Srovnání hladin cyklosporinu a takrolimu namìøených na systému ARCHITECT i2000sr a cobas 8000 modular analyzer

Transkript

1 Mgr. Magdalena Žánová 1, Ing. Ivana Hupáková 1, prof. MUDr. Jaroslav Racek, DrSc. 1, MUDr. Daniel Rajdl, Ph.D. 1, Mgr. Romana Uøinovská, Ph.D. 2, Mgr. Pavel Šištík 2 1 Ústav klinické biochemie a hematologie L UK a N Plzeò 2 Oddìlení klinické farmakologie, Ústav laboratorní diagnostiky, N Ostrava Srovnání hladin cyklosporinu a takrolimu namìøených na systému ARCHITECT i2000sr a cobas 8000 modular analyzer Rejekce transplantovaného štìpu pøedstavuje jeden z hlavních problémù v transplantologii. Ke znaènému snížení pravdìpodobnosti odmítnutí orgánu slouží podávání imunosupresiv. Úvod Cyklosporin A (CSA) a takrolimus (TCL) patøí mezi léky potlaèující reakce imunitního systému na novì transplantovaný orgán. Velkou roli hrají samotné rozsahy dávek a interindividuální variabilita farmakokinetických parametrù [1], [2], [3]. Dávky tìchto lékù jsou v zahajovací a udržovací fázi léèby voleny tak, aby minimalizovaly nežádoucí vedlejší úèinky a zajistily odpovídající potlaèení imunitní reakce [4]. Aby bylo dosaženo co nejlepších léèebných výsledkù, je u pacientù provádìno pravidelné terapeutické monitorování hladin tìchto lékù; ve N Plzeò je k mìøení hladin imunosupresiv rutinnì využíván systém Abbott ARCHITECT i2000sr, pracující na principu chemiluminiscenèní imunoanalýzy (CMIA). Cílem práce bylo srovnat výsledky získané na tomto systému s výsledky získanými novì nabízenými soupravami pro stanovení CSA a TCL firmy Roche, které pracují na principu elektrochemiluminiscenèní imunoanalýzy (ECLIA). Experimentální èást Celkový poèet vzorkù pacientù èinil 362. Nìkteré namìøené hladiny CSA nebylo možné k hodnocení použít, nebo diagnózou u tìchto pacientù nebyla pouze transplantace (imunosuprese): ve skupinì se objevovali pacienti s autoimunitními nemocemi, pacienti z chirurgických, oèních oddìlení èi klinické farmakologie. Ti byli pro další porovnávání ze souboru pro menší poèet vylouèeni a byli ponecháni pouze nemocní po transplantaci ledviny a kostní døenì, léèení na Hematoonkologickém oddìlení (HOO) a v Transplantaèní nefrologické ambulanci I. interní kliniky N v Plzni. V první èásti srovnávání bylo použito Labor Aktuell 04/17 17

2 Tab. 1: Pøíprava vzorkù k analýze na jednotlivých mìøicích systémech Tab. 2: Analytické charakteristiky stanovení cyklosporinu Tab. 3: Analytické charakteristiky stanovení takrolimu celkem 284 vzorkù nesrážlivé krve, která byla odebrána do zkumavky s K 3EDTA. Bylo použito 169 vzorkù ke stanovení CSA a 115 vzorkù ke stanovení TCL. Nutná byla pøedúprava vzorkù, a to jak v pøípadì systému Abbott, tak v pøípadì systému Roche pøi stanovení obou analytù. V druhé èásti bylo zpracováno 78 vzorkù pouze ke stanovení hladin CSA. Pøíprava vzorkù k analýze je shrnuta v tabulce 1. Metodika Ke stanovení imunosupresiv na systému ARCHITECT od spoleènosti Abbott je využívána chemiluminiscenèní imunoanalýza (CMIA). Analyt ze vzorku soutìží s CSA èi TCL, který je znaèený akridinovým esterem, o vazbu na monoklonální myší protilátku proti CSA (TCL), která je vázána na paramagnetické mikroèástice. Vzniklé komplexy antigen-protilátka se po inkubaci separují magneticky. V alkalickém prostøedí dochází pùsobením H 2O 2 k rozpadu akridinového esteru a vzniká chemiluminiscenèní signál, který je detekován. Mezi množstvím CSA (TCL) ve vzorku od pacienta a množstvím relativních svìtelných jednotek (RLU) detekovaných optickým systémem existuje nepøímá úmìra. Analyzátor využívá ke stanovení vlastní reagencie soupravy ARCHITECT Cyclosporin a ARCHITECT Tacrolimus Reagent Kit, pøipravené k okamžitému použití. Kalibraèní roztoky jsou dodávány v kapalné podobì ARCHITECT Cyclosporine a Tacrolimus Calibrators, pøipravené k okamžitému použití. Kontrolní materiál Technopath Control Multichem WBT je dodáván zmrazený, po rozmrazení je možné ho uchovávat v lednici po dobu deseti dnù. Dále je tøeba Whole Blood Precipitation Reagent a Whole Blood Solubilization Reagent. V pøípadì systému cobas e 602 od spoleènosti Roche se CSA (TCL) stanovuje také kompetitivní imunoanalýzou, která využívá elektrochemiluminiscenèní technologii (ECLIA). Imunosupresiva ze vzorku soutìží s CSA (TCL) znaèeným rutheniovým komplexem o vazbu na monoklonální protilátku proti CSA (TCL), která je vázaná na mikroèástice potažené streptavidinem. V pøípadì stanovení CSA se jedná o myší monoklonální protilátku a v pøípadì TCL o ovèí protilátku. Vzniklé komplexy antigen-protilátka se po inkubaci Supernatanty obsahující CSA a TCL byly dále testovány na obou systémech za použití souprav ARCHITECT Cyclosporine, ARCHITECT Tacrolimus Reagent Kit a Elecsys Cyclosporine, Elecsys Tacrolimus. Po celou dobu testování byly sledovány analytické vlastnosti jednotlivých metod. Za tímto úèelem se pravidelnì provádìly analýzy kontrolního materiálu pøíslušných firem, kdy se na poèátku u obou metod mìøily všechny tøi hladiny kontrol každý den, pozdìji se jednotlivé kontroly støídaly tak, aby byla dennì testována minimálnì jedna kontrolní hladina. Hladina 1 byla mìøena patnáctkrát, hladina 2 ètrnáctkrát a hladina 3 dvanáctkrát. Získané hodnoty opakovatelnosti a mezilehlé preciznosti jsou uvedeny v tabulkách 2 a Labor Aktuell 04/17

3 Obr. 3: Porovnání namìøených hladin CSA 250 µg/l separují magneticky v mìøicí cele. Na povrchu elektrody jsou mikroèástice zachyceny magnetickým polem. Pomocí roztoku ProCell, který je rovnìž substrátem reakce, se odmyjí nenavázané složky z mìøicí cely. Po zavedení napìtí na pracovní elektrodu dojde k následné chemiluminiscenèní emisi fotonù, která je detekována fotonásobièem. Zde platí pøímá úmìra mezi intenzitou signálu a koncentrací analytu ve vzorku. Analyzátor cobas e 602 využívá ke stanovení obou imunosupresiv soupravy Elecsys Cyclosporine a Elecsys Tacrolimus, které jsou pøipravené k okamžitému použití. Zvláš je dodávaný kalibraèní a kontrolní materiál (Cyclosporine CalSet, Tacrolimus CalSet a PreciControl ISD) vyžadující pøedúpravu rozpuštìním v 1,00 ml destilované vody. Dále se užívá precipitaèní èinidlo Elecsys ISD Sample Pretreatment, které je jediné a zároveò spoleèné pro pøedúpravu vzorku ke stanovení jak CSA, tak TCL, pøípadnì dalších imunosupresiv (Sirolimus, Everolimus). Doplòující tøetí stanovení vzorkù s hladinami ARCHITECT CSA 250 µg/l bylo provedeno na systému Waters Acquity UPLC systém metodou UHPLC-MS/MS. [5]. Výsledky Výsledky porovnání obou metod prezentujeme formou komentovaných grafù (Passing-Bablokova regrese a Bland-Altmanovy grafy). Hodnocení výsledkù na základì terapeutických rozmezí jednotlivých klinik je prezentováno formou tabulek. Shoda v hladinách do 200 µg/l je dobrá, 250 µg/l jsou patrné znaèné rozdíly mezi jednotlivými metodami [n = 169; r = 0,9376; y = 14,45 (95% CI = 6,81 až 20,34) + 0,86 x (95% CI = 0,82 až 0,91)]. (Obr. 1) Hodnoty namìøené platformou Abbott jsou vyšší prùmìrnì o 19,5 µg/l, ve vyšších hodnotách se rozdíl zvyšuje. (Obr. 2) Prùmìrný rozdíl vysokých hladin CSA mezi metodami CMIA (Abbott) a ECLIA Obr. 1: Porovnání namìøených hladin CSA pomocí Passing-Bablokovy regrese Obr. 2: Porovnání namìøených hladin CSA Bland-Altmanovými grafy Obr. 4: Porovnání namìøených hladin CSA 250 µg/l Obr. 5: Porovnání namìøených hladin CSA 250 µg/l Obr. 6: Porovnání namìøených hladin TCL pomocí Passing-Bablokovy regrese Obr. 7: Porovnání namìøených hladin TCL Bland-Altmanovými grafy Labor Aktuell 04/17 19

4 (Roche) je 104,1 µg/l [n = 78; r = 0,8820; y = 59,90 (95% CI = 17,58 až 99,50) + 1,15 x (95% CI = 0,99 až 1,34)]. Nad 2 SD leží 2,6 % výsledkù, naopak pod 2 SD leží 1,3 % výsledkù. (Obr. 3) Srovnání vysokých hladin CSA metodami CMIA (Abbott) a UHPLC-MS/MS (Waters) prokázalo prùmìrný rozdíl hladin CSA mezi obìma metodami 80,9 µg/l [n = 78; r = 0,8824; y = 68,73 (95% CI = 29,12 až 101,90) + 1,03 x (95% CI = 0,88 až 1,20)]. Nad 2 SD leží 3,8 % výsledkù, pod 2 SD leží 1,3 % výsledkù. (Obr. 4) Vysoké hladiny CSA namìøené metodou UHPLC-MS/MS (Waters) a ECLIA (Roche) se prùmìrnì liší o 23,3 µg/l [n = 78; r = 0,9195; y = -8,09 (95% CI = -36,47 až 22,87) + 1,13 x (95% CI = 1,01 až 1,28)]. Nad 2 SD leží 3,8 % výsledkù, pod 2 SD leží 1,3 % výsledkù. (Obr. 5) Metody CMIA (Abbott) a ECLIA (Roche) jsou zde v dobré vzájemné shodì [n = 115; r = 0,9218; y = -0,30 (95% CI = -0,63 až 0,16) + 1,00 x (0,93 až 1,05)]. (Obr. 6) Prùmìrný rozdíl hladin TCL mezi obìma metodami je 0,6 µg/l. (Obr. 7) Pro každé oddìlení je rozhodující jiné terapeutické rozmezí. Na základì toho byli pacienti rozdìleni do jednotlivých skupin. Na oddìlení HOO je terapeutická šíøe Tab. 4: Pøehled terapeutických rozmezí a poètu vzorkù u jednotlivých oddìlení Tab. 5: Porovnání výsledkù pacientù HOO cyklosporin Tab. 6: Porovnání výsledkù pacientù transplantaèní nefrologické ambulance I. IK cyklosporin Tab. 7: Porovnání výsledkù pacientù transplantaèní nefrologické ambulance I. IK takrolimus CSA µg/l, jak ukazuje tabulka 5. Do hodnoty 200 µg/l jsou obì metody témìø shodné. Na diagonále, tedy vždy v totožných RI, je vidìt, že celkový rozdíl obou metod je malý. Pøesto se 22,73 % výsledkù neshoduje. Bez povšimnutí nemohou zùstat ani hodnoty ležící v krajních intervalech, kdy ve ètyøech pøípadech hodnoty mìøené na analyzátoru cobas e 602 spadly do vyššího intervalu než tytéž vzorky stanovené na pøístroji ARCHI- TECT. Naopak 26 vzorkù poskytlo v pøípadì cobas nižší hodnoty než u metody CMIA (Abbott). Toto potvrzuje fakt, že analyzátor cobas má tendenci nižších výsledkù. Hodnoty vychýlené mimo RI v tomto pøípadì nemusí znamenat chybu mìøení èi nesprávnì zavedenou metodu. Pravdìpodobnou pøíèinou je zde cílené udržování pacientù po transplantaci právì pod nebo nad terapeutickou hladinou. Vìtší korespondence je patrná u vzorkù z transplantaèní nefrologické ambulance I. IK, jak je vidìt v tabulce 6. Dùvodem mùže být i nižší koncentrace CSA v tìchto vzorcích, kde je mezi obìma metodami vìtší shoda. Hodnocení TCL bylo v rámci tohoto porovnávání omezeno pouze na transplantaèní nefrologickou ambulanci I. IK, kde je využíváno terapeutické rozmezí µg/l. Tabulka 7 zachycuje shodu v 92,92 % pøípadù. Vìtšina mìøení je shodná v intervalu pod 10 µg/l. Nenastal zde pøípad toho, že by výsledky ležely ve vzdálenosti více než jednoho intervalu, stejnì jako tomu bylo u porovnávaných hladin CSA z této ambulance. 20 Labor Aktuell 04/17

5 Diskuse Cílem této práce není posuzovat vìtší vhodnost toho kterého systému, ale srovnat mìøení pro nás dostupných metod. Po vyhodnocení celkového souboru namìøených hodnot CSA na obou systémech je na první pohled patrné (obr. 1, 2), že hodnoty CSA namìøené metodou EC- LIA Roche Diagnostics jsou obecnì nižší, než hodnoty poskytnuté metodou CMIA ARCHITECT, Abbott. Pøi bližším pohledu je vidìt, že v intervalu od 0 do 250 µg/l jsou výsledky srovnatelné, vìtší rozdíl je patrný až u vyšších koncentrací. Srovnání hladin CSA v koncentracích 250 µg/l potvrdilo fakt vyplývající již z pøedchozího hodnocení, tj. že metoda CMIA (Abbott) poskytuje statisticky významnì vyšší hodnoty (obr. 3), kdy byl prùmìrný rozdíl mezi hodnotami 104,1 µg/l (37,6 %). Námi namìøené a porovnané hodnoty hladin CSA jsou shodné s hodnocením uvedeným ve studii multicentrického analytického hodnocení srovnávající hladiny CSA mimo jiné metodou CMIA (Abbott) a ECLIA (Roche), ECLIA (Roche) a UHPLC-MS/MS (Waters) [6]. Opomeneme-li rozdíl ve velikosti souboru, který je zde irelevantní, mùžeme pozorovat obdobné výsledky. Pøíkladem mùže být prùmìrný rozdíl hodnot CSA namìøený metodami CMIA (Abbot) a ECLIA (Roche), který u hodnot nad 200 µg/l, uvedených v publikaci, èiní 24,4 %. Rovnomìrné rozložení hodnot 250 µg/l poskytlo srovnání ECLIA (Roche) a UHPLC-MS/MS (Waters) (obr. 5). UHPLC-MS/MS (Waters) je díky své citlivosti a specifiènosti všeobecnì považována za zlatý standard. Její využití je ale v rutinních provozech omezeno a využívány jsou spíše právì imunoanalytické metody. V rámci této práce bylo možné námi namìøené výsledky porovnat s výsledky získanými metodou UHPLC-MS/MS (Waters) díky spolupráci s Ústavem laboratorní diagnostiky N Ostrava. Výsledky našeho srovnání metodami ECLIA (Roche) a UHPLC-MS/MS (Waters) vykazují dobrou shodu a jsou mírnì nadhodnocovány spíše v pøípadì metody UHPLC/MS-MS (Waters). Tento fakt však není shodný s výsledky uvádìnými v publikaci z roku 2014 [6], kde metoda ECLIA (Roche) poskytuje výsledky vyšší oproti metodì UHPLC/MS-MS (Waters). Je však nutné uvést, že v publikaci srovnávali tyto metody v celém rozsahu mìøení a ne pouze hodnoty 250 µg/l. Porovnání hladin TCL na zmínìných systémech poskytlo obdobné výsledky jako v pøípadì prvního imunosupresiva. Tuto skuteènost zachycuje graf (obr. 6, 7), na kterém je však zøejmé, že rozdíly v mìøení jsou opravdu minimální a metody jsou zde ve vìtší vzájemné shodì. Experimentem prokázaný prùmìrný rozdíl 8,4 % je možné porovnat s hodnotou 10,5 % uvedenou v literatuøe [7]. Literatura: 1)Lüllmann, H.; Mohr, K.; Wehling, M. armakologie a toxikologie. Praha: 2004, Grada Publishing a. s. 2) Viklický, O. Imunosupresivní léèba. Postgraduální medicína, 2008, 9. 3) Patel, N.; Cook, A.; Greenhalgh, E.; Rech, M., A.; Rusinak, J.; Heinrich, L. Overview of extended release tacrolimus in solid organ transplantation. World Journal of Transplantation, 2016, 6:1, s ) Leichtman, A., B. Balancing Efficacy and Toxicity in Kidney-Transplant Immunosuppression. The New England Journal of Medicine, 2007, 357:25, s ) Brozmanová, H., Peøinová, I., Halvová, P., Grundmann, M. Liquid chromatogramytandem mass spektrometry method for simultaneous determination of cyclosporine A Závìr Výsledky stanovení CSA metodou CMIA (Abbott) a ECLIA (Roche) byly statisticky odlišné, a to zejména v hodnotách 250 µg/l. Nejlepší shodu se zlatým standardem UHPLC-MS/MS (Waters) prokázala metoda ECLIA (Roche) s nejmenším prùmìrným rozdílem 23,3 µg/l a korelaèním koeficientem 0,9195. V pøípadì TCL jsou metody v dobré vzájemné shodì. Velkým pøínosem firmy Roche je také jednokroková pøedúprava vzorku pomocí univerzálního èinidla pro všechna imunosupresiva a stabilní dvoubodová kalibrace. and its free metabolites AM1, AM9 and AM4N in whole blood and isolated lymphocytes in renal transplant patients. Journal of Separation Science, 2010, 33, s ) Vogeser, M., Shipkova, M., Rigo-Bonnin, R., Walemacq, P., Orth, M., Widmann, M., Verstraete, A., G. Multicenter Analytical Evaluation of the Automated Electrochemiluminiscence Immunoassay for Cyclosporine. Therapeutic Drug Monitoring, 2014, 36:5, s ) Shipkova, M.; Vogeser, M.; Ramos, O., A.; Verstraete, A., G.; Orth, M.; Schneider, Ch.; Wallemacq, P. Multi-center analyical evaluation of a novel automated tacrolimus immunoassay. Clinical Biochemistry, 2014, 47, s Labor Aktuell 04/17 21