ANTISERUM SALMONELLA URČENÍ SÉROTYPU SALMONELY

Transkript

1 ANTISERUM SALMONELLA URČENÍ SÉROTYPU SALMONELY 1. KLINICKÝ VÝZNAM Bakterie Salmonela způsobují některé infekce, které se velmi odlišují, vzhledem k mnoha odpovědným sérotypům a variabilitou vyvolaných klinických příznaků. Rod Salmonela zahrnuje 2 poddruhy: S. bongori (20 sérovarů) a S. enterica (2 415 sérovarů). Druh S. enterica se dělí na 6 poddruhů: - S. enterica subsp. enterica (I nebo 1) - S. enterica subsp. salamae (II nebo 2) - S. enterica subsp. arizonae (IIIa nebo 3a) - S. enterica subsp. diarizonae (IIIb nebo 3b) - S. enterica subsp. houtenae (IV nebo 4) - S. enterica subsp. indica (VI nebo 6). Sérovary poddruhů enterica (1,435 sérovarů) představují 99.5% všech izolovaných kmenů (1). V Kauffmann-Whitově schématu (1) jsou sérovary klasifikovány podle kombinace somatických antigenů (O) a flagelárních antigenů (H) salmonel Antigenní složení je určeno pomocí aglutinačních sér (anti-o a anti-h). O Sérovary skupiny O, individualizované jako první, byly označeny abecedně, následovně bylo nutno pokračovat použitím čísel. Nyní je logičtější určit každou skupinu charakteristickým O faktorem. Ekvivalence mezi abecední nomenklaturou a charakteristickým O faktorem abecední nomenklatura O-antigen abecední nomenklatura O-antigen abecední nomenklatura O-antigen A 2 I 16 R 40 B 4 J 17 S 41 C1 C2 C3 6, 7, 8 K 18 T 42 D 9 L 21 U 43 E1 E2 3, 10 M 28 V 44 E4 1, 3, 19 N 30 W 45 F 11 O 35 X 47 G1 G2 13 P 38 Y 48 H 6, 14 Q 39 Z POUŽITÍ Antiséra Salmonela (anti-o a anti-h) jsou určena k sérologické identifikaci kultur salmonely aglutinační metodou na sklíčku, pro epidemiologické a diagnostické účely. 3- PRINCIP Test je založen na aglutinaci bakterií vykazujících odpovídající antigeny pomocí specifických antisér (anti-o a anti-h). Tato antiséra jsou získána imunizací králíků vybranými kmeny Salmonel. Monovalentní séra js LITERATURA ou adsorbována za účelem zvýšení jejich specificity. Jsou membránově filtrována s přídavkem azidu sodného o koncentraci 0.1%. 1. Séra pro aglutinaci na sklíčkách a) O séra Polyvalentní O séra k provádění sérotypizace Tato polyvalentní O séra nejsou adsorbována. Jsou určena pro sérotypizaci a v podstatě doporučena pro detekci salmonel v potravinářských produktech a v životním prostředí. Podstatná část (okolo 98%) salmonel vyskytujících se u lidí a teplokrevných živočichů vykazuje O antigen odpovídající aglutininům obsažených v sérech OMA a OMB. 1

2 O séra pro určení antigenního složení Tato séra jsou určena k identifikaci O skupiny. Musí být použity postupně v logickém pořadí (nejprve polyvalentní, pak skupinově specifické, monovalentní, atd.), eventuálně jako funkce specifických biochemických charakteristik (např. sérotypy typhi a paratyphi A). Sekundární O faktory jsou zkoumány až v dalších krocích. Například: - faktory O:7 a O:8 se testují pouze pokud se sérem O:6, 7, 8 došlo k aglutinaci. - faktor O:15 se testuje pouze pokud se séry O:3, 10, 15 došlo k aglutinaci.. Pouze aglutinace s monovalentním O-sérem umožňuje identifikovat O skupinu. Anti-Vi sérum Vi antigen je teplotně labilní povrchový antigen, který může maskovat somatickou antigenní aktivitu. Je vykazován převážně kmeny S. typhi a méně často kmeny S. paratyphi C. Salmonely vykazující tento antigen nejsou aglutinovány O antisérem. Pokud testovaný kmen neaglutinuje se směsí sér OMA ani OMB, je doporučeno vyzkoušet tento kmen s Vi sérem. Pokud je výsledek reakce pozitivní, zahřejte bakteriální suspenzi na 100 C po dobu 30 minut a opakujte test s polyvalentními OMA a OMB séry a následně s odpovídajícími monovalentními séry. b) H séra H séra k určení sérotypu Podobně jako specifická O séra, zejména se používají k identifikaci velmi odlišných sérotypů (potravinářská bakteriologie, bakteriologie životního prostředí). H séra pro určení antigenního složení Tato séra musí být používána obdobným způsobem jako O séra. Například: - monovalentní séra H:2, H:5, H:6, H:7 se používají, jestliže s polyvalentním sérem H1 došlo k aglutinaci - monovalentní séra z10 a z15 se používají, jestliže s polyvalentním sérem HE došlo k aglutinaci, atd 2. Fázově inverzní séra Anti-H fázově inverzní séra (Sven-Gardova metoda): Pokud bakteriální populace vykazuje fázi 1 fázi 2 H antigenu v rovnocenném zastoupení, mohou být tyto bakterie detekovány a určen jejich sérovar. Na druhou stranu,jestliže mohou být identifikovány H antigeny pouze jedné fáze, je nutné určit specifitu druhé fáze použitím Sven-Gardova fázově inverzního agaru s přídavkem SG antiséra, které obsahuje aglutinin již určené fáze. Sven-Gardovo médium (kód 53431) je dostatečně měkký agar umožňující pohyblivým salmonel ám po inokulaci do středu Petriho misky se rozprostřít po celém povrchu média během inkubace přes noc. 4- BALENÍ Polyvalentní a monovalentní séra jsou dodávána ve 3ml kapacích lahvičkách (60 testů). O-SÉRA Polyvalentní O séra k určení sérotypu Polyvalentní séra Antiserum Salmonella polyvalent OMA Antiserum Salmonella polyvalent OMB Obsahující antigeny skupin A, B, D, E, L C, F, G, H Odpovídající somatický O-antigen 1, 2,12 + 4, 5,12 + 9,12 + 9,46 + 3,10 + 3,15 + 1,3, , 7 + 6, , , , 14, , 20 Antiserum Salmonella polyvalent OMC I, J, K, M, N, O, P Antiserum Salmonella polyvalent OMC Q, R, S, T, U, V, W Antiserum Salmonella polyvalent OME X, Y, Z, Antiserum Salmonella polyvalent OMF Antiserum Salmonella polyvalent OMG Monovalentní O séra pro určení antigenního složení Kód Monovalentní séra Kód Monovalentní séra Kód Antiserum Salmonella monovalent O:1, A Antiserum Salmonella monovalent O:3, 10, 15 E1, E Antiserum Salmonella monovalent O:4,5 B Antiserum Salmonella monovalent O: Antiserum Salmonella monovalent O:6,7,8 C Antiserum Salmonella monovalent O:1, 3, 19 E Antiserum Salmonella monovalent O: Antiserum Salmonella monovalent O:11 F Antiserum Salmonella monovalent O: Antiserum Salmonella monovalent O:13, 22, G Antiserum Salmonella monovalent O:9 D Antiserum Salmonella monovalent O:6, 14, Monovalentní antisérum Salmonella Vi (kód 60951) 2

3 H SÉRA Polyvalentní H séra k určení sérotypu Polyvalentní séra Odpovídající flagelární antigen Kód Antiserum Salmonella polyvalent HMA a + b + c + d + i + z10 + z Antiserum Salmonella polyvalent HMB e, h + e, n, x + e, n, z15 +G Antiserum Salmonella polyvalent HMC k + y + z + L + Z4 + r Antiserum Salmonella polyvalent HMD z35 + z36 + z38 + z39 + z41 + z42 + z44 + z Antisérum Salmonela polyvalentní HMIII faktor H subspecie III (Arizona) Polyvalentní H séra pro určení antigenního složení Polyvalentní séra z52 + z53 + z54 + z55 + z57 + z Antiserum Salmonella polyvalent H1 H1 = 1,2 +1,5 + 1,6 + 1,7 + z Antiserum Salmonella polyvalent HL HL = l, v + l, w + l, z13 + l, z28 + l, z Antiserum Salmonella polyvalent HE HE = e, h + e, n, x + e, n, z Antiserum Salmonella polyvalent HZ4 HZ4 = z4,z23 + z4,z24 + z4,z Antiserum Salmonella polyvalent HG HG = f, g + g, p + g, m, s + g, m + m, t Monovalentní H séra pro určení antigenního složení Kód Monovalentní séra Kód Antiserum Salmonella monovalent H:r Antiserum Salmonella monovalent H:a Antiserum Salmonella monovalent H:v Antiserum Salmonella monovalent H:b Antiserum Salmonella monovalent H:w Antiserum Salmonella monovalent H:c Antiserum Salmonella monovalent H:x Antiserum Salmonella monovalent H:d Antiserum Salmonella monovalent H:y Antiserum Salmonella monovalent H:g, m Antiserum Salmonella monovalent H:z Antiserum Salmonella monovalent H:g, p Antiserum Salmonella monovalent H: z Antiserum Salmonella monovalent H:h Antiserum Salmonella monovalent H: z Antiserum Salmonella monovalent H:i Antiserum Salmonella monovalent H: Antiserum Salmonella monovalent H:k Antiserum Salmonella monovalent H: Antiserum Salmonella monovalent H:m Antiserum Salmonella monovalent H: Antiserum Salmonella monovalent H:p Antiserum Salmonella monovalent H: Anti-H fázová inversní séra (sven-gardova metoda) Polyvalentní séra Aglutininy Kód Antiserum Salmonella SG1 a + b+ c+ z Antiserum Salmonella SG2 d + i + e, h Antiserum Salmonella SG3 k + y + l, v + l, w + l, z13 + l, z Antiserum Salmonella SG4 r + z Antiserum Salmonella SG5 e, n, x + e, n, z Antiserum Salmonella SG6 1, 2 + 1, 5 + 1, 6 + 1, 7 + z UCHOVÁVÁNÍ Séra uchovávaná při +2-8 C jsou stabilní i po otevření do data exspirace uvedeného na obalu výrobku, jestliže nejsou kontaminována. 6- POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY Podložní mikroskopické sklíčko. Plastická nebo platinová očkovací klička. Fyziologický roztok. 3

4 7- OCHRANA ZDRAVÍ A BEZPEČNOST PRÁCE Dodržujte běžně používané techniky a zásady bezpečnosti práce s mikrobiologicky nebezpečným materiálem při práci s biologickými produkty používanými k aglutinační reakci, stejně tak i při jejich likvidaci. Séra obsahují < 0.1% azidu sodného. Azid sodný může vytvářet s olovem nebo mědí obsaženou ve vodovodním potrubí výbušné kovové azidy. Při likvidaci těchto reagencií je hojně řeďte vodou, aby se zabránilo tvorbě azidových usazenin. Neřeďte reagencie. 8- PRACOVNÍ POSTUP 1) Séra pro aglutinaci na sklíčkách Určení sérotypu se provádí po identifikaci druhu s čistou, čerstvou kulturou salmonel, izolovanou na neselektivním agarovém médiu. Kontrolní test provádějte s testovaným kmenem ve fyziologickém roztoku: Naberte jednu očkovací kličku kultury salmonely. Tyto bakterie resuspendujte v kapce fyziologického roztoku, vytvořte homogenní suspenzi. Ve fyziologickém roztoku nesmí dojít k aglutinaci. Jestliže je pozorována aglutinace jedná se o samoaglutinující kmen a test pomocí antiséra není možno interpretovat. Začněte s testováním aglutinace nejprve s polyvalentními séry a následně specifickými séry podle toho jaká polyvalentní směs vyvolala výraznou pozitivní aglutinaci (polyvalentní O séra monovalentní O séra, polyvalentní H séra monovalentní H séra). Naneste 1 kapku antiséra na mikroskopické podložní sklíčko. Odeberte jednu očkovací kličku kultury salmonely (pro detekci H antigenů z nejvlhčí zóny kultury). Tyto bakterie resuspendujte v kapce fyziologického roztoku, vytvořte homogenní suspenzi postupným přidáváním baktérií k séru. Protřepejte sklíčko jemnými krouživými pohyby. Směs prohlédněte proti tmavému pozadí nebo lépe za pomoci konkávního zrcadla. 2) Fázová inverze Přidejte jednu kapku SG-séra, obsahujícího aglutinin již dříve určené fáze, do rozehřátého Sven-Gardova agaru (při teplotě cca 45 C). Promíchejte médium krouživými pohyby a vytvořte homogenní směs, kterou nalijete do Petriho misky. Pokud po ztuhnutí agaru zůstanou na povrchu nějaké kapky zkondenzované vody, částečně odkryjte Petriho misku a nechte agar vysušit. Hustě naočkujte do středu Petriho misky, 3 až 4 kolonie salmonel z čisté a čerstvé kultury na agarovém médiu. Inkubujte 18 hodin při 37 C (Petriho miska je otočena dnem vzhůru). Sledujte aglutinaci s anti H sérem na okrajích zón invaze bakterií do agaru (viz. postup). Příklad: V testované kultuře salmonely byly identifikovány antigeny O:4,5 a H:1,2. Pro fázovou inverzi použijeme sérum SG6 (1,2 + 1,5 + 1,7 + z6). Druhý den aglutinace s: - anti-h:i sérem indikuje přítomnost Salmonely typhimurium (O : 1, 4, [5], 12 H : i :1,2) - anti-h:b sérem indikuje přítomnost Salmonely paratyphi B (O : 1, 4, [5], 12 H : b :1,2) 9- INTERPRETACE VÝSLEDKŮ O positivní reakci se jedná v případě, kdy se aglutinace objeví maximálně do jedné minuty. O aglutinace je jemná a pravidelná, snadno odlišitelná od slabě emulsifikovaných fragmentů bakteriálních kolonií. Poznámka: Jakákoliv O-aglutinující kultura salmonel bude okamžitě aglutinovat s jedním z polyvalentních sér. Více opožděná a méně intenzivní aglutinace musí nastat s jedním nebo několika jinými séry. Pokud kmen bakterií Salmonela neaglutinuje ani s OMA ani s OMB séry, doporučuje se provést test tohoto kmenu s Visérem. S. typhi formy V neaglutinuje s O séry pokud je živá, aglutinuje pouze po zahřátí suspenze. HMA, HMB, HMC, a HMD séra neobsahují O aglutininy, ale O aglutininy přetrvávají v HM III séru. Pokud je kultura aglutinována tímto sérem, pravá příčina H aglutinace musí být potvrzena přidáním jedné kapky HMIII séra k 1 ml bakteriální suspense. Po 2 hodinách při 37 C ve vodní lázni by měla být patrná vločkovitá aglutinace s kmenem vykazujícím antigen odpovídající protilátce tohoto séra. Bakteriální kmen vykazující H:g faktor je aglutinován H:g,m sérem a H:g,p sérem. H1 sérum se používá k detekci kmenů s H antigeny v nespecifické fázi 2 (1, 2 nebo 1, 5 nebo 1, 7). 4

5 10- ÚČINNOST TESTU/KONTROLA KVALITY Aktivita polyvalentních a monovalentních antisér Salmonella je kontrolována pomocí následujících positivních kmenů : O-SÉRA Sérum Bakteriální kmen Antigenní struktura OMA Paratyphi A (O:1,2,12 H:a : [1,5]) OMB Newport (O:6,8,20 H:e,h : 1,2 [z67]) OMC Tel Aviv (O:28 H:y : e,n,z15) OMD Champaign (O:39 H:k :1,5) OME Bergen (O: 47, H: i : e,n,z15) OMF Uccle (O: 3,54 H: g,s,t : -) OMG IIIa (Arizona) (O:63 H: g, z51 : -) O:1, 2 Paratyphi A (O:1,2,12 H:a : [1,5]) O:4, 5 Typhimurium (O:1,4,[5],12 H:i :1,2) O:6, 7, 8 Newport (O:6,8,20 H:e,h :1,2 [z67]) O:7 Braenderup (O:6,7,14 H:e,h : e,n,z15) O:8 Blockley (O:6,8 H:k : 1,5) O:9 Enteritidis (O:1,9,12 H: g,m : -) O:3, 10, 15 London (O:3,10 [15] H:l,v : 1,6) O:15 Strasbourg (O:9,46 H:d : 1,7) O:1, 3, 19 Senftenberg (0:1,3,19 H:g,[s],t : -) O:11 Aberdeen (O:11 H: i : 1,2) O:13, 22, 23 Grumpensis (O:1,13,23 H:d :1,7) O:6, 14, 24 Carrau (O:6,14,[24] H:y :1,7) VI-SÉRA Sérum Bakteriální kmen Antigenní struktura Vi Typhi (0:9,12,[Vi] H:d : -) FÁZOVÁ INVERZNÍ SÉRA Sérum Bakteriální kmen Antigenní struktura SG 1 Paratyphi A (O:1,2,12 H: a : [1,5]) SG 2 Newport (O:6,8,20 H:e,h :1,2 [z67]) SG 3 Thompson (O:6,7,14 H:k :1,5) SG 4 Heidelberg (O:1,4,[5],12 H: r : 1,2) SG 5 Abortusequi (O:4,12 H: - : e,n,x) SG 6 Typhimurium (O:1,4,[5],12 H: i :1,2) 5

6 H-SÉRA Sérum Bakteriální kmen Antigenní struktura HMA Paratyphi A (O:1,2,12H: a : [1,5]) HMB Enteritidis (O:1,9,12 H: g,m : -) HMC Blockley (O:6,8 H: k : 1,5) HMD Fresno (O:9,46H: z38 : -) HM III IIIb (Arizona) (O:65 H: c: z53) H1 Bovismorbificans (O:6,8,20 H: r,[i] : 1,5) HL Livingstone (O:6,7,14 H: d : l,w) HE Newport (O:6,8,20 H: e,h : 1,2) HZ4 Dusseldorf (O:6,8 H: z4, z24 : -) HG Dublin (O:1,9,12 [Vi] H: g,p : -) a Paratyphi A (O:1,2,12 H: a : [1,5]) b Paratyphi B (O:1,4,[5],12 H: b : 1,2) c Paratyphi C (O:6,7,[Vi] H: c: 1,5) d Livingstone (O:6,7,14 H: d : l,w) g, m Enteritidis (O:1,9,12 H: g,m : -) g, p Dublin (O:1,9,12 [Vi] H: g,p : -) h Newport (O:6,8,20 H: e,h : 1,2 [z67]) i Typhimurium (O:1,4,[5],12 H: i : 1,2) k Blockley (O:6,8 H: k : 1,5) m Enteritidis (O:1,9,12 H: g,m : -) p Dublin (O:1,9,12 [Vi] H: g,p : -) r Infantis (O:6,7,14 H: r : 1,5) v London (O:3,10 [15] H: l,v : 1,6) w Meleagridis (O:3,10 [15][15, 34] H: e,h : l,w) x Abony (O:1,4,[5],12,27 H: b : e,n,x) y Carrau (O:6,14,[24] H: y :1,7) z Worthington (O:1,13,23 H: z :l,w) z10 Lexington (O:3,10,[15] [15,34]H: z10 :1,5) z15 Brandenburg (O:1,4,[5],12,27 H:l,v:e,n,z15) 2 Newport (O:6,8,20 H: e,h : 1,2 [z67]) 5 Infantis (O:6,7,14 H: r : 1,5) 6 London (O:3,10 [15] H: l,v : 1,6) 7 Carrau (O:6,14,[24] H: y :1,7) 11- KONTROLA KVALITY PROVÁDĚNÁ VÝROBCEM Všechny vyráběné a komercionalizované reagencie jsou kontrolovány kompletním systémem kontroly kvality začínajícím od přijetí surovin až po komercionalizaci produktu. Každá šarže je podrobena kontrole kvality a je uvolněna na trh pouze tehdy, jestliže odpovídá stanoveným kritériím. Dokumentace vztahující se k výrobě a kontrole každé jednotlivé šarže jsou uchovávány společností Bio-Rad. 12- MEZE UŽITÍ Vlastnímu určení sérotypu musí předcházet identifikace bakteriálního druhu. Definitivní sérologickou identifikaci umožní pouze kompletní určení sérotypu O a H antigenů. 6

7 13- NEJČASTĚJI SE VYSKYTUJÍCÍ SÉROTYPY Nejčastěji izolované salmonely jsou Salmonela enteritidis a Salmonela typhimurium. B (O: 4) O H Abony 1,4,[5],12,27 b e,n,x Agona 1,4,12,27 f,g,s [1,2] Brandenburg 1,4,[5],12,27 l,v e,n,z15 Bredeney 1,4,12,27 l,v 1,7 Coeln 1,4,[5],12 y 1,2 Derby 1,4,[5],12 f,g [1,2] Heidelberg 1,4,[5],12 r 1,2 Indiana 1,4,12 z 1,7 Paratyphi B 1,4,[5],12 b 1,2 Saintpaul 1,4,[5],12 e,h 1,2 Schwarzengrund 1,4,12,27 d 1,7 Stanley 1,4,[5],12,27 d 1,2 Typhimurium 1,4,[5],12 i 1,2 E1 - E2 (O: 3, 10-3, 15) Anatum 3,10 [15][15, 34] e,h 1,6 London 3,10 [15] l,v 1,6 Meleagridis 3,10 [15][15, 34] e,h l,w Muenster 3,10 [15][15, 34] e,h 1,5 Groupe E4 (O: 1, 3, 19) Senftenberg 1,3,19 g,[s],t - A (O: 1, 2) Paratyphi A 1,2,12 a [1,5] D1 (O: 9) O H Dublin 1,9,12 [Vi] g,p Enteritidis 1,9,12 g,m - Napoli 1,9,12 l,z13 e,n,x Panama 1,9,12 l,v 1,5 Typhi 9,12,[Vi] d - 7

8 C1 (O: 6, 7) Braenderup 6,7,14 e,h e,n,z15 Infantis 6,7,14 r 1,5 Livingstone 6,7,14 d l,w Mbandaka 6,7,14 z10 e,n,z15 Montevideo 6,7,14 g,m,[p],s [1,2,7] Ohio 6,7,14 b l,w Thompson 6,7,14 k 1,5 Virchow 6,7 r 1,2 C2 - C3 (O: 6, 8) Blockley 6,8 k 1,5 Bovismorbificans 6,8,20 r,[i] 1,5 Goldcoast 6,8 r l,w Hadar 6,8 z10 e,n,x Kottbus 6,8 e,h 1,5 Litchfield 6,8 l,v 1,2 Muenchen 6,8 d 1,2 [z67] Newport 6,8,20 e,h 1,2 [z67] Podtrhnuté O faktory (např.: 1, 4, 12): faktory jejichž přítomnost je závislá na konverzi bakteriofágem. Jsou přítomny pouze v případě lyzogenního působení příslušného bakteriofága. Faktory v hranatých závorkách (např.: 5, 15, [Vi]): chromosomálně určený faktor, který může chybět nebo být přítomen, aniž by změnil sérotypovou diagnosu. 14- LITERATURA 1. POPOFF M. Y., LE MINOR L., 1997, Antigenic formulas of the Salmonella serovars, 7 th revision. WHO collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella. Institut Pasteur, Paris, France. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) Fax : +33 (0) /08 8