Studium vlivu zvýšené koncentrace CO 2 : metodické příspěvky ke studiu fotosyntézy

Transkript

1 P Ř Í R O D O V Ě D E C K Á F A K U L T A Jiří Kalina Studium vlivu zvýšené koncentrace CO 2 : metodické příspěvky ke studiu fotosyntézy Habilitační práce O S T R A V S K Á U N I V E R Z I T A V O S T R A V Ě 2005

2 4

3 Poděkování V následujících větách bych rád vyjádřil díky těm, kteří přispěli k rozvoji mých názorů a vlastně i možnosti, abych se mohl podílet na rozvoji biofyziky v rámci ekofyziologie rostlin. V rámci studia biofyziky na PřF UP v Olomouci jsem se mohl účastnit zkoumání problémů, které mě zajímaly. Děkuji mnohokrát Prof. RNDr. J. Naušovi, CSc., který mi ukázal cestu, která spočívala v uplatnění biofyzikálního přístupu ke zkoumání funkčního stavu rostlin. I dnes jsem vděčen za to, že úlohy oponenta mé diplomové práce se zhostil Prof. RNDr. Ing. Michal V. Marek, CSc. Díky jeho vizi o přebudování výzkumného směru ústavu jsem mohl nastoupit na ÚEK AV ČR v Brně a byl to on, který mě uvedl do evropské ekofyziologie. Děkuji Ing. D. Janoušovi, CSc. a také spolupracovníkům z Oddělení ekologické fyziologie lesních dřevin ÚEK AV ČR za podnětnou spolupráci jakož i Mgr. O. Urbanovi, Ph.D. díky němuž je stále živá spolupráce mezi OEFLD ÚEK AV ČR a skupinou biofyziků na PřF OU v Ostravě. Jsem rád, že mohla vzniknout provázanost náhledu na ekofyziologii rostlin ve smyslu polních a laboratorních měření. I dnes je mi ctí, že jsem se mohl a můžu podílet na společných měřeních a že jsem snad k této provázanosti přispěl i já. Patří můj srdečný dík Doc. RNDr. Vladimíru Špundovi, CSc. jakož i mým současným spolupracovníkům za podnětnou spolupráci při realizaci některých myšlenek vedoucích ke společným publikacím. Patří můj veliký dík mému bratru nebratru RNDr. Václavovi Slovákovi, Ph.D., že mě motivoval sepsat tuto práci.

4 Autorce autora autor. Díky mami. 4

5 Předmluva Tato práce vznikla na základě mé publikační aktivity za uplynulých 10 let, která vyplynula ze spolupráce s kolegy z ÚEK AV ČR v Brně, kde jsem působil od roku 1989 až do roku 1995 a s kolegy biofyziky z PřF OU v Ostravě, kde působím od roku Po roce 1989 se výrazně změnil přístup k financování vědy (vznikly grantové agentury) a bylo třeba změnit orientaci dosavadního výzkumu ÚSEB AV ČR (dnes ÚEK AV ČR). Původní zaměření (vliv průmyslových imisí na lesní ekosystémy) bylo postupně nahrazováno komplexním ekofyziologickým výzkumem produkční aktivity porostů lesních dřevin se zaměřením na vliv měnících se podmínek životního prostředí (globální klimatické změny). Díky Prof. M. V. Markovi se Oddělení ekologické fyziologie lesních dřevin ÚEK AV ČR zapojilo do řešení celoevropského projektu The likely impact of rising CO 2 and temperature on European forests, na kterém se podílelo 11 pracovišť z celé Evropy. Na základě této spolupráce vznikají i dnes další projekty, které postupně rozvíjí řešení problematiky vlivu globálních klimatických změn na rostliny. Do značné míry určují výzkumné zaměření celého oddělení (dnes LEFLD ÚEK AV ČR) a to od studia mikroklimatu ekosystémů, přes studium fotosyntézy, vodního režimu, respirace, distribuce a přírůstku biomasy až po studium toků energií a látek. Komplexní přístup ke studiu fyziologických procesů vyžadoval a vyžaduje zavedení a rozšiřování experimentálních metod výzkumu jak v polních tak i v laboratorních podmínkách. Právě proto vznikla spolupráce s biofyziky na PřF OU v Ostravě, kde je možnost laboratorních analýz i provádění simulačních experimentů, které tvoří základ k vysvětlování mechanismů fotosyntetických procesů a umožňují spolehlivou predikci aklimace a adaptace na měnící se přírodní podmínky. Příkladem spolupráce bylo řešení jedné části projektu Výzkumné centrum: Mechanismus, ekofyziologie a biotechnologie fotosyntézy. Obsah práce je rozdělen tématicky do tří kapitol, i když studium jednotlivých problémů se překrývalo. První kapitola se stručně zabývá vlivem zvýšené koncentrace CO 2 na fotosyntézu smrku a ječmene. Se svými spolupracovníky jsem se snažil a snažím rozlišit stimulaci či depresi fotosyntézy pro různé rostliny či různý typ asimilačního aparátu (slunný vs. stinný typ) a rozpoznat mechanismy a příčiny aklimační deprese fotosyntézy. Naléhavost studia vedla k nutnosti vybudování a testování experimentálních zařízení simulující zvýšenou koncentraci CO 2 ať už v přírodních či laboratorních podmínkách, což už je vlastně obsahem 2. kapitoly. K zařazení třetí kapitoly mě vedla skutečnost, že v publikacích jsou metodické postupy popsány velmi stručně a rozvoj metodik a jejich zavádění je nedílnou součástí rozvoje komplexního ekofyziologického přístupu. Shrnuje mé metodické příspěvky ke studiu fotosyntézy, které bylo nutno vyřešit v průběhu dosavadního vědeckého zkoumání. Ve struktuře každé kapitoly je zařazena předmluva k tématu a úvod do problematiky, ve kterých jsou stručně uvedeny problémy, se kterými jsem se potýkal či které jsem se snažil vyřešit. Následuje kapitola vlastní výsledky a přínos autora, kde jsem se pokusil v samostatných odrážkách shrnout výsledky, které považuji za nejpodstatnější. Ke konci každé kapitoly je uvedena vybraná literatura, která je pro dané téma nepostradatelná. Jsem si vědom toho, že se jedná pouze o výtah těch nejpodstatnějších prací a nikoliv o úplný výčet prací souvisejících s daným tématem. Za literaturou jsou uvedeny publikace k tématu, které jsem se svými kolegy publikoval. Tímto zpracováním či shrnutím výsledků za posledních 10 let týkajících se problematiky vlivu globálních klimatických změn (zvýšené koncentrace CO 2 ) se tento směr výzkumu neuzavírá vzhledem k tomu, že se ukázala řada dalších perspektiv např. v oblasti dynamiky aklimace rostlin na měnící se podmínky prostředí. únor 2005 Jiří Kalina 5

6 6

7 Obsah 1.: VLIV ZVÝŠENÉ KONCENTRACE CO 2 NA FOTOSYNTÉZU...8 PŘEDMLUVA K TÉMATU...9 ÚVOD DO PROBLEMATIKY...9 VLASTNÍ VÝSLEDKY...9 PŘÍNOS AUTORA...10 LITERATURA...10 PUBLIKACE K TÉMATU : EXPERIMENTÁLNÍ ZAŘÍZENÍ PRO STUDIUM VLIVU ZVÝŠENÉ KONCENTRACE CO 2 NA FOTOSYNTÉZU...12 PŘEDMLUVA K TÉMATU...12 ÚVOD DO PROBLEMATIKY...12 VLASTNÍ VÝSLEDKY...13 PŘÍNOS AUTORA...15 LITERATURA...16 PUBLIKACE K TÉMATU : METODICKÉ PŘÍSPĚVKY KE STUDIU FOTOSYNTÉZY...17 PŘEDMLUVA K TÉMATU...17 METODICKÉ PROBLÉMY ŘEŠENÉ AUTOREM...17 ÚVOD DO PROBLEMATIKY...18 Stanovení pigmentů obsažených ve fotosyntetickém aparátu vyšších rostlin Fluorescence chlorofylu a Gazometrické metody...22 Stanovení projekční listové plochy Stanovení aktivity enzymu Rubisco VLASTNÍ VÝSLEDKY...24 Stanovení pigmentů obsažených ve fotosyntetickém aparátu vyšších rostlin Fluorescence chlorofylu a a gazometrické metody Stanovení projekční listové plochy Stanovení aktivity enzymu Rubisco PŘÍNOS AUTORA...30 LITERATURA...30 PUBLIKACE K TÉMATU...31 SEZNAM PŘILOŽENÝCH PUBLIKACÍ

8 8 1.: Vliv zvýšené koncentrace CO 2 na fotosyntézu

9 Předmluva k tématu Jedním z hlavních faktorů prostředí, který významně ovlivňuje růst a vývoj rostlin, je koncentrace CO 2 [CO 2 ] v atmosféře. Vliv zvýšené [CO 2 ] na fotosyntetický aparát různých druhů rostlin je stále jedním ze stěžejních témat moderní ekofyziologie. Krátkodobé zvýšení [CO 2 ] stimuluje rychlost fotosyntézy u C 3 rostlin. Důvodem je nedostačující schopnost atmosférické [CO 2 ] (kolem 370 µmolco 2 mol -1 ) saturovat aktivitu enzymu Rubisco a inhibovat fotorespiraci (Bowes 1991, Stitt 1991, Makino a Mae 1999). Úvod do problematiky Počáteční stimulace asimilace CO 2 může po dlouhodobějším vystavení rostlin zvýšené [CO 2 ] (týdny - měsíce - roky) zcela vymizet. Působení zvýšené koncentrace CO 2 obecně vede jak ke zvýšení kapacity fotosyntézy (pozitivní aklimace) spojené se zvýšeným využitím absorbované energie ve fotochemických reakcích (Habash a kol. 1995, Garcia a kol. 1998), tak i k poklesu kapacity fotosyntézy (aklimační deprese) spojené se sníženou fotochemickou účinností PS II (Peterson 1991, Van Oosten a Besford 1995, Marek a Kalina 1996, Kalina a kol. 2001). Mechanismy a příčiny aklimační deprese fotosyntézy jsou stále předmětem diskusí a hypotéz. Jedna z hypotéz (tzv. limitace "sinkem ) předpokládá, že rychlost zvýšené tvorby asimilátů přesáhne kapacitu jejich využití v sinku u rostlin dlouhodobě vystaveným zvýšené [CO 2 ] (Stitt 1991, Paul a Foyer 2001, Urban a kol. 2003). Aklimační deprese fotosyntézy bývá rovněž způsobena sníženou aktivitou nebo množstvím enzymu Rubisco (Sage a kol. 1989) či poklesem obsahu dusíku v listech (Makino a Mae 1999). Další příčiny je možno nalézt v redistribuci anorganického fosfátu, akumulaci škrobů s následném poškození thylakoidních membrán, inhibici transkripce fotosyntetických genů a změnách ve světlosběrných komplexech (blíže např. Nátr 2000 nebo Urban 2003). Při sledování odezvy rostlin na zvýšenou [CO 2 ] je třeba brát v úvahu druh rostliny, fázi vývoje rostlin, minerální výživu, mikroklimatické podmínky při kultivaci, působení dalších stresových faktorů, použití různých typů experimentálních zařízení pro kultivaci rostlin ve zvýšené [CO 2 ] apod. (Garcia a kol. 1998, Hymus a kol. 1999). Podrobněji o možných příčinách aklimační deprese pojednávají např. Makino a Mae (1999) nebo Urban (2003). Vlastní výsledky Rozdílná odezva na působení zvýšené [CO 2 ] byla rovněž pozorována mezi různými druhy stromů. Například, některé topoly spíše profitovaly ze zvýšeného přísunu CO 2 (Kalina a Ceulemans 1997), naopak smrk ztepilý vykazoval spíše aklimační depresi fotosyntézy (Marek a Kalina 1996; Marek a kol. 1997; Urban a Marek 1999). O působení různé ozářenosti nebo zvýšené [CO 2 ] na fotosyntetický aparát rostlin již byla publikována řada prací, nicméně o kombinovaném působení obou faktorů na rostliny (především v přesně definovaných podmínkách) je výsledků méně. Z výsledků polních experimentů vyplývá odlišná odezva slunného a stinného asimilačního aparátu smrku ztepilého na zvýšenou [CO 2 ] (Kalina a kol. 2001). Slunné jehlice vykazovaly v tomto případě mírnou aklimační depresi fotosyntézy, zatímco u stinných jehlic v nižších korunových patrech byla pozorována stimulace asimilace CO 2 a zvýšená kapacita fotosyntézy při saturační koncentraci CO 2. Dále byla aklimační deprese pozorována u smrku hlavně na konci vegetační sezóny, zatímco během jarního období byla pozorována stimulace fotosyntetické aktivity související s účinnějším sinkem (Urban a kol. 2003).Rovněž u dubu (Quercus ilex) došlo k aklimační depresi fotosyntézy především u slunného typu listoví (Marek a kol. 2001). 9

10 Výsledky laboratorních experimentů přispěly ke stanovení rozsahu aklimační deprese fotosyntézy při kombinovaném působení vysoké ozářenosti a zvýšené [CO 2 ]. Zjistili jsme, že aklimační deprese fotosyntetické asimilace CO 2 ječmene jarního není výsledkem přímého synergického působení vysoké ozářenosti a zvýšené [CO 2 ], ale je ovlivněna spíše nedostatečnou kapacitou spotřeby asimilátů (Kurasová a kol. 2003a). Laboratorní experimenty na smrku ztepilém potvrdily, že průkazná aklimační deprese fotosyntetické aktivity je pozorována pouze při kombinovaném působení vysoké ozářenosti a zvýšené koncentrace CO 2 (Kurasová a kol. 2003b). Při současném působení extrémně vysoké ozářenosti a zvýšené koncentrace CO 2 na smrk ztepilý má klíčovou fotoprotektivní úlohu účinná nezářivá disipace ve světlosběrných komplexech PS II (Kurasová a kol. 2003b). V současné době se zabýváme dynamikou aklimace při působení rozdílné ozářenosti a zvýšené [CO 2 ]. Přínos autora Rozlišení stimulace a deprese fotosyntézy (na začátku a konci vegetační sezóny) u smrku ztepilého na základě měření a analýzy CO 2 křivek (Marek a kol.1995) a na základě měření fluorescenčních parametrů a obsahu fotosynteticky aktivních pigmentů (zvýšení náchylnosti k fotoinhibici slunných jehlic) (Marek a kol. 1997) myšlenková a realizační spolupráce. Rozlišení stimulace a deprese fotosyntézy pro dva klony topolu (rychle rostoucí klon Baeupré, pomalu rostoucí klon Robusta) (Kalina a Ceulemans 1997) - myšlenka a realizace projektu. Potvrzení hypotézy, že dlouhodobé vystavení asimilačního aparátu zvýšené [CO 2 ] může zvyšovat jeho náchylnost ke stresu z vysoké ozářenosti (Špunda a kol. 1998) myšlenka a realizace projektu. Zjištění sekvence odezvy PS II vzhledem k době trvání působení zvýšené [CO 2 ] pro smrk ztepilý (Kalina a kol. 2000) - myšlenková a realizační spolupráce. Rozlišení vlivu zvýšené [CO 2 ] pro stinné a slunné jehlice smrku ztepilého (Kalina a kol. 2001) - myšlenková a realizační spolupráce. Zjištění výrazné deprese fotosyntézy pro ječmen kultivovaný ve zvýšené [CO 2 ] v růstové komoře (Kurasová a kol. 2003a) Kalina - řešitel projektu Kombinovaný vliv působení zvýšené koncentrace CO 2 a vysoké ozářenosti na fotosyntetický aparát smrku a ječmene v kontrolovaných podmínkách, GA ČR 522/00/1381. Literatura 1. Bowes, G. (1991) Plant Cell Environ. 14: Garcia, R.L., Long, S.P., Wall, G.W., Osborne, C.P., Kimball, B.A., Nie, G.Y., Pinter, Jr P.J., Lamorte, R.L., Wechsung, F. (1998) Plant Cell Environ. 21: Habash, D., Paul, M., Parry, M.A.J., Keys, A.J., Lawlor, D.W. (1995) Planta 197: Hymus, G.J., Ellsworth, D.S., Baker, N.R., Long, S.P. (1999) Plant Physiol. 120: Makino, A., Mae, T. (1999) Plant Cell Physiol. 40(10): Marek MV, Šprtová M, DeAngelis P, Scarascia-Mugnozza G (2001) Spatial distribution of photosynthetic response to long-term influence of elevated CO 2 in a Mediterranean Macchia mini-ecosystem. Plant Science 160: Nátr, L. (2000): Koncentrace CO 2 a rostliny. ISV Praha, Vydání 1. ISBN Paul, M.J., Foyer, CH. (2001) J. Exp. Bot. 52(302):

11 9. Peterson, R.B. (1991) Plant Physiol. 97: Sage, R.F., Sharkey, T.D., Seemann, J.R. (1989) Plant Physiol. 89: Stitt, M. (1991) Plant Cell Environ. 14: Urban O (2003) Physiological impacts of elevated CO 2 concentration ranging from molecular to whole plant responses. Photosynthetica 41 (1): Urban O, Marek MV (1999) Seasonal changes of selected parameters of CO 2 fixation biochemistry of Norway spruce under the long-term impact of elevated CO 2 Photosynthetica 36 (4): Van Oosten, J.-J., Besford, R.T. (1995) Plant Cell Environ. 18: Publikace k tématu 1. Kalina, J., Ceulemans, R. (1997) Clonal differences in the response of dark and light reactions of photosynthesis to elevated atmospheric CO 2 in poplar. Photosynthetica 33 (1): Kalina, J, Čajánek, M., Kurasová, I., Špunda, V., Vrána, J., Marek, M. V. (2000) Acclimation of photosystem 2 function of Norway spruce induced during first season under elevated CO 2 in lamellar domes. Photosynthetica 38 (4): Kalina, J., Urban, O., Čajánek, M., Kurasová, I., Špunda, V., Marek, M. V. (2001) Different responses of Norway spruce needles from shaded and exposed crown layers to the prolonged exposure to elevated CO 2 studied by various chlorophyll a fluorescence techniques. Photosynthetica 39 (3): Kurasová, I., Kalina, J., Štroch, M., Urban, O., Špunda, V. (2003a) Response of photosynthetic apparatus of spring barley (Hordeum vulgare L.) to combined effect of elevated CO 2 concentration and different growth irradiance. Photosynthetica 41 (2): Kurasová, I., Kalina, J., Urban, O., Štroch, M., Špunda, V. (2003b) Acclimation of two distinct plant species, spring barley and Norway spruce, to combined effect of various irradiance and CO 2 concentration during cultivation in controlled environment. Photosynthetica 41 (4): Marek, M.V., Kalina, J. (1996) Comparison of two experimental approaches used in the investigations of the long-term effects of elevated CO 2 concentration. Photosynthetica 32 (1): Marek, M. V., Kalina, J., Matoušková, M. (1995) Response of photosynthetic carbon assimilation of Norway spruce exposed to long-term elevation of CO 2 concentration. Photosynthetica 31 (2): Marek, M. V., Šprtová, M., Kalina, J. (1997) The photosynthetic irradiance-response of Norway spruce exposed to a long-term elevation of CO 2 concentration. Photosynthetica 33 (2): Špunda, V, Kalina, J., Čajánek, M., Pavlíčková, H., Marek, M. V. (1998) Long-term exposure of Norway spruce to elevated CO 2 concentration induces changes in photosystem II mimicking an adaptation to increased irradiance. J. Plant Physiol. 152: Urban, O., Pokorný, R., Kalina, J., Marek, M. V. (2003) Control mechanisms of photosynthetic capacity under elevated CO 2 concentration: evidence from three experiments with Norway spruce trees. Photosynthetica 41 (1):

12 2.: Experimentální zařízení pro studium vlivu zvýšené koncentrace CO 2 na fotosyntézu Předmluva k tématu Jak již bylo řečeno, jedním z hlavních faktorů prostředí, který významně ovlivňuje růst a vývoj rostlin, je koncentrace CO 2 [CO 2 ] v atmosféře. Studium vlivu zvýšené [CO 2 ] na fotosyntetický aparát různých druhů rostlin v polních (přírodních) či laboratorních podmínkách je založeno na vybudování takového experimentálního zařízení, které nejlépe splňuje jak požadované mikroklimatické podmínky tak i cíl dané studie. Úvod do problematiky Pro studium vlivu zvýšené [CO 2 ] v polních podmínkách byla zhotovena a vyzkoušena řada experimentálních zařízení. K těm technicky a ekonomicky (co se provozu týče) nejméně nákladným zařízením patří větvové vaky (BB branch bags, např. Barton a kol. 1993), které byly vybudovány a provozovány např. na výzkumné stanici Flakalinden ve Švédsku, kde byly jednotlivé větve smrku ztepilého vystaveny působení zvýšené [CO 2 ] (obr. 2.1.). Obr. 2.1.: Větvové vaky (BB branch bags) na výzkumné stanici Flakalinden ve Švédsku. Nákladnějším zařízením jsou komory s otevřeným vrchem (OTC open top chambers, např. Leadley a Drake 1993). OTC již umožňují sledovat vliv zvýšené [CO 2 ] na celý strom (např. EEP Bílý Kříž), či skupinu stromů (např. Univerzita Antverpy, obr. 2.2.). K nejnákladnějším zařízením pak patří systém FACE (Free-Air CO 2 Enrichment, např. Hendrey a kol. 1993). Nákladnost FACE i jeho provozu je však vyvážena nesmírnou výhodou spočívající v možnosti sledování vlivu zvýšené [CO 2 ] pro značnou část rostlin (pokusná plocha 100 až 200 m 2 ) s nezměněným mikroklimatem, tedy ve vyloučení komorového efektu. Kompromisním řešením mezi nákladností FACE a nemožností studia vlivu zvýšené [CO 2 ] pro část porostu v OTC jsou minisféry se systémem otočných lamel (semi-open glass domes with adjustable windows, GDs) (Urban a kol. 2001). 12

13 Obr. 2.2.: Komory s otevřeným vrchem (OTC) pro studium vlivu zvýšené [CO 2 ] na topol (Univerzita Antverpy, Belgie). Pro studium vlivu zvýšené [CO 2 ] v laboratorních podmínkách, podobně jako v polních podmínkách, neexistují komerčně dodávané kultivační (růstové) komory. Růstové komory jsou totiž vybaveny pouze regulací ozářenosti, teploty a vlhkosti. Kultivační komory, které jsou vybaveny regulací [CO 2 ] pak nesplňují experimentální nároky na ozářenost a na rozsah nastavení [CO 2 ], která bývá řádově v procentech, což je pro potřeby ekofyziologie rostlin nevyhovující vzhledem k aktuální koncentraci oxidu uhličitého v atmosféře (tj. 0,037%). Vlastní výsledky V roce 1992 byl na EEP Bílý Kříž v Moravskoslezských Beskydech zahájen dlouhodobý experiment sledující vliv zvýšené [CO 2 ] na jedince smrku ztepilého. Tento experiment byl realizován v rámci projektu Globální klimatické změny - integrace jejich účinků na fyziologii produkce biomasy v měřítku lesního porostu (GA ČR. 501/93/0055, spoluřešitel - Kalina) a The likely impact of rising CO 2 and temperature on European forests (EU, CEC.CIPD 3510PL922052, spoluřešitel - Kalina). Bylo vybudováno osm stavebnicových OTC, přičemž každá obsahovala jeden smrk (obr. 2.3.). Ve čtyřech OTC byla [CO 2 ] shodná s okolím, v dalších čtyřech byla okolní [CO 2 ] obohacena o 352 ± 6 µmol(co 2 ) mol -1. V průběhu experimentu se ukázalo, že systém OTC byl z technického i funkčního hlediska v podmínkách horských smrčin plně vyhovující pro dané experimentální využití (Janouš a kol. 1996). V roce 1996 byl zahájen na EEP Bílý Kříž v Moravskoslezských Beskydech dlouhodobý experiment sledující vliv zvýšené [CO 2 ] na porost smrku ztepilého. V rámci projektů ECOCRAFT II - Fluxes of Carbon Dioxide into Forest Stands under Global Changes Approach (EU RD program Environment, spoluřešitel - Kalina) a Stanovení vlivu zvýšené koncentrace CO 2 na porosty lesních dřevin za použití "mini-biosfér" a volného porostu (GA ČR 522/96/1106, spoluřešitel - Kalina) byly vybudovány dvě GDs (obr. 2.4.). V každé z nich bylo umístěno 56 dvanáctiletých smrků ve dvou různých hustotách (simulace řídkého a hustého porostu). Podobně jako OTC pro jedince smrku tak i GDs se ukázaly plně vyhovujícím kultivačním zařízením pro mini - porost smrku (Urban a kol. 2001). 13

14 Obr. 2.3.: Komory s otevřeným vrchem (OTC) pro studium vlivu zvýšené [CO 2 ] na smrk ztepilý (EEP, AV ČR, Bílý Kříž, Česká republika). Obr. 2.4.: Kultivační sféry (GDs) pro studium vlivu zvýšené [CO 2 ] na smrk ztepilý (EEP, AV ČR, Bílý Kříž, Česká republika). V rámci projektu Kombinovaný vliv působení zvýšené koncentrace CO 2 a vysoké ozářenosti na fotosyntetický aparát smrku a ječmene v kontrolovaných podmínkách (GA ČR 522/00/1381, Řešitel: J. Kalina, PřF OU v Ostravě) byl zvládnut bezchybný chod zařízení pro regulaci CO 2 v růstové komoře HB 1014 (obr. 2.5.). Díky tomu bylo možno standardně připravovat rostlinný materiál (ječmen, smrk) v definovaných podmínkách (teplota, vlhkost, ozářenost, koncentrace CO 2 ) (Kurasová a kol. 2003a). 14

15 Obr. 2.5.: Růstová komora BIO-LINE HB 1014 (Heraeus Vötsch - Industrietechnik, Německo) (vlevo) s regulací koncentrace CO 2 (dodala fy. - H. Walz, Německo) (vpravo). V tomto zařízení lze přesně naprogramovat různé mikroklimatické podmínky během pěstování rostlin (teplota, vlhkost, ozářenost, koncentrace oxidu uhličitého) což je nesmírně důležité pro opakování experimentů s rostlinným materiálem a dosažení spolehlivých reprodukovatelných výsledků. Přínos autora Podíl na výstavbě 8 OTC spolupráce. Navržení systému kontinuálního měření [CO 2 ] v OTC pomocí infračerveného analyzátoru plynů WMA-1 (PP-Systém, Anglie) - myšlenka a realizace. Ocenění komorového efektu OTC z hlediska fyziologických parametrů na základě měření fluorescenčních parametrů a obsahu fotosynteticky aktivních pigmentů (Janouš a kol. 1996) myšlenková a realizační spolupráce. Zjištění nevhodnosti použití BB jakožto experimentálního zařízení pro studium vlivu zvýšené [CO 2 ] na smrk (Marek a Kalina 1996) - myšlenková a realizační spolupráce. Podíl na výstavbě 2 GDs spolupráce. Ocenění komorového efektu GDs z hlediska fyziologických parametrů na základě měření fluorescenčních parametrů a obsahu fotosynteticky aktivních pigmentů (Urban a kol. 2001) realizační spolupráce. 15

16 Navržení, sestavení a zvládnutí bezchybného chodu zařízení pro regulaci [CO 2 ] v růstové komoře HB 1014 (Kurasová a kol. 2003a) - myšlenka a realizace. Literatura 15. Barton, C.V.M., Lee, H.S.J., Jarvis, P.G. (1993) Plant Cell Environ. 16: Hendrey, G.R., Lewin, K.F., Nagy, J.(1993) Vegetatio 104/105: Leadley, P.G., Drake, B.G. (1993) Vegetatio 104/105: 3-15 Publikace k tématu 11. Janouš, D., Dvořák, V., Opluštilová, M., Kalina, J. (1996) Chamber effects and responses of trees in the experiment using open top chambers. J. Plant Physiol. 148: Kurasová, I., Kalina, J., Štroch, M., Urban, O., Špunda, V. (2003a) Response of photosynthetic apparatus of spring barley (Hordeum vulgare L.) to combined effect of elevated CO 2 concentration and different growth irradiance. Photosynthetica 41 (2): Marek, M. V., Kalina. J. (1996) Comparison of two experimental approaches used in the investigations of the long-term effects of elevated CO 2 concentration. Photosynthetica 32 (1): Urban, O., Janouš, D., Pokorný, R., Marková, I., Pavelka, M., Fojtík, Z., Šprtová, M., Kalina, J., Marek, M. V. (2001) Glass domes with adjustable windows: A novel technique for exposing juvenile forest stands to elevated CO 2 concentration. Photosynthetica 39 (3):

17 3.: Metodické příspěvky ke studiu fotosyntézy Předmluva k tématu Rád bych poděkoval přízni osudu, že jsem mohl být a pracovat v laboratořích ať už na PřF OU v Olomouci, na OPELD ÚSEB ČSAV Brno (dnes LEFLD ÚEK AV ČR v Brně) nebo na PřF OU v Ostravě, kde se začaly po roku 1990 objevovat (pokud už nebyly) přístroje, které splňovaly světové parametry pro výzkum fotosyntetických procesů. Tak se stalo, že upadly v zapomnění některé jednoduché přístroje na jejichž vývoji jsem se podílel (Nauš a Kalina 1989). Podobně, s nástupem a dostupností počítačové techniky a tabulkových procesorů, ztratily na významu programy umožňující zpracování naměřených dat, které jsem vytvořil či na kterých jsem se podílel. Dostupnost komerčních přístrojů však měla i druhou stránku mince. Bylo třeba tyto přístroje uvést do provozu, naučit se s nimi pracovat a uzpůsobit či vytvořit metodiky použitelné a relevantní pro vlastní experimenty. A to hlavně vzhledem k tomu, že metodiky uváděné v publikacích bývají stručné a některé triky nebývají často záměrně uvedeny. Navíc, i některé komerční přístroje neměly vyřešeny některé nezbytné doplňky. To se týká hlavně gazometrických systémů, pro které zpočátku nebyly komerčně dostupné systémy pro homogenní ozáření vlastní asimilační komůrky. Jiným příkladem může být stanovení listové plochy pomocí komerčních přístrojů, které je nezbytné pro vyjádření fotosyntetických parametrů. Málokdo si při koupi takovéhoto přístroje uvědomí možná úskalí stanovení listové plochy pro jehlice (např. smrku), která souvisí se statickou elektřinou a tím pádem znesnadňují či znehodnocují vlastní měření. Vzhledem k tomu, že část experimentů, na kterých jsem se podílel, probíhala a probíhá na Bílém Kříži v Moravskoslezských Beskydech, bylo nutno naučit se převážet vzorky pro analýzy v laboratoři. Týkalo a týká se to vzorků pro stanovení fotosyntetických pigmentů či v současné době vzorků pro stanovení aktivity enzymu Rubisco, obsahu dusíku či fosforu. Tyto postupy jsou i v dnešní době využívány v laboratorních experimentech či přímo v praktických cvičeních studentů, bakalářské a diplomové práce z toho nevyjímaje, a to nejen na pracovišti KF PřF OU v Ostravě. Metodické problémy řešené autorem V průběhu své vědecké činnosti jsem se setkal s následujícími metodickými problémy, které bylo třeba vyřešit (seřazeno tématicky, ne časově): 1. Stanovení obsahu fotosyntetických pigmentů (chlorofyl a, chlorofyl b, suma karotenoidů) - spektrofotometricky s použitím spektrofotometru Specord M400 (Carl Zeiss Jena, Německo) a UV550 (Unicam, Anglie). 2. Stanovení obsahu fotosyntetických pigmentů (chl a, chl b, neoxantin, violaxantin, anteraxantin, lutein, zeaxantin, β - karoten) - pomocí HPLC a to isokraticky či gradientově s použitím HPLC systému TSP Analytical (USA). 3. Současné měření fluorescenčních a gazometrických parametrů. 4. Stanovení projekční listové plochy jehlic smrku ztepilého. 5. Spektrofotometrické stanovení aktivity enzymu Rubisco. 17

18 Některé metodické problémy, týkající se simulace zvýšené [CO 2 ], jsou zmíněny v kapitole 2 a proto zde již nejsou uváděny. Úvod do problematiky Z celé řady metodik, které se využívají v biofyzikálním či ekofyziologickém přístupu ke studiu fotosyntézy, jsou vybrány jen ty, kterými jsem se hlouběji zabýval. Stanovení pigmentů obsažených ve fotosyntetickém aparátu vyšších rostlin Složení fotosyntetického aparátu fotosyntetizujících organismů je tak důmyslné, že tyto organismy jsou schopny využít téměř celé viditelné spektrum slunečního záření dopadajícího na Zemi. Vyšší rostliny obsahují mimo chlorofyly (chlorofyl a - chl a, chlorofyl b - chl b) také karotenoidy (car x+c ), ke kterým patří neoxantin (N), violaxantin (V), anteraxantin (A), lutein (L), zeaxantin (Z) a β - karoten (β - kar). Spektroskopické stanovení chlorofylů se začalo používat od 40. let minulého století, kdy rovnice pro výpočet obsahů chlorofylů publikoval MacKinney (1941). Od té doby se v publikacích objevila celá řada dalších rovnic a to i pro různé druhy rozpouštědel. Ucelenější přehledná práce byla publikována Šestákem a kol. (1971) a později H. K. Lichtenthalerem (1987), který do svých rovnic zahrnul i rovnici pro výpočet obsahu karotenoidů. Pro stanovení jednotlivých karotenoidů je možno využít dvou přístupů. Prvním z nich je tenkovrstevná chromatografie, která s sebou nese problémy při kvantifikaci jednotlivých pigmentů. Druhou z nich je vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC). Metodiky HPLC pro kvantifikaci fotosyntetických pigmentů se objevovaly v 80. letech, ale jejich výrazný rozmach nastal v 90. letech minulého století (např. Gilmore a Yamamoto 1991, Jahns 1995) a to hlavně v souvislosti s metodikami měření fluorescence chl a (např. Jahns a Krause 1994). Fluorescence chlorofylu a Chlorofyl a je přirozená fluorescenční sonda zabudovaná v pigment proteinových komplexech thylakoidních membrán. V intaktním fotosyntetickém aparátu je prakticky veškerá fluorescence v červené oblasti spektra ( nm) emitována chl a. Vzhledem ke skutečnosti, že fluorescence chl a je kompetitivní proces k fotochemickým reakcím a nezářivým disipačním procesům v pigment proteinových komplexech, lze měření fluorescence chl a při pokojové (fyziologické) teplotě použít ke komplexnímu studiu funkčního stavu fotosystému II (PS II) a fotosyntetického aparátu obecně. V současné době je z fluorescenčních charakteristik počítána řada parametrů, které mají svou fyziologickou interpretaci, a tudíž svůj velký význam (viz. dále). Problém fyziologické interpretace fluorescenčních parametrů je i v dnešní době aktuální a stále není ukončen. Fluorescenčním indukčním jevem (FIJ) je nazývána časová závislost intenzity fluorescence chl a fotosyntetického systému, který je dostatečně adaptován na tmu, po náhlém ozáření aktinickou fotosynteticky aktivní radiací (FAR). Fluorescenční indukční jev (někdy označován jako Kautskyho efekt) je zdrojem informací o funkčnosti fotosyntetického aparátu. Význam fluorescence, jakožto experimentální techniky, roste již od doby prvního pozorování, které provedli Kautsky a Hirsch (1931). Ze změny intenzity fluorescence po zapnutí aktinického světla pak upozornili na souvislost kinetiky fluorescence a fotochemickými reakcemi resp. asimilací CO 2. Podle doby pozorování FIJ rozlišujeme: - velmi rychlou fázi fluorescenčního indukčního jevu (vrfij), 18

19 - rychlou fázi fluorescenčního indukčního jevu (rfij), - pomalou fázi fluorescenčního indukčního jevu (pfij). Rychlý fluorescenční indukční jev rfij Ve fungujících komplexech PS II jsou potřebné dva elektrony z Q A k redukci Q B. Takováto reakční centra (RC) PS II označujeme jako aktivní (Cao a Govindjee 1990) nebo Q B -redukující (Melis 1985). Existují však i reakční centra PS II, která nejsou schopna přenášet elektron z Q A na Q B. Tyto pak označujeme jako neaktivní nebo Q B - neredukující. Počáteční nárůst fluorescence z minimální intenzity fluorescence (F 0 ) do F pl je přisuzován uzavírání Q B -neredukujících RC PS II. Relativní výška F pl vyjádřena jako poměr (F pl F 0 )/(F M - F 0 ) je používána k určení relativního množství Q B -neredukujících reakčních center PS II (Cao a Govindjee 1990, Guennther a Melis 1990b). Maximální intenzita fluorescence F M je obvykle určována z velmi rychlého indukčního jevu s použitím DCMU (Melis 1985, Cao a Govindjee 1990) (srovnej s obr. 3.3.). Typická křivka rfij je na obr Určení F pl z křivky velmi rychlého fluorescenčního indukčního jevu je možno pomocí první derivace křivky (Klinkovský a Nauš 1990). intenzita fluorescence [r.j.] 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 F 0 F pl 0,3 0,5 0,7 0,9 1,1 1,3 1,5 čas [s] Obr. 3.1.: Typická křivka rfij získaná pomocí PAM 101, 102, 103 fluorimetru na jehlicích smrku ztepilého. Popis jednotlivých parametrů viz. text. K základním parametrům používaným k interpretaci měření rfij je maximální fotochemická účinnost PS II ve stavu adaptovaném na tmu (F V /F M, pro nepoškozené listy nabývá hodnoty ± 0.004, Björkman a Demmig 1987). K dalším patří doba nárůstu intenzity fluorescence z F 0 do (F P - F 0 )/2 (t 1/2 ). Tento parametr souvisí s velikostí plastochinonového poolu a velikostí antén. Relativní množství RC PS II neschopných redukovat Q B je možno určit jako poměr (F pl - F 0 )/(F M - F 0 ), který na rozdíl od F V /F M přináší přímé informace o heterogenitě PS II (Klinkovský a Nauš 1994, Nauš a Melis 1992, Guenther a Melis 1990a). F P 19

20 Pomalý fluorescenční indukční jev. Pokud rostlinný materiál, který byl aklimován na tmu, vystavíme delší dobu aktinické ozářenosti, můžeme pozorovat tzv. pomalý fluorescenční indukční jev, který se popisuje písmeny O-P-S-M-T (Papageorgiou a Govindjee 1968a,b). Z minimální hodnoty fluorescence (O) narůstá intenzita fluorescence přes maximum P a klesá přes lokální minima a maxima (S, M) do ustálené hodnoty fluorescence (T) (obr. 3.2., poznámka: T je na obr označeno jako F S ). Intenzita fluorescence [r.j.] 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 P S M T O čas [s] Obr. 3.2.: Typická křivka pfij získaná pomocí PAM 101, 103 fluorimetru na ječmeni jarním s vyznačením význačných bodů (blíže viz. text). Obr. 3.3.: Typická křivka pfij získaná pomocí PAM 101, 103 fluorimetru na ječmeni jarním 2,5aklimovaného na nízkou kultivační ozářenost. Saturační pulz je označen jako L S, zapnutí či vypnutí aktinické ozářenosti je označeno jako L A on či L A off. Popis jednotlivých F M parametrů viz text. 2 Intenzita fluorescence [r.j.] 1,5 1 0,5 0 F 0 L S L A on F M F S F0 L A off čas [s] F M L A on L S F S L A off 20

21 Pokles intenzity fluorescence z maxima P je způsobován tzv. zhášením fluorescence. Rozlišujeme fotochemické (q P ) a nefotochemické (q N ) zhášení (Bilger a Schreiber 1986, Schreiber a kol. 1986). Detailní popis a fyziologický význam komponent zhášení publikovali Krause a Weis (1991). Schreiber a kol. (1986) vyvinuli metodu saturačních pulzů pro rozlišení a analýzu fotochemického a nefotochemického zhášení, která využívá silné světelné (saturační) pulzy saturující fotosyntetický elektronový transport na akceptorové straně PS II. Z měření světelných křivek fluorescence chl a v ustáleném stavu na ozářenosti (srovnej s obr. 3.3.) stanovujeme pět základních parametrů. Stav, kdy jsou všechna reakční centra (RC) v otevřeném stavu či v uzavřeném stavu je charakterizován počáteční (minimální či maximální) intenzitou fluorescence (F 0, F M ). V ustáleném stavu systému aklimovaného na určitou ozářenost stanovujeme F S a pomocí saturačního pulzu určujeme F M. Minimální intenzitu fluorescence u rostlin krátkodobě aklimovaných na určitou úroveň ozářenosti (F 0 ) měříme bezprostředně po vypnutí aktinického světla popř. po aplikaci dalekého červeného světla. Z těchto měřených parametrů se počítá řada parametrů, které mají svou fyziologickou interpretaci. K nejpoužívanějším patří maximální fotochemická účinnost PS II ve stavu aklimovaném na tmu (F V /F M ). Dále připomeňme alespoň např. fotochemické a nefotochemické zhášení fluorescence (q P, q N nebo NPQ, Bilger a Björkman 1990), aktuální účinnost PS II (Y neboli P, Genty a kol. 1989, Demmig- Adams a kol. 1996), poměrnou část nadbytečné excitační energie (E) či poměrnou část energie rozptýlenou nezářivou disipací (D, Demmig-Adams a kol. 1996) (více také např. Roháček a Barták 1999). Měření závislosti parametrů fluorescence chl a v ustáleném stavu na aktinické ozářenosti Jednou z důležitých fyziologických charakteristik je měření závislosti parametrů fluorescence chl a v ustáleném stavu na aktinické ozářenosti. Charakterizace fotosyntetických procesů v rostlinách během aklimace ze stavu temnotní aklimace, přes aklimaci na zvyšující se ozářenost, až po aklimaci na saturační ozářenost slouží pak k interpretaci fyziologického stavu rostlin v přírodních podmínkách. Ve stavu aklimovaném na tmu jsou veškerá reakční centra PS II v otevřeném stavu (tzv. fotochemické zhášení fluorescence q P je maximální - podle definice rovno 1), thylakoidní membrána je v tzv. relaxovaném (neenergizovaném) stavu - není vytvořen gradient ph přes thylakoidní membránu a nezářivá disipace excitační energie (NRD) je minimální (parametry charakterizující NRD tzv. nefotochemické zhášení fluorescence q N, respektive NPQ jsou podle definicí rovny 0). Zároveň potenciální kvantový výtěžek fotochemické reakce PS II (F V /F M ) je maximální. Vystavíme-li nyní rostlinu působení aktinické ozářenosti, dojde k indukci fotosyntetických reakcí a po přibližně 5-10 minutách se ustaví ustálený stav odpovídající krátkodobé aklimaci fotosyntetického aparátu na danou úroveň ozářenosti (srovnej s obr. 3.3.). Tento stav je charakterizován uzavřením části RC PS II, vytvořením gradientu ph přes thylakoidní membránu a rozběhnutím fotosyntetické asimilace CO 2, respektive fotosyntetického vývoje O 2. Tento ustálený stav je charakterizován částečným poklesem q P, zvýšením NRD monitorovaným pomocí q N, respektive NPQ, poklesem potenciálního výtěžku fotochemické reakce PS II (F V /F M - souvisí se zvýšením NRD) i aktuálního výtěžku fotochemické reakce(y). Dále může dojít k poklesu fluorescence F 0, který lze kvantifikovat analogicky jako q 0, respektive SV 0, a který indikuje relativní míru NRD ve světlosběrných anténách (LHC) a souvisí s poklesem účinnosti přenosu excitační energie z LHC na jádro PS II. 21

22 Čím je vyšší ozářenost, která působí na rostlinu, tím výraznější jsou výše popsané změny fluorescenčních parametrů. Při vystavení rostliny velmi vysoké ozářenosti může dojít k uzavření převážné části RC PS II (q P poklesne pod 0,4 - potenciálně může klesat až k 0), k nasycení kapacity NRD (q N, NPQ, SV 0 ani q 0 se nezvyšují neomezeně, při určité ozářenosti dochází k saturaci jejich nárůstu a při dalším zvyšování ozářenosti již hodnoty těchto parametrů nerostou). Pokles q P pod 0,4 lze korelovat s fotoinhibičním poškozením PS II. Gazometrické metody Ke studiu fotosyntetické aktivity rostlin se ve velké míře využívají gazometrické metody. Tyto metody, především s použitím moderních komerčních přístrojů, jsou rychlé, nedestruktivní a umožňují měření celkové bilance uhlíku v rostlině. Jsou založeny na stanovení výměny oxidu uhličitého a vodní páry mezi asimilačním aparátem rostlin a okolní atmosférou (např. Leegood 1993). Principem této metody je absorpce oxidu uhličitého a vodní páry v infračervené oblasti. Příjem resp. výdej CO 2 asimilujícím pletivem se projeví změnou koncentrace CO 2 v atmosféře obklopující měřený objekt. Změna koncentrace je měřena pomocí infračerveného analyzátoru (IRGA). Aby bylo možno stanovit tuto změnu, je nutno umístit asimilující objekt do tzv. asimilační komory neboli listové kyvety. Tato je vzduchotěsně a elektronicky spojena s IRGA. Na listovou kyvetu se připevňuje zdroj fotosynteticky aktivní radiace. Existuje řada přístrojů (typů), které se používají pro měření změn koncentrace oxidu uhličitého. Jsou to např. LI-6200 či LI-6400 nebo LI6262 (LI-COR Inc., Lincoln, Nebraska, USA), CIRAS-1 či CIRAS-2 (PP Systems Ltd., Hitchin, Herts, UK) (obr. 3.4.) nebo LCA-4 (ADC Ltd., Hoddesdon, Herts, UK) i řada asimilačních komor, které se liší hlavně podle způsobu použití (na ploché listy, jehličnany). Obr. 3.4.: Celkový pohled na otevřený gazometrický systém CIRAS-2 (zleva: rostliny ječmene jarního, listová kyveta, zdroj FAR, infračervený analyzátor plynů s trubicemi pro regulaci množství CO 2 a H 2 O v systému a dávkovacím zařízením oxidu uhličitého, PC s obslužným software pro řízení měření a záznam měřených hodnot). 22

23 Výsledkem měření rychlosti fotosyntézy jsou tzv. fotosyntetické křivky, které jsou počítány s ohledem na různé determinující faktory([co 2 ], FAR). CO 2 křivky fotosyntézy (CRC) vyjadřují vztah mezi okolní koncentrací CO 2 a rychlostí asimilace oxidu uhličitého při určité teplotě a ozářenosti. Světelné křivky fotosyntézy (LRC, obr. 3.5.) vyjadřují vztah mezi ozářeností listu a rychlostí asimilace CO 2 při určité teplotě a koncentraci CO 2. Všeobecně mají tyto křivky lineární charakter při nízkých koncentracích CO 2 a nízké ozářenosti (směrnice této přímky vyjadřuje karboxylační či fotochemickou účinnost). Při vysokých koncentracích nebo ozářenostech dosahují křivky víceméně konstantních hodnot, které odpovídají maximálním hodnotám A Nmax ve vztahu ke koncentraci CO 2 (resp. ozářenosti). Z CRC můžeme dále počítat například pomocí programu FOTOS (Pirochtová a Marek 1991) nebo pomocí programu Photosyn Assistant (Dundee, Anglie) řadu parametrů, které mají svoji fyziologickou interpretaci. Patří k nim rychlost karboxylace či oxidace enzymu Rubisco (V c, V 0 ), rychlost regenerace akceptoru CO 2 RuBP (Brooks a Farquhar 1985, Marek 1983), rychlost tvorby glycinu, rychlost přenosu elektronů (J a ), která je výsledkem fotochemických reakcí vyplývajících z procesů záchytu kvant zářivé energie chlorofylovými centry (Farquhar a kol 1980), rychlost karboxylace (J), která je limitována transportem elektronů z fotochemických reakcí (Farquhar a Caemmerer 1981). Z LRC pak počítáme kompenzační ozářenost, fotochemickou účinnost, parametr konvexity či maximální rychlost asimilace A Nmax (např. Marek 1983) (srovnej s obr. 3.5). A N [µmol m -2 s -1 ] R D fotochemická účinnost kompenzační ozářenost parametr konvexity ("rychlost saturace") A Nmax FAR [µmol m -2 s -1 ] Obr. 3.5.: Idealizovaná světelná křivka (LRC) z reálných dat (závislost rychlosti asimilace - A N - na fotosynteticky aktivní radiaci - FAR). Od temnotní respirace R D je křivka charakterizována lineární částí (fotochemická účinnost je dána směrnicí této přímky), prochází tzv. kompenzační ozářeností (rychlosti asimilace a respirace jsou v rovnováze) až k maximální hodnotě A Nmax - ozářeností saturovaná rychlost fotosyntézy. 23

24 Stanovení projekční listové plochy Projekční plocha listu se používá jako vztažná jednotka pro chemické analýzy obsahů látek v rostlinném materiálu (např. obsah chlorofylů a karotenoidů, ale také pro vyjádření gazometrických parametrů). Projekční plochu listů můžeme stanovit několika způsoby: - Nejjednodušší způsob jak stanovit projekční plochu listu spočívá v přiložení listu (nebo jeho části) na milimetrový papír, obkreslení listu a spočítání čtverců. - Další metodou může být tzv. vážková metoda, kdy list (popř. jeho část) přiložíme na papír, obkreslíme (popřípadě zkopírujeme na kopírce), obrys vystřihneme a zvážíme. Pomocí známé plošné hustoty papíru (udává se v g mm -2 ) pak přepočítáme hmotnost vystřiženého obrysu listu na plochu listu. V případě, že není známa plošná hustota použitého papíru, můžeme ji zjistit pomocí kalibrační přímky (závislost plochy čtverců papíru na jejich hmotnosti). - Projekční plocha listů se také dá stanovit pomocí komerčně vyráběných přístrojů tzv. areametrů (např. LI-3000A, LI-3050, LI 3100, LI-COR; LAM-100, ADC; AMS, Delta-T Devices; S1700, Skye Instruments). Princip měření plochy pomocí těchto přístrojů je následující. Listy prochází mezi řadou světlo emitujících diod (LED) a řadou fotocitlivých diod. Projekční plocha listů je pak stanovena z úbytku ozářenosti. Komerčně vyráběné přístroje dosahují vysoké přesnosti (1 mm 2 ). - Projekční plocha listů se také dá stanovit pomocí skeneru a programu Cernota (viz. vlastní výsledky). Stanovení aktivity enzymu Rubisco Enzym ribulóza-1,5-bisfosfát karboxyláza/oxygenáza (Rubisco, EC ) je nejdůležitějším fotosyntetickým enzymem a zároveň nejhojnější bílkovinou v biosféře. Nachází se ve stroma chloroplastů ve velké koncentraci (až 0,2 g ml -1 ). Obsahuje přibližně 50% celkového množství dusíku v listech C3 rostlin. Jeho funkce spočívá v karboxylaci a oxygenaci. S Calvin-Bensonovým cyklem, jak jsou tyto reakce nazývány, je spojena i aktivita tohoto enzymu, která může být různorodá pro tutéž rostlinu díky ovlivnění okolními podmínkami fotosynteticky aktivní radiací, teplotou, výživou dusíkem, množstvím dostupného CO 2, apod. Rubisco je ve tmě neaktivní a teprve po ozáření je aktivován aktivázou Rubisco, která se vyskytuje ve stroma chloroplastů (např. Procházka 1998). Tato aktivace je nutná, aby mohl enzym Rubisco katalyzovat fotosyntetickou fixaci CO 2. V noci si rostlina syntetizuje inhibitor 2-karboxyarabanitol-1-fosfát, který znemožňuje plnou aktivaci enzymu Rubisco (Leegood 1993). Tento inhibitor je během dne degradován, takže vzorky rostlinné tkáně odebrané uprostřed dne vykazují největší aktivitu enzymu. Aktivitu enzymu Rubisco lze stanovit radiometrickou metodou, gelovou elektroforézou, pomocí imunoblottingu a westernblottingu nebo spektrofotometricky. Pro spektrofotometrické stanovení aktivity enzymu Rubisco vycházel Hrstka (2002) z metodiky Besford (1994). Podobný přístup lze nalézt i v publikaci de la Peňa (2001). Vlastní výsledky Stanovení pigmentů obsažených ve fotosyntetickém aparátu vyšších rostlin Vzhledem k tomu, že rostlinný materiál obsahuje velké procento vody (pro jehlice smrku je to kolem 50%, pro listy ječmene kolem 90%), možnosti stanovení sumy karotenoidů a i vzhledem k cenové dostupnosti acetonu, jsme zvolili rovnice pro 80% aceton (jakožto extrakční rozpouštědlo). Původní rovnice (Lichtenthaler 1987) vyžadují 24

25 měření absorbance pro 3 vlnové délky (470 nm, 646,8 nm a 663,2 nm). Tyto rovnice byly upraveny o odečet absorbance při 750 nm, kde již chlorofyly ani karotenoidy neabsorbují, a tudíž hodnota absorbance je způsobena rozptylem nečistotami, které zbyly po filtraci či centrifugaci. Výsledek je pak udáván v µg na 1 mililitr extraktu. Upravené rovnice pro výpočet obsahů chlorofylů jsou tedy: chl a = 12,25 * (A 663,2 - A 750 ) 2,79 * (A 646,8 - A 750 ) chl b = 21,5 * (A 646,.8 - A 750 ) 5,10 * (A 663,2 - A 750 ) chl a+b = 7,15 * (A 663,2 - A 750 ) + 18,71 * (A 646,8 - A 750 ) car x+c = [1000 * (A A 750 ) 1,82 * chl a 85,02 * chl b]/198 Pro fyziologické interpretace se výsledek uvádí na plochu listu či na čerstvou či suchou hmotnost (výsledek je pak udáván v g m -2 nebo v mg g -1 ). Při přípravě extraktů jsme se potýkali i s problémem filtrace. Nejprve jsme používali aparaturu pro filtraci za sníženého tlaku (frita se sintrem S3). Později jsme extrakt centrifugovali, což přispělo ke zpřesnění výsledků (menší rozptyl hodnot) a také jsme se vyhnuli možným ztrátám vzorků při filtraci. Tato metodika je používána dodnes (Marek a kol. 1994, Kurasová a kol. 2002), a to nejen na pracovišti v Ostravě a Olomouci, ale byla poskytnuta i slovenským kolegům (RNDr. Lubica Ditmarová, Ph.D.) a kolegyním z Kanárských ostrovů. Problémů se zaváděním HPLC analýz ke stanovení pigmentů se objevila celá řada. V prvním kroku jsme používali starší typ HPLC sestavy (Spectra Physics, USA) a kolonu (ET 250/4 Nucleosil 120-5, C18), kterou uváděli Gilmore a Yamamoto (1991). Záznam chromatogramu byl na termocitlivý papír a oddělení zeaxantinu od luteinu nebylo dokonalé. Teprve po sdělení Dr. P. Jahnse, že uváděný typ kolon je značně nespolehlivý (kvalitní separace probíhá tak na 1 koloně z 10), jsme přešli na kolony 250/4 RP 18 LICHROCART (Merck, Německo), které mi osobně doporučil. V té době jsme již měli k dispozici nový HPLC systém (TSP Analytical, USA), který se skládal z isokratické pumpy, dávkovacího ventilu, PDAD (photo-diode-array-detector) UV-VIS detektoru (UV- 6000LP, TSP Analytical, USA) propojeného s PC a ovládaného pomocí programu ChromQuest pro Windows NT. Tento program navíc umožňuje záznam a zpracování naměřených chromatogramů (včetně absorpčních spekter podle předem zvoleného rozsahu vlnových délek). Vzhledem k tomu, že separace pigmentů probíhá pomocí dvou mobilních fází a přechod z jedné mobilní fáze na druhou je řešen gradientově, bylo nutno vyřešit modifikaci této metodiky pro isokratickou pumpu. Pomocí zakoupeného ventilu jsme ručně přepínali průtok z jedné mobilní fáze na druhou a výsledky byly spolehlivé i když měření bylo náročné na obsluhu (Kurasová a kol. 2002, Kurasová a kol. 2003a). Příklad konverze violaxantinu přes anteraxantin na zeaxantin je uveden na části chromatogramu (od 2. do 10. minuty), kdy jsou eluovány pigmenty xantofylového cyklu (V, A, Z) a neoxantin s luteinem (obr. 3.6.). Další úskalí metodiky HPLC bylo s odplyňováním mobilních fází. Nejprve jsme mobilní fáze probublávali héliem, ale vzhledem k ceně hélia jsme od tohoto přístupu upustili. Zjistili jsme, že mobilní fáze je možno odplynit vložením lahví do ultrazvukové lázně na dobu 10 minut. V současné době však již používáme odplyňovač mobilních fází SCM1000 (TSP Analytical, USA). 25

26 absorbance [mau] DAB LAB L V N Z A Retenční čas [min] Obr. 3.6.: Části chromatogramů (od 2. do 10. minuty) pro ječmen jarní aklimovaný na tmu (DAB černá křivka), kde je malé množství anteraxantinu (A) a žádný zeaxantin (Z), a 10 minut vystavený ozářenosti 1500 µmol m -2 s -1 (LAB červená křivka), kde je zřejmý pokles violaxantinu (V), nárůst anteraxantinu a značné množství zeaxantinu. N neoxantin, L lutein. Aby bylo možno zpracovávat celé série měření (v současné době cca 1000 analýz ročně), bylo nutno zautomatizovat a standardizovat HPLC metodiku, která by vedla ke standardizaci chromatogramů, a tudíž ke snazšímu a rychlejšímu získání výsledků analýz, kterých neustále přibývá. Proto byl zakoupen upgrade isokratické pumpy na gradientovou pumpu (P4000, TSP Analytical, USA) a dokoupen i autosampler (AS 3000, TSP Analytical, USA) a odplyňovač mobilní fáze (SCM1000, TSP Analytical, USA). V současné době tedy používáme gradientovou metodu (Štroch a kol. 2004). Vzhledem k tomu, že analýzy probíhají za nestejných okolních teplot v laboratoři (léto vs. zimní období), zjistili jsme posun retenčních časů jednotlivých pigmentů. Tato nejednotnost pak ztěžovala integraci jednotlivých píků pro vlastní výsledky. Podařilo se nám stabilizovat retenční časy temperací mobilních fází i kolony na 20 0 C (Kuldová a Kalina 2004). Při této teplotě nedochází k degradaci pigmentů v průběhu analýzy. Při hledání optimální metodiky HPLC jsme zjistili, že ředění mobilní fáze B, snížení anebo zvýšení průtoku mobilní fáze kolonou, neposkytuje kvalitnější výsledky HPLC analýzy. Proto byl zvolen postup, kdy do 10 minuty protéká mobilní fáze A (acetonitril, metanol a Tris-HCl v poměru 3:10:87, ph upraveno 4M NaOH na 8), následuje lineární gradient z mobilní fáze A na B mezi 10 až 12 minutou a od 12. do 25. minuty protéká mobilní fáze B (metanol a hexanu a v poměru 4:1) s průtokem 2 ml min -1. Díky standardizaci metodiky jsme se přesvědčili o skutečnosti, že pigmenty extrahované z jehlic smrku obsahují nejen anteraxantin, ale také jeho pravděpodobný stereoizomer. V současné době se snažíme o vysvětlení fyziologické funkce dvou předpokládaných forem anteraxantinu označených jako A1 a A2 (Kalina a kol. 2002) (obr. 3.7.). 26