Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk Diplomová práce Brno 2007 Lenka Činčárová

2 Ráda bych tímto poděkovala svojí školitelce Mgr. Marii Brázdové, Ph.D. za cenné rady, odborné vedení, pomoc a připomínky při tvorbě této diplomové práce. Dále bych ráda poděkovala Veronice Kudláčkové a celému kolektivu LBCHMO za vytvoření příjemné pracovní atmosféry a inspirativního prostředí. Dekuji také své rodině za podporu během studia. Tato práce byla vypracována na Biofyzikálním ústavu Akademie Věd ČR v Brně v Laboratoři biofyzikální chemie a molekulární onkologie.

3 SEZNAM ZKRATEK aa aminokyselinové zbytky Amp ampicilin Amp r rezistence k ampicilinu bp páry bazí BSA hovězí sérový albumin DBSS strukturně selektivní vazba na DNA (DNA structure-selective binding) DEPC diethylpyrokarbonát, inhibitor RNAázy dsdna dvouřetězcová DNA (double stranded DNA) DTT 1,4-dithio-1-treitol EDTA ethylendiamintetraoctová kyselina flp53 lidský protein o celé délce (full lenght) FPLC rychlá proteinová kapalinová chromatografie HEPES N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N -2-ethansulfonová kyselina IPTG izopropyl-β-thiogalaktosid lin DNA lineární forma DNA MOPS 4-morfolinpropansulfonová kyselina mutp53 mutantní forma proteinu p53 mutp53bs mutp53binding sites NK nukleová kyselina ocdna, oc otevřená kružnicová DNA p53c C-koncová DNA vazebná doména (aa ) p53cd centrální doména p53 (aa ) p53con konvenční sekvence specifické vazby p53 (consensus sequence) 5 PuPuPuC(A/T)(T/A)GpyPyPy3 p53for primer pro sekvenci p53, forward p53rev primer pro sekvenci p53, revers v opačném směru Pu purinová báze Py pyrimidinová báze RE responsivní element, místo vazby mutp53 scdna, sc superhelikální, nadšroubovicová DNA SCS selektivní vazba na scdna (supercoiled selective binding) SDS dodecyl síran sodný

4 SDS-PAGE sirna ssdna ssrna TEMED Tris wtp53 polyakrilamidová elektroforéza s SDS malé interferující molekuly RNA (small interfering RNA) jednořetězcová DNA jednořetězcová RNA N,N,N,N -tetramethylethylendiamin tris(hydroxymethyl)-aminomethan standardní forma proteinu p53

5 OBSAH 1. ÚVOD Nádorový supresorový protein p Struktura genu TP Mutace proteinu p Struktura proteinu p Polymorfismus kodonu 72 v genu TP Konformace proteinu wtp53 a mutp Funkce a regulace standardního typu proteuinu p53 (wtp53) Biologické konsekvence mutace proteinu p Heterogenita způsobů inaktivace wtp53 v lidských nádorech Mutantní p53 jako onkogen Dominantně negativní efekt Mechanismy získaných vlastností mutp53 ( gain-of-function ) Zvýšení poločasu rozpadu mutp53, narušená dráha degradace proteinem MDM Protein-protein interakce Transaktivace genů mutantními proteiny p Vazba p53 na DNA Sekvenčně specifická vazba na p53con (konsensní sekvence p53) Vazba mutp53 na DNA Sekvenčně specifická vazba mutp Strukturně selektivní vazba mutp Vazba mutp53 k MAR/SAR elementům in vivo Vazba mutp53 k repetetivním sekvencím in vivo Gliomy Astrocytomy Molekulární změny astrocytomů Role p53 v nádorech mozku p53 terapie mozkových nádorů CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE MATERIÁL A METODY Materiál Bakteriální kmeny (Escherichia coli) Buněčné linie Plasmidová DNA Mapy plasmidů určených pro studium vazby p Mapy plasmidů určených pro studium exprese p Mapa plasmidu psuper (Brummelkamp, 2002) Příprava plasmidové DNA pro studium vazby p Metody Techniky pro práci s DNA Transformace buněk E.coli Izolace plasmidové DNA kolonou GIAGEN-tip

6 Izolace plasmidové DNA kitem NucleoSpin Plasmid (Macherey- Nagel) Stanovení koncentrace nukleových kyselin Příprava lineárních fragmentů pro vazbu p Metodika klonování Štěpení plasmidové DNA restrikční endonukleázou Van91I Izolace DNA z agarózového gelu kitem NucleoSpin Extract (Macherey-Nagel) Defosforylace vektorové DNA alkalickou fosfatázou Purifikace DNA pomocí fenol/chloroform/isoamylakoholové extrakce Ligace T4 DNA ligasou (Invitrogen) izolovaných fragmentů mutp53 a bakteriálního expresního vektoru pt PCR Techniky práce s proteiny Izolace rekombinantních proteinů mutp Separace proteinů na SDS polyakrylamidových gelech Barvení SDS PAGE gelu Coomasie blue (Eckershorn aj., 1988) Stanovení koncentrace proteinů podle obarveného SDS-PAGE Coomasie Blue Stanovení koncentrace proteinů podle Bradfordové Přenos proteinů z polyakrylamidových gelů, elektorblot Vazba proteinů na lineární DNA Inkubace p53 s DNA Agarózová elektroforéza Detekce DNA Přenos z agarózového gelu, vakuový blot Imunodetekce proteinů na membránách Práce s buněčnými kulturami Kultivace gliomových linií Izolace DNA z gliomových buněk Příprava proteinových lyzátů z gliomových buněk Izolace celkové RNA z gliomových buněk Syntéza cdna metodou TermoScriptTM RT-PCR Štěpení BstUI Transientní transfekce buněk gliomu Přečištění RNA pomocí DNA-freeTM kitu (Ambion) Detekce exprese genů pomocí PCR Přístroje VÝSLEDKY Charakterizace gliomových linií s mutp Detekce mutace v p Detekce exprese mutp53 v buňkách gliomových linií Polymorfismus kodonu 72 v genu TP53 gliomových linií U251, Onda10 a Onda Morfologie buněk linií Onda10, Onda Příprava mutp53 proteinu v E.coli Příprava expresního vektoru pro produkci mutp53 v E.coli BL21 (DE3) Vazba p53 na lineární DNA...44

7 4.3.1 Vazba proteinů p53 na lineární DNA fragmenty pbluescript, ppgm1, ppgm Vazba wtp53 proteinu Vazba mutp53 proteinů Vazba mutp53 na lineární fragmenty genomové DNA Charakterizace genomové DNA určené pro vazbu mutp Vazba mutantních proteinů R273C a R273H na genomovou DNA Regulace exprese kandidátních genů proteinem mutp53 v gliomových liniích Příprava cdna Test exprese metodou PCR DISKUSE Charakterizace gliomových linií s mutantní p Charakterizace vazebných schopností mutantních proteinů p Regulace genové exprese ZÁVĚR SUMMARY LITERATURA...65