Využití rep-pcr v bakteriální taxonomii

Transkript

1 Využití rep-pcr v bakteriální taxonomii Pavel Švec Česká sbírka mikroorganismů Přírodovědecká fakulta MU

2 rep-pcr založeny na shlukové analýze PCR produktů získaných s primery komplementárními k rozptýleným repetitivním sekvencím

3 Rozptýlené repetitivní sekvence (Interspersed Repetitive Sequences) < 500 bp, nekódující, rozšířeny v genomech prokaryot v různé orientaci a poloze dříve: -vbakteriálním genomu jen kódující a regulační sekvence -repetice jen minimálně (např geny pro trna, rrna) dnes: -v bakteriálním genomu velký podíl repetic - regulace, struktura

4 Rozptýlené repetitivní sekvence (Interspersed Repetitive Sequences) polynukleotidové repetice: poly-trinukleotidy (GTG) n, (TGG) n pentanukleotidy GCTGG krátké: < 50 bp dlouhé: bp Mosaikové repetitivní elementy: shluky více repetitivních sekvencí v kombinaci

5 ? funkce v genomu? -vazebná místa pro proteiny (DNA polymeráza, DNA gyráza) -regulace translace -palindromy -> sekundární struktura stabilizující mrna -vazebná místa pro transpozony -místa pro intrachromozomální rekombinaci

6 podle Versalovic &Lupski, Bacterial Genomes, Physical Structure and Analysis, Kluiwer, 1999

7 ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus), bp, popsán u E coli, S typhimurium primery ERIC1R ERIC2 5'-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3' 5'-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3' REP (repetitive extragenic palindromic sequence), bp, popsán u E coli, S typhimurium primery REP1R-I REP2-I 5'-III ICG ICG ICA TCI GGC-3' 5'-ICG ICT TAT CIG GCC TAC-3' BOX,154 bp, popsán u Streptococcus pneumoniae primer BOXA1R 5'-CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G-3' (GTG) 5,15 bp, popsán u Salmonella spp, Shigella spp primer (GTG) 5 5'-GTG GTG GTG GTG GTG-3'

8 PCR produkty o velikostech 200 až 5000 bp (4-5 kb limit Taq polymerázy) PCR reakce gelová ELFO genomová DNA shluková analýza HC21 HC22 HC6 HC10 IR13 IR21 IR23 IR26 IR12 IR20 IR25

9 REP-PCR P1735 CCM 4617 P1734 P1745 P1742 P1736 P1750 P1747 P1792 P1738 P1740 P1737 P1739 P1741 P1868 P1869 CCM 4046T CCM 7374T P1751 P1752 P1870 P1867 P1743 P1744 ERIC-PCR P1744 P1868 P1743 P1741 P1747 P1738 P1740 P1735 P1750 P1745 P1751 CCM 7373T P1752 P1742 P1734 P1867 P1869 P1737 P1739 P1870 P1792 P1748 CCM 7374T P1736 CCM 4617 CCM 4046T BOX-PCR P1737 P1739 P1870 P1741 P1742 P1738 P1740 P1734 P1867 P1868 CCM 4046T CCM 4617 P1748 P1752 P1747 CCM 7373T P1745 P1869 P1735 P1750 P1743 P1744 CCM 7374T P1736 P1751 (GTG)-PCR 5 CCM 4617 P1750 CCM 7374T CCM 7373T P1792 P1867 P1868 P1734 P1751 P1869 P1752 P1738 P1740 P1745 P1736 P1743 P1744 P1735 P1741 P1737 P1739 P1747 P1870 CCM 4046T

10 ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus) 30x Escherichia coli 150x Salmonella enterica 700x Photorhabdus luminescens typizace rodů Vibrio, Shigella, Yersinia, Erwinia, Sinorhizobium 30x v genomu E coli K12-20x celá délka ( bp) -10x kratší části (19-99 bp) F F běžně používaná ERIC-PCR - vazba primeru jen na celé sekvence průměrná vzdálenost 230 kb nedostatečný počet analýza sekvence fragmentů získaných ERIC-PCR α-proteobakterií Sinorhizobium spp sekvence odpovídá ERIC jen v místě vazby primerů G vazba primerů ne jen na ERIC sekvence, ale i na podobné sekvence ~ AP-PCR (náhodně amplifikovaná DNA)

11 J Výhody rep-pcr: -rozlišovací schopnost - druhově až kmenově specifická -dobrá reprodukovatelnost - nutná optimalizace a standardizace -jednoduché provedení - časová nenáročnost a rychlost -nízká cena L Nevýhody rep-pcr: -problematická mezilaboratorní reprodukovatelnost - přenositelnost výsledků -vliv metody izolace DNA, použitý termocykler

12 DiversiLab System (Bacterial BarCodes, Inc, Houston)

13 (bp) Identifikace Lactococcus lactis subsp lactis z povrchové vody -skupina 9 kmenů izolovaná na Slanetz-Bartley a Kanamycin esculin azide agaru; růst typický pro enterokoky -morfologie i základní růstové testy Enterococcus spp -(GTG) 5 -PCR identifikace jako L lactis subsp lactis; jednoznačně potvrzeno soupravou API 50CH 20 Similarity (%) CCM 4542 T CCM 4543 T CCM 4494 T CCM 4541 T CCM 7414 T CCM 1877 T CCM 1881 CCM 4754 P1328 P1942 P1409 P2011 P2013 P1946 P2016 P2019 P1944 CCM 7413 T L plantarum L raffinolactis L piscium L lactis ssp hordniae L lactis ssp cremoris L lactis ssp lactis L lactis ssp lactis L lactis ssp lactis water strains L garvieae Molecular Weight Marker

14 DĚKUJI VÁM ZA POZORNOST