ANTISERUM SALMONELLA URČENIE SÉROTYPU SALMONELY

Transkript

1 ANTISERUM SALMONELLA URČENIE SÉROTYPU SALMONELY 1. KLINICKÝ VÝZNAM Baktérie Salmonela spôsobujú niektoré infekcie, ktoré sa veľmi odlišujú, vzhľadom na mnohé za ne odpovedajúce sérotypy a variabilitu vyvolaných klinických príznakov. Rod Salmonela zahrňuje 2 poddruhy: S. bongori (20 sérovarov) a S. enterica (2 415 sérovarov). Druh S. enterica sa delí na 6 poddruhov: - S. enterica poddruh enterica (I alebo 1) - S. enterica poddruh salamae (II alebo 2) - S. enterica poddruh arizonae (IIIa alebo 3a) - S. enterica poddruh diarizonae (IIIb alebo 3b) - S. enterica poddruh houtenae (IV alebo 4) - S. enterica poddruh indica (VI alebo 6). Sérovary poddruhov enterica (1 435 sérovarov) predstavujú 99.5% všetkých izolovaných kmeňov (1). V Kauffmannovej-Whitovej schéme (1) sú sérovary klasifikované podľa kombinácie somatických antigénov (O) a flagelárnych antigénov (H) salmonel. Antigénne zloženie je určené pomocou aglutinačných sér (anti-o a anti-h). Skupina O Sérovary skupiny O, individualizované ako prvé, boli označené podľa abecedy, nasledovne bolo nutné pokračovať pomocou čísel. V súčasnosti je logickejšie určiť každú skupinu charakteristickým O faktorom. Ekvivalencia medzi abecednou nomenklatúrou a charakteristickým O faktorom Skupina abecedná nomenklatúra Skupina O- antigén Skupina abecedná nomenklatúra Skupina O- antigén Skupina abecedná nomenklatúra Skupina O- antigén A 2 I 16 R 40 B 4 J 17 S 41 C1 C2 C3 6, 7, 8 K 18 T 42 D 9 L 21 U 43 E1 E2 3, 10 M 28 V 44 E4 1, 3, 19 N 30 W 45 F 11 O 35 X 47 G1 G2 13 P 38 Y 48 H 6, 14 Q 39 Z POUŽITIE Antiséra salmonela (anti-o a anti-h) sú určené na sérologickú identifikáciu kultúr salmonely aglutinačnou metódou na sklíčku, pre epidemiologické a diagnostické účely. 3- PRINCÍP Test je založený na aglutinácii baktérií vykazujúcich odpovedajúce antigény pomocou špecifických antisér (anti-o a anti-h). Tieto antiséra sa získali imunizáciou králikov vybranými kmeňmi Salmonel. Monovalentné séra sú adsorbované za účelom zvýšenia ich špecificity. Sú membránovo filtrované s prídavkom azidu sodného o koncentrácii 0.1%. 1

2 1. Séra pre aglutináciu na sklíčkach a) O séra Polyvalentné O séra na uskutočňovanie sérotypizácie Tieto polyvalentné O séra nie sú adsorbované. Sú určené pre sérotypizáciu a doporučujú sa na detekciu salmonel v potravinárskych produktoch a v životnom prostredí. Podstatná časť (okolo 98%) salmonel vyskytujúcich sa u ľudí a teplokrvných živočíchov vykazuje O antigén odpovedajúci aglutinínom obsiahnutým v sérach OMA a OMB. O séra na určenie antigénneho zloženia Tieto séra sú určené na identifikáciu O skupiny. Musia byť použité postupne v logickom poradí (najprv polyvalentné, potom skupinovo špecifické, monovalentné, atď.), prípadne ako funkcia špecifických biochemických charakteristík (napr. sérotypy typhi a paratyphi A). Sekundárne O faktory sa skúmajú až v ďalších krokoch. Napríklad: - faktory O:7 a O:8 sa testujú len keď so sérom O:6, 7, 8 došlo k aglutinácii. - faktor O:15 sa testuje len keď so sérami O:3, 10, 15 došlo k aglutinácii. Iba aglutinácia s monovalentným O-sérom umožňuje identifikovať O skupinu. Anti-Vi sérum Vi antigén je teplotne labilný povrchový antigén, ktorý môže maskovať somatickú antigénnu aktivitu. Je vykazovaný prevažne kmeňmi S. typhi a menej často kmeňmi S. paratyphi C. Salmonely vykazujúce tento antigén nie sú aglutinované O antisérom. Pokiaľ testovaný kmeň neaglutinuje so zmesou sér OMA ani OMB, doporučuje sa vyskúšať tento kmeň s Vi sérom. Pokiaľ je výsledok reakcie pozitívny, zahrejte bakteriálnu suspenziu na 100 C po dobu 30 minút a opakujte test s polyvalentnými OMA a OMB sérami a následne s odpovedajúcimi monovalentnými sérami. b) H séra H séra na určenie sérotypu Podobne ako špecifické O séra, používajú sa najmä na identifikáciu veľmi odlišných sérotypov (potravinárska bakteriológia, bakteriológia životného prostredia). H séra na určenie antigénneho zloženia Tieto séra sa musia používať obdobným spôsobom ako O séra. Napríklad: - monovalentné séra H:2, H:5, H:6, H:7 sa používajú, ak s polyvalentným sérom H1 došlo k aglutinácii - monovalentné séra z10 a z15 sa používajú, ak s polyvalentným sérom HE došlo k aglutinácii, atď. 2. Fázovo inverzné séra Anti-H fázovo inverzné séra (Sven-Gardova metóda): Pokiaľ bakteriálna populácia vykazuje fázu 1 a 2 H antigénu v rovnocennom zastúpení, môžu byť tieto baktérie detegované a môže byť určený ich sérovar. Na druhej strane, ak môžu byť identifikované iba H antigény jednej fázy, je nutné určiť špecificitu druhej fázy použitím Sven-Gardovho fázovo inverzného agaru s prídavkom SG antiséra, ktoré obsahuje aglutinín už určenej fázy. Sven-Gardovo médium (kód 53431) je dostatočne mäkký agar, ktorý umožňuje pohyblivým salmonelám rozprestrieť sa po inokulácii do stredu Petriho misky po celom povrchu média počas inkubácie cez noc. 4- BALENIE Polyvalentné a monovalentné séra sú dodávané v 3 ml kvapkovacích fľaštičkách (60 testov). O-SÉRA Polyvalentné O séra na určenie sérotypu Polyvalentné séra Obsahujúce antigény skupín Odpovedajúci somatický O-antigén Antisérum Salmonela polyvalentné OMA A, B, D, E, L 1, 2,12 + 4, 5,12 + 9,12 + 9,46 + 3,10 + 3,15 + 1,3, Antisérum Salmonela polyvalentné OMB C, F, G, H 6, 7 + 6, , , , 14, , Antisérum Salmonela polyvalentné OMC I, J, K, M, N, O, P Antisérum Salmonela polyvalentné OMD Q, R, S, T, U, V, W Antisérum Salmonela polyvalentné OME X, Y, Z, Antisérum Salmonela polyvalentné OMF Antisérum Salmonela polyvalentné OMG Kód 2

3 Monovalentné O séra na určenie antigénneho zloženia Monovalentné séra Skupina Kód Monovalentné séra Skupina Kód O:1, 2 O:4,5 O:6,7,8 A O:3,10,15 E1, E B O: C O:1,3,19 E O: O:11 F O: O:13,22,23 G O:9 D O:6,14, Monovalentné antisérum Salmonella Vi (kód 60951) H SÉRA Polyvalentné H séra na určenie sérotypu Polyvalentné séra Odpovedajúci flagelárny antigén Kód Antisérum Salmonela polyvalentné HMA a + b + c + d + i + z10 + z Antisérum Salmonela polyvalentné HMB e, h + e, n, x + e, n, z15 +G Antisérum Salmonela polyvalentné HMC k + y + z + L + Z4 + r Antisérum Salmonela polyvalentné HMD z35 + z36 + z38 + z39 + z41 + z42 + z44 + z Antisérum Salmonela polyvalentné HMIII faktor H poddruhu III (Arizona) z52 + z53 + z54 + z55 + z57 + z Polyvalentné H séra na určenie antigénneho zloženia Polyvalentné séra Kód Antisérum Salmonela polyvalentné H1 H1 = 1,2 +1,5 + 1,6 + 1,7 + z Antisérum Salmonela polyvalentné HL HL = l, v + l, w + l, z13 + l, z28 + l, z Antisérum Salmonela polyvalentné HE HE = e, h + e, n, x + e, n, z Antisérum Salmonela polyvalentné HZ4 HZ4 = z4,z23 + z4,z24 + z4,z Antisérum Salmonela polyvalentné HG HG = f, g + g, p + g, m, s + g, m + m, t Monovalentné H séra na určenie antigénneho zloženia Monovalentné séra Kód H:r H:a H:v H:b H:w H:c H:x H:d H:y H:g, m H:z H:g, p H: z H:h H: z H:i H: H:k H: H:m H: H:p H:

4 Anti-H fázové inverzné séra (sven-gardova metóda) Polyvalentné séra Aglutiníny Kód Antisérum Salmonela SG1 a + b+ c+ z Antisérum Salmonela SG2 d + i + e, h Antisérum Salmonela SG3 k + y + l, v + l, w + l, z13 + l, z Antisérum Salmonela SG4 r + z Antisérum Salmonela SG5 e, n, x + e, n, z Antisérum Salmonela SG6 1, 2 + 1, 5 + 1, 6 + 1, 7 + z UCHOVÁVANIE Séra uchovávané pri +2-8 C sú stabilné aj po otvorení do dátumu exspirácie uvedeného na obale výrobku, ak nie sú kontaminované. 6- POTREBNÝ MATERIÁL, KTORÝ NIE JE SÚČASŤOU DODÁVKY Podložné mikroskopické sklíčko. Plastická alebo platinová očkovacia kľučka. Fyziologický roztok. 7- OCHRANA ZDRAVIA A BEZPEČNOSŤ PRÁCE Pri práci s biologickými produktmi používanými na aglutinačnú reakciu, rovnako tak aj pri ich likvidácii, dodržujte bežne používané techniky a zásady bezpečnosti práce s mikrobiologicky nebezpečným materiálom. Séra obsahujú < 0.1% azidu sodného. Azid sodný môže vytvárať s olovom alebo meďou obsiahnutou vo vodovodnom potrubí výbušné kovové azidy. Pri likvidácii týchto reagencií ich výdatne rieďte vodou, aby sa zabránilo tvorbe azidových usadenín. Reagencie nerieďte. 8- PRACOVNÝ POSTUP 1) Séra pre aglutináciu na sklíčkach Určenie sérotypu sa uskutočňuje po identifikácii druhu s čistou, čerstvou kultúrou salmonel, izolovanou na neselektívnom agarovom médiu. Kontrolný test robte s testovaným kmeňom vo fyziologickom roztoku: Naberte jednu očkovaciu kľučku kultúry salmonely. Tieto baktérie resuspendujte v kvapke fyziologického roztoku, vytvorte homogénnu suspenziu. Vo fyziologickom roztoku nesmie dôjsť k aglutinácii. V prípade, že je aglutinácia pozorovaná, jedná sa o samoaglutinujúci kmeň a test nie je možné pomocou antiséra interpretovať. Začnite s testovaním aglutinácie najprv s polyvalentnými sérami a následne špecifickými sérami podľa toho aká polyvalentná zmes vyvolala výraznú pozitívnu aglutináciu (polyvalentné O séra monovalentné O séra, polyvalentné H séra monovalentné H séra). Naneste 1 kvapku antiséra na mikroskopické podložné sklíčko. Odoberte jednu očkovaciu kľučku kultúry salmonely (pre detekciu H antigénov z najvlhšej zóny kultúry). Tieto baktérie resuspendujte v kvapke fyziologického roztoku, vytvorte homogénnu suspenziu postupným pridávaním baktérií ku séru. Pretrepte sklíčko jemnými krúživými pohybmi. Zmes prehliadnite proti tmavému pozadiu alebo lepšie pomocou konkávneho zrkadla. 2) Fázová inverzia Pridajte jednu kvapku SG-séra, obsahujúceho aglutinín už skôr určenej fázy, do rozohriateho Sven-Gardovho agaru (pri teplote cca 45 C). Premiešajte médium krúživými pohybmi a vytvorte homogénnu zmes, ktorú nalejete do Petriho misky. Pokiaľ po stuhnutí agaru zostanú na povrchu nejaké kvapky skondenzovanej vody, čiastočne odkryte Petriho misku a nechajte agar vysušiť. Do stredu Petriho misky husto naočkujte 3 až 4 kolónie salmonel z čistej a čerstvej kultúry na agarovom médiu. Inkubujte 18 hodín pri 37 C (Petriho miska je otočená hore dnom). Sledujte aglutináciu s anti H sérom na okrajoch zón invázie baktérií do agaru (viď. postup). 4

5 Príklad : V testovanej kultúre salmonely boli identifikované antigény O:4,5 a H:1,2. Pre fázovú inverziu použijeme sérum SG6 (1,2 + 1,5 + 1,7 + z6). Nasledujúci deň aglutinácia s: - anti-h:i sérom indikuje prítomnosť Salmonella typhimurium (O : 1, 4, [5], 12 H : i :1,2) - anti-h:b sérom indikuje prítomnosť Salmonella paratyphi B (O : 1, 4, [5], 12 H : b :1,2) 9- INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV O pozitívnu reakciu sa jedná v prípade, keď sa aglutinácia objaví maximálne do jednej minúty. O aglutinácia je jemná a pravidelná, ľahko odlíšiteľná od slabo emulzifikovaných fragmentov bakteriálnych kolónií. Poznámka: Akákoľvek O-aglutinujúca kultúra salmonel bude okamžite aglutinovať s jedným z polyvalentných sér. Viac oneskorená a menej intenzívna aglutinácia musí nastať s jedným alebo viacerými inými sérami. Pokiaľ kmeň baktérií salmonela neaglutinuje ani s OMA ani s OMB sérami, doporučuje sa urobiť test tohto kmeňa s Visérom. S. typhi formy V neaglutinuje s O sérami pokiaľ je živá, aglutinuje iba po zahriatí suspenzie.. HMA, HMB, HMC, a HMD séra neobsahujú O aglutiníny, avšak O aglutiníny pretrvávajú v HM III sére. Pokiaľ je kultúra aglutinovaná týmto sérom, skutočná príčina H aglutinácie musí byť potvrdená pridaním jednej kvapky HM III séra k 1 ml bakteriálnej suspenzie. Po 2 hodinách pri 37 C vo vodnom kúpeli by mala byť zrejmá vločkovitá aglutinácia s kmeňom vykazujúcim antigén odpovedajúci protilátke tohto séra. Bakteriálny kmeň vykazujúci H:g faktor je aglutinovaný H:g,m sérom a H:g,p sérom. H1 sérum sa používa na detekciu kmeňov s H antigénmi v nešpecifickej fáze 2 (1, 2 alebo 1, 5 alebo 1, 7). 10- ÚČINNOSŤ TESTU/KONTROLA KVALITY Aktivita polyvalentných a monovalentných antisér Salmonella je kontrolovaná pomocou nasledujúcich pozitívnych kmeňov: O-SÉRA Sérum Bakteriálny kmeň Antigénna štruktúra OMA Paratyphi A (O:1,2,12 H:a : [1,5]) OMB Newport (O:6,8,20 H:e,h : 1,2 [z67]) OMC Tel Aviv (O:28 H:y : e,n,z15) OMD Champaign (O:39 H:k :1,5) OME Bergen (O: 47, H: i : e,n,z15) OMF Uccle (O: 3,54 H: g,s,t : -) OMG IIIa (Arizona) (O:63 H: g, z51 : -) O:1, 2 Paratyphi A (O:1,2,12 H:a : [1,5]) O:4, 5 Typhimurium (O:1,4,[5],12 H:i :1,2) O:6, 7, 8 Newport (O:6,8,20 H:e,h :1,2 [z67]) O:7 Braenderup (O:6,7,14 H:e,h : e,n,z15) O:8 Blockley (O:6,8 H:k : 1,5) O:9 Enteritidis (O:1,9,12 H: g,m : -) O:3, 10, 15 London (O:3,10 [15] H:l,v : 1,6) O:15 Strasbourg (O:9,46 H:d : 1,7) O:1, 3, 19 Senftenberg (0:1,3,19 H:g,[s],t : -) O:11 Aberdeen (O:11 H: i : 1,2) O:13, 22, 23 Grumpensis (O:1,13,23 H:d :1,7) O:6, 14, 24 Carrau (O:6,14,[24] H:y :1,7) 5

6 VI-SÉRA Sérum Bakteriálny kmeň Antigénna štruktúra Vi Typhi (0:9,12,[Vi] H:d : -) FÁZOVO INVERZNÉ SÉRA Sérum Bakteriálny kmeň Antigénna štruktúra SG 1 Paratyphi A (O:1,2,12 H: a : [1,5]) SG 2 Newport (O:6,8,20 H:e,h :1,2 [z67]) SG 3 Thompson (O:6,7,14 H:k :1,5) SG 4 Heidelberg (O:1,4,[5],12 H: r : 1,2) SG 5 Abortusequi (O:4,12 H: - : e,n,x) SG 6 Typhimurium (O:1,4,[5],12 H: i :1,2) H-SÉRA Sérum Bakteriálny kmeň Antigénna štruktúra HMA Paratyphi A (O:1,2,12H: a : [1,5]) HMB Enteritidis (O:1,9,12 H: g,m : -) HMC Blockley (O:6,8 H: k : 1,5) HMD Fresno (O:9,46H: z38 : -) HM III IIIb (Arizona) (O:65 H: c: z53) H1 Bovismorbificans (O:6,8,20 H: r,[i] : 1,5) HL Livingstone (O:6,7,14 H: d : l,w) HE Newport (O:6,8,20 H: e,h : 1,2) HZ4 Dusseldorf (O:6,8 H: z4, z24 : -) HG Dublin (O:1,9,12 [Vi] H: g,p : -) a Paratyphi A (O:1,2,12 H: a : [1,5]) b Paratyphi B (O:1,4,[5],12 H: b : 1,2) c Paratyphi C (O:6,7,[Vi] H: c: 1,5) d Livingstone (O:6,7,14 H: d : l,w) g, m Enteritidis (O:1,9,12 H: g,m : -) g, p Dublin (O:1,9,12 [Vi] H: g,p : -) h Newport (O:6,8,20 H: e,h : 1,2 [z67]) i Typhimurium (O:1,4,[5],12 H: i : 1,2) k Blockley (O:6,8 H: k : 1,5) m Enteritidis (O:1,9,12 H: g,m : -) p Dublin (O:1,9,12 [Vi] H: g,p : -) r Infantis (O:6,7,14 H: r : 1,5) v London (O:3,10 [15] H: l,v : 1,6) w Meleagridis (O:3,10 [15][15, 34] H: e,h : l,w) x Abony (O:1,4,[5],12,27 H: b : e,n,x) y Carrau (O:6,14,[24] H: y :1,7) z Worthington (O:1,13,23 H: z :l,w) z10 Lexington (O:3,10,[15] [15,34]H: z10 :1,5) z15 Brandenburg (O:1,4,[5],12,27 H:l,v:e,n,z15) 2 Newport (O:6,8,20 H: e,h : 1,2 [z67]) 5 Infantis (O:6,7,14 H: r : 1,5) 6 London (O:3,10 [15] H: l,v : 1,6) 7 Carrau (O:6,14,[24] H: y :1,7) 6

7 11- KONTROLA KVALITY USKUTOČŇOVANÁ VÝROBCOM Všetky vyrábané a komercionalizované reagencie sú kontrolované kompletným systémom kontroly kvality začínajúcim od prijatia surovín až po komercializáciu produktu. Každá šarža sa podrobuje kontrole kvality a je uvolnená na trh len vtedy, keď odpovedá stanoveným kritériám. Dokumentácia vzťahujúca sa k výrobe a kontrole každej jednotlivej šarže je uchovávaná spoločnosťou Bio-Rad. 12- OBMEDZENIA Vlastnému určeniu sérotypu musí predchádzať identifikácia bakteriálneho druhu. Definitívnu sérologickú identifikáciu umožní len kompletné určenie sérotypu O a H antigénov. 13- NAJČASTEJŠIE SA VYSKYTUJÚCE SÉROTYPY Najčastejšie izolované salmonely sú Salmonella enteritidis a Salmonella typhimurium. Skupina B (O: 4) O H Abony 1,4,[5],12,27 b e,n,x Agona 1,4,12,27 f,g,s [1,2] Brandenburg 1,4,[5],12,27 l,v e,n,z15 Bredeney 1,4,12,27 l,v 1,7 Coeln 1,4,[5],12 y 1,2 Derby 1,4,[5],12 f,g [1,2] Heidelberg 1,4,[5],12 r 1,2 Indiana 1,4,12 z 1,7 Paratyphi B 1,4,[5],12 b 1,2 Saintpaul 1,4,[5],12 e,h 1,2 Schwarzengrund 1,4,12,27 d 1,7 Stanley 1,4,[5],12,27 d 1,2 Typhimurium 1,4,[5],12 i 1,2 Skupina E1 - E2 (O: 3, 10-3, 15) Anatum 3,10 [15][15, 34] e,h 1,6 London 3,10 [15] l,v 1,6 Meleagridis 3,10 [15][15, 34] e,h l,w Muenster 3,10 [15][15, 34] e,h 1,5 Groupe E4 (O: 1, 3, 19) Senftenberg 1,3,19 g,[s],t - Skupina A (O: 1, 2) Paratyphi A 1,2,12 a [1,5] 7

8 Skupina D1 (O: 9) O H Dublin 1,9,12 [Vi] g,p Enteritidis 1,9,12 g,m - Napoli 1,9,12 l,z13 e,n,x Panama 1,9,12 l,v 1,5 Typhi 9,12,[Vi] d - Skupina C1 (O: 6, 7) Braenderup 6,7,14 e,h e,n,z15 Infantis 6,7,14 r 1,5 Livingstone 6,7,14 d l,w Mbandaka 6,7,14 z10 e,n,z15 Montevideo 6,7,14 g,m,[p],s [1,2,7] Ohio 6,7,14 b l,w Thompson 6,7,14 k 1,5 Virchow 6,7 r 1,2 Skupina C2 - C3 (O: 6, 8) Blockley 6,8 k 1,5 Bovismorbificans 6,8,20 r,[i] 1,5 Goldcoast 6,8 r l,w Hadar 6,8 z10 e,n,x Kottbus 6,8 e,h 1,5 Litchfield 6,8 l,v 1,2 Muenchen 6,8 d 1,2 [z67] Newport 6,8,20 e,h 1,2 [z67] Podtrhnuté O faktory (napr.: 1, 4, 12): faktory ktorých prítomnosť závisí na konverzii bakteriofágom. Sú prítomné len v prípade lyzogénneho pôsobenia príslušného bakteriofága. Faktory v hranatých zátvorkách (napr.: 5, 15, [Vi]): chromozomálne určený faktor, ktorý môže chýbať alebo byť prítomný, bez toho, aby zmenil sérotypovú diagnózu. 14- REFERENCES 1. POPOFF M. Y., LE MINOR L., 1997, Antigenic formulas of the Salmonella serovars, 7t h revision. WHO collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella. Institut Pasteur, Paris, France. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) Fax : +33 (0) /08 8