Vstup pro syntézu oligonukleotid a kontrola istoty

Transkript

1 1 stup pro syntézu oligonukleotid a kontrola istoty Úloha do laboratorního cviení Speciální metody pro 4. roník odborné chemie, jarní semestr 2007/ Historie kapalinové chromatografie Botanik Cvet dlí na sloupci sorbentu listová barviva Nobelova cena Martin, Synge v oboru chromatografie té dob se používají kolony s rozmrem ástic d p = µm, tok vlivem gravitaní síly, odebírání frakcí eluátu a stanovení obsahu dlených látek ve frakcích se dje nejastji kolorimetricky Nevýhody - pracnost, zdlouhavost a malá úinnost té dob se také rozvíjí plynová chromatografie (GC), jak v technice tak i v teorii. Pevzetí poznatk z plynové chromatografie a uplatnní souasného stavu pístrojové techniky znamenaly revoluní zmnu, jejíž poátek se klade do konce let šedesátých a zaátku sedmdesátých: - úinnost kolon se zvyšuje zmenšením ástic až po nejastji i dnes užívané 7-10 µm, souasný trend jde až na 1.5 µm, rozmry se úmrn zmenšují na nejobvyklejší 4mm x mm pro konvenní chromatografii, 0,5mm x 60 mm pro pikochromatografii. - vývojem prošla erpadla na dopravu mobilní fáze pod tlakem skrze kolony, naplnné malými ásticemi s rostoucím odporem proti toku mobilní fáze - konstrukce detektor umožuje citlivé sledování zmn fyzikálních vlastností v toku mobilní fáze, vyvolaných pítomností eluovaných látek (nap. spektrofotometrický U-IS detektor pro konvenní chromatografii s objemem optické cely 4 µl mí absorpci svtla, v moderním provedení s diodovým mostem (PDA) umožuje analyzovat spektrofotometricky práv eluovanou látku, elektrochemické detektory zaznamenávají elektrochemickou redukovatelnost roztoku nebo zmnu vodivosti prostedí, mají zabudovaná idla pímo v kapiláe, kterou proudí mobilní fáze.) souasné dob se bez kapalinové kolonové chromatografie provozované pod tlakem (HPLC, jinak též vysokoúinné kapalinové chromatografie) neobejde žádná laborato. HPLC si stále udržuje svj význam umožuje analyzovat prakticky veškeré organické látky v množstvích od desítek procent do 0,00001 % a v rozptí relativních molekulových hmotností od stovek u iont až po nkolik set tisíc u makromolekul až ástic.

2 2 2. Základní schéma kapalinového chromatografu Požadavky na chromatografické zaízení: a) umožnit pravidelný a konstantní tok mobilní fáze stacionární fází b) zajistit kvantitativní a asov co nejkratší nadávkování analyzované smsi na stacionární fázi c) vytvoit podmínky k co nejvtšímu potu opakování sorpních a desorpních proces jako výsledku vzájemných vztah mezi stacionární fází, molekulami složek mobilní fáze a molekulami solut v analyzované smsi. d) uskutenit prbžné mení a zaznamenávání zmn uritých vlastností tekoucí mobilní fáze, které jsou výsledkem pítomnosti separovaných látek e) být schopné selektivn uvedené zmny analyzovat a kvantifikovat Na splnní tchto požadavk jsou konstruovány nebo operátorem voleny jednotlivé ásti chromatografického zaízení. 1) zásobník mobilní fáze a erpadlo, 2) erpadlo, 3) mi tlaku a petlakový regulátor, 4) pedkolona, 5) spojka, 6) pícka (možnost termostatování kolonového prostoru), 7) dávkovací kohout se smykou, 8) kolona, 9) detektor (U-IS, PDA, elektrochemický), 10) zaízení pro záznam a zpracování dat,

3 3 3. Provedení HPLC chromatografického stanovení 3.1 Úkoly cviení : stanovení mrtvého objemu M kolony pomocí neinteragující látky (thiomoovina), testování kolony analýzou testovací smsi urit základní parametry kolony, separace a identifikace tí izomer guanosinmonofosfátu v jejich smsi metodou HPLC v chromatografické soustav s obrácenou polaritou fází (tzv. reverse phase HPLC), výpoet chromatografického rozlišení, stanovení pímsi (neistoty) ve vzorku guanosin 5 -monofosfátu metodou standardního pídavku. 3.2 Experimentální podmínky: Chromatograf jako stavebnice, složená z ástí HPLC systém 10 AP fy SHIMADZU: - odplyova GT-154, - systémová ídící jednotka SCL-10AP, - pumpa LC-10AP na dopravu mobilní fáze pod tlakem, - pícka CTO-10ASP s dávkovacím kohoutem heodyne 7120 a dávkovací smykou 20 µl na injektování vzorku na kolonu, - fotometrický detektor s diodovým polem detektor SPD-M10AP, ídící software Class-P 5.02), - chromatografická kolona rozmr 250 x 4 mm plnná sorbentem Silasorb C-18, zrnní 5 µm (silikagel s chemicky vázanou oktadecylovou skupinou) - injekní stíkaka se speciáln upravenou jehlou pro dávkování vzork - ultrazvuková láze - odmrné baky a další bžné laboratorní zaízení Chemikálie: mobilní fáze: 25 mm fosfátový pufr, ph 7.0 zásobní roztoky: guanosin 5 -monofosfát (5 GMP) guanosin 3 -monofosfát (3 GMP) guanosin 2 -monofosfát (2 GMP)

4 4 3.3 Píprava chromatografu Píprava mobilní fáze Mobilní fáze musí být irá, bez zákalu a mechanických neistot. Opominutí tohoto kroku zpsobí, že pod tlakem pístu v erpadle se vzduch uvolní a bubliny naruší kontinuitu toku mobilní fáze. Pozorujte proto bedliv, zda ve výtokové kapiláe z detektoru nejdou bubliny. Pokud jsou pítomny je záznam detektoru bezcenný. Mobilní fáze se pedem filtruje na speciálním zaízení pes filtr definovaných dimenzí pór. K odvzdušnní mobilní fáze slouží odplyova. Obsahuje-li mobilní fáze vysoký podíl takových organických rozpouštdel, která snadno rozpouštjí vzduch (nap. metanol), je teba mobilní fázi pedem odvzdušnit v ultrazvukové lázni. Zásadou postupu ped napojením toku mobilní fáze na kolonu je zbavit vedení v kapiláe vzduchu. Na panelu erpadla, nebo softwarov, se nastaví prtok mobilní fáze pes kolonu na hodnotu 0,20 ml/min Ekvilibrace kolony Spustí se erpadlo stiskem píslušné ikony ovládacího softwaru nebo tlaítka PUMP na erpadle, asi po 10 min ekvilibrace kolony se prtok pepne na hodnotu 0,50 ml/min. Dávkování vzorku a mení je možno zahájit po ustálení tlaku, zpravidla asi za pl hodiny Sbr dat Sbr dat se provede dle návodu vedoucího cviení Dávkování vzorku dávkovacím kohoutem Ped zahájením vlastního mení se doporuuje nkolikrát nastíknout do dávkovacího kohoutu destilovanou vodu nebo mobilní fázi. zorek dávkovaný na kolonu musí být irý, ástice nebo zákal mohou nevratn znehodnotit kolonu. zorky obsahující rozpuštné plyny (nap. metanolické roztoky) je teba ped nástikem dkladn odvzdušnit v ultrazvukové lázni. Naplnní smyky dávkovae Pi plnní dávkovací smyky o objemu 20 µl se páka dávkovae pepne do pohotovostní horní polohy, do dávkovacího otvoru se jemn zasune jehla injekní stíkaky (nezasouvat násilím na doraz) a tlakem na píst injekní stíkaky se naplní dávkovací smyka dávkovae (na konci odpadní kapiláry odkápne 3 5 kapek). Nástik vzorku na kolonu Jehla se vytáhne a páka se pepne do pravé spodní polohy. Tím se uvnit dávkovae pepne smr toku mobilní fáze tak, že prochází smykou. 3.4 Provedení analýzy Stanovení mrtvého objemu kolony Nastíknutím látky, která není zadržovaná sorbentem, se stanoví tzv. mrtvý as t M, tj. doba, za kterou kolonou projde látka zcela inertní vi sorbentu. Pi znalosti prtokové

5 5 objemové rychlosti (F, ml/min), lze vypoítat M mrtvý objem kolony. Odeteme as t M a s použitím údaje F se vypote mrtvý objem kolony M Testování kolony Ped použitím kolony pro chromatografickou analýzu, a v rutinní analytice v prmyslu nebo i ve vdeckém výzkumu, se doporuuje testování kolony. Pi testování se nezajímáme o schopnost kolony separovat a rozlišit uritou sms solut, ani o to, pro píky nkterých solut se více rozmývají než jiné. Toto hodnocení vychází z termodynamického aspektu separaního procesu a tyto parametry lze ovlivnit zmnou bu složení jen mobilní nebo jen stacionární fáze nebo obou najednou. Od testování kolony oekáváme její charakteristiku z hlediska transportní funkce, z hledisek kinetiky distribuního procesu mezi stacionární a mobilní fází. Postup testování má být univerzální, parametry kolony se mají porovnávat s uritým standardem, který má být volen tak, aby bylo možné ho použít na kolony, aniž by byl ovlivnn jejich rozmrem, druhem solutu a použitou mobilní fází. Pro testování se volí standardní vzorek testovací sms - jejíž složky se chovají ideáln z hledisek termodynamiky procesu, mají symetrické píky. Jsou to smsi jednoduchých organických látek - ve cviení bude analyzována testovací sms aceton, benzen, toluen. Testování provádí i výrobci kolon a atest je ke kolon piložen, obsahuje údaje: typ kolony, výrobní šarže, složení testovací smsi, objem dávkovaného vzorku, složení mobilní fáze, objemová prtoková rychlost mobilní fáze ml/min, zpsob detekce (λ a rozsah mení AU) a vzorový chromatogram. Provedení pokusu Pipravíme testovací sms, obsahující 4 ml acetonu, 1 ml benzenu a 1 ml toluenu v 44 ml methanolu Na kolonu nadávkujeme 10 µl testovací smsi a zaznamenáme chromatogram, analýzu poté zopakujeme. Z chromatogram vyhodnotíme údaje (pro každý pík) - d a Y 0.5. Srovnáme hodnotu n (poet teoretických pater), H (výšku ekvivalentu teoretického patra) a redukované veliiny (h= H/dp) vypotenou na základ tchto hodnot a hodnoty vypotené softwarem Stanovení retenních as pro analyzované soluty a) pipravíme pracovní roztoky mených standard izomer guanosinmonofosfátu, b) provedeme dva nástiky každého z tchto roztok na kolonu Analýza smsi izomer guanosinmonofosfátu a) nastíkneme vzorek smsi a provedeme analýzu, nástik opakujeme dvakrát Stanovení obsahu neistoty ve vzorku 5 GMT a) pipravíme si pracovní roztok vzorku guanosin 5 -monofosfátu dle pokynu vedoucího cviení, b) tento pracovní roztok nastíkneme a zanalyzujeme, c) k pracovnímu roztoku pidáme dvakrát standardní pídavek identifikované neistoty a promíme,

6 d) každou analýzu provedeme 2x. 6

7 7 3.5 yhodnocení: a) vypoítáme mrtvý objem kolony M b) pro všechny píky v testovací smsi stanovíme jejich šíku Y 0.5 v polovin výšky v mm, z hodnot jejich t a Y 0.5 vypoítáme poet pater N, pepoteme na výšku teoretického patra a získáme údaj pro hodnocení úinnosti kolony c) stanovíme retenní objemy separovaných standard izomer guanosinmonofosfátu d) stanovíme kapacitní pomry k separovaných látek jako retenní charakteristiku, sloužící k porovnávání chromatogram pi zmn experimentálních podmínek (zmna složení mobilní fáze aj.) e) dle mení standard (retenní asy, spektra) provedeme identifikaci látek v analyzované smsi izomer guanosinmonofosfátu. f) identifikujeme neistotu ve vzorku guanosin 5 -monofosfátu. g) pro píky v chromatogramu smsi izomer stanovíme chromatografické rozlišení. h) ze sady chromatogram mení standardního pídavku uríme obsah neistoty ve vzorku guanosin 5 -monofosfátu.

8 8 yhodnocení chromatografického záznamu t 2 t 1 t M.. mrtvý as, retence inertní látky t X.. eluní as solutu X (min:sec) t M 1 X vzdálenost píku na záznamu od startu v mm 2 2 Y 0.5 (X) šíka v polovin výšky píku M 1 solut 1 inert solut 2 Y 0.5 (1) Y 0.5 (2) Charakteristickou veliinou pro každou chromatografovanou látku je eluní (retenní objem). Existuje vztah mezi eluní dobou t, která uplyne od nástiku vzorku do dosažení maxima eluní kivky a eluním (retenním) objemem, tj. objemem mobilní fáze, který za tu dobu protee => = t FM kde F M, je objem mobilní fáze, proteklé kolonou za jednotku asu (objemová rychlost toku ml/min). Eluní as t M odeteme na vytištném chromatogramu, eventueln jej lze získat ze záznamu zapisovae pepotem z hodnot vzdálenosti d maxima píku od linie nástiku (v mm) s použitím údaje o posunu papíru s (v mm/min). Hodnota eluního asu je v minutách. t d = s Eluní objem je soutem dvou objemových veliin M = + kde M je mrtvý objem a je redukovaný eluní objem. Pro hodnocení rozdíl v retencích látek se asto používá pojmu retenní pomr r 1,2. Jeho hodnota se poítá z pomru redukovaných retenních objem r1, 2 = 2 1

9 9 literatue se retence látek, zvlášt pi optimalizaci podmínek a hodnocení trend zmn retence, asto vyjadují pojmem kapacitní pomr k. Ten je definován k 1 = 1 M M Je vyjadován jako pomr celkového množství separované látky ve stacionární fázi k jejímu celkovému množství ve fázi mobilní k = K D S M K D je distribuní konstanta, S objem stacionární fáze, M mrtvý objem. Základním údajem o rozmývání složek vzorku pi transportu kolonou (které se projevuje šíkou píku) je poet teoretických pater kolony n. Tento údaj slouží k hodnocení úinnosti kolony podobn jako odvozená veliina výškový ekvivalent teoretického patra H. Poet teoretických pater se zjistí experimentáln dosazením namených parametr do vztahu d t n = = Y 5, 545 5, 545 Y s kde Y 0.5 je šíka píku v polovin výšky v mm, d vzdálenost maxima píku od linie nástiku v mm, t je eluní as v sekundách a Y s0.5 je šíka píku v polovin výšky vyjádená také v asových jednotkách (sekundy). ýškový ekvivalent výškového patra H (v mm) se vypoítá z délky kolony (v pokusu 150mm) a vypoteného potu pater n H = L n Pro hodnocení, jak jsou píky od sebe oddleny, se používá veliiny rozlišení. ozlišení 1,2 se vypoítá z rozdílu eluních objem separovaných látek 1 a 2, a hodnot šíek obou eluních kivek v poloviní výšce 1, , ( 2 1) = Y + Y 0. 5( 1) 0. 5( 2) Z hodnoty 1,2 lze odhadnout míru pekrývání sousedících pík, pi hodnot =1 jsou píky pekryty z 2% plochy, dokonale oddleny jsou pi hodnot 1,5 Doporuená literatura: J. Churáek, P. Jandera: Úvod do vysokoúinné kapalinové kolonové chromatografie. SNTL, Praha 1984.