro farmacii jsou prenylované flavonoidy s antioxidačními, fytoestrogenními, protivirovými a antikarcinogenními účinky (Miranda et. al. 2000a,b). Pro studium molekulárních DNA markerů kvantitativních znaků (QTLs quantitative trait loci) jsou v současnosti používány metody založené na analýze specifické hybridní populace a jejich přenositelnost a vypovídací hodnota tak není velká. U chmelu byla tato analýza provedena pro obsah alfa hořkých kyselin (Čerenak et al. 2006), polyfenolů (Patzak et al. 2012) a sekundárních metabolitů (Koie a Inaba 2005). Čerenak et al. (2006) identifikovali celkem 3 QTLs pro obsah alfa hořkých kyselin, jejichž podíl na fenotypové variabilitě byl celkem 50%. Koie a Inaba (2005) též detekovali 3 QTLs pro obsah alfa hořkých kyselin, z toho jeden byl specifický pouze pro kohumulon. Tato vazebná skupina však byla též specifická pro kolupulon a xanthohumol. Následnou analýzou byla získána sekvence šlechtitelského markeru (Okada a Koie 2011), jež ve formátu RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) nebo CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) určitým podílem koreluje s obsahem kohumulonu, farnesenu a linalolu, a lze jej tak využít pro skrínink chmelových odrůd s nízkým podílem kohumulonu a vysokým obsahem farnesenu a linalolu v systému selekce podle molekulárních markerů (MAS - Marker Assisted Selection). Tato sekvence, stejně jako předchozí markery, vychází z nespecifické sekvence. Využití kvalitativně nových DNA markerů získaných ze sekvencí genů jsme ověřili v našich QTL analýzách markerů polyfenolů (Patzak et al. 2012), kde jsme identifikovali 14 potencionálních QTL markerů xanthohumolu a 8 potencionálních QTL markerů desmethylxanthohumolu (DMX) s podílem na fenotypové variabilitě až 28%. Též jsme identifikovali 8 QTL markerů pro obsah alfa hořkých kyselin, jejichž podíl na fenotypové variabilitě byl až 34%. V rámci metodiky tak vycházíme z molekulárně-genetických markerů odvozených od genetických elementů a sekvencí genů kodeterminujících metabolom chmele, které byly získány v rámci naší experimentální činnosti. Pro experimentální část metodiky bylo ze světového sortimentu chmele vybráno celkem 85 odrůd a 7 genotypů šlechtitelského materiálu, u kterých byly charakterizovány morfologické, fenologické a chemotaxonomické znaky. V Příloze 4 je uveden jejich seznam i s charakteristikou hospodářských znaků, které byly také zapsány a jsou dostupné v databázi EVIGEZ ( Dále bylo použito a charakterizováno 116 jedinců potomstva F1 generace segregujícího křížení Taurus x Sm06 H14 11/167 (Příloha 6). Analýza obsahu chmelových pryskyřic a polyfenolů v suchých hlávkách byla provedena EBC 7.7. metodou kapalinovou chromatografií (HPLC) na koloně Nucleosil RP C18 (Macherey-Nagel, Germany, 5 µm, 250 x 4 mm) na kapalinovém chromatografu SHIMADZU LC 20A (Shimadzu, Kyoto, Japan) s diode array detektorem (Krofta 2003). Chmelové silice byly z matrice izolovány destilační metodou a analyzovány plynovou chromatografií na kapilární koloně DB 5 (Chromservis, Praha, ČR, 30 m x 0.25 mm x 0.25 mm film thickness) na plynovém chromotografu Varian 3400 (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA) s Finnigan ITD 800 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) hmotnostním detektorem (Krofta 2003). Výsledky chemických analýz (Příloha 4 a 6) byly využity pro korelační analýzy potenciálních molekulárně-genetických markerů s hospodářskými znaky chmele s následnou možností mapování jednotlivých molekulárně-genetických markerů a softwarovou kvantitativní analýzu jejich vazby. Ze všech vybraných genotypů chmele byla vyizolována DNA pomocí CTAB metody uvedené výše. Vysokomolekulární DNA byla využita pro molekulárně-genetické analýzy SSR (Simple Sequence Repeat) markerů (Hadonou et al. 2004, Jakše et al. 2002, Štajner et al. 2005), STS (Sequence-Tagged Sites) a EST-SSR (Expressed Sequence Tag-Simple Sequence Repeat) markerů (Patzak et al. 2007, Patzak a Matoušek 2011). Typická PCR reakce probíhala při standardním protokolu a amplifikačních podmínek uvedených výše. Amplifikované produkty byly rozlišeny vertikální polyakrylamidovou elektroforézou a vizualizovány barvením stříbrem, jak je uvedeno výše. U produktů byla zaznamenána jejich prezence nebo absence v jednotlivých vzorcích na základě molekulárních velikostí podle velikostních markerů uvedených výše a byly zapsány v binárním kódu (0, 1) do matice vzorek-marker. Softwarový program STATISTICA 8.0 CZ (StatSoft, Tulsa, OK, USA) byl použit pro statistické a korelační analýzy. Pro mapování jednotlivých molekulárně-genetických markerů a softwarovou kvantitativní analýzu jejich vazby byly použity programy Multipoint v2.1 a MultiQTL v2.6 (MultiQTL, Haifa, Israel). Před korelační analýzou molekulárně-genetických markerů s hospodářskými znaky chmele byla nejprve provedena korelační analýza závislosti jednotlivých znaků v rámci souboru genotypů. Tato analýza prokázala, že některé znaky jsou ve velice těsné závislosti. Nejtěsnější je závislost mezi obsahem kohumulonu a kolupulonu, která měla korelační koeficient r=0,8765 ve světovém sortimentu a r=0,73 v F1 populaci křížení, oba obsahy jsou nejstabilnějšími odrůdovými chemotaxonomickými znaky. Obsah alfa hořkých kyselin je více variabilní, na něm je nejvíce závislý poměr alfa/beta kyselin s korelací r=0,7321 ve světovém sortimentu. V F1 populaci byla závislost ještě těsnější, když korelace mezi alfa a beta hořkými kyselinami byla 8 2. Vlastní popis METODIKY

11 r=0,97. Obsah xanthohumolu byl též závislý na obsahu alfa hořkých kyselin ve vybraných genotypech světového sortimentu (r=0,6285), ale v F1 populaci křížení byl nezávislý. Vzájemné významné korelace byly nalezeny též mezi obsahy jednotlivých silic, když mezi obsahem myrcenu byla negativní korelace s obsahem humulenu (r=-0,6627) a karyofylenu (r=-0,5384), jejichž obsahy byly vzájemně závislé (r=0,6836) ve světovém sortimentu. Obsahy ostatních sekundárních metabolitů byly vzájemně nezávislé nebo byla závislost méně než 50%. Statistickou analýzou molekulárně-genetických EST-SSR markerů bylo prokázáno, že existují statisticky prokazatelné párové korelace (r<-0,3, r>0,3) mezi některými alelami studovaných lokusů a obsahy sekundárních metabolitů v hlávce chmele. Jednalo se o alely 12 strukturních genů a transkripčních faktorů a jedné sekvence retrotransposonu (Tabulka 1). Jelikož obsahy sekundárních metabolitů v hlávce jsou mnohdy enzymaticky propojené, generovaly jednotlivé alely genů více molekulárně -genetických markerů obsahových látek chmelové hlávky. Celkem bylo nalezeno 17 markerů obsahu alfa hořkých kyselin, 2 markery obsahu beta hořkých kyselin, 12 markerů obsahu xanthohumolu, 4 markery obsahu DMX, 10 markerů obsahu kohumulonu a kolupulonu, 5 markerů obsahu myrcenu, 8 markerů obsahu humulenu, 1 marker obsahu farnesenu a 3 markery obsahu karyofylenu (Příloha 7). Markery obsahu alfa hořkých kyselin, xanthohumolu, kohumulonu a kolupulonu se výrazně překrývaly, což bylo způsobeno závislostí jednotlivých znaků, kterou prokázala i korelační analýza. Molekulárně-genetické markery nemohly absolutně korelovat s obsahy jednotlivých metabolitů pro jejich kvantitativní povahu a genetické založení, proto je informace jimi získaná pouze podílová. Pro ověření jsme provedli též QTL analýzu několika potencionálních markerů v F1 populaci křížení. Tato analýza potvrdila naše získané výsledky, když molekulárně-genetické markery GPPS-SSU (malá podjednotka geranylgeranyldifosfát syntázy, FJ455406), CMPS, LAR1 a CGG2 (hypotetický protein, ES652842) prokazatelně korelovaly a štěpily v populaci v závislosti na obsahu xanthohumolu a alfa hořkých kyselin. Tyto geny, jako i ostatní nalezené markery, jsou tak prokazatelně napojeny na produkci a biosyntetické dráhy sekundárních metabolitů. III. SROVNÁNÍ NOVOSTI POSTUPŮ Tato metodika je první komplexní metodika využití molekulárně-genetických markerů pro charakterizaci genových zdrojů chmele, spolehlivou identifikaci jednotlivých genotypů chmele a systém selekce hospodářských znaků podle molekulárních markerů (MAS) ve šlechtitelském procesu chmele. Metodika plně nahrazuje původní metodiky kontroly odrůdové čistoty porostů chmele a odrůdy Vital (Nesvadba et al. 2008, 2010), využívající SSR markery pro determinaci českých odrůd chmele, jejichž nevýhodou je nízká úroveň genetického polymorfismu v českých odrůdách chmele a nespecifická sekvenční informace, když se nacházejí v nekódujících oblastech genomu chmele. Nová metodika vychází z EST-SSR molekulárně-genetických markerů odvozených od genetických elementů a sekvencí genů kodeterminujících metabolom chmele a jedná se tak o efektivní markerovací systém, kvalitativně vyšší úrovně, pro determinaci a kontrolu čistoty a uniformity odrůd chmele a selekci genotypů chmele s požadovanými hospodářskými znaky ve šlechtitelském procesu. Metodika nabízí mnohem více specifických EST-SSR molekulárně-genetických markerů než evropský patent EP (Okada a Koie 2011) způsobu selekce chmelové linie pomocí šlechtitelského markeru ve formátu RFLP nebo CAPS, který lze využít pro skrínink chmelových odrůd s nízkým podílem kohumulonu a vysokým obsahem farnesenu a linalolu v systému selekce podle molekulárních markerů (MAS). IV. POPIS UPLATNĚNÍ CERTIFIKOVANÉ METODIKY Využití molekulárně-genetických metod ve šlechtitelském procesu a k hodnocení genových zdrojů je v současnosti nejúčinnější metodou charakterizace jednotlivých genotypů. Hlavním přínosem využití molekulárně-genetických markerů je přesná charakterizace genotypů chmele, jež v budoucnu povede ke zkrácení tvorby a zvýšení efektivnosti šlechtitelského procesu nových odrůd chmele. Uplatnění naleznou molekulárně-genetické markery i v kontrolních mechanismech čistoty a uniformity odrůd, při hodnocení genetické variability, biodiversity a genealogických vztahů mezi jednotlivými genotypy chmele. Molekulárně-genetické markery kodeterminující metabolom chmele jsou též využitelné jako efektivní markerovací systém, kvalitativně vyšší úrovně pro hospodářské znaky chmele ve šlechtitelském procesu. Molekulárně-genetické markery tak vyhovovují novým potřebám klasického šlechtění v rámci selekce podle molekulárních markerů (MAS) a pro budoucí tvorbu a kontrolu GMO (geneticky modifikované organismy). Metodika je určena šlechtitelům, MZe ČR, ÚKZÚZ, pěstitelům a další odborné a chmelařské veřejnosti. V. EKONOMICKÉ ASPEKTY Hlavním přínosem využití molekulárně-genetických markerů je přesná charakterizace genotypů chmele pro kontrolu odrůdové čistoty a uniformity. Molekulárně-genetické markery vyhovují novým potřebám klasického šlechtění, kde umožní efektivně využít prostředky na šlechtění chmele, urychlí a zefektivní tvorbu nových odrůd s upravenými vlastnostmi metabolomu reagujícími na potřeby trhu a agrárního sektoru. Exaktní vyjádření ekonomického přínosu metodiky pro české chmelařství se dotýká několika oblastí. První oblastí je pro- 2. Vlastní popis METODIKY / 3. SROVNÁNÍ NOVOSTI POSTUPŮ / 4. POPIS UPLATNĚNÍ... / 5. EKONOMICKÉ ASPEKTY 9

12 dukce sadbového materiálu, kdy spolehlivou a přesnou kontrolou odrůdové čistoty sadbového materiálu, kterou nelze provést jinou metodou (chemotaxonomie, morfologie) než analýzou DNA, lze zabránit záměně a příměsím odrůd chmele. Při 10% příměsi odrůdy hybridního původu v žateckém poloraném červeňáku (ŽPČ) by vyčíslená škoda na kvalitě činila 7 tis. Kč na tunu vyprodukovaného chmele při průměrné výkupní ceně ŽPČ 150 tis. Kč/t a odrůdy hybridního původu 80 tis. Kč/t (při průměrném výnosu 1 t suchého chmele/ha vyčíslená škoda odpovídá ztrátě na hektar). Při absolutní záměně tak vyčíslená škoda na kvalitě činí 70 tis. Kč na tunu vyprodukovaného chmele. Tytéž hodnoty platí i pro kontrolu autenticity produkce chmele při jeho prodeji nákupními organizacemi a pivovary. Další oblastí je samotné šlechtění chmele, kde využití molekulárně-genetických markerů umožní snížit náklady selekcí hybridního potomstva a neperspektivní genotypy semenáčů tak nemusí být pěstovány ve šlechtitelských školkách (2 roky hodnocení) při nákladech 45 Kč na rostlinu a rok. Další úspory jsou ve zkrácení tvorby nových odrůd v procesu šlechtění chmele a tvorba odrůd chmele s požadovanými vlastnostmi metabolomu, které jsou nezbytným předpokladem pro udržení konkurenceschopnosti agrárního sektoru v podmínkách EU a povedou k ekonomickým ziskům u pěstitelů chmele. VI. SEZNAM POUŽITÉ SOUVISEJÍCÍ LITERATURY DE COOMAN, L., EVERAERT, E., DE KEUKELEIRE, D. : Quantitative analysis of hop acids, essential oils and flavonoids as a clue to the identification of hop varieties. Phytochemistry Analysis 9: , ČERENAK A., SATOVIC Z., JAVORNIK B.: Genetic mapping of hop (Humulus lupulus L.) applied to the detection of QTLs for alpha- -acid content. Genome 49: , HADONOU, A. M., WALDEN, R., DARBY, P.: Isolation and characterization of polymorphic microsatellites for assessment of genetic variation of hops (Humulus lupulus L.). Molecular Ecology Notes 4: , JAKŠE, J., BANDELJ, D., JAVORNIK, B.: Eleven new microsatellites for hop (Humulus lupulus L.). Molecular Ecology Notes 2: , KOIE K., INABA A., OKADA Y., KANEKO T., ITO K.: Construction of the genetic linkage map and QTL analysis on hop (Humulus lupulus L.). Acta Horticulturae 668: 59-66, KROFTA K.: Comparison of quality parameters of Czech and foreign hop varieties. Plant Soil and Environment 49: , KROFTA K., PATZAK J.: Investigation of Czech hop varieties authenticity by means of chemical and genetic analyses. Kvasný průmysl 57: , MIRANDA C., APONSO G.L., STEVENS J.F., DEINZER, M.L.: Prenylated chalkones and flavanones as inducers of quinone reductase in mouse Hepa 1c1c7 cells. Cancer Letters 149: 21-29, 2000a. MIRANDA C., YANG Y., HENDERSON M., STEVENS J., DEINZER, M.: Prenylflavonoids from hops inhibit the metabolic activation of the carcinogenic heterocyclic amines mediated by cdna-expressed human CYP1A2. Drug Metabolism Dispositions 28: , 2000b. NESVADBA V., BRYNDA M., PATZAK J., KROFTA K.: Metodika pro udržení odrůdové čistoty chmelových porostů. Metodika pro praxi 5/08 Žatec, ISBN NESVADBA, V., POLONČÍKOVÁ, Z., HENYCHOVÁ, A., KROFTA, K., PATZAK, J.: Charakterizace a identifikace odrůdy Vital. Metodika pro praxi 6/10. Žatec: Chmelařský institut, ISBN NESVADBA V., POLONČÍKOVÁ Z., HENYCHOVÁ A., KROFTA K., PATZAK J.: Atlas českých odrůd chmele. Žatec: Chmelařský institut, ISBN OKADA Y., KOIE K.: Způsob selekce chmelové linie a šlechtitelský marker a soubor primerů použité pro selekci chmelové linie. EP , OVESNÁ, J., HODEK, J.: Využití AFLP pro DNA genotypizaci rostlin. Metodika pro praxi, Praha - Ruzyně, Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., ISBN PAPRŠTEIN, F., PATZAK, J.: Metodika hodnocení jabloně (Malus x domestica) molekulárně-genetickými metodami. Certifikovaná metodika, Holovousy, VŠÚO Holovousy s.r.o., ISBN PATZAK, J.: Comparison of RAPD, STS, ISSR and AFLP molecular methods used for assessment of genetic diversity in hop (Humulus lupulus L.). Euphytica 121: PATZAK J., MATOUŠEK, J.: Development and evaluation of expressed sequence tag-derived microsatellite (EST-SSR) markers for genotyping of hop (Humulus lupulus L.). Biologia Plantarum 55: , PATZAK, J., VRBA, L., MATOUŠEK, J.: New STS molecular markers for assessment of genetic diversity and DNA fingerprinting in hop (Humulus lupulus L.). Genome 50: 15-25, ŠTAJNER, N., JAKŠE, J., KOZJAK, P., JAVORNIK, B. The isolation and characterisation of microsatellites in hop (Humulus lupulus L.). Plant Science 168: TOBE H., MURAKI Y., KITAMURA K., KOMIYAMA O., SATO, Y.: Bone resorption inhibitors from hop extract. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 61: YAMAMOTO, K., WANG J., TOBE, H.: Suppression of cyclooxygenase 2 gene transcription by humulone of beer hop extract. FEBS Letters 465: EKONOMICKÉ ASPEKTY / 6. SEZNAM POUŽITÉ SOUVISEJÍCÍ LITERATURY

13 VII. SEZNAM PUBLIKACÍ, KTERÉ PŘEDCHÁZELY METODICE KROFTA K., PATZAK J.: Investigation of Czech hop varieties authenticity by means of chemical and genetic analyses. Kvasný průmysl 57: , KROFTA K., PATZAK J.: Determining the authenticity of Czech hop varieties via chemical and molecular genetics analyses/ Zjišťování autenticity českých odrůd chmele pomocí chemických a molekulárně-genetických analýz. s CZECH HOPS 2012 / ČESKÝ CHMEL Praha: Ministerstvo zemědělství, ISBN MATOUŠEK, J.: Transgenní metabolom chmelu, některé aspekty jeho přípravy a perspektivy využití. Kvasný Průmysl 58: 13-19, MATOUŠEK, J., KOCÁBEK, T., PATZAK, J., FÜSSY, Z., PROCHÁZKOVÁ, J., HEYERICK, A.: Combinatorial analysis of lupulin gland transcription factors from R2R3Myb, bhlh and WDR families indicates a complex regulation of chs_h1 genes essential for prenylflavonoid biosynthesis in hop (Humulus lupulus L.). BMC Plant Biology 12: 27, MATOUŠEK, J., KOCÁBEK, T., PATZAK, J., STEHLÍK, J., FÜSSY, Z., KROFTA, K., HEYERICK, A., ROLDÁN-RUIZ, I., MALOUKH, L., DE KEU- KELEIRE, D.: Cloning and molecular analysis of HlbZip1 and HlbZip2 transcription factors putatively involved in the regulation of the lupulin metabolome in hop (Humulus lupulus L.). Journal of Agriculture and Food Chemistry 58: , MATOUŠEK, J., PATZAK, J., KOCÁBEK, T., FÜSSY, Z., STEHLÍK, J., ORCTOVÁ, L., DURAISAMY, G.S.: Functional analyses of lupulin gland-specific regulatory factors from WD40, bhlh and Myb families of hop (Humulus lupulus L.) show formation of crucial complexes activating chs_h1. Brewing Science 64: , MATOUŠEK, J., ŠKOPEK, J., KOCÁBEK, T., PATZAK, J., ORCTOVÁ, L., FUSSY, Z., KROFTA, K., HEYERICK, A, MALOUKH, L., ROLDÁN- -RUIZ, I.,DE KEUKELEIRE, D.: Cloning and molecular analyses of hop transcription regulation factors. Acta Horticulturae 848: 41-48, NESVADBA V., BRYNDA M., PATZAK J., KROFTA K.: Metodika pro udržení odrůdové čistoty chmelových porostů. Metodika pro praxi 5/08 Žatec, ISBN NESVADBA, V., POLONČÍKOVÁ, Z., HENYCHOVÁ, A., KROFTA, K., PATZAK, J.: Charakterizace a identifikace odrůdy Vital. Metodika pro praxi 6/10. Žatec: Chmelařský institut, ISBN NESVADBA V., POLONČÍKOVÁ Z., HENYCHOVÁ A., KROFTA K., PATZAK J.: Atlas českých odrůd chmele. Žatec: Chmelařský institut, ISBN PATZAK J., MATOUŠEK, J.: Development and evaluation of expressed sequence tag-derived microsatellite (EST-SSR) markers for genotyping of hop (Humulus lupulus L.). Biologia Plantarum 55: , PATZAK, J., HENYCHOVÁ A., NESVADBA V., KROFTA K.: Study of molecular markers for xanthohumol and DMX contents in hop (Humulus lupulus L.) by QTLs mapping analysis. Brewing Science 65: , PATZAK, J., MATOUŠEK, J.: Gene specific molecular markers for hop (Humulus lupulus L.). Acta Horticulturae 848: 73-80, PATZAK, J., VRBA, L., MATOUŠEK, J.: New STS molecular markers for assessment of genetic diversity and DNA fingerprinting in hop (Humulus lupulus L.). Genome 50: 15-25, SEZNAM PUBLIKACÍ, KTERÉ PŘEDCHÁZELY METODICE 11

14 PŘÍLOHY Příloha 1. Sekvenční homologie a polymorfismus jednotlivých amplifikovaných fragmentů alel genů a) WRKY1, b) CMPS, c) LAR1, d) CaEFh a e) Myb1 v českých odrůdách chmele. a) b) c) d) 12 PŘÍLOHA Č. 1

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36 Metodika využití molekulárně-genetických markerů sekvencí genů a genetických elementů ve šlechtění a managementu chmele (Humulus lupulus) Autoři: Josef Patzak, Jaroslav Matoušek Vydal: Chmelařský institut s.r.o., Žatec Grafická úprava, sazba a t k: Petr Kopecký Počet kopii: 50 ISBN:

37

38