MULTIMARKEROVÝ PŘÍSTUP V DIAGNOSTICE KARDIOLOGICKÝCH ONEMOCNĚNÍ S VYUŽITÍM PROTEINOVÝCH BIOČIPŮ

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA BIOCHEMICKÝCH VĚD MULTIMARKEROVÝ PŘÍSTUP V DIAGNOSTICE KARDIOLOGICKÝCH ONEMOCNĚNÍ S VYUŽITÍM PROTEINOVÝCH BIOČIPŮ DISERTAČNÍ PRÁCE HRADEC KRÁLOVÉ 2012 RNDr. MARTINA VAŠATOVÁ 1

2 Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. RNDr. Martina Vašatová.. 2

3 Moje největší poděkování patří školiteli prof. RNDr. Miloši Tichému, CSc., konzultantce Ing. Jaroslavě Vávrové, Ph.D. a prof. MUDr. Vladimíru Paličkovi, CSc., dr.h.c. za odborné vedení, cenné rady a připomínky, trpělivost, toleranci, pomoc a dobrou náladu při řešení této práce. Můj dík patří také kolektivu Ústavu klinické biochemie a diagnostiky za podporu, spolupráci a pohodovou atmosféru v laboratoři. Dále děkuji lékařům I. Interní kliniky, Oddělení klinické hematologie na II. Interní klinice a Transfuzního oddělení Fakultní nemocnice v Hradci Králové, obzvláště pak prof. MUDr. Radkovi Pudilovi, CSc., MUDr. Janu Horáčkovi, Ph.D., MUDr. Lucii Horákové, MUDr. Tomášovi Tomkovi, MUDr. Jaroslavu Duškovi, Ph.D. a MUDr. Vítu Řeháčkovi, za skvělou spolupráci na klinických studiích. Děkuji prof. MUDr. Jaroslavu Dršatovi, CSc. za důležité informace týkající se studia na Farmaceutické fakultě. 3

4 Obsah 1. Abstrakt Abstract Úvod Cíle práce Teoretická část Kardiální markery Historie Běžné kardiální markery Srdeční troponiny Funkce a biochemie troponinů Troponin a akutní koronární syndromy Metody stanovení troponinů CKMB izoenzym kreatinkinázy Myoglobin Natriuretické peptidy Nové markery ischemie nebo nekrózy myokardu Protein vázající volné mastné kyseliny (FABP) Funkce a biochemie FABP Metody stanovení FABP BB izoenzym glykogenfosforylázy (GPBB) Funkce a biochemie GPBB Metody stanovení GPBB Ischemií modifikovaný albumin (IMA) Volné mastné kyseliny (FFA) Karboanhydráza III (CA III) Markery zánětlivé reakce C-reaktivní protein (CRP) CD40 ligand (CD40L) Myeloperoxidáza (MPO) Pregnancy associated plasma protein A (PAPP-A) Placentární růstový faktor (PIGF)

5 Cholin Cytokiny a adhezní molekuly Proteomika a proteinové biočipy Multiplexní analýza proteinovými čipy Problémy proteinových biočipů Multianalytový přístup a některé klinické aplikace Akutní koronární syndromy Hypertrofická kardiomyopatie Monitorování léčby arytmií radiofrekvenční katetrovou ablací Kardiotoxicita cytostatik Experimentální část Metody Biočipový Evidence Investigator Cardiac array Kalibrace Analytické parametry soupravy Srovnání metod High-sensitivity troponin T Kalibrace Analytické parametry soupravy Materiál Pacienti Výsledky a diskuse Analytické parametry panelu Cardiac Array Vnitřní kontrola kvality - mezilehlá přesnost a správnost Linearita měření Opakovatelnost Ředění vzorků Citlivost metod Pokles luminiscence v čase Srovnání metod CKMB a MYO GPBB a FABP Zamražování vzorků a stabilita Kalibrace po zamražení

6 Zamražení vzorků Analytické parametry hs-ctnt Vnitřní kontrola kvality - mezilehlá přesnost a správnost Srovnání metod Klinické aplikace Kontrolní skupina dárců krve Akutní infarkt myokardu Hypertrofická kardiomyopatie Radiofrekvenční katetrové ablace Kardiotoxicita cytostatik Závěr Seznam literatury Publikace vztahující se k tématu disertační práce Publikace vztahující se k tématu disertační práce s IF Seznam všech publikací Seznam prezentací na vědeckých setkáních Použitá literatura Seznam zkratek Seznam obrázků a tabulek Přílohy

7 1. Abstrakt Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: RNDr. Martina Vašatová Školitel: prof. RNDr. Miloš Tichý, CSc. Název disertační práce: Multimarkerový přístup v diagnostice kardiologických onemocnění s využitím proteinových biočipů Úvod: Sledování biochemických markerů poškození myokardu hraje důležitou roli v diagnostice kardiovaskulárních onemocnění. U akutního infarktu myokardu (AIM) bez nebo s elevacemi ST segmentů (NSTEMI, STEMI) je zvýšení kardiálních biomarkerů jedním z hlavních diagnostických kritérií. European Society of Cardiology, American College of Cardiology Foundation, American Heart Association a World Heart Federation publikovali novou univerzální definici infarktu myokardu, která zahrnuje detailní návody pro použití kardiálních markerů při podezření na AIM. V první řadě je doporučeno stanovení kardiálních troponinů T a I (ctnt a ctni) jako markerů nekrózy myokardu a kvantifikace myoglobinu (MYO) a hmotnostní koncentrace MB izoenzymu kreatinkinázy (CKMB mass) při diagnostice reinfarktu. Kromě akutního koronárního syndromu může také docházet k poškození myokardu u jiných kardiovaskulárních onemocnění, během různých léčebných procedur a výkonů (např. perkutánní koronární intervence, radiofrekvenční ablace atd.) nebo při léčbě kardiotoxickými preparáty. Metody: V současnosti jsou pro kardiospecifické troponiny rychle vyvíjeny metody s vyšší analytickou citlivostí, nazývané high-sensitivní testy. A také se spektrum kardiálních markerů značně rozšiřuje a zahrnuje některé molekuly, které by mohly být potenciálně důležité pro diagnostiku kardiovaskulárních onemocnění a je vhodné jejich odzkoušení v rutinních aplikacích. Mezi tyto nové molekuly patří BB izoenzym glykogenfosforylázy (GPBB), srdeční typ proteinu vázajícího mastné kyseliny (h-fabp) a karboanhydráza III (CAIII). Pro měření vybraných kardiálních markerů: CKMB mass, MYO, CAIII, ctni, h-fabp, GPBB jsme použili biočipový systém Evidence Investigator (Randox) a dále jsme testovali novou high-senzitivní metodu pro kardiální troponin T (hs-ctnt) na analyzátoru Elecsys 2010 (Roche). Kardiální markery byly 7

8 hodnoceny u zdravých dárců krve a v různých skupinách pacientů s kardiovaskulárními onemocněními (akutní infarkt myokardu, hypertrofická kardiomyopatie, kardiotoxicita chemoterapie, radiofrekvenční ablace). Výsledky: Jak jsme předpokládali, u pacientů s akutním infarktem myokardu byly zvýšené sérové koncentrace všech kardiálních markerů. U radiofrekvenčních ablací naše data ukazují, že procedura způsobuje drobná poškození myokardu, která lze nejlépe monitorovat sledováním zvýšené koncentrace hs-ctnt. U pacientů s hypertrofickou kardiomyopatií jsou GPBB a h-fabp citlivějšími markery ve srovnání s troponinem I, CKMB mass a myoglobinem. Koncentrace GPBB dokonce koreluje s klinickým stavem. Naše další výsledky ukazují, že podávání chemoterapie u hematoonkologických malignit může být spjato s poškozením myokardu, které je manifestováno uvolněním GPBB z kardiomyocytů. Závěr: Multimarkerový přístup biočipové analýzy je aplikovatelný v biochemické diagnostice kardiovaskulárních onemocnění, může rozšířit naše informace a vhodně doplnit rutinní stanovení. 8

9 2. Abstract Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Kralove Department of Biochemical Sciences Candidate: RNDr. Martina Vasatova Supervisor: prof. RNDr. Milos Tichy, CSc. Title of Doctoral Thesis: Multimarker approach in diagnosis of cardiovascular diseases with using protein biochips Background: Measurement of biochemical markers of myocardial injury plays an important role in the diagnosis of cardiovascular disseases. Increase in some cardiac biomarkers is one of main diagnostic standard in acute myocardial infarction (AIM) with or without ST elevation (STEMI, NSTEMI). Recently, the European Society of Cardiology, the American College of Cardiology Foundation, the American Heart Association, and the World Heart Federation have published a consensus definition of myocardial infarction (AIM) that includes a detailed guideline for the assessment of biochemical markers in suspected AIM. The principal markers recommended in this setting include cardiac troponins (ctni and ctnt) as markers of myocardial necrosis and myoglobin (MYO) and creatine kinase MB isoenzyme (CK-MB mass) quantification in the diagnosis of reinfarction. Excluding acute coronary syndromes, myocardial injury may be found in patients with the other cardiovascular diseases, during therapeutic procedures and operations (e.g. percutaneous coronary intervention, radiofrequency ablation etc.) or in treatment with cardiotoxic drug. Methods: For cardiac troponins, in last time, methods on higher analytical sentitivity, so called high-sensitive tests, have been rapidly developed. The armamentarium of cardiac markers has expanded to include several molecules that could be potentially useful for diagnosis of acute coronary syndromes (AKS) and are awaiting validation for routine clinical applications. These novel analytes include glycogen phosphorylase BB isoenzyme (GPBB), heart-type fatty acid-binding protein (h-fabp) and carbonic anhydrase III (CA III). Evidence Investigator biochip system (Randox) was used to measure levels selected cardiac biomarkers including CKMB mass, ctni, MYO, h-fabp, CAIII and GPBB. In addition, we have tested a highly sensitive cardiac troponin T 9

10 (hs-ctnt) assay for Elecsys 2010 analyzer (Roche). Cardiac biomarker levels were measured in cohorts of healthy blood donors and various patient s groups with cardiovascular diseases (acute myocardial infarction, hypertrophic cardiomyopathy, cardiotoxicity of chemotheraphy, radiofrequency ablation). Results: As expected, in AIM patients we have observed statistically significant increases in the serum levels of the measured cardiac biomarkers. In radiofrequency ablation our data indicate that procedure causes the most significant increase of serum hs-ctnt concentration that could be used to monitor myocardial injury. In hypertrophic cardiomyopathy patients, GPBB and h-fabp levels are more sensitive markers compare to troponin I, CKMB mass and myoglobin levels, GPBB level was associated with clinical parameters. Our results suggest that administration of chemotherapy for hematologic malignancies could be associated with myocardial injury manifested by increased release of GPBB from cardiomyocytes. Conclusion: Multianalyte biochip-based assay is applicable for biochemical diagnosis of acute coronary syndromes and may add valuable information to standard single marker assays. 10

11 3. Úvod Kardiovaskulární onemocnění jsou celosvětově nejčastější příčinou úmrtí a invalidity mužů i žen. Pojem kardiovaskulární onemocnění zahrnuje velké množství jednotlivých chorob. Mezi nejzávažnější patří ischemická choroba srdeční, cévní mozková příhoda a srdeční selhání. Akutní koronární syndrom (klinická prezentace ischemické choroby srdeční) je jako nestabilní angina pectoris, infarkt myokardu bez elevace ST a infarkt myokardu s elevací ST hlavní příčinou hospitalizace a úmrtí pacientů. Kromě akutního koronárního syndromu může také docházet k poškození myokardu u různých kardiovaskulárních onemocnění, během léčebných procedur a výkonů (např. při perkutánní koronární intervenci, radiofrekvenční ablaci atd.) nebo při léčbě kardiotoxickými preparáty. Svým dopadem na morbiditu a mortalitu pacientů a také na ekonomickou stránku zdravotní péče předčí kardiovaskulární příhody všechna ostatní onemocnění. V Evropě v současné době umírá na choroby srdce a cév každý rok více než 4,3 miliónu nemocných, což představuje necelou polovinu všech úmrtí. Pokud se vše převede do ekonomického pohledu, odhaduje se, že celkové náklady na diagnostiku a léčbu kardiovaskulárních onemocnění v EU představují ročně 192 miliard eur, z toho 57 % činí přímé náklady na zdravotní péči, 21 % připadá na vrub poklesu produktivity práce a 22 % tvoří nepřímé náklady. Z tohoto důvodu je léčba a prevence kardiovaskulárních onemocnění hlavní prioritou zdravotnictví na celém světě (1,2). Pro diagnostiku poškození struktury myokardu existuje v dnešní době široké spektrum biochemických markerů. V první řadě jsou to kardiospecifické srdeční troponiny, které jsou preferovány pro průkaz nekrózy myokardu, ale jejichž stanovení je limitováno pomalou kinetikou v prvních hodinách po vzniku nekrózy buněk srdečního svalu. Dále se v klinické praxi využívá stanovení myoglobinu a CKMB mass jako kardiálních markerů, sice tkáňově nespecifických, ale s rychlejší kinetikou vzestupu než je pozorována u troponinů; pro hodnocení funkce myokardu se využívá stanovení natriuretických peptidů. Přesto v současné době prochází oblast laboratorní medicíny zabývající se kardiálními markery dynamickým vývojem a hledají se nové perspektivní molekuly využitelné pro kardiologickou diagnostiku. Rozšiřují se poznatky 11

12 o nových analytech, které by bylo možné využívat pro sledování ischemie či nekrózy myokardu, a které by postupně mohly výhodně doplnit spektrum již rutinně používaných kardiálních markerů. U některých z těchto látek se předpokládá, že by mohly dobře korelovat s klinickým stavem pacientů a že by se mohly stát dobrými prediktory rizika nebo markery pro kontrolu léčby. V oblasti analýzy kardiálních markerů se vyvíjí neustále citlivější metody, které jsou schopné zachytit i fyziologické nebo mírně zvýšené koncentrace a umožnit tak časnější diagnostiku akutních koronárních syndromů a jiných kardiovaskulárních komplikací. Kromě klasických analytických technik se s rozvojem proteomiky objevují biočipové analýzy, které umožňují simultánní stanovení více parametrů z jednoho vzorku. V současnosti jsou již komerčně dostupné některé biočipové aplikace pro stanovení panelu kardiálních markerů a postupně pronikají do oblasti klinické biochemie. Tato disertační práce se zabývá možným využitím nové high-senzitivní metody na stanovení srdečního troponinu T (hs-ctnt) a diagnostické soupravy Cardiac Array pro biočipový systém Evidence Investigator se spektrem analytů: MB izoenzym kreatinkinázy (CKMB), myoglobin (MYO), BB izoenzym glykogenfosforylázy (GPBB), srdeční typ proteinu vázajícího mastné kyseliny (h-fabp), karboanhydráza III (CAIII) a srdeční troponin I (ctni) u různých kardiovaskulárních onemocnění. 12

13 4. Cíle práce Předložená disertační práce se zabývá možným využitím multimarkerového přístupu v diagnostice kardiovaskulárních onemocnění. Cílem práce bylo sledovat analytické znaky a možné klinické využití nových metod pro stanovení kardiálních markerů u různých poškození myokardu: a) diagnostická souprava Cardiac Array pro biočipový systém Evidence Investigator se spektrem analytů: MB izoenzym kreatinkinázy (CKMB), myoglobin (MYO), BB izoenzym glykogenfosforylázy (GPBB), srdeční typ proteinu vázajícího mastné kyseliny (h-fabp), karboanhydráza III (CAIII) a srdeční troponin I (ctni), b) nová high-senzitivní metoda na stanovení srdečního troponinu T (hs-ctnt). 13

14 5. Teoretická část 5.1. Kardiální markery V dnešní době existuje velmi pestrá paleta biomarkerů poškození myokardu, které mají vztah k metabolismu kardiomyocytů a k průběhu různých patologických dějů. Využití většiny měřených analytů používaných jako kardiální markery je určitým způsobem omezeno, a proto je snaha nalézt a ověřit biomarker, který by se stal ideálním kardiálním markerem a vyhovoval potřebám klinické praxe. Měl by mít v kardiomyocytech vysokou koncentraci, být uvolňován časně po počátku ischemie, měl by přetrvávat zvýšený několik hodin, ale ne příliš dlouho, aby byla umožněna detekce recidivy poškození myokardu. Dále by měl být kardiospecifický a jeho hladina v krvi by měla korelovat s rozsahem poškození. Pro krátkodobé i dlouhodobé stanovení rizika nemocných by měla být také známá korelace mezi přítomností a nepřítomností laboratorního ukazatele v séru a prognózou nemocných. Z analytického hlediska by pak měla být pro jeho stanovení použita kvantitativní a dostatečně senzitivní metoda, i když by měla být také možnost semikvantitativního stanovení u lůžka pacienta (3) Historie Počátek využívání biochemických parametrů v diagnostice ischemického poškození myokardu se datuje do roku 1954, kdy Karmen et al. poprvé popsali uvolnění aspartátaminotransferázy (AST) z poškozených kardiomyocytů (4). Od té doby dochází k neustálému rozšiřování spektra biomarkerů využitelných k průkazu ischemie či nekrózy buněk srdečního svalstva. Následovalo stanovení aktivity dalších enzymů, především izoenzymů laktátdehydrogenázy (LD) a kreatinkinázy (CK). Vyvrcholením této etapy bylo zavedení srdečního izoenzymu CKMB do klinické praxe. Stanovení CK a CKMB se pak stalo po řadu let zlatým standardem při biochemické diagnostice akutního infarktu myokardu (AIM) (5,6). V posledních asi 15 letech probíhá rozšiřování spektra biochemických markerů srdečního poškození velmi dynamicky a kontinuálně. 14

15 Na poli kardiologické diagnostiky se v průběhu let objevovala řada molekul, jejichž stanovení přispívalo ke zpřesnění procesu diagnostiky onemocnění myokardu. Došlo k zavedení a postupné inovaci metod na stanovení myoglobinu (MYO), hmotnostní koncentrace CKMB (CKMB mass), srdečních troponinů (ctnt a ctni) i ke zvýšení citlivosti stanovení C-reaktivního proteinu (CRP) (6). V současné době jsou testovány a používány další biomarkery, které mají vztah k průběhu různých patologických dějů poškození myokardu od zánětlivých změn cévní stěny (prozánětlivé cytokiny IL-6, TNF-α) přes markery destabilizace koronárního plátu (myeloperoxidáza, adhezní molekuly), markery ruptury sklerotického plátu (CD40 ligand, PIGF, PAPP-A) až po markery ischemie (IMA, FFA, cholin) a nekrózy kardiomyocytů (ctn, CKMB mass, MYO, GPBB, h-fabp). Zatímco tato skupina parametrů ukazuje na patologické postižení struktury myokardu, je v klinické praxi používána pouze jedna skupina molekul odrážející funkci myokardu - natriuretické peptidy (BNP a NT-proBNP atd.) (7) Běžné kardiální markery Metody pro stanovení markerů nekrózy myokardu, které byly ještě na konci 90. let standardně doporučovány, jsou již v dnešní době považovány za obsolentní. Určení katalytické aktivity aminotransferáz, laktátdehydrogenázy a jejích izoenzymů, 3-hydroxybutyrátdehydrogenázy, kreatinkinázy a CKMB jako markerů srdečního poškození není vhodné pro nedostatečnou diagnostickou specificitu (8,9,10). Dnes je v první řadě doporučováno vyšetřování tkáňově specifických kardiálních troponinů, jejichž stanovení bylo v minulosti analyticky limitováno nízkou citlivostí metod. Rychlá detekce nárůstu koncentrace troponinu v prvních hodinách po vzniku nekrózy buněk srdečního svalu byla problémem vzhledem k pomalé kinetice tohoto markeru. V současnosti jsou analytické problémy diagnostických souprav řešeny a již jsou k dispozici vysoce senzitivní testy pro stanovení kardiálních troponinů (11,12). Průkaz srdečních troponinů přispěl k zavedení pojmu akutní koronární syndrom (AKS) a k redefinicím AIM v letech 2000 a 2007 (10,13). 15

16 Dále se v klinické praxi běžně využívá stanovení myoglobinu a CKMB mass jako kardiálních markerů, sice tkáňově nespecifických, ale s podstatně rychlejší kinetikou uvolnění do krve. Kromě markerů nekrózy myokardu se pro sledování funkce srdečního svalu používá stanovení natriuretických peptidů a některé markery zánětu, především CRP. Tyto markery se sledují v souvislosti s rozvojem aterosklerózy a predikcí rizika kardiovaskulárních komplikací a mortality Srdeční troponiny Troponinový komplex je imobilizovaný na tenkých filamentech kontraktilního aparátu příčně pruhovaných svalů. Je složen ze tří proteinů kódovaných odlišnými geny, které tvoří část srdečního kontraktilního aparátu. Tento komplex se podílí na regulaci svalové kontrakce a zahrnuje troponin I (ctni, 22 kda), troponin T (ctnt, 37 kda), troponin C (ctnc, 18 kda) a tropomyozin (5) Funkce a biochemie troponinů Funkce ctnt je strukturální, váže tropomyozin a ctnc. Při depolarizaci sarkolemy dochází k uvolnění iontů Ca 2+ z cytoplazmy. Ionty Ca 2+ se váží na ctnc a indukují konformační změny, které zvyšují afinitu ctnc k ctni, dochází ke změně tvaru tropomyozinového vlákna. Tím je umožněna vzájemná interakce aktinu a myozinu, která je závislá na dostupnosti ATP. Pokud je dostatek ATP i Ca 2+, interakce aktinu s myozinem se stále opakují a vyvolávají tím aktivní svalovou kontrakci. Pokud již není dostatek vápníku k navázání na ctnc, dochází k jeho konfirmačním změnám, tím je umožněna vazba ctni na aktin a inhibice aktivity aktinomyozinové Mg 2+ -ATPázy, dochází ke svalové relaxaci (5,14). Molekuly ctnt a ctni mají v myokardu a v kosterním svalu malé, ale zřetelné rozdíly ve skladbě aminokyselin a mohou být imunologicky rozlišeny. Troponin C je identický v srdečním i kosterním svalu, proto se pro diagnostiku AKS nevyužívá. V cytosolu se nachází 6,0-8,0 % ctnt a 2,8-6,0 % ctni (5). Většina troponinů je součástí kontraktilního aparátu a k jejich uvolnění dochází vlivem proteolytické degradace proteázami v myokardu a v krvi (kalpain I, kaspázy, matrixové 16

17 metaloproteinázy). Proteolýza troponinu se objevuje v myokardu jako následek ischemie vedoucí k post-translačním modifikacím působícím selektivní degradaci, tvorbu kovalentních komplexů, fosforylaci, oxidaci a N-terminální acetylaci (14). Proto je troponin vyskytující se v krvi pacientů heterogenní směsí volných, posttranslačně modifikovaných, degradovaných a zkrácených forem. Troponin I se v krvi nachází jako volný a ve formě komplexů hlavně ctni-ctnc, méně pak v komplexu s ctnt (ctnt-ctni-ctnc). Troponin T cirkuluje hlavně ve volné formě, ale byly popsány také fragmenty a komplexy (ctnt-ctni-ctnc) (8,14). Kinetika troponinu T je bifazická, s počátečním vrcholem (ctnt z cytosolu) za 12 hodin od poškození, pokračuje s dalším vrcholem za 3-5 dní, s postupným poklesem obvykle do 10 dní. Doba zvýšení ctnt odpovídá rozsahu AIM, u malého AIM může být kratší než 7 dní, zatímco u rozsáhlého transmurálního AIM může zvýšená hodnota ctnt přetrvávat až 21 dní. Dosažení časného vrcholu a jeho výška závisí na reperfúzi. Vylučování ctni je monofazické, chybí časný vrchol, protože ctni má malý cytosolový pool. Stejně jako u ctnt i u ctni je doba zvýšení velmi variabilní a závislá na rozsahu AIM (5) Troponin a akutní koronární syndromy V diagnostice akutních koronárních syndromů nebo při poškození myokardu jiné etiologie a patogeneze jsou při odpovídající klinické symptomatologii vyšší koncentrace ctn považovány za důsledek ireverzibilní nekrózy myokardu. V roce 2007 European Society of Cardiology (ESC), American College of Cardiology Foundation (ACCF), American Heart Association (AHA) a World Heart Federation (WHF) publikovaly místo původního doporučení (13) novou univerzální definici infarktu myokardu (10). V témže roce vyšla také nová doporučení National Academy of Clinical Biochemistry (NACB) a International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) (9,15), v nichž je přesně dáno použití biochemických markerů poškození myokardu. V první řadě jsou pro průkaz nekrózy myokardu doporučeny srdeční troponiny ctni a ctnt. Doporučení však požadují, aby byla jako hodnota cut-off používána hodnota 99. percentilu zdravé referenční populace stanovená s analytickou přesností (CV%) do 10 %. Tento požadavek na citlivost většina diagnostických souprav pro stanovení troponinu nesplňuje, i když v současné době již nově pronikají na trh soupravy 17

18 s nižšími limity detekce a kvantifikace (tzv. high-senzitivní metody), kterými už lze měřit nízké koncentrace troponinu s požadovanou přesností (11,12). V roce 2010 Thygesen et. al. publikovali v návaznosti na definici AIM (10) doporučení pro využití měření kardiálních troponinů v akutní kardiologické péči, kde jsou popisovány preanalytické, analytické i postanalytické faktory a interpretace stanovení srdečních troponinů (14). Podle všech dosud zveřejněných mezinárodních doporučení poskytují oba kardiální troponiny (ctnt i ctni) v diagnostice a při stratifikaci rizika dalšího vývoje kardiovaskulárních komplikací rovnocenné klinické informace (8,9,10,14). Zvýšení troponinů je známkou poškození myokardu, ale pouze klinické symptomy mohou ukazovat na etiologii uvolnění troponinu do krevního oběhu. Jen v případě akutního poškození myokardu způsobeného ischemií může být diagnostikován AIM. Nicméně existují i jiné patologické podmínky (Tab. 1), které vedou k poškození srdečního svalu a nesmí být zaměněny s AIM (10,14). Tab. 1: Příčiny možného zvýšení kardiálních troponinů při absenci ischemické choroby srdeční (10) kontuze srdce nebo jiné trauma zahrnující chirurgické zákroky těžké srdeční selhání, kardiogenní šok disekce aorty těžká stenóza aortální chlopně hypertrofická kardiomyopatie, tako tsubo kardiomyopatie tachy- a bradykardie, srdeční blok, elektrická kardioverze (defibrilace, radiofrekvenční ablace) rhabdomyolýza s poškozením myokardu plicní embolie, plicní hypertenze selhání ledvin akutní neurologické choroby, mozková mrtvice, subarachnoideální hemoragie infiltrativní onemocnění: amyloidóza, hemochromatóza, sarkoidóza, myokarditida, perikarditida toxické vlivy kriticky nemocní: respirační selhání, sepse popáleniny extrémní námaha 18

19 Zachycení prvního nárůstu troponinu v prvních hodinách po počátku akutní koronární příhody, je velmi důležité pro zahájení včasné reperfúze. Zvyšování citlivosti metod samozřejmě urychluje diagnostiku AKS, ale na druhou stranu odmaskuje daleko více chronických vzestupů koncentrace troponinu. Proto je důležité hodnotit kinetiku vzestupu a poklesu koncentrace ctn v několika následujících odběrech pro odlišení akutního a chronického poškození myokardu. Odběr vzorku by se měl provádět při příjmu pacienta a po dalších 6-9 (případně ještě po 12-24) hodinách. Akutní proces se manifestuje vzestupem koncentrace ctn, zatímco u chronických stavů (renální selhání, stabilní angina pectoris, chronického srdečního selhání atd.) zůstává ctn bez výrazných změn. Vysoce citlivými metodami se hledají hodnoty krátkodobých a dlouhodobých biologických variabilit (CVi, CVg) a kritické diference (RCV) pro stanovení kardiálních troponinů (Tab. 2) (16,17). Tab 2. Biologické variability kardiálních markerů (16,17). Hodnoty kardiálních troponinů byly získány high-senzitivními metodami (ctni Errena Singulex a hs-ctnt Roche), CVa - variační koeficient analytický, CVi - variační koeficient individuální, CVg - variační koeficient skupinový, II - index individuality, RCV kritická diference marker CVa, % CVi, % CVg, % II RCV, % čas akutní markery CK ,52 72,2 den CK-MB, aktivita 29 4,9 14 0,35 81,8 den CK-MB, mass 6, ,3 54,4 den myoglobin ,38 61,2 den ctni 8,3 9,7 57 0,21 +46, -32 hodina c TnT 53,5 48,2 85,9 0,84 84,6 hodina chronické markery myoglobin 6, ,80 35,0 týden CRP 5, , týden MPO ,2 100 týden BNP 8, , týden NT-proBNP 3, ,0 98 týden NT-proBNP 1, ,9 92 týden ctni ,39 +81, -45 týden ctnt ,4 315 týden 19

20 Metody stanovení troponinů Metody na stanovení srdečních troponinů používané v klinické praxi jsou vesměs založené na imunochemických principech. Používané soupravy na stanovení troponinu I jsou produkovány řadou výrobců a jak je u imunochemických metod obvyklé, odlišují se použitými protilátkami a způsoby detekce komplexů antigenprotilátka. Následky této skutečnosti jsou pro klinickou praxi nepříjemné, je třeba vzít na vědomí, že různé analytické systémy měření troponinů poskytují nesrovnatelné číselné výsledky, vykazují velmi odlišné hodnoty 99. percentilu a rozdílné hodnoty přesnosti měření. Logickým důsledkem jsou pak rozdílné počty pozitivních a negativních klinických klasifikací akutního koronárního syndromu (6). V roce 2008 byla publikována práce srovnávající 14 různých systémů na stanovení troponinu I od 10 různých výrobců (18). Všechny systémy měly různou použitou sestavu protilátek, kromě dvou systémů Abbott, ty však používaly různé detekční substráty a metody. U všech systémů byly odlišné meze detekce a rozhodovací limity. U 5 sytémů byly hodnoty 99. percentilu referenční populace nižší než trojnásobek meze detekce (LOD), což je analyticky nepříznivá skutečnost a pouze u 4 systémů pak bylo možné na úrovni koncentrace 99. percentilu dosáhnout přesnosti CV 10%. V roce 2010 bylo testováno 5 systémů na stanovení high-senzitivního ctni. Ani jeden nebyl schopen dosáhnout přesnosti CV 10% pro hodnotu 99. percentilu. Jen u jednoho systému byl 99. percentil větší než trojnásobek meze detekce (11). K vyšší úrovni harmonizace výsledků ctni by měla přispět návaznost metod na referenční standard SRM -NIST 2921 (19). Nejcitlivější metodou na stanovení ctni je imunoanalýza založená na počítání jednotlivých částic Erenna (Singulex, Alameda, USA) s limitem detekce 0,2 ng/l a CV<10% při koncentraci 0,78 1,6 ng/l (20). Takto senzitivní metodou je možné stanovit přesnou koncentraci ctni téměř u všech zdravých lidí. Distribuce koncentrací ctni u zdravých dárců krve je znázorněna na obrázku (Obr. 1). 20

21 Obr. 1: Naměřené koncentrace ctni metodou Erenna Singulex ve zdravé referenční populaci, převzato z (20). Produkce souprav ke stanovení ctnt je dosud omezena jen na jednoho výrobce. V roce 2010 byla publikována validace nové high-senzitivní metody využívající principu elektrochemiluminiscenční imunoanalýzy (ECLIA) (12). Metoda vykazuje mez detekce LOD=5 ng/l, rozsah měření ng/l a hodnotu 99. percentilu 14 ng/l, při které je přesnost CV=9,0% (n=616). Citlivost a reprodukovatelnost je dle požadavků doporučení (9,10,14) dostatečná, ale výsledky srovnání původní a nové generace metody nejsou v nízkých koncentracích troponinu T příliš uspokojivé. Na hladině cut-off původní metody (30 ng/l) dává ultrasenzitivní metoda přibližně o 75% vyšší výsledky, což může být způsobeno problémy s kalibračními materiály a jejich návazností na referenční materiál (12,21). Nově publikovaná data (22) o této metodě ukazují 100% diagnostickou senzitivitu a 100 % negativní prediktivní hodnotu (NPV) při naměřené koncentraci hs-ctnt menší než 3 ng/l. To umožní rychlé vyloučení AIM u těchto pacientů již v době přijetí pacienta podezřením na AIM (již do 3 hodin po nástupu bolestí na hrudi). Pro koncentraci 99. percentilu (cut-off=14 ng/l) je pak senzitivita 85,4%, specificita 82,4% a NPV 96,1%. Ve srovnání s předchozí generací metody je u hs-ctnt stanovení vyšší senzitivita, NPV a plocha pod ROC křivkou (Obr. 2), ale nižší specificita. 21

22 Obr. 2: ROC křivka hs-ctnt versus ctnt 4. generace, převzato z (22). 22

23 CKMB izoenzym kreatinkinázy MB izoenzym kreatinkinázy (CKMB) je tkáňově nespecifický marker nekrózy kardiomyocytů a v současnosti představuje náhradní alternativu v případech, kdy není k dispozici stanovení srdečních troponinů. Standardem je stanovení hmotnostní koncentrace CKMB (CKMB mass) imunochemickými technikami. Dříve používané stanovení aktivity CKMB se již nedoporučuje vzhledem k nižší diagnostické senzitivitě a speciticitě v porovnání s CKMB mass (9). CKMB se kromě myokardu v malé míře nachází i v kosterním svalstvu, bránici, děloze, prostatě a jiných orgánech. Pro rychlejší kinetiku vzestupu, ale hlavně vzhledem k poklesu sérových koncentrací po vzniku nekrotického ložiska v srdeční svalovině je zatím CKMB mass kardiomarkerem první volby k detekci reinfarktu v době, kdy v krvi ještě přetrvává vysoká koncentrace troponinů (10). K vzestupu koncentrace CKMB v krvi při nekróze kardiomyocytů dochází za 3 až 10 hodin po začátku onemocnění, koncentrace dosahuje maxima přibližně za 24 hodin a vrací se k normě do 48 až 72 hodin. Časování odběrů je obdobné jako u kardiálních troponinů (8) Myoglobin Myoglobin je cytosolový, kyslík vážící protein příčně pruhovaného svalstva. Vzhledem ke své nízké relativní molekulové hmotnosti (17 kda) uniká při nekróze rychle do lymfatického a krevního oběhu. K vzestupu koncentrací myoglobinu v krvi dochází již 1 až 2 hodiny po začátku onemocnění, koncentrace kulminují během 4 až 10 hodin a vracejí se k normě do 24 hodin. Stanovení myoglobinu se používá hlavně k časné diagnóze akutního koronárního syndromu (AKS) u nemocných, u kterých došlo k příznakům onemocnění v době, kdy ještě nedošlo k vzestupu koncentrace troponinů měřených méně citlivými metodami. Pro vyloučení diagnózy AKS je významná hlavně vysoká negativní prediktivní hodnota stanovení myoglobinu do 6 hodin po začátku onemocnění (přes 90%). Dále je myoglobin použitelným markerem k detekci reinfarktu v době, kdy v krvi přetrvává vysoká koncentrace ctn (8). Myoglobin je časný, ale orgánově nespecifický marker nekrózy myokardu. Vzestup jeho koncentrace v krvi však může být nespecificky podmíněn poškozením struktury kosterního svalstva. Jeho 23

24 stanovení je také limitováno u pacientů s poruchou funkce ledvin (falešně pozitivní výsledek u pacientů s renálním selháním) Natriuretické peptidy Natriuretické peptidy (NP) jsou v klinické praxi hodnoceny coby indikátory selhávání srdce jako pumpy bez ohledu na jeho etiologii. Do krevního oběhu se vyplavují jako projev aktivace jednoho ze základních neurohumorálních systémů regulace srdeční výkonnosti. Natriuretické peptidy jsou cirkulující hormony, významně zasahující do homeostázy vody a iontů. Jsou produkovány v řadě orgánů, klinicky nejvýznamnější je jejich syntéza v myokardu. Způsobují vzestup glomerulární filtrace, natriurézy a diurézy, v cévách vasodilataci společně s dalšími vasodilatačně působícími látkami (prostaglandiny). Blokují neurohumorální systém renin-angiotenzin-aldosteron a působí jako antagonisté adrenergního systému (sympatiku). Mezi NP patří několik strukturálně podobných peptidů: síňový NP (ANP), urodilatin (izoforma ANP), mozkový NP (BNP), NP typu C (CNP) a další. Mimo to byla popsána řada dalších peptidů s natriuretickými vlastnostmi (adrenomedulin, bradykinin) (8,23). Síňový natriuretický peptid (ANP) je syntetizován ve svalovině srdečních síní, méně komor, jako preproanp (151 AMK). Během transportu do sekrečních granulí v cytosolu síňových kardiomyocytů se odštěpuje signální peptid a vzniká proanp. Vlivem stimulu (zvýšení napětí stěny síní) je proanp štěpen na NT-proANP a aktivní ANP. Uvolnění ANP je okamžité, řádově v desítkách sekund až v minutách (8,23). Mozkový natriuretický peptid (BNP) není skladován analogickým způsobem a je za normálních okolností velmi málo syntetizován svalovinou síní a komor. Vzestup jeho koncentrace v krvi je dán rychlostí aktivace jeho syntézy v kardiomyocytech komor hlavně za patologických stavů. Nejsilnějším stimulem je tlakové přetížení komor. Vzestup koncentrace BNP v krvi je však velmi rychlý, řádově v minutách až desítkách minut. Tvorba prekurzorů BNP je obdobná jako u ANP (8,23). Podle dosud zveřejněných mezinárodních doporučení (9,24) poskytuje stanovení BNP i NT-proBNP rovnocenné klinické informace. Výsledek vyšetření přispívá především k diferenciální diagnostice kardiální a extrakardiální etiologie dušnosti. 24

25 U nemocných s klinicky dominující dušností se provádí odběr ihned při přijetí. Kontrolní vyšetření se pak provádí den po přijetí a s odstupem 1-2 týdnů. Výsledky vyšetření také přispívají ke stratifikaci rizika vývoje kardiovaskulárních onemocnění a srdečního selhání. Například Blankenberg et. al. ve studii MONICA (Monitoring of Trends and Determinations of Cardiovascular Disease) vyhodnotili potenciální přínos 30 biomarkerů desetiletého sledování rizika vývoje kardiovaskulárních onemocnění. Studie shrnovala 9 metabolických procesů ve spojení s aterosklerózou: lipidové biomarkery, markery funkce ledvin, metabolické markery diabetu a obezity, markery funkce cév a neurohumorální aktivity, markery zánětu, markery oxidačního stresu a antioxidanty, koagulační markery, markery angiogeneze a markery nekrózy. Markery BNP, NT-proBNP, ctni a CRP se zdají být nejlepšími prediktory rizika kardiovaskulárních příhod (25). V současnosti se běžně komerčně dostupnými soupravami stanovují ANP, BNP, jejich prekursory (probnp) a fragmenty (NT-proANP, NT-proBNP). V případě BNP, NT-proBNP a probnp jsou všechny formy v krvi přítomny současně. V různých analytických systémech se na výsledku podílí určitou mírou zkřížená reaktivita forem BNP, probnp nebo NT-proBNP. V současnosti neexistuje srovnatelnost mezi výsledky měřicích systémů a není ani dostupný primární referenční materiál (8,23). Dále se pak v souvislosti se srdečním selháním začínají na trhu objevovat testy pro další molekuly např. fragmenty NP, copeptin, galectin-3, ST2 receptor interleukinu-1 nebo matrixové metaloproteinázy (26,27). Některé z těchto molekul mají obdobnou diagnostickou senzitivitu a specificitu jako NP a mohou být užitečné při stratifikaci rizika u těchto pacientů Nové markery ischemie nebo nekrózy myokardu V současné době se kromě běžně používaných kardiálních markerů objevují nové molekuly, které mají potenciál stát se dobrými ukazateli poškození myokardu. Mezi nové markery ischemie a nekrózy myokardu patří: srdeční typ proteinu vázajícího mastné kyseliny (h-fabp), BB izoenzym glykogenfosforylázy (GPBB), ischemií modifikovaný albumin (IMA) a volné mastné kyseliny (FFA). 25

26 Kromě těchto molekul může být spektrum markerů ischemie a nekrózy myokardu doplněno o karboanhydrázu III (CA III), která slouží k odlišení poškození srdečního a kosterního svalu, protože se v kardiomyocytech nevyskytuje Protein vázající volné mastné kyseliny (FABP) Jedním z nových slibných kardiomarkerů je srdeční typ proteinu vázajícího mastné kyseliny (heart type fatty acid binding protein, h-fabp). Poprvé byl nalezen v séru po poškození myokardu v roce 1988 (28). Po několika studiích bylo objeveno jeho možné využití jako časného biochemického markeru poškození myokardu a ukazuje se, že by mohl být efektivnějším kardiomarkerem než myoglobin v prvních hodinách po vzniku infarktu myokardu (29,30,31) a možným markerem pro hodnocení prognózy po AKS (30). Hladina h-fabp vzrůstá 1-3 hod po propuknutí příznaků AIM, vrcholu dosahuje během 6-8 hodin a do fyziologických hodnot se jeho koncentrace vrací po 2 dnech. Vzestup h-fabp však není specifický jen pro nekrózu myokardu, ale jeho koncentrace se zvyšuje i při ischemii (32) Funkce a biochemie FABP Proteiny vázající mastné kyseliny jsou relativně malé cytoplazmatické proteiny (15 kda), náležící do rodiny intracelulárních lipidy transportujících proteinů. Hojně se vyskytují ve všech tkáních s aktivním metabolismem mastných kyselin. Mezi ně patří jaterní parenchym, střevo a především myokard, kde % energetické spotřeby zajišťuje metabolismus mastných kyselin lipidovou oxidací. Tyto proteiny obsahují aminokyselin a mají z % identickou sekvenci. Jejich terciální struktura se podobá škebli s otevřenými lasturami, mezi které se váže ligand pomocí interakcí se specifickými aminokyselinami uvnitř vazebné kapsy. Primární funkcí FABP je umožnit intracelulární transport mastných kyselin s dlouhými řetězci. Další funkce zahrnují regulaci genové exprese a předpokládanou ochranu buněk proti efektům lokálně vysoké koncentrace mastných kyselin s dlouhými řetězci během tkáňové ischemie. 26

27 Buněčná exprese FABP je primárně regulovaná na úrovni transkripce a je ovlivňována změnami v metabolismu lipidů např. během tkáňové ischemie, vytrvalostního tréninku, diabetu, orgánové hypertrofie nebo hypolipidemické léčby (29,33). Proteiny vázající mastné kyseliny byly detekovány ve všech lidských tkáních. Díky jednoduchým mutacím vznikly rozdílné izoformy těchto proteinů, které se liší fyzikálními vlastnostmi, hlavně izoelektrickým bodem. Zatím bylo identifikováno devět subtypů FABP, které se liší tkáňovou distribucí a poločasem života v intracelulárním prostředí (2-3 dny). Typy proteinů vázajících mastné kyseliny jsou pojmenovány podle tkání, kde byly poprvé objeveny. Některé formy jsou tkáňově specifické a jiné se mohou vyskytovat ve více různých tkáních. Tkáňově specifické jsou například mozkový (b-fabp) a střevní typ (i-fabp). Srdeční typ (h-fabp) se hojně vyskytuje v kardiomyocytech, méně v buňkách kosterního svalstva, distálních tubulů, specifických částí mozku, střeva, mléčné žlázy a placenty. Jaterní izoforma (l-fabp) je nejvíce zastoupená v hepatocytech, ale v nízkých koncentracích se nachází také v enterocytech a v buňkách proximálních ledvinných tubulů. Díky multiorgánové expresi některé tkáně obsahují více než jeden typ FABP, což je způsobeno koexpresí různých typů FABP v jedné buňce nebo zastoupením více typů buněk s expresí různých typů FABP ve tkáni (29,33) Metody stanovení FABP Pro stanovení izoforem FABP v biologických materiálech byly vyvinuty různé imunochemické metody. Existují také soupravy určené pro screeningová vyšetření. Tyto testy jsou založené na chromatografické imunoanalýze solubilního h-fabp z plné krve. Vzorek se aplikuje do zóny se specifickými protilátkami, pak prochází přes oblast s konjugátem, který obsahuje značené protilátky pro h-fabp. Nakonec se vzniklý imunokomplex zachytí v detekční linii a přebytek značených protilátek je zachycen v kontrolní zóně. Jedná se o rychlé, ale kvalitativní stanovení. Pro kvantifikaci h-fabp se využívají převážně sendvičové imunoanalýzy (29,31). 27

28 BB izoenzym glykogenfosforylázy (GPBB) Funkce a biochemie GPBB Glykogenfosforyláza ( -1,4-D-glukanortofosfát-D-glukosyltransferáza, EC ) je dimerický enzym složený ze dvou stejných podjednotek. V lidských tkáních jsou přítomny tři izoenzymy glykogenfosforylázy: GPLL, GPMM a GPBB. Izoenzym GPLL je obsažen především v jaterní tkáni a ve všech ostatních orgánech s výjimkou příčně pruhovaného svalstva, myokardu a mozkové tkáně. GPMM se vyskytuje převážně ve tkáních příčně pruhovaného svalstva a zřetelně méně v myokardu. Izoenzym GPBB je protein o délce 862 aminokyselin a molekulové hmotnosti 94 kda. Není orgánově specifický, kromě mozku a myokardu se nachází v malém množství také v leukocytech, slezině, ledvinách, močovém měchýři, testes, v zažívacím traktu a v aortě. (33). Izoenzymy GP jsou kódovány odlišnými geny a mohou také mít různé funkční a imunologické vlastnosti. Přibližně 80 % sekvence aminokyselin je u všech tří izoenzymů identických. Rozdíly ve struktuře jednotlivých forem jsou patrné hlavně na C-terminálním konci, který je katalytickou doménou enzymu. GPBB hraje důležitou roli v regulaci metabolismu cukrů. Katalyzuje první krok glykogenolýzy, v němž se glykogen konvertuje na glukóza-1-fosfát za využití anorganického fosfátu. Aktivita GP je allostericky regulována vazbou s AMP a fosforylací. Fyziologická role GP je poskytnout energetickou zásobu pro svalovou kontrakci. V kardiomyocytech je GP vázána s glykogenem a tvoří se sarkoplazmatickým retikulem makromolekulární komplex. Stupeň zapojení GP v tomto komplexu záleží v podstatě na metabolickém stavu myokardu. V případě tkáňové hypoxie je konvertována GP na svou aktivní formu za katalýzy fosforylázakinázou a následně je rozkládán glykogen. Tím GP přechází z formy strukturálně vázané na sarkoplazmatické retikulum do solubilní cytoplazmatické formy. Okamžitě tak vzniká velký koncentrační gradient GP v sarkoplazmatickém retikulu. Když se zároveň zvýší permeabilita buněčné membrány je GP uvolněna z buňky. Uvolnění GP z myokardu při hypoxii a nedostatku živin bylo pozorováno na izolovaných krysích nebo králičích srdcích. Míra uvolnění GP korelovala s obsahem zbytkového glykogenu. Experimentální navození glykogenolýzy 28

29 pomocí dávky adrenalinu nebo pokusy s poškozením membrány po podání imipraminu vedly k závěrům, že na uvolnění GPBB z myokardu je potřeba obou podmínek, jak navození glykogenolýzy tak i zvýšení permeability buněčné membrány. Obě podmínky jsou splněny během ischemie myokardu, proto je GPBB slibný analyt pro detekci ischemického poškození myokardu (34). Dosavadní pozorování ukazují, že GPBB je velmi citlivý marker myokardiální nekrózy a ischemie s časným vzestupem hodnot po AIM za 2-4 hodiny po začátku bolesti, vrcholu dosahuje za 6-20 hodin a k normě se navrací za 1-2 dny. Další studie ukazují, že ke zvýšení hodnot může dojít i v průběhu ischemie myokardu bez nekrózy například v průběhu perkutánních koronárních intervencí, aortokoronárních bypasů apod. (34,35) Metody stanovení GPBB Stejně jako u h-fabp jsou také metody stanovení GPBB založeny na imunochemických reakcích. Pro stanovení GPBB u lůžka pacienta existuje stripový test založený na principu chromatografické imunoanalýzy. Druhou již kvantitativní variantou je stanovení klasickou ELISA technikou, která naopak není vhodná pro statimové měření vzorků. Pro praktické využití je zapotřebí technologie, která kombinuje výhody obou předchozích metod. Zajišťuje kvantitativní analýzu a rychlou diagnostiku GPBB Ischemií modifikovaný albumin (IMA) Mezi nové markery odrážející stav myokardu patří také ischemií modifikovaný albumin (IMA). Během srdečního selhání vznikají kyslíkové radikály, které způsobují zánět a nekrózu myocytů. Předpokládá se, že během ischemie a reperfúze myokardu vytvořené volné reaktivní formy kyslíku jako jsou hydroxylové radikály či superoxid modifikují N-terminální konec molekuly albuminu (36). Stanovení ischemií modifikovaného albuminu je založeno na pozorování, že změněná molekula má sníženou svoji afinitu pro vazbu s kobaltem. Velmi rychle byl vyvinut test na měření vazebné kapacity albuminu pro kobalt albumin cobalt binding test (ABC test) (35,37,38). 29

30 Ke zvýšení hladiny IMA dochází v průběhu ischemie myokardu a to i v nepřítomnosti nekrózy. Tento fakt lze využít k odlišení bolestí na hrudi ischemického původu od bolestí jiné etiologie, ale nelze tímto testem odlišit ischemii od nekrózy myokardu. Další nevýhodou tohoto kardiomarkeru je i skutečnost, že ke zvyšování jeho hladiny dochází i při jiných patologických stavech. K nespecifickému vzestupu koncentrace IMA dochází také při jaterních chorobách, selhání ledvin, vytrvalostním běhu, ischemii centrálního nervového systému a gastrointestinálního traktu, ne však při ischemii kosterního svalstva (8,33). Důležité je rovněž správné načasování odběru krve. IMA má proti jiným markerům srdečního poškození velmi rychlou kinetiku vzestupu koncentrace. K růstu plazmatické hladiny dochází již po několika minutách ischemie a k normě se zvýšené hodnoty vracejí během 6 až 12 hodin (8). Pro klinickou praxi jsou důležité studie prokazující vztah zvýšení IMA u pacientů s ischemií myokardu. Bylo prokázáno, že ke zvýšení IMA dochází také po perkutánních koronárních intervencích (36). IMA vykazuje v souboru pacientů s bolestmi na hrudi dobrou diagnostickou senzitivitu, specificitu a vysokou negativní prediktivní hodnotu (37). Diagnostická senzitivita IMA je při přijetí nemocných v časné fázi AKS vyšší než pro ctn. Vyšetření je používáno k časnému vyloučení ischemie u nemocných s bolestí na hrudi a nízkou prevalencí akutního koronárního syndromu (8). Právě zde by tento marker mohl posloužit jako pomocný ukazatel k rozhodnutí, zda nemocného propustit domů, nebo ho hospitalizovat a dále podrobně vyšetřovat Volné mastné kyseliny (FFA) Volné mastné kyseliny, známé také jako neesterifikované mastné kyseliny, slouží jako fyziologicky důležitý energetický substrát po jejich uvolnění z adipocytů lipolýzou triglyceridů. Volné mastné kyseliny cirkulují v plazmě v koncentraci 0,1-1,0 mmol/l a jsou převážně vázané na albumin. Vysoké hladiny FFA jsou spojené s inzulinovou rezistencí, poškozením jater, arteriální hypertenzí, aterosklerózou a dysfunkcí myokardu. Některé klinické studie ukazují, že u pacientů se srdečním selháním a akutním koronárním syndromem roste hladina 30

31 volných mastných kyselin. Mechanismus zvýšení FFA po ischemii není zatím plně objasněn, předpokládá se, že se na něm podílí zvýšení katecholaminů v krvi, ischemií aktivovaná lipolýza tukové tkáně, hydrolýza lipidů v myokardu, změny metabolismu a energetického substrátu v myokardu (7). Měření volných mastných kyselin je výrazně limitováno intra-individuálním rozsahem, který je ovlivněn stravovacími návyky a stresovými situacemi. FFA jsou obvykle měřeny enzymatickou metodou, ve které jsou nejprve aktivovány acyl-coa (CoA)-syntetázou na acyl-coa. Ten je pak oxidován na enoyl-coa. V této reakci vzniká peroxid vodíku, který dál reaguje se substrátem za katalýzy peroxidázou, barevný produkt reakce je měřen fotometricky (39) Karboanhydráza III (CA III) Karboanhydrázy (CA) jsou zinečnaté enzymy, které katalyzují reverzibilní hydrataci oxidu uhličitého za vzniku hydrogenuhličitanu a vodíkového kationtu (CO 2 + H 2 O HCO H + ). U savců se vyskytuje 16 izoenzymů CA s rozdílnou subcelulární lokalizací a tkáňovou distribucí. Existují formy cytosolové, mitochondriální, vázané na membrány a sekreční. Tři formy CA jsou také známé jako tzv. CA related proteins (proteiny spojené s CA, CARP) (40). Karboanhydráza III (CAIII) není ve své podstatě kardiálním markerem. Je to hlavní cytoplazmatický protein (28 kda) kosterního svalstva, který zprostředkovává facilitovanou difúzi CO 2 do krevních kapilár. Vysoké koncentrace tohoto izoenzymu byly objeveny v adipocytech. V kardiologické diagnostice by mohla být CA III markerem používaným k odlišení poškození myokardu od kosterního svalstva, protože se v myokardu nevyskytuje. Kombinované určení sérové hladiny CA III a myoglobinu zvyšuje diagnostickou specificitu a senzitivitu stanovení myoglobinu jako časného markeru pro AIM. Při poškození myokardu by hladina CAIII měla zůstat v normě, zatímco sérová koncentrace myoglobinu by měla být zvýšená. Při poškození kosterní svaloviny je poměr MYO/CAIII přibližně 3:1. Oba analyty najednou se uvolňují při tělesné námaze a u pacientů s neuromuskulárním onemocněním (41,42). 31

32 Markery zánětlivé reakce Jako markery zánětlivé reakce se v kardiologické diagnostice mohou používat ty markery, které souvisí s destabilizací aterosklerotického plátu. Tyto markery mohou přispívat k časné stratifikaci vysokého rizika vývoje akutního koronárního syndromu (AKS). V současnosti však většinou pro tyto analyty chybí standardizované metody stanovení, a především kriticky zhodnocené závěry velkých klinických studií o skutečném přínosu jejich stanovení C-reaktivní protein (CRP) U nemocných s klinickou symptomatologií AKS (ischemií nebo nekrózou myokardu) nastává vzestup koncentrace CRP především v důsledku nespecifické reakce organismu na akutní zátěž. Koncentrace CRP vyšší než 15 mg/l při přijetí nemocného a v časné fázi onemocnění jsou spojeny s vysokým rizikem nepříznivého vývoje onemocnění. Při primární prevenci koronární nemoci a u kardiálně stabilizovaných nemocných s AKS jsou přetrvávající koncentrace CRP vyšší než 3 mg/l spojeny s vysokým rizikem rekurentního onemocnění, koncentrace nižší než 1 mg/l s nízkým rizikem. Význam změn CRP pro predikci vzniku AKS, pro stanovení diagnózy a volbu léčby není dosud průkazný. Interpretaci koncentrací CRP v krvi znesnadňuje jeho vysoká biologická a analytická variabilita (8) CD40 ligand (CD40L) CD40L je protein buněčné membrány trombocytů, buněk hladkého svalstva a makrofágů. Zvýšení CD40L bylo zjištěno u zánětlivých onemocnění, hypercholesterolemií a diabetu. Při aktivaci imunitních reakcí v destabilizovaných aterosklerotických placích je uvolňován CD40L do krve v solubilní formě jako scd40l a je markerem aktuální trombogenní aktivity. Zvýšené hodnoty CD40L byly nalezeny u pacientů s AKS. Stanovení koncentrace CD40L může pomoci odhalit pacienty se zvýšeným rizikem trombózy a může být užitečným indikátorem nestability aterosklerotického plátu u AKS ve spojení s markery 32

33 srdeční ischemie. U pacientů s troponin negativními AKS měla skupina nemocných se zvýšeným CD40L 3,4x vyšší mortalitu (7,35) Myeloperoxidáza (MPO) Myeloperoxidáza (MPO) je enzym secernovaný aktivovanými neutrofily, monocyty a makrofágy v průběhu destabilizace aterosklerotických plaků. Vysoké koncentrace MPO jsou udávány jako rizikový faktor pro nástup srdeční příhody u pacientů s AKS. MPO je také prezentována jako marker predikce rizika mortality a kardiogeního šoku u pacientů se STEMI (7,35) Pregnancy associated plasma protein A (PAPP-A) PAPP-A je glykoprotein (200 kda) syntetizovaný syncyciotrofoblastem v průběhu těhotenství a je známý jako biochemický marker v oblasti sledování vrozených vývojových vad (Downův syndrom). Kromě toho se v poslední době začaly objevovat informace o jeho možném využití v kardiologické diagnostice. PAPP-A patří do skupiny insulinu podobných růstových faktorů a má metaloproteinázovou aktivitu. Podílí se na destrukci fibrózního krytu aktivovaného plaku (8). PAPP-A je přítomen v lidských fibroblastech a při ruptuře nestabilního aterosklerotického plátu je uvolňován do cirkulace. Některé studie ukázaly že u pacientů s troponin negativními AKS predikuje PAPP-A vysoké riziko. Korelace mezi PAPP-A a ctni nebo CKMB je špatná, což ukazuje, že zvýšení PAPP-A neindikuje nekrózu myokardu. Současná pozorování ukázala, že PAPP-A je spíše nezávislým prediktorem výskytu ischemie a může pomoci při indikaci koronárních intervencí. (35,43,44,45) Placentární růstový faktor (PIGF) PIGF je další z molekul studovaných v souvislosti s procesy ischemie a nekrózy myokardu. PIGF patří do rodiny proteinů odvozených od destiček s funkcí chemoatraktantu pro monocyty. Vyskytuje se ve dvou izoformách PIGF-1 a PIGF-2. Jeho produkce byla prokázána také v řadě tkání (štítná žláza, plíce, placenta), avšak jeho funkce nebyly zatím plně objasněny. Předpokládá se, že by 33

34 mohl sloužit jako biomarker stability či ruptury aterosklerotického plátu, méně pak ischemie a změn hemostázy v průběhu AKS. PIGF hraje významnou roli v regulaci růstu a funkce cévního endotelu. Podle zatím ne četných sdělení se plazmatický PIGF ukazuje jako nezávislý ukazatel nepříznivého vývoje u nemocných s AKS (35,43,46) Cholin Cholin a fosfatidová kyselina jsou hlavními produkty štěpení fosfolipidové membrány účinkem fosfolipázy D. Při lipolýze fosfolipidů v aktivovaném plaku dochází k uvolňování a vzestupu koncentrace cholinu v krvi. Aktivace fosfolipázy D je považována za jeden z klíčových faktorů destabilizace koronárního plátu. Předpokládá se, že roli zde mohou hrát stimulace makrofágů, oxidovaný LDL, změny aktivity matrixových metaloproteináz, aktivace destiček kolagenem či trombinem a podpora vazby fibrinogenu na receptor IIb/III glykoproteinu. Prozatím je stanovení cholinu laboratorně obtížné (HPLC-MS) a je nutný vývoj použitelné diagnostické soupravy (7) Cytokiny a adhezní molekuly Cytokiny a adhezní molekuly mohou být sledovány jako prozánětlivé a protizánětlivé markery účasti imunitního systému během kardiovaskulárních onemocnění Proteomika a proteinové biočipy V posledních letech se použití biočipové technologie rozšiřuje z oblasti výzkumu genomiky a proteomiky i do klinických laboratoří. Proteinové čipy mohou být využity pro kvalitativní i kvantitativní analýzy a studium vzájemných interakcí proteinů. Z pohledu biochemie jsou čipy používány pro výzkum nových a analýzy současných diagnostických a prognostických markerů. Při pohledu do historie začal vývoj metod proteomiky již v polovině 19. století. Jeden z prvních laboratorních testů na stanovení proteinu byl průkaz Bence- 34

35 Jonesovy bílkoviny v moči. Od té doby byly vyvinuty různé analytické testy pro stovky proteinů v biologických materiálech, přičemž se jednalo jak o metody separační či fotometrické, tak o metody založené na imunologických principech. V roce 1994 pak vznikl pojem proteomika jako název samostatného vědního oboru. Nové postupy proteomiky využívající technik chromatografie v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (např. MALDI-TOF MS) umožňují analýzu stovek proteinů, jejich identifikaci, kvantifikaci a také odhalení jejich strukturálních modifikací (47). Preanalytická příprava vzorků je však obtížná. Jednotlivé složky proteinového komplexu v biologickém materiálu je nejprve nutné odseparovat, k čemuž se využívají elektroforetické, či chromatografické postupy, nebo je možné proteiny ze směsi vychytávat pomocí vazby s protilátkami. Jednotlivé proteiny je dále nutné štěpit na menší fragmenty. Upravený vzorek se nakonec vnáší do analytického systému. Tyto postupy jsou z pohledu biochemika vhodné pro identifikování nových neznámých potenciálních biomarkerů, využití těchto technik v praxi je ale zdlouhavé. Vzhledem k rychlosti provedení jsou hledány postupy jednoduché a dobře automatizovatelné, které by bylo možné využívat případně i ve statimovém režimu laboratoří. Do této kategorie metod patří různé techniky, mezi než můžeme zahrnout také proteinové biočipy Multiplexní analýza proteinovými čipy Podstatnou výhodou analýzy proteinů s využitím biočipových technologií je simultánní stanovení několika analytů z minimálního množství vzorku při spotřebě minimálního množství reagencí. Metody využívající klasických proteinových biočipů umožňují rychlé kvalitativní či kvantitativní stanovení se snadnou preanalytickou přípravou vzorku. Rychlý rozvoj metod v posledních letech již také nabízí v některých případech možnost automatizace analýzy. Na malých destičkách jsou v miniaturních, přesně definovaných pozicích (spotech) imobilizované proteiny sloužící k vyvázání analytu ze vzorku. Imunochemická reakce probíhá po napipetování vzorku a příslušných ředících roztoků do jamky s biočipem. Imunochemické čipy využívají jak kompetitivní tak sendvičové techniky. Pipetování příslušných reagencií na biočip je prováděno 35

36 buď manuálně nebo v některých případech již plně automaticky. Pro detekci signálu se nejčastěji používají chemiluminiscenční nebo fluorescenční reakce. Záření z jednotlivých spotů snímají tzv. CCD-kamery (charge-coupled device). V některých případech jsou protilátky naspotované na dno mikrotitračních destiček (Nanodot Array Luminometric Immunoassay, NALIA). Detekční systémy jsou vybaveny CCD systémy pro skenování jednotlivých jamek v destičce (48). U biočipových systémů Evidence a Evidence Investigator firmy Randox je princip založen na enzymoimunoanalýze (křenová peroxidáza) a na reakci produkovaného peroxidem vodíku s luminolem. Délka analýzy se pohybuje okolo 2 hodin v závislosti na používaném diagnostickém panelu a je nutné zpracovávat větší sérii vzorků najednou. Z těchto důvodů nejsou přístroje zatím využitelné pro statimové vzorky. Naproti zmiňovaným nevýhodám je zde ale zajímavé široké spektrum nabízených panelů metod. Existují soupravy pro stanovení kardiálních markerů (49-52), tyroidních hormonů (53), cytokinů, adhezních molekul, pohlavních hormonů, nádorových markerů nebo toxikologických nox. Pro všechny tyto panely jsou dodávány směsné kalibrátory a vzorky pro vnitřní kontrolu kvality na třech koncentračních úrovních. Výhodou systému Evidence je již plná automatizace analyzátoru. U této verze odpadá nutnost manuální přípravy vzorku, ale stejně jako Evidence Investigator pracuje tento automat s panely pro sérii biočipů. Nejnovější variantou analyzátoru je automatický Evidence Multistat, který umožňuje statimový provoz. Došlo zde ke zkrácení doby inkubace na přibližně 20 minut a přístroj je vybaven systémem pro práci s jednotlivými čipy. Bohužel spektrum možných biočipových panelů je zatím pro tento typ analyzátoru omezeno na stanovení kardiálních markerů a toxikologických nox (54). V rozvoji techniky imunochemických biočipů nezůstávají pozadu ani další firmy. Společnost Roche Diagnostics má ve vývoji panel pro stanovení kostních markerů. Technologie je označována názvem Immunological MultiParameter Chip Technology (IMPACT). Na polystyrenový čip s vrstvou streptavidinu jsou naspotované biotinylované protilátky, druhá monoklonální protilátka je značená digoxinem a detekce je zajištěna díky fluorescenčně značené protilátce proti digoxinu. Pro každý marker je na biočipu připraveno spotů a koncentrace je pak vypočtena z průměrné hodnoty signálu naměřené na jednotlivých spotech. Využití opakovaného měření zlepšuje reprodukovatelnost výsledků (55). 36

37 Thermo Fisher Scientific a Meso Scale Discovery dodává kity pro imunochemická stanovení pracující v mikrotitračních destičkách. SearchLight Protein Array Technology (Thermo Fisher Scientific) umožňuje detekci až 300 cytokinů a biomarkerů a nabízí výrobu čipů (printing) na zakázku (56-58) Problémy proteinových biočipů Nově vznikající postupy přináší mnoho výhod, ale i řadu problémů. Mezi nevýhody imunochemických biočipů patří obtížná analytická optimalizace metod. Pro všechny markery v měřeném panelu je třeba sjednotit podmínky detekce, délku inkubace a promývání, zvolit také vhodné ředění. Dalším parametrem, kterým je třeba se zabývat, je srovnání biočipových metod s klasickými imunochemickými technikami a kontrola kvality (59). Publikované studie zabývající se analytickými vlastnostmi imunochemických biočipů ukazují podobné výsledky. Di Serio et al. (60) prezentuje nízkou mezilehlou přesnost u sytému Evidence. Investigator Cardiac Array s variačními koeficienty: 16,4-18,7 % pro MYO, 17,1-19,0 % pro CAIII a 23,7-34,0 % pro GPBB. Elington et al. (59) ve své práci sledoval opakovatelnost u SearchLight Protein Array Technology (Thermo Fisher Scientific). Byly měřeny 2 panely cytokinů (15 markerů) a byla hodnocena nepřesnost měření v dubletech. Byly použity směsné kontroly a plazmatické vzorky. Procentuální zastoupení vzorků s nepřesností (CV%) větší než 10, 20 a 30 % bylo průměrně v 35,2, v 18,2 a v 11,6 % případů Multianalytový přístup a některé klinické aplikace Současná biochemie nabízí možnost simultánního stanovení více parametrů postižení myokardu pomocí technologie proteinových biočipů. Tato multimarkerová strategie umožňuje komplexnější pohled na diagnostiku poškození myokardu. Využití multiplexního přístupu zvyšuje diagnostickou senzitivitu a specificitu biočipového stanovení ve srovnání s jednotlivými testy. 37

38 Z tohoto důvodu může být využití čipové technologie v některých situacích vhodné. Multianalytový přístup k diagnostice je využitelný jak u diagnostiky a stratifikace rizika pacientů s akutními koronárními syndromy (AKS) tak také v dalších oblastech kardiologické diagnostiky Akutní koronární syndromy Akutní koronární syndromy jsou vážnou komplikací v rámci ischemické choroby srdeční a jsou významnou příčinou mortality v současné civilizované společnosti. Klinická manifestace ischemické choroby srdeční zahrnuje němou ischemii, stabilní anginu pectoris, akutní koronární syndromy, srdeční selhání a náhlou smrt. Nemocní s akutními koronárními syndromy (AKS) představují významnou část z těch nemocných, kteří mají jako hlavní symptom bolest na hrudi. Správná a rychlá diagnostika je důležitá, protože všechny formy AKS mohou být provázeny závažnými komplikacemi, včetně úmrtí. Určení diagnózy a stanovení stupně individuálního rizika nemocného je základem pro rozhodnutí o způsobu farmakoterapie a využití některé z metod revaskularizace (perkutánní koronární intervence nebo chirurgické řešení formou aortokoronárního bypassu). Mezi akutní koronární syndromy patří akutní infarkt myokardu (AIM) s elevacemi ST úseků na EKG (STEMI) a akutní koronární syndromy bez elevací ST úseků, mezi které patří AIM bez ST elevací (NSTEMI) a nestabilní angina pectoris (UAP). Na EKG se u AKS bez elevace ST-úseků nejčastěji vyskytují trvalé nebo přechodné deprese ST- úseků, samotné změny vlny T, nebo jen přechodné elevace ST-úseků. U části nemocných může být nález na EKG normální. Nestabilní angina pectoris a NSTEMI infarkt se pak rozlišuje podle přítomnosti zvýšení srdečních markerů. Infarkt myokardu (NSTEMI nebo STEMI) je definován jako akutní ložisková ischemická nekróza srdečního svalu vzniklá na podkladě náhlého uzávěru či progresivního extrémního zúžení věnčité tepny zásobující příslušnou oblast. Akutní infarkt myokardu je charakterizován typickým vzestupem a poklesem biochemických markerů nekrózy myokardu (troponin T či I, CKMB mass) při současné přítomnosti alespoň jednoho z následujících kritérií: a) klinické příznaky ischemie, b) vývoj patologických vln Q na EKG, c) EKG změny svědčící 38

39 pro ischemii (elevace ST či deprese), d) souvislost s koronární revaskularizací (perkutánní koronární intervence, bypass), e) průkaz nové regionální poruchy kinetiky nebo nové ztráty viabilního myokardu zobrazovací metodou (10) Hypertrofická kardiomyopatie Hypertrofická kardiomyopatie je definována morfologicky přítomností hypertrofie myokardu především levé komory při absenci vyvolávající hemodynamické příčiny. Histologický obraz je charakterizován dezorganizací myocytů (myocytární dysarray), fibrózou myokardu a abnormitami drobných cév (61). Jde o onemocnění s autozomálním typem dědičnosti s různou penetrací a odhadovanou prevalencí 1/500. Doposud bylo popsáno více než 400 mutací 11 genů kódujících tvorbu sarkomerických proteinů (62). Onemocnění může probíhat asymptomaticky nebo může nemocného ohrozit komplikacemi (synkopy, srdeční selhání, arytmie či náhlé úmrtí aj.) (63,64). Vzhledem k závažnosti onemocnění existuje snaha o nalezení vhodných biomarkerů pro diagnostiku a stratifikaci rizika tohoto onemocnění (65). Doposud byla s použitím stanovení biomarkerů prokázána v průběhu onemocnění aktivace imunitního systému (66), endoteliální dysfunkce (67), apoptózy, proces vzniku fibrózy (68), degradace extracelulární matrix (69), aktivace koagulace a destiček apod. (63). Dále byla popsána očekávaná zvýšení hladin natriuretických peptidů (ANP i BNP) v souvislosti se zvýšením napětí stěny levé komory srdeční (70,71). Zcela ojediněle se práce zmiňují o mírném zvýšení hladiny srdečních troponinů. Sato a kol. (72) hodnotil koncentraci ctnt u 30 pacientů s hypertrofickou kardiomyopatií a ukázal vztah mezi zvýšením ctnt a změnou funkce levé komory. Pop a kol. (73) zmiňuje zvýšení ctnt po fyzické námaze u 7 pacientů s hypertrofickou kardiomyopatií Monitorování léčby arytmií radiofrekvenční katetrovou ablací Radiofrekvenční katetrová ablace je metoda využívající elektrické energie k poškození tkáně odpovědné za narušení srdečního rytmu. Je metodou první 39

40 volby při léčbě mnoha typů arytmií (např. fluter a fibrilace síní, supraventrikulární tachykardie a některé typy ventrikulárních arytmií) (74,75). Použití léčby radiofrekvenční ablací může způsobit malá poškození myokardu vlivem zvýšené teploty. Když překročí teplota 50 C, dochází k depolarizaci buněk, narušení činosti transmembránových pump a je překročena pufrovací kapacita buňky pro vápenaté ionty (76). Radiofrekvenční katetrová ablace způsobuje myokardiální nekrózu malého rozsahu. Publikované práce ukazují na zvýšení aktivity kreatinkinázy a kardiálních troponinů (77,78) Kardiotoxicita cytostatik Kardiotoxicita je jedním z vedlejších nežádoucích účinků onkologické léčby. Nejčastějšími projevy kardiotoxicity jsou arytmie, ischemie myokardu nebo srdeční selhání. Většina těchto komplikací probíhá akutně v průběhu léčby nebo bezprostředně po jejím ukončení. Největší riziko vývoje kardiotoxicity představují antracyklíny (ANT) (79,80) a vysokodávková chemoterapie (HD-CT) s přípravným režimem zahrnujícím vysokou dávku cyklofosfamidu (81,82). Chronická toxicita antracyklínů se projevuje jako kardiomyopatie a chronické srdeční selhání s časovým odstupem po ukončení léčby. Diagnostika kardiotoxicity je důležitá jak v období léčby, tak po jejím ukončení. Cílem je časná detekce poškození myokardu ještě ve fázi subklinické. Pro monitorování kardiotoxicity v onkologii byly doporučeny různé metody (83,84). V našich podmínkách jsou běžně užívané echokardiografie a elektrokardiografie (85,86). V poslední době se ale objevují zmínky o výzkumu biochemických markerů poškození myokardu (troponiny a natriuretické peptidy) v souvislosti s kardiotoxicitou vyvolanou protinádorovou terapií (87-89). 40

41 6. Experimentální část 6.1. Metody Biočipový Evidence Investigator Cardiac array Pro analýzu kardiálních markerů byl použit diagnostický panel Cardiac Array pro biočipový analyzátor Evidence Investigator (Randox Laboratories, Velká Británie) se spektrem analytů: MB izoenzym kreatinkinázy (CKMB), myoglobin (MYO), BB izoenzym glykogenfosforylázy (GPBB), srdeční typ proteinu vázajícího mastné kyseliny (h-fabp), karboanhydráza III (CAIII) a srdeční troponin I (ctni). Měření kardiálních markerů je založeno na principu sendvičové enzymoimunoanalýzy. Pro detekci značených protilátek je využívána chemiluminiscenční reakce peroxidu vodíku s luminolem katalyzovaná křenovou peroxidázou. Luminiscence je cíleně snímána z jednotlivých spotů na biočipu CCD kamerou. Zobrazovací technologie umožňuje kvantifikovat množství světla vycházejícího z jednotlivých reakčních ploch a software systému signály přepočítá na hodnotu koncentrací analytů ve vzorku Kalibrace Nelineární devítibodová kalibrace je součástí každého setu. Souprava obsahuje devět lyofilizovaných sérových kalibrátorů a elektronické médium s příslušnými koncentracemi analytů. Kalibrace je prováděna vždy se změnou šarže kitů. Vzorky rekonstituovaných kalibrátorů materiálů byly skladovány při -70 C po dobu maximálně 14 dnů Analytické parametry soupravy Vnitřní kontrola kvality byla měřena na třech hladinách koncentrací pomocí kontrolních materiálů dodávaných výrobcem. Vzorky rekonstituovaných kontrolních materiálů byly skladovány při -70 C do doby exspirace. 41

42 Pro ověření údajů o metodě dodávaných výrobcem soupravy byla provedena verifikace analytického postupu a sledování dalších analytických parametrů soupravy pokles signálu (koncentrace analytu) v závislosti na čase od přidání luminiscenčního činidla, vliv zamražování vzorků a ředení Srovnání metod Pro porovnání biočipové technologie Evidence Investigator s rutinně užívanými metodami byla měřena skupina vzorků s širokým rozsahem měřených hodnot. Vzorky byly vybrány jak ze skupin dárců krve, tak od pacientů s diagnózou akutního infarktu myokardu (n=75). Přibližně u poloviny vzorků byl očekáván výskyt patologických koncentrací kardiálních markerů. Hodnotili jsme data naměřená systémem Evidence Investigator (Cardiac array) ve srovnání s výsledky získanými metodami CKMB mass a myoglobin na analyzátoru Elecsys 2010 (Roche) a ELISA testy pro GPBB (Diagenics) a h-fabp (Hycult Biotechnology). Vnitřní kontrola kvality byla testována měřením kontrolních materiálů dodávaných příslušnými výrobci. Všechna měření byla provedena během jednoho dne. Koncentrace myoglobinu, CKMB mass, GPBB a h-fabp získané ve srovnávací studii byly analyzované Passing Bablokovou regresí a Bland-Altmanovou analýzou High sensitivity troponin T Pro doplnění spektra kardiálních markerů měřených na biočipovém analyzátoru bylo provedeno stanovení troponinu T založené na principu imunochemické elektrochemiluminiscenční analýzy (ECLIA). Kardiální troponin T byl měřen novou vysoce senzitivní metodou pro analyzátor Elecsys Troponin T hs (Roche Diagnostics, Německo). Systém pracuje na principu sendvičové imunoanalýzy s využitím dvou monoklonálních protilátek proti lidskému ctnt. Protilátky specificky rozeznávají dva epitopy (úseky aminokyselinového řetězce a ) lokalizované v centrální části molekuly ctnt. Sendvič biotinylovaná protilátka - ctnt - protilátka značená rhuténiovým komplexem se váže 42

43 na mikročástice potažené streptavidinem (vazba biotin-streptavidin). Reakční směs je nasáta do měřící komůrky, kde jsou mikročástice zachyceny magnetickým polena povrchu elektrody a nenavázané složky jsou odstraněny. Napětí na elektrodách dodá excitační energii a vyvolá chemiluminiscenční emisi fotonů, která je zachycena detekčním systémem Kalibrace Kalibrační soubor je vkládán pomocí čárového kódu a kalibrace je adjustována změřením dvou firemních kalibrátorů. Kalibrátory jsou dodávány v lyofilizované formě a po rekonstituci jsou stabilní 3 měsíce při -20 C Analytické parametry soupravy Vnitřní kontrola kvality byla prováděna na dvou koncentračních hladinách s použitím lyofilizovaných kontrolních materiálů dodávaných výrobcem. Vzorky rekonstituovaných kalibrátorů materiálů byly skladovány dle požadavku výrobce. Kontrolní materiál byl stabilní 3 měsíce při - 20 C po rekonstituci. Pro ověření údajů o metodě dodávaných výrobcem soupravy byla provedena verifikace analytického postupu a srovnání metody s předchozí 4. generací metod pro stanovení ctnt Materiál Pro získání zkušeností s panelem kardiálních markerů na přístroji Evidence Investigator (Randox) a s high-senzitivní metodou na stanovení troponinu T bylo provedeno několik předběžných klinických studií. Vzorky do těchto studií byly získané ve Fakultní nemocnici v Hradci Králové. Krev byla standardně odebrána žilním katetrem a do hodiny byla zpracována v laboratoři. Pro obě sledované metody bylo materiálem volby sérum (centrifugace 2500 g, 5 nebo 10 min.). Alikvoty vzorků séra byly skladovány do analýzy při -20 C nebo -70 C. Každý vzorek byl rozmražen pouze jednou, vytemperován na laboratorní teplotu a ihned zpracován. 43

44 6.3. Pacienti Při výběru pacientů zařazených do jednotlivých studií byla navázána spolupráce s I. interní klinikou, Oddělením klinické hematologie na II. interní klinice a Transfuzním oddělením FN a LF v Hradci Králové. Projekty byly schváleny etickou komisí FN a LF UK v Hradci Králové a pacienti podali písemný souhlas s experimentem. 44

45 7. Výsledky a diskuse V mezinárodním doporučení pro diagnostiku AIM je definována hodnota cut-off metod pro stanovení kardiálních markerů jako koncentrace 99. percentilu referenční zdravé populace. Doporučováno je především stanovení kardiálních troponinů. Je zde také kladen požadavek na dostatečnou citlivost metod. Při hodnotě cut-off by metoda měla mít mezilehlou přesnost s CV 10 %. Z tohoto důvodu bylo nutné ověřit analytické parametry používaných souprav Analytické parametry panelu Cardiac Array Vnitřní kontrola kvality - mezilehlá přesnost a správnost Vašatová M, Tichý M, Horáček J M, Pudil R, Horáková L, Palička V. Multianalytový přístup k diagnostice srdečních chorob technologií proteinových biočipů. Čas Lék čes. 2009; 148 (12): Hodnocení kontroly kvality bylo provedeno na základě měření lyofilizovaných kontrolních materiálů (Randox) na třech koncentračních hladinách. Mezilehlá přesnost byla získána v rámci hodnocení vnitřní kontroly kvality mezi jednotlivými sériemi analýz (n = 10). Správnost měření byla hodnocena jako BIAS vypočtený z průměrné hodnoty koncentrací analytů ve vzorcích kontrolních materiálů měřených pro stanovení mezilehlé přesnosti. Volba koncentrací pro kontrolu kvality biočipové technologie u většiny markerů nevyhovuje klinickým potřebám. Kontrolní materiály by měly obsahovat koncentrace normální i patologické. Měření vnitřní kontroly kvality nezasahuje oblast normálních hodnot u všech kardiálních markerů. U CA III jsou naopak všechny koncentrace kontrolních materiálů v referenčních mezích a nezasahují do oblasti hodnot patologických. Tento fakt vyniká hlavně u ctni vzhledem k faktu, že troponiny jsou markerem první volby v diagnostice infarktu myokardu. Správnost a mezilehlá přesnost vypočtená z naměřených hodnot kontroly kvality je shrnuta v tabulce (Tab 3.). Námi stanovené hodnoty jsou ve shodě 45

46 s údaji výrobce ve všech parametrech kromě mezilehlé přesnosti u myoglobinu, kde jsme naměřili vyšší hodnoty variačního koeficientu (11,6-15,6 %) než udává výrobce (8,8-9,5 %). Tab 3. Výsledky hodnocení interní kontroly kvality pro Evidence Investigator Cardiac Array (Randox). analyt c (μg/l) BIAS (%) CV (%) CKMB mass MYO GPBB FABP CAIII CTNI kontrola 1 3,9 86,3 8,4 3,2 4,0 1,6 kontrola 2 13,2 124,6 27,9 18,9 29,6 7,0 kontrola 3 30,9 120,7 68,1 43,8 39,6 12,0 kontrola 1 2,0-7,5-8,8-3,2 5,0-9,1 kontrola 2 2,8-6,5 0,8 5,3-6,0 3,0 kontrola 3 3,6-8,1-1,7-2,4-9,9 0,4 kontrola 1 7,5 13,5 6,6 5,0 7,0 8,7 kontrola 2 6,9 11,6 4,2 5,7 9,3 6,0 kontrola 3 8,6 15,6 7,9 8,7 9,8 9, Linearita měření Pro stanovení linearity měření byly použity lyofilizované kontrolní materiály firmy Randox založené na matrici lidského séra dodávané jako součást panelu Cardiac array. Kontrolní materiál je dodáván na třech koncentračních hladinách (nízká, sřední a vysoká). Pro ověření linearity jsme měřili tyto tři kontrolní vzorky a další dvě koncentrační hladiny jsme získali ředěním kontrolních materiálů v poměru 1:1. Koncentrace analytů ve vzorcích pro ověření linearity (μg/l) jsou uvedeny v tabulkách. Každá koncentrační hladina byla měřena v tripletu a jako výsledná koncentrace je udáván průměr získaných hodnot. Teoretické koncentrace kardiálních markerů v naředěných roztocích a naměřené sérové hladiny jsou uvedeny v tabulkách (Tab 4 a 5.). U všech analytů byla ověřena linearita metody v udávaném rozsahu koncentrací. Rovnice regrese 46

47 a korelační koeficienty pro jednotlivé markery jsou prezentovány v tabulce (Tab 6.). Tab 4. Koncentrace kontrol udávaná výrobcem (osa x): kontrola CKMB MYO GPBB h-fabp CA III CTNI mass (μg/l) (μg/l) (μg/l) (μg/l) (μg/l) (μg/l) 1 4,94 64,55 7,16 6,93 2,15 1,7 2 13,47 90,70 53,68 21,67 14,45 2, ,99 115,58 100,19 36,41 26,74 4, ,52 141,1 146,71 51,14 39,04 5, ,04 166,61 193,22 65,88 51,53 6,66 Tab 5. Průměrná hodnota naměřených koncentrací (osa y): kontrola CKMB MYO GPBB h-fabp CA III CTNI mass (μg/l) (μg/l) (μg/l) (μg/l) (μg/l) (μg/l) 1 4,71 62,49 5,87 6,42 2,01 1, ,57 91,80 38,7 19,51 13,2 3, ,70 103,88 88,67 40,20 24,24 4, ,32 139,61 130,27 45,26 36,71 5, ,32 147,05 172,54 60,23 48,14 6,93 Tab 6. Linearita Rovnice závislosti Korelační koeficient (R 2 ) CK-MB mass (μg/l) y = 1,0002x - 0,0148 0,9980 MYO (μg/l) y = 0,8527x + 10,308 0,9672 GPBB (μg/l) y = 0,9135x - 4,3121 0,9971 h-fabp (μg/l) y = 0,905x + 1,3753 0,9756 CA III (μg/l) y = 0,9386x - 0,2764 0,9996 CTNI (μg/l) y = 1,018x + 0,2254 0,

48 Opakovatelnost Opakovatelnost byla získána opakovaným měřením vzorku směsného séra v sérii na jedné destičce (n=8). Obdobně jako při měření mezilehlé přesnosti byl i při měření vzorků v jedné sérii zjištěn vyšší variační koeficient u myoglobinu (Tab 7). Tab 7. Opakovatelnost analyt CKMB MYO GPBB FABP CA3 CTNI c (μg/l) 5,36 59,17 10,62 5,01 21,45 2,69 CV (%) 5,95 13,03 9,19 8,59 8,07 4, Ředění vzorků Během pokusů jsme zaznamenali problémy s ředěním vzorků. Zkoušeli jsme ředit vzorek séra fyziologickým roztokem (F), ředícím roztokem (AD, assay diluent) a na doporučení firmy promývacím pufrem (WB, wash buffer). V tabulce jsou uvedeny očekávané koncentrace po pětinásobném ředění vzorku séra a hodnoty naměřené při použití různých způsobů ředění (Tab 8.). Tab 8. Ředění vzorků očekávaná hodnota naměřená hodnota (μg/l) procentuální výtěžek (%) (μg/l) F WB AD F WB AD CKMB 13,1 16,05 18,51 19,87 122,5 141,3 151,7 MYO 90,4 2,7 2,7 2,7 3,0 3,0 3,0 GPBB 25,6 14,47 12,77 11,96 56,5 49,9 46,7 FABP 12,0 11,94 13,22 12,36 99,5 110,2 103,0 CA III 22,4 23,7 26,31 20,37 105,8 117,5 90,9 ctni 2,8 3,87 4,35 3,94 138,2 155,4 140,7 48

49 Hlavně u myoglobinu jsme pro různé možnosti ředění nezískali reprodukovatelné výsledky. Očekávaná koncentrace myoglobinu byla 90,4 μg/l, ale naměřené hodnoty myoglobinu v naředěných vzorcích byly na úrovni limitu detekce. Také koncentrace GPBB byla po naředění poloviční oproti očekávané hodnotě. U ostatních analytů nemělo ředění na naměřené hodnoty výraznější vliv. Na náš podnět se firma začala zabývat výrobou ředícího roztoku Citlivost metod Citlivost metod udává výrobce jako limit kvantifikace, hodnotu koncentrace měřitelnou s nepřesností menší než 20 %. Tento fakt je v rozporu s definicí AIM, ve které je požadovaná přesnost měření s variačním koeficientem menším než 10 % Pokles luminiscence v čase Pokles luminiscenčního signálu v čase byl sledován opakovaným měřením kontrolního materiálu s nejvyšší koncentrací kardiálních markerů (kontrola 3). Byl sledován pokles naměřené koncentrace v závislosti na času od přidání luminiscenčního činidla. Blednutí luminiscenčního záření bylo pozorováno u všech sledovaných analytů. Závislost poklesu naměřené koncentrace na čase byla lineární (Tab 9). Tab 9. Závislost poklesu naměřené koncentrace na čase, y = koncentrace (μg/l), x = čas (min) analyt rovnice přímky korelační koeficient MYO y = -3,6748x + 278,55 0,9871 CKMB y = -0,3454x + 27,001 0,9704 ctni y = -0,0867x + 7,7544 0,9932 CAIII y = -0,8612x + 54,425 0,9707 FABP y = -0,5516x + 33,450 0,9718 GPBB y = -1,6328x + 108,18 0,

50 Srovnání metod CKMB a MYO Vašatová M, Tichý M, Horáček JM, Pudil R, Horáková L, Palička V. Multianalytový přístup k diagnostice srdečních chorob technologií proteinových biočipů. Čas Lék čes. 2009; 148 (12): Ulrychova M, Tichy M, Friedecky B, Vavrova J, Horacek JM, Pudil R. Determination of cardiac markers by protein biochip technology in comparison with classic immunochemical methods. Clin Chem Lab Med. 2009; 47, Suppl.1: S 245. Srovnání mezi metodami pro CKMB a myoglobin na Evidence Investigatoru a rutinně používaném analyzátoru Elecsys 2010 bylo hodnoceno podle Passing-Bablokovy regrese a Bland-Altmanovou analýzou. Vzorky byly vybrány tak, aby obsahovaly širokou škálu hodnot. Ze skupiny dárců krve bylo vybráno 30 vzorků, u kterých se očekávaly hodnoty v referenčním rozmezí. Dalších 45 vzorků bylo získáno od pacientů s diagnózou akutního infarktu myokardu. Ze souboru byly vyřazeny výsledky vzorků, u kterých byly naměřené koncentrace mimo měřící rozsah metod. Passing-Bablokova regrese a Bland-Altmanovy grafy ukazují statisticky významné rozdíly ve výsledcích. Rovnice Passing-Bablokovy regrese byly následující (Obr. 3 a 4): CKMB: Elecsys = 2,0656 EvInvest + 0,0946 MYO: Elecsys = 1,4232 EvInvest + 0,4320 Důvodem těchto odchylek je špatná standardizace metod a diskrepance mezi kalibracemi. Absolutní naměřené hodnoty jsou sice číselně nesrovnatelné, ale v rozlišení normálních a patologických koncentrací se metody téměř shodují (shoda 94,5 % výsledků u CKMB mass a 90,4 % u MYO). Z klinického hlediska je důležité sledování kinetiky kardiálních markerů. Z našich výsledků vyplývá, že pro kardiologickou diagnostiku lze použít metody obě, ale nelze kombinovat výsledky 50

51 měření z jednotlivých analyzátorů mezi sebou. Tomu také odpovídá skutečnost, že jsou rozdílné hodnoty cut-off udávané jednotlivými výrobci (Elecsys: CKMB mass = 6,8 μg/l, MYO = 72,0 μg/l; Evidence Investigator: CKMB mass = 3,9 μg/l, MYO = 59,0 μg/l). Obr 3. Passing-Bablokova regrese - porovnání metod CK-MB mass ELECSYS_CKMB EVIDENCE_CKMB Obr 4. Passing-Bablokova regrese - porovnání metod MYO ELECSYS_MYO EVIDENCE_MYO 51

52 GPBB a FABP Ulrychova M, Tichy M, Friedecky B, Vavrova J, Horacek JM, Pudil R. Determination of cardiac markers by protein biochip technology in comparison with classic immunochemical methods. Clin Chem Lab Med. 2009; 47, Suppl.1: S 245. Srovnání GPBB a FABP metod pro Evidence Investigator s příslušnou ELISA technikou bylo interpretováno za použití stejných statistických testů. Rovnice Passing-Bablokovy regrese byly následující (Obr. 5 a 6): GPBB: ELISA = 0,7707 EvInvest 0,9250 FABP: ELISA = 0,8842 EvInvest 0,1914 Jako hodnoty cut-off pro Evidence Investigator výrobce udává hodnoty: GPBB = 10,6 μg/l a FABP = 4,5 μg/l. U stanovení GPBB a FABP metodami ELISA výrobce hodnoty cut-off neuvádějí. Proto jsme se výpočtem pokusili určit cut-off hodnoty pro ELISA metody: GPBB = 7,2 μg/l a FABP = 3,8 μg/l. Z našich výsledků vyplývá, že pro diagnostiku lze opět použít metody obě, ale nelze kombinovat výsledky měření z jednotlivých analyzátorů mezi sebou. Pro rozlišení normálních a patologických výsledků byla použita data naměřená biočipovým systémem Evidence Investigator. Shoda v hodnocení normálních a patologických výsledků byla u obou metod dobrá (h-fabp ve 100 % a GPBB v 95,8 %). 52

53 Obr 5. Passing-Bablokova regrese - porovnání metod h-fabp ELISA_FABP EVIDENCE_FABP Obr 6. Passing-Bablokova regrese - porovnání metod GPBB ELISA_GPBB EVIDENCE_GPBB 53

54 Zamražování vzorků a stabilita Kalibrace po zamražení Stabilitu kalibračních materiálů po zamražení jsme ověřili změřením koncentrace kalibrátoru čerstvě rozpuštěného a kalibrátoru po zamražení. Pokyny výrobce pro uchování rekonstituovaného kalibrátoru při -70 C byly dodrženy a materiál byl rozmražen po 14 dnech. Kalibrační materiál byl po zamražení stabilní Zamražení vzorků U třech vzorků séra jsme sledovali vliv opakovaného rozmražování na stabilitu analytů v průběhu dvou měsíců. Všechny vzorky byly vždy po 14 dnech rozmraženy a analyzovány. Po analýze byl vzorek opět zamražen při -20 C do dalšího měření. U myoglobinu a GPBB jsme zaznamenali pokles koncentrace po prvním rozmražení vzorků. Při opakovaném rozmražování se již koncentrace těchto analytů dále neměnila. Ostatní měřené kardiální markery byly stabilní po celou dobu testu Analytické parametry hs-ctnt Vnitřní kontrola kvality - mezilehlá přesnost a správnost Vašatová M, Tichý M, Pudil R, Horáková L, Tomko T, Řeháček V. První zkušenosti se stanovením kardiálního troponinu T high-sensitivní metodou. Klin Biochem Metab. 2010; 18 (39), 1: Validaci ultrasenzitivní metody na stanovení troponinu T publikovali v roce 2010 Giannitsis a kol. (12). Citlivost a reprodukovatelnost byla dle požadavků doporučení dostatečná. Dle požadavku definice AIM jsme hodnotili koncentraci odpovídající 99. percentilu zdravé populace (73 dárců krve). Námi stanovená hodnota 54

55 99. percentilu byla 0,018 μg/l, zatímco výrobce udává jako cut-off koncentraci 0,014 μg/l. Tento nepatrný rozdíl může být způsoben volbou referenční skupiny. Pro ověření analytických parametrů soupravy jsme využili měření kontrolních materiálů. Mezilehlá přesnost (n=10) byla hodnocena na dvou koncentračních hladinách (2,36 a 0,028 μg/l). Výsledky vnitřní kontroly kvality byly CV = 2,0 a 3,8 % a BIAS = -1,0 a 1,8 %. Kromě analýzy kontrolních materiálů jsme hodnotili také opakovatelnost na vzorku séra o koncentraci ctnt nižší než hodnota cut-off (0,010 μg/l). Z hodnot naměřených na této koncentrační úrovni byl vypočten variační koeficient CV = 9,6 %. Podle našich výsledků tedy metoda splňuje požadavky na citlivost kladené definicí AIM (10) a námi naměřená data jsou také ve shodě s výše uvedenou prací Giannitsise (12) Srovnání metod Vašatová M, Holečková M, Bartošková I, Tichý M, Friedecký B. Kardiální troponin T ultrasenzitivní metodou porovnání metod. Klin Biochem Metab. 2010; 18 (39), 4: Výsledky srovnání původní a nové generace metody ve validační studii (12) nebyly v nízkých koncentracích troponinu T příliš uspokojivé. Na hladině cut-off původní metody (0,030 μg/l) vykazovala ultrasenzitivní metoda přibližně o 75 % vyšší výsledky. Cílem naší práce bylo získat vlastní zkušenosti se stanovením troponinu T ultrasenzitivní metodou na analyzátorech používaných v naší laboratoři a porovnat obě metody a jednotlivé analyzátory mezi sebou. Celkově jsme hodnotili 72 vzorků séra pacientů (37 žen, 35 mužů, věk 68±15 let). Na imunochemickém modulu E-170 Modular (E170) jsme měřili ctnt běžně používanými metodami a pro analyzátor Elecsys 2010 (Elecsys) jsme použili statimové varianty analýzy (kity pro modul E170: Elecsys Tropo T hs, Elecsys Tropo T a kity pro Elecsys 2010: Elecsys Tropo T hs STAT, Elecsys Tropo T STAT). Pro porovnání metod jsme měřili simultánně troponin T ve vzorcích novou ultrasenzitivní i původní metodou (4.generace). První dva soubory dat naměřené na obou analyzátorech původní a ultrasenzitivní metodou ukazují podobné výsledky s validací metody publikovanou Giannitsisem 55

56 (12). U obou analyzátorů byla v nižších koncentracích nalezena systematická diference výsledků. Na hladině cut-off původní metody 4. generace jsme ultrasenzitivní metodou naměřili troponin v průměru o 50 % ( %) vyšší. Ve vyšších koncentracích jsou naopak hodnoty naměřené ultrasenzitivní metodou přibližně o 20 % nižší. Také zvýšené počty výsledků nad rozhodovací limit u soupravy hs-ctnt jsou podobné, jako u zmíněné práce Giannitsise (12) a ilustrují nutnost řešení problémů laboratoří s reinterpretací zvýšených hodnot ctnt. Při porovnání hodnot naměřených ultrasenzitivní metodou na obou analyzátorech (E170 a Elecsys) jsme nezaznamenali výrazné odchylky v celém měřeném rozsahu koncentrací. Výsledky z obou analyzátorů se dobře shodují. Jen v nízkých koncentracích troponinu T (pod 0,100 μg/l) se projevila vyšší nepřesnost měření (náhodné chyby). Systematická odchylka měření nebyla v tomto případě nalezena. Neshody ve výsledcích mohou být pravděpodobně způsobeny problémy v kalibracích a návazností kalibrátorů na referenční materiál. Výrobce sice posloupnost návaznosti v příbalových informacích deklaruje, ale naše výsledky ukazují signifikantní rozdíly v naměřených koncentracích kalibrátorů jednotlivými variantami metody. Z tohoto faktu vyplývá několik otázek, na které by měl odpovědět výrobce. Proč není použit jeden kalibrátor pro všechny varianty metody na stanovení troponinu T, u kterého by byla jasně popsána návaznost na referenční standard? Jak je vůbec referenční standard zvolen? Proč používá firma ke kalibraci několik různých kalibrátorů? A v případě, že je návaznost kalibrací v pořádku, proč se výsledky v nízkých koncentračních hladinách systematicky liší u jednotlivých generací metod? 7.3. Klinické aplikace Kontrolní skupina dárců krve Pro ověření referenčních mezí (cut-off) výrobce, jsme stanovili kardiální markery ve skupině zdravých kontrol celkově 73 dárců krve (48 mužů, 25 žen, věk 56

57 56 ± 13 let). Výsledky jsou uvedeny v tabulce (Tab 10), včetně námi vypočteného 99. percentilu. Tab 10. Koncentrace kardiálních markerů u zdravých kontrol. CKMB μg/l MYO μg/l GPBB μg/l h-fabp μg/l CA III μg/l ctni μg/l hs-ctnt μg/l průměr 1,88 36,50 3,24 1,88 26,91 <0,18 <0,003 medián 1,62 35,69 2,26 1,66 20,63 <0,18 <0, percentil 5,93 77,49 10,63 4,84 73,66 0,42 0,018 cut off výrobce 3,9 59,0 7,3 4,5 55,0 0,4 0, Akutní infarkt myokardu Ulrychová M, Horáková L, Tichý M, Horáček J M, Pudil R. Využití technologie proteinových biočipů pro stanovení kardiálních markerů u pacientů s akutním infarktem myokardu. Klin Biochem Metab. 2008; 16 (37), 4: Horáková L, Pudil R, Tichý M, Ulrychová M, Vojáček J. Kardiospecifické markery v průběhu akutního infarktu myokardu zkušenosti s využitím proteinových biočipů. Interv Akut Kardiol. 2010; 9, 4: Cílem této studie bylo sledování markerů ischemie a nekrózy myokardu u pacientů s diagnózou akutního infarktu myokardu s elevacemi ST-segmentů (STEMI) a u nových markerů ověření kinetiky uvolňování z kardiomyocytů. Diagnóza akutního infarktu myokardu byla založena na anamnéze (bolest na hrudi neustupující do 30 minut od svého vzniku), změnách na EKG záznamu a stanovení biochemických parametrů se vztahem k poškození myokardu - elevace kreatinkinázy CK, CK MB izoenzymu a ctnt (4.generace), dle tehdejších doporučení (13). Pro posouzení kinetiky uvolňování jednotlivých markerů byl proveden odběr krve bezprostředně při přijetí na katetrizačním sále, dále za 24 hodin a následně 5. den od prvního odběru. Naměřená data ukazují, že FABP je v prvních hodinách po vzniku AIM lepším diagnostickým markerem než myoglobin. Uvolňování GPBB z kardiomyocytů je 57

58 proti myoglobinu pomalejší, ale přesto zůstává časným markerem poškození myokardu. Dále je možné využít stanovení CA III a poměrů myoglobin / FABP nebo myoglobin / CA III k odlišení léze myokardu od poškození kosterního svalstva. Je tedy možné říci, že stanovení kardiálních markerů pomocí proteinových biočipů umožní komplexnější pohled na diagnostiku poškození myokardu. V současnosti jsou však nejdůležitější v diagnostice akutních koronárních syndromů high-senzitivní troponiny, které mají v prvních hodinách po nástupu bolestí na hrudi nejvyšší diagnostickou senzitivitu ze všech kardiálních markerů Hypertrofická kardiomyopatie Vašatová M, Pudil R, Tichý M, Fučíková A, Lenčo J. Pozitivní hodnoty highsenzitivního kardiálního troponinu T u pacientů s hypertrofickou kardiomyopatií. Labor Aktuell. 2010; 3: Pudil R, Vasatova M, Lenco J, Tichy M, Fucikova A, Horacek JM, Vojacek J, Stulik J, Palicka V. Plasma glycogen phosphorylase BB is associated with pulmonary artery wedge pressure and left ventricle mass index in patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clin Chem Lab Med. 2010; 48: Pudil R, Tichý M, Lenčo J, Horáček JM, Ulrychová M, Fučíková A, Vojáček J, Stulík J, Palička V: Hladiny markerů poruchy struktury myokardu u pacientů s hypertrofickou kardiomyopatií. Interv Akut Kardiol. 2009; 8, 4: Hypertrofická kardiomyopatie je onemocnění provázené změnami struktury a následně funkce myokardu, které je definováno morfologicky přítomností hypertrofie myokardu, především levé komory, při absenci hemodynamických příčin. Histologický obraz je charakterizován dezorganizací myocytů (myocytární dysarray), fibrózou myokardu a abnormitami drobných cév. Onemocnění může probíhat asymptomaticky nebo může nemocného ohrozit komplikacemi (synkopy, srdeční selhání, arytmie či náhlé úmrtí atd.). Vzhledem k závažnosti onemocnění existuje snaha o nalezení vhodných biomarkerů pro diagnostiku a stratifikaci rizika tohoto onemocnění. Zatím zcela ojediněle bylo popsáno jen mírné zvýšení sérové hladiny srdečních troponinů (72,73). 58

59 Cílem naší studie bylo stanovit biočipovou technologií koncentrace kardiálních markerů u pacientů s hypertrofickou kardiomyopatií, výsledky porovnat s kontrolní skupinou dárců krve a posoudit je vzhledem ke klinickému stavu. Dále jsme se v naší práci zabývali hodnocením koncentrací ctnt měřenou novou high-sensitivní metodou. Při porovnání s kontrolní skupinou jsme zjistili statisticky významné zvýšení plazmatické hladiny všech kardiálních markerů měřených biočipovou technologií. Koncentrace GPBB byla zvýšená u většiny pacientů, její hladina signifikantně korelovala s hmotností levé komory, jejím indexem a tlakem v zaklínění. U ostatních markerů nebyla zjištěna významnější korelace s vybranými echokardiografickými a invazivními parametry. Z těchto poznatků vyplývá, že role měření markerů ischemie a nekrózy myokardu, hlavně GPBB, v patogenezi a diagnóze hypertrofické kardiomyopatie může být důležitá pro stratifikaci rizika u těchto pacientů Radiofrekvenční katetrové ablace Vasatova M, Pudil R, Tichy M, Buchler T, Horacek J M, Haman L, Parizek P, Palicka V. High-sensitivity troponin T as a marker of myocardial injury after radiofrequency catheter ablation. Ann Clin Biochem. 2011; 48: Pudil R, Pařízek P, Tichý M, Haman L, Horáková L, Ulrychová M, Vojáček J, Palička V. Use of the biochip microarray system in detection of myocardial injury cause by radiofrequency catheter ablation. Clin Chem Lab Med. 2008; 46 (12): Radiofrekvenční katetrová ablace je běžně používánou léčbou pro široké spektrum srdečních arytmií (síňo-komorová uzlová tachykardie, flutter síní, fibrilace síní). Během této léčby vznikají drobná ložiska poškozené tkáně myokardu, způsobená zvýšenou teplotou. Cílem této studie bylo změření kardiálních markerů novou biočipovou technologií a high-senzitivní metodou hs-ctnt, což by mělo umožnit detekovat malé poškození myokardu u pacientů podstupujících léčbu RFA. Pro korelační hodnocení klinického stavu a hladiny biomarkerů byl monitorován počet radiofrekvenčních impulsů a délka trvání 59

60 procedury. Kardiální markery byly měřeny před procedurou a 24 hodin po radiofrekvenční ablaci. Výsledná drobná poranění během procedury byla spojena s významným zvýšením kardiálních markerů (ctni, CKMB mass, h-fabp, hs-ctnt a GPBB). V koncentracích MYO signifikantní změny nalezeny nebyly. Největší nárůst koncentrací jsme zaznamenali u hs-ctnt. Sérové koncentrace ctni, CKMB mass a h-fabp korelovaly s počtem radiofrekvenčních pulsů, zatímco postprocedurální sérový hs-ctnt měl vztah kromě počtu radiofrekvenčních pulsů také s délkou trvání RFA. Výsledkem naší studie je fakt, že nárustem kardiálních troponinů jsme schopni dobře posoudit poranění kardiomyocytů během RFA a měla by se rozvinout snaha o zvýšení účinnosti a bezpečnosti RFA s cílem minimalizovat poškození myokardu během této procedury Kardiotoxicita cytostatik Horacek J, Vasatova M, Tichy M, Pudil R, Jebavy L, Maly J. The use of cardiac biomarkers in detection of cardiotoxicity associated with conventional and high-dose chemotherapy for acute leukemia. Exp Oncol. 2010; 32, 2: Horacek JM, Tichy M, Jebavy L, Pudil R, Ulrychova M, Maly J. Use of multiple biomarkers for evaluation of anthracycline-induced cardiotoxicity in patients with acute myeloid leukemia. Exp Oncol. 2008; 30, 2: Horacek JM, Pudil R, Tichy M, Jebavy L, Strasova A, Ulrychova M, Zak P, Maly J. Cardiac troponin I seems to be superior to cardiac troponin T in the early detection of cardiac injury associated with anthracycline treatment. Onkologie. 2008; 31 (10): Kardiotoxicita je dobře známou a vážnou komplikací protinádorové terapie, která může výrazně ovlivnit kvalitu života pacienta a cenu zdravotní péče. Největší riziko vývoje kardiotoxicity představují antracyklíny (ANT) nebo vysokodávková chemoterapie (HD-CT) s přípravným režimem zahrnujícím 60

61 vysokou dávku cyklofosfamidu. Pro monitorování kardiotoxicity v onkologii byly doporučeny různé metody. V našich podmínkách jsou běžně užívané echokardiografie a elektrokardiografie. V poslední době se ale objevují také zmínky o výzkumu biochemických markerů poškození myokardu v souvislosti s kardiotoxicitou vyvolanou protinádorovou terapií. U biochemického monitorování kardiotoxicity protinádorové terapie bylo cílem sledovat uvolnění kardiálních markerů (MYO, ctni, hs-ctnt, h-fabp, GPBB a CKMB mass) vlivem neischemického poškození myocytů při léčbě konvenční chemoterapií (CT) antracyklíny a vysokodávkovou chemoterapií následovanou transplantací hematopoetických buněk (HD-CT). V obou skupinách jsme u některých pacientů nalezli signifikantní zvýšení GPBB. Po chemoterapii antracyklíny v 16,7-20,8 % případech a v 21,7 % případech po vysokodávkové chemoterapii s následnou transplantací krvetvorných buněk. U 8,3 % pacientů léčených antracyklíny jsme zaznamenali také zvýšení ctni (zároveň vyšší koncentrace GPBB). Po HD-CT a HCT byl u všech pacientů ctni negativní. Zvýšené uvolňování GPBB z kardiomyocytů po podání chemoterapie může být známkou příznaků akutní subklinické kardiotoxicity této léčby. Pozitivita GPBB a negativita ostatních biomarkerů ukazuje, že GPBB by mohla být citlivějším markerem pro detekci akutního kardiálního poškození vlivem jak konvenční tak vysokodávkové chemoterapie. Zda tyto akutní změny GPBB budou mít prediktivní hodnotu pro budoucí vývoj kardiomyopatie u těchto pacientů je zatím nejasné. 61

62 8. Závěr V současnosti prochází oblast laboratorní medicíny zabývající se kardiálními markery dynamickým vývojem a hledají se nové perspektivní molekuly využitelné pro kardiologickou diagnostiku. Současně se také rozvíjí analytické metody a nabízí možnosti stále citlivějších analýz a simultánního stanovení biochemických markerů. Cílem této práce bylo zhodnotit možné použití multimarkerového přístupu v diagnostice kardiovaskulárních onemocnění, sledovat analytické znaky a možné klinické využití biočipové metody Evidence Investigator Cardiac Array na stanovení kardiálních markerů se spektrem analytů: MB izoenzym kreatinkinázy (CKMB), myoglobin (MYO), BB izoenzym glykogenfosforylázy (GPBB), srdeční typ proteinu vázajícího mastné kyseliny (h-fabp), karboanhydráza III (CAIII) a srdeční troponin I (ctni) a také high-senzitivního testu na stanovení kardiálního troponinu T (hs-ctnt) pro analyzátor Elecsys. Z klinického hlediska jsou nové high-senzitivní metody na stanovení troponinů nejvhodnější pro běžnou laboratorní diagnostiku akutních koronárních syndromů, i když v současné době nejsou zcela dořešeny analytické parametry těchto metod např. návaznost komerčních kalibrátorů na referenční materiály. U biočipového analyzátoru Evidence Investigator není reprodukovatelnost výsledků a citlivost ctni metody v souladu s požadavky definice pro diagnostiku AIM. Dalšími nevýhodami poloautomatického systému Evidence Investigator zůstávají velký podíl manuální práce a nemožnost provádění statimových vyšetření z důvodu potřeby nasbírání série vzorků. V rámci výzkumných projektů jsme pomocí proteinových biočipů testovali celou sérii markerů. Pro diagnostiku akutních infarktů myokardu jsou z testovaných analytů nejdůležitější hs-ctnt a FABP. Zachycení prvního nárůstu troponinu v prvních hodinách po počátku akutní koronární příhody je velmi důležité pro zahájení včasné reperfúze. Se zvyšováním citlivosti metod a poklesem cut-off hodnoty samozřejmě dochází k urychlení diagnostiky AIM, zvyšuje se diagnostická senzitivita, ale samozřejmě klesá specificita, neboť se odmaskuje daleko více chronických vzestupů koncentrace troponinu. Vzhledem k biologické variabilitě troponinu je vhodnější posuzovat kinetiku vzestupu naměřené koncentrace troponinu ve dvou po sobě následujících odběrech než 62

63 hodnotit výsledek striktně podle hodnoty cut-off. FABP má u AIM obdobnou kinetiku vzestupu jako myoglobin, má ovšem vyšší diagnostickou účinnost. Poškození myokardu při radiofrekvenční katetrové ablaci se nejlépe projevuje zvýšenou koncentrací high-senzitivního troponinu T, jehož hodnoty korelují s počtem radiofrekvenčních pulsů a délkou trvání procedury. Lze tedy říci, že hs-ctnt je vhodnou metodou pro monitorování tíže poškození myokardu při radiofrekvenční ablaci. U pacientů s hypertrofickou kardiomyopatií dochází ke vzestupu koncentrace markerů poškození struktury myokardu, především GPBB. Zvýšení hladiny kardiálních markerů by mohlo sloužit k diagnostice onemocnění, korelovat se závažností klinického stavu a být využito ke stratifikaci rizika u těchto pacientů. Na druhou stranu může způsobit problémy v interpretaci výsledků při diagnostice AIM. Zvýšení GPBB bylo rovněž sledováno při hodnocení subklinické kardiotoxicity cytostatik. Data ukazují, že by se GPBB mohla stát citlivým biomarkerem pro detekci akutní kardiotoxicity spojené s konvenční a vysokodávkovou chemoterapií u akutní leukémie. Ve výsledku se ukazuje, že multiplexní stanovení kardiálních markerů umožní komplexnější pohled na diagnostiku poškození myokardu v rámci plošného monitorování proteomických změn. Pro rutinní biochemickou analýzu může být výhodnější použití pouze jednoho nebo výběr několika parametrů. Proto v některých situacích může být relativní nevýhodou nutnost zpracování celého měřeného panelu bez možnosti výběru spektra analytů. 63

64 9. Seznam literatury 9.1. Publikace vztahující se k tématu disertační práce Vasatova M, Pudil R, Tichy M, Buchler T, Horacek JM, Haman L, Parizek P, Palicka V. High-sensitivity troponin T as a marker of myocardial injury after radiofrequency catheter ablation. Ann Clin Biochem. 2011; 48: Vašatová M, Holečková M, Bartošková I, Tichý M, Friedecký B. Kardiální troponin T ultrasenzitivní metodou porovnání metod. Klin Biochem Metab. 2010; 18 (39), 4: Vašatová M, Tichý M, Pudil R, Horáková L, Tomko T, Řeháček V. První zkušenosti se stanovením kardiálního troponinu T high-sensitivní metodou. Klin Biochem Metab. 2010; 18 (39), 1: Vašatová M, Tichý M, Vávrová J. Multiplexní analýza s využitím proteinových čipů. Klin Biochem Metab. 2010; 18 (39), 1: 4-7. Vašatová M, Pudil R, Tichý M, Fučíková A, Lenčo J. Pozitivní hodnoty highsenzitivního kardiálního troponinu T u pacientů s hypertrofickou kardiomyopatií. Labor Aktuell. 2010; 3: Ulrychová M, Tichý M, Horáček JM, Pudil R, Horáková L. Stanovení kardiálních markerů technologií proteinových biočipů multimarkerová strategie. FONS. 2009; 2: Vašatová M, Tichý M, Horáček JM, Pudil R, Horáková L, Palička V. Multianalytový přístup k diagnostice srdečních chorob technologií proteinových biočipů. Čas Lék čes. 2009; 148 (12):

65 Ulrychová M, Horáková L, Tichý M, Horáček JM, Pudil R. Využití technologie proteinových biočipů pro stanovení kardiálních markerů u pacientů s akutním infarktem myokardu. Klin Biochem Metab. 2008; 16 (37), 4: Chek J, Dusek J, Stasek J, Vojacek J, Bis J, Ulrychova M, Tichy M, Tomko T, Bukac J. Role of ischemia-modified albumin in estimating the extent and scope of cardiac ischemia in patients with ST elevation myocardial infarction. Heart Vessels. 2011; 26: Friedecký B, Tichý M, Kratochvíla J, Vašatová M, Pudil R, Vávrová J, Palička V. Srdeční troponiny historie, současná praxe, novinky a trendy. Klin Biochem Metab. 2010; 18(39), 4: Pudil R, Vasatova M, Lenco J, Tichy M, Fucikova A, Horacek JM, Vojacek J, Stulik J, Palicka V. Plasma glycogen phosphorylase BB is associated with pulmonary artery wedge pressure and left ventricle mass index in patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clin Chem Lab Med. 2010; 48: Horáková L, Pudil R, Tichý M, Ulrychová M, Vojáček J. Kardiospecifické markery v průběhu akutního infarktu myokardu zkušenosti s využitím proteinových biočipů. Interv Akut Kardiol. 2010; 9, 4: Dušek J, Chek JL, Šťásek J, Bis J, Vašatová M, Vojáček J. Markery myokardiální ischémie: slepá ulička nebo budoucnost laboratorní diagnostiky v kardiologii? Interv Akut Kardiol. 2010; 9, 4: Horacek JM, Jebavy L, Ulrychova M, Tichy M, Pudil R, Zak P, Maly J. Glycogen phosphorylase BB could be a new biomarker for detection of cardiac toxicity during hematopoietic cell transplantation for hematological malignancies. Bone Marrow Transpl. 2010; 45, 6:

66 Horacek J, Vasatova M, Tichy M, Pudil R, Jebavy L, Maly J. The use of cardiac biomarkers in detection of cardiotoxicity associated with conventional and highdose chemotherapyfor acute leukemia. Exp Oncol. 2010; 32, 2: Pudil R, Tichý M, Lenčo J, Horáček JM, Ulrychová M, Fučíková A, Vojáček J, Stulík J, Palička V. Hladiny markerů poruchy struktury myokardu u pacientů s hypertrofickou kardiomyopatií. Interv Akut Kardiol. 2009; 8, 4: Horacek JM, Tichy M, Pudil R, Jebavy L, Zak P, Ulrychova M, Slovacek L, Maly J. Multimarker approach to evaluation of cardiac toxicity during preparative regiment and hematopoietic cell transplantation. Neoplasma. 2008; 55, 6: Pudil R, Tichý M, Ulrychová M, Horáková L, Vojáček J. Biomarkery ischemie a nekrózy myokardu v roce Vnitr Lek. 2008; 54, 10: Pudil R, Pařízek P, Tichý M, Haman L, Horáková L, Ulrychová M, Vojáček J, Palička V. Use of the biochip microarray system in detection of myocardial injury cause by radiofrequency catheter ablation. Clin Chem Lab Med. 2008; 46 (12): Horacek JM, Tichy M, Jebavy L, Pudil R, Ulrychova M, Maly J. Use of multiple biomarkers for evaluation of anthracycline-induced cardiotoxicity in patients with acute myeloid leukemia. Exp Oncol. 2008; 30 (2): Horacek JM, Pudil R, Tichy M, Jebavy L, Strasova A, Ulrychova M, Zak P, Maly J. Cardiac troponin I seems to be superior to cardiac troponin T in the early detection of cardiac injury associated with anthracycline treatment. Onkologie. 2008; 31 (10): Horacek JM, Tichy M, Pudil R, Jebavy L, Zak P, Ulrychova M, Vavrova J, Maly J, Palicka V. New biomarkers of myocardial injury and assessment of cardiac toxicity during preparative regimen and hematopoietic cell transplantation in acute leukaemia. Clin Chem Lab Med. 2008; 46(1):

67 Vavrova J, Friedecky B, Ulrychova M, Licbinska E, Palička V. Vyšetřování tyreoidních hormonů na systému Randox Evidence Investigator technikou microarray. Klin Biochem Metab. 2007; 15 (36), 4:

68 9.2. Publikace vztahující se k tématu disertační práce s IF Vasatova M, Pudil R, Tichy M, Buchler T, Horacek J M, Haman L, Parizek P, Palicka V. High-sensitivity troponin T as a marker of myocardial injury after radiofrequency catheter ablation. Ann Clin Biochem. 2011; 48: Chek J, Dusek J, Stasek J, Vojacek J, Bis J, Ulrychova M, Tichy M, Tomko T, Bukac J. Role of ischemia-modified albumin in estimating the extent and scope of cardiac ischemia in patients with ST elevation myocardial infarction. Heart Vessels. 2011; 26: Pudil R, Vasatova M, Lenco J, Tichy M, Fucikova A, Horacek JM, Vojacek J, Stulik J, Palicka V. Plasma glycogen phosphorylase BB is associated with pulmonary artery wedge pressure and left ventricle mass index in patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clin Chem Lab Med. 2010; 48: Horacek JM, Jebavy L, Ulrychova M, Tichy M, Pudil R, Zak P, Maly J. Glycogen phosphorylase BB could be a new biomarker for detection of cardiac toxicity during hematopoietic cell transplantation for hematological malignancies. Bone Marrow Transpl. 2010; 45, 6: Horáček J, Vašatová M, Tichý M, Pudil R, Jebavý L, Malý J The use of cardiac biomarkers in detection of cardiotoxicity associated with conventional and highdose chemotherapy for acute leukemia. Exp Oncol. 2010; 32, 2: Horacek JM, Tichy M, Pudil R, Jebavy L, Zak P, Ulrychova M, Slovacek L, Maly J. Multimarker approach to evaluation of cardiac toxicity during preparative regiment and hematopoietic cell transplantation. Neoplasma. 2008; 55, 6:

69 Pudil R, Pařízek P, Tichý M, Haman L, Horáková L, Ulrychová M, Vojáček J, Palička V. Use of the biochip microarray system in detection of myocardial injury cause by radiofrequency catheter ablation. Clin Chem Lab Med. 2008; 46 (12): Horacek JM, Tichy M, Jebavy L, Pudil R, Ulrychova M, Maly J. Use of multiple biomarkers for evaluation of anthracycline-induced cardiotoxicity in patients with acute myeloid leukemia. Exp Oncol. 2008; 30(2): Horacek JM, Pudil R, Tichy M, Jebavy L, Strasova A, Ulrychova M, Zak P, Maly J. Cardiac troponin I seems to be superior to cardiac troponin T in the early detection of cardiac injury associated with anthracycline treatment. Onkologie. 2008; 31 (10): Horacek JM, Tichy M, Pudil R, Jebavy L, Zak P, Ulrychova M, Vavrova J, Maly J, Palicka V. New biomarkers of myocardial injury and assessment of cardiac toxicity during preparative regimen and hematopoietic cell transplantation in acute leukaemia. Clin Chem Lab Med. 2008; 46 (1):

70 9.3. Seznam všech publikací Vasatova M, Pudil R, Tichy M, Buchler T, Horacek JM, Haman L, Parizek P, Palicka V. High-sensitivity troponin T as a marker of myocardial injury after radiofrequency catheter ablation. Ann Clin Biochem. 2011; 48: Vašatová M, Holečková M, Bartošková I, Tichý M, Friedecký B. Kardiální troponin T ultrasenzitivní metodou porovnání metod. Klin Biochem Metab. 2010;18 (39), 4: Vašatová M, Tichý M, Pudil R, Horáková L, Tomko T, Řeháček V. První zkušenosti se stanovením kardiálního troponinu T high-sensitivní metodou, Klin Biochem Metab. 2010; 18 (39), 1: Vašatová M, Tichý M, Vávrová J. Multiplexní analýza s využitím proteinových čipů. Klin Biochem Metab. 2010; 18 (39), 1: 4-7. Vašatová M, Ličbinská E. Stanovení karbohydrát-deficientního transferinu kapilární elektroforézou. FONS. 2010; 3: Vašatová M, Pudil R, Tichý M, Fučíková A, Lenčo J. Pozitivní hodnoty highsenzitivního kardiálního troponinu T u pacientů s hypertrofickou kardiomyopatií. Labor Aktuell. 2010; 3: Ulrychová M, Tichý M, Horáček JM, Pudil R, Horáková L. Stanovení kardiálních markerů technologií proteinových biočipů multimarkerová strategie. FONS. 2009; 2: Ulrychová M, Tichý M, Horáček JM, Pudil R, Horáková L, Palička V. Multianalytový přístup k diagnostice srdečních chorob technologií proteinových biočipů. Čas Lék čes. 2009; 148 (12):

71 Ulrychová M, Horáková L, Tichý M, Horáček JM, Pudil R. Využití technologie proteinových biočipů pro stanovení kardiálních markerů u pacientů s akutním infarktem myokardu. Klin Biochem Metab. 2008; 16 (37),4: Ulrychova M, Vavrova J, Palička V. Stanovení metanefrinů v plazmě a moči metodou HPLC-ED. Klin Biochem Metab. 2007; 15 (36), 4: Chek J, Dusek J, Stasek J, Vojacek J, Bis J, Ulrychova M, Tichy M, Tomko T, Bukac J. Role of ischemia-modified albumin in estimating the extent and scope of cardiac ischemia in patients with ST elevation myocardial infarction. Heart Vessels. 2011; 26: Cermak P, Cermakova S, Schwarzerova A, Klementova M, Ulrychova M, Mazurova J. The potential use of blood culture systems for diagnosing intravascular catheter-related infections. Clin Lab. 2011; 57 (1-2): Karasova JZ, Zemek F, Bajgar J, Vasatova M, Prochazka P, Novotny L, Kuca K. Partition of bispyridinium oximes (trimedoxime and K074) administered in therapeutic doses into different parts of the rat brain. J Pharm Biomed Anal. 2011; 54, 5: Friedecký B, Tichý M, Kratochvíla J, Vašatová M, Pudil R, Vávrová J, Palička V. Srdeční troponiny historie, současná praxe, novinky a trendy. Klin Biochem Metab. 2010; 18(39), 4: Hons J, Zirko R, Ulrychova M, Cermakova E, Doubek P, Libiger J. Glycine serum level in schizophrenia: Relation to negative symptoms. Psychiat Res. 2010; 176, 2-3: Pudil R, Vasatova M, Lenco J, Tichy M, Fucikova A, Horacek JM, Vojacek J, Stulik J, Palicka V. Plasma glycogen phosphorylase BB is associated with pulmonary artery wedge pressure and left ventricle mass index in patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clin Chem Lab Med. 2010; 48:

72 Horáková L, Pudil R, Tichý M, Ulrychová M, Vojáček J. Kardiospecifické markery v průběhu akutního infarktu myokardu zkušenosti s využitím proteinových biočipů. Interv Akut Kardiol. 2010; 9, 4: Dušek J, Chek JL, Šťásek J, Bis J, Vašatová M, Vojáček J. Markery myokardiální ischémie: slepá ulička nebo budoucnost laboratorní diagnostiky v kardiologii? Interv Akut Kardiol. 2010; 9, 4: Horacek JM, Jebavy L, Ulrychova M, Tichy M, Pudil R, Zak P, Maly J. Glycogen phosphorylase BB could be a new biomarker for detection of cardiac toxicity during hematopoietic cell transplantation for hematological malignancies. Bone Marrow Transpl. 2010; 45, 6: Horáček J, Vašatová M, Tichý M, Pudil R, Jebavý L, Malý J. The use of cardiac biomarkers in detection of cardiotoxicity associated with conventional and highdose chemotherapy for acute leukemia. Exp Oncol. 2010; 32, 2: Pudil R, Tichý M, Lenčo J, Horáček JM, Ulrychová M, Fučíková A, Vojáček J, Stulík J, Palička V. Hladiny markerů poruchy struktury myokardu u pacientů s hypertrofickou kardiomyopatií. Interv Akut Kardiol. 2009; 8, 4: Horacek JM, Tichy M, Pudil R, Jebavy L, Zak P, Ulrychova M, Slovacek L, Maly J. Multimarker approach to evaluation of cardiac toxicity during preparative regiment and hematopoietic cell transplantation. Neoplasma. 2008; 55, 6: Pudil R, Tichý M, Ulrychová M, Horáková L, Vojáček J. Biomarkers of myocardial ischemia and necrosis in Vnitr Lek. 2008; 54, 10: Pudil R, Pařízek P, Tichý M, Haman L, Horáková L, Ulrychová M, Vojáček J, Palička V. Use of the biochip microarray system in detection of myocardial injury cause by radiofrequency catheter ablation. Clin Chem Lab Med. 2008; 46 (12):

73 Horacek JM, Tichy M, Jebavy L, Pudil R, Ulrychova M, Maly J. Use of multiple biomarkers for evaluation of anthracycline-induced cardiotoxicity in patients with acute myeloid leukemia. Exp Oncol. 2008; 30 (2): Hons J, Zirko R, Ulrychova M, Cermakova E, Libiger J. D-serine serum levels in patients with schizophrenia: relation to psychopathology and comparison to healthy subjects. Neuroendocrinol Lett. 2008; 29, 4: Hons J, Žirko R, Ulrychová M, Čermáková E, Libiger J. Vztah sérové koncentrace D-serinu a psychopatologie u schizofrenie. Čes a Slov Psychiatr, 2008; 104, 6: Horacek JM, Pudil R, Tichy M, Jebavy L, Strasova A, Ulrychova M, Zak P, Maly J. Cardiac troponin I seems to be superior to cardiac troponin T in the early detection of cardiac injury associated with anthracycline treatment. Onkologie. 2008; 31 (10): Horacek JM, Tichy M, Pudil R, Jebavy L, Zak P, Ulrychova M, Vavrova J, Maly J, Palicka V. New biomarkers of myocardial injury and assessment of cardiac toxicity during preparative regimen and hematopoietic cell transplantation in acute leukaemia. Clin Chem Lab Med. 2008; 46(1): Vavrova J, Friedecky B, Ulrychova M, Licbinska E, Palička V. Vyšetřování tyreoidních hormonů na systému Randox Evidence Investigator technikou microarray. Klin Biochem Metab. 2007; 15 (36), 4: Čermák P, Sedláková P, Mejstříková L, Ulrychová M, Víchová P, Mazurová J. Metoda kvantitativní mikrobiologické diagnostiky infekce cévních katetrů využívající lahvičky BacT/Alert SA. Klin Mikrobiol Inf Lék. 2006; 12 (6):

74 9.4. Seznam prezentací na vědeckých setkáních Vašatová M, Tichý M, Pudil R, Horáček JM, Bartošková I. Některé méně obvyklé kardiální markery. Klin Biochem Metab. 2011; 19 (40), 3: 182. Sjezd ČSKB, 2011, Plzeň. Přednáška. Vasatova M, Horacek JM, Tichy M, Jebavy L, maly J. The use of cardiac biomarkers in detection of cardiotoxicity induced by conventional and high-dose chemotherapy for acute leukemia. Clin Chem Lab Med. 2011; 49, Suppl. 1: S 837. Euromedlab 2011, Berlin. Poster. Vašatová M, Tichý M. Nové trendy ve využití kardiálních markerů v laboratorní diagnostice poškození myokardu. Kardiální diagnostika, 2010, Praha. Přednáška. Vašatová M, Tichý M. Nové trendy ve využití kardiálních markerů v laboratorní diagnostice poškození myokardu. Kardiální diagnostika, 2010, Jindřichův Hradec. Přednáška. Vašatová M, Tichý M. První zkušenosti se stanovením hs-ctnt. Biolab, 2010, Hradec Králové. Přednáška. Vašatová M, Pudil R, Tichý M, Horáková l, Tomko T: První zkušenosti se stanovením hs-troponinu T. Regionální seminář v oboru klinické biochemie, 2009, Hradec Králové. Přednáška. Ulrychova M, Tichy M, Friedecky B, Vavrova J, Horacek JM, Pudil R. Determination of cardiac markers by protein biochip technology in comparison with classic immunochemical methods. Clin Chem Lab Med. 2009; 47, Suppl. 1: S 245. Euromedlab 2009, Innsbruck. Poster. Ulrychova M, Tichy M, Friedecky B, Vavrova J, Horacek JM, Pudil R. Use of protein biochip technology for determination of cardiac markers in patients with 74

75 acute myocardial infarction diagnosis. Clin Chem Lab Med. 2009; 47, Suppl. 1: S153. Euromedlab 2009, Innsbruck. Poster. Ulrychová M, Tichý M. Multiplexní analýza s využitím proteinových čipů. Klin Biochem Metab. 2009; 17 (38), 3: 179. Sjezd ČSKB, 2009, Praha. Přednáška. Ulrychová M, Tichý M, Vávrová J, Friedecký B, Pudil R, Horáček JM. Multimarkerový přístup k analýze kardiálních markerů biočipová technologie. Kardiologická laboratorní vyšetření, 2009, Olomouc, Přednáška. Ulrychová M, Vávrová J, Horáček J, Pudil R, Tichý M. Technologie proteinových biočipů možnosti laboratorní analýzy a klinického využití. Laboratórna diagnostika. 2008; 1-2: Sjezd SSKB, 2008, Bratislava. Přednáška. Ulrychová M, Tichý M, Vávrová J, Horáček JM, Pudil R. Nové možnosti laboratorní diagnostiky kardiálních markerů. XXVI. Setkání biochemiků Královéhradeckého, Pardubického a Jihočeského regionu, 2008, Tábor. Přednáška. Ulrychová M, Vávrová J, Tichý M, Friedecký B. Uplatnění technologie proteinových biočipů v klinické biochemii. Regionální seminář v oboru klinická biochemie, 2007, Hradec Králové. Přednáška. 75

76 9.5. Použitá literatura 1. Aschermann M. Kardiovaskulární onemocnění v Evropě a v Evropské unii vztah ke kouření. Cor Vasa. 2010; 52 (9): European Heart Network: European cardiovascular disease statistics Dostupné na webových stránkách: 3. Zima T. Laboratorní diagnistika. Galén, Praha, Karmen A, Vroblewski F, LaDue JS. Transaminase activity in human blood. J Clin Incest. 1954; 34: Tichý M, Gregor J. Přehled biochemických markerů poškození myokardu. Klin Biochem Metab. 2002; 10: Friedecký B, Tichý M, Kratochvíla J et al. Srdeční troponiny historie, současná praxe, novinky a trendy. Klin Biochem Metab. 2010; 18 (39), 4: Pudil R, Tichý M, Vojáček J. Kardiomarkery na prahu třetího tisíciletí. Interv Akut Kardiol. 2007; 6: Friedecký B, Engliš M, Franeková J et al. Doporučení České společnosti klinické biochemie ke stanovení biochemických markerů poškození myokardu. Klin Biochem Metab. 2008; 16: Apple FS et al. National Academy of Clinical Biochemistry and IFCC Committee for standardization of markers of cardiac damage laboratory medicine practice guidelines: analytical issues for biochemical markers of acute coronary syndromes. Clin Chem. 2007; 53, 4: Thygesen K, Albert JS, White HD. Universal definition of myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 2007; 50: La'ulu SL, Roberts WL. Performance characteristics of five cardiac troponin I assays. Clin Chim Acta. 2010; 411 (15-16): Giannitsis E, Kurz K, Hallermayer K et al. Analytical validation of a highsensitivity cardiac troponin T assay. Clin Chem. 2010; 56 (2): Antman E, Bassand JP, Klein W et al. Myocardial infarction redefined - a consensus document of The Joint European Society of Cardiology / American College of Cardiology Committee for the redefinition of myocardial infarction, J Am Coll Cardiol. 2000; 36:

77 14. Thygesen K, Mair J, Katus H et al. Recommendations for the use of cardiac troponin measurement in acute cardiac care. Eur Heart J. 2010; 31: Morrow DA, Canon CP, Jesse RL et al. National Academy of Clinical Biochemistry laboratory medicine practice guidelines: clinical characteristics and utilization of biochemical markers in acute coronary syndromes. Clin Chem. 2007; 53: Vasile VC, Saenger AK, Kroning JM et al. Biological and analytical variability of a novel high-sensitivity cardiac troponin T assay. Clin Chem. 2010; 56 (7): Wu AHB, Lu QA, Todd J et al. Short- and long-term biological variation in cardiac troponin I measured with a high-sensitivity assay: implications for clinical practice. Clin Chem. 2009; 55,1: Tate JR, Ferguson W, Bais R et al. The determination of the 99th centile level for troponin assays in an Australian reference population. Ann Clin Biochem. 2008; 45: Bunk DM, Welch MJ. Characterization of a new certified reference material for human cardiac troponin I. Clin Chem. 2006; 52, 2: Todd J, Freese B, Lu A et al. Ultrasensitive flow-based immunoassays using single-molecule counting. Clin Chem. 2007; 53, 11: Vašatová M, Holečková M, Bartošková I et al. Kardiální troponin T ultrasenzitivní metodou porovnání metod. Klin Biochem Metab. 2010;18 (39), 4: Body R, Carley S, McDowell G et al. Rapid exclusion of acute myocardial infarction in patients with undetectable troponin using a high-sensitivity assay. J Am Coll Cardiol. 2011; 58 (13): Pudil R, Tichý M. Natriuretické peptidy a srdeční selhání-současný pohled. Klin Biochem Metab. 2010; 18 (39): Christenson RH et al. Biomarkers of acute coronary syndromes and heart failure. NACB, Dostupné na webových stránkách: /SiteCollectionDocuments/NACB/LMPG/ACS_PDF_online.pdf 25. Blankenberg S, Keller T, Saarela O et al. Contribution of 30 biomarkers to 10- year cardiovascular risk estimation in 2 population cohorts the MONICA, risk, 77

78 genetics, archiving, and monograph (MORGAM) biomarker project. Circulation. 2010; 121: Neuhodl S, Huelsmann M, Strunk G, et al. Comparison of copeptin, B-Type natriuretic peptide, and amino-terminal pro-b-type natriuretic peptide in patients with chronic heart failure: prediction of death at different stages of the disease. J Am Coll Cardiol. 2008; 52, 4: Kramer F, Milting H. Novel biomarkers in human terminal heart failure and under mechanical circulatory support. Biomarkers. 2011; 16 (S1): S31 S Glatz JF, van Bilsen M, Paulussen R et al. Release of fatty acid-binding protein from isolated rat heart subjected to ischemia and reperfusion or the calcium paradox. Biochim Biophys Acta. 1988; 961: Pelsers MMAL, Hermes WT, Blaty JFC. Fatty acid-binding proteins as plasma markers of tissue injury. Clin Chim Acta. 2005; 352: Kilcullen N, Viswanathan K, Das R et al. Heart-type fatty acid-binding protein predicts long-term mortality after acute coronary syndrome and identifies highrisk patients across the range of troponin values. J Am Coll Cardiol. 2007; 50, 21: Ecollan P, Collet JP, Boon G et al. Pre-hospital detection of acute myocardial infarction with ultra-rapid human fatty acid-binding protein (H-FABP) immunoassay. Int J Cardiol. 2007; 119: Liao J, Chan CP, Cheung Y et al. Human heart-type fatty acid-binding protein for on-site diagnosis of early acute myocardial infarction. Int J Cardiol. 2009; 133 (3): Pudil R, Tichý M, Ulrychová M, Horáková L, Vojáček J. Biomarkery ischemie a nekrózy myokardu v roce Vnitr Lek. 2008; 54, 10: Mair J. Glycogen phosphorylase isoenzyme BB to diagnose ischemic myocardial damage. Clin Chim Acta. 1998; 272: Apple FS, Wu AHB, Mair J et al. Future biomarkers for detection of ischemia and risk stratification in acute coronary syndrome. Clin Chem. 2005; 51, 5: Dominguez-Rodriguez A, Abreu-Gonzalez P, Garcia-Gonzalez MJ et al. Relation of ischemia-modified albumin levels and left ventricular systolic function in patients with ST-segment elevation myocardial infarction treated 78

79 with primary percutaneous coronary intervention. Clin Chim Acta. 2008; 388: Bhagavan NV, Lai EM, Rios PA et al. Evaluation of human serum albumin cobalt binding assay for the assessment of myocardial ischemia and myocardial infarction. Clin Chem. 2003; 49: Bar Or D, Lau E, Winkler JV. A novel assay for cobalt albumin binding and its potential as a marker for myocardial ischemia preliminary report. J Emerg Med. 2000; 19: Pilz S, Marz W. Free fatty acids as a cardiovascular risk factor. Clin Chem Lab Med. 2008; 46 (4): Supuran CT, Scozzafava A. Carbonic anhydrases as targets for medicinal chemistry. Biorg Med Chem. 2007; 15: Beuerle JR, Azzazy ME, Styba G et al. Characteristis of myoglobin, carbonic anhydrase III and the myoglobin / carbonic anhydrase III ratio in trauma, exercise, and myocardial infarction patients. Clin Chim Acta. 2000; 294: Vuori J, Huttunen K, Vuotikka P et al. The use of myoglobin / carbonic anhydrase III ratio as marker for myocardial damage in patients with renal failure. Clin Chim Acta. 1997; 265: Pudil R, Tichý M, Ulrychová M et al. Biomarkery ischemie a nekrózy myokardu v roce Vnitř Lék. 2008; 54, 10: Heeschen C, Fichtlscherer S, Hamm CW. Pregnancy associated plasma protein A (PAPPA) plasma level independently predict outcome in troponin negative patients with acute coronary syndrome. Circulation. 2003; 108, Suppl. IV: Khosravi J, Diamandi A, Krishna RG et al. Pregnancy associated plasma protein A : ultrasensitive imunoassay and determination in coronary heart disease. Clin Biochem. 2002; 35: Heeschen C, Dimmeler S, et al. Prognostic value of placental growth factor in patients with acute chest pain. JAMA. 2004; 291: Hortin, G.L. The MALDI-TOF mass spectrometric view of the plasma proteome and peptidome. Clin Chem. 2006; 52: McBride JD, Gabriel FG, Fordham J et al. Screening autoantibody profiles in systemic rheumatic disease with a diagnostic protein microarray that uses a 79

80 filtration-assisted nanodot array luminometric immunoassay (NALIA). Clin Chem. 2008; 54: Ulrychová M, Tichý M, Horáček JM et al. Multianalytový přístup k diagnostice srdečních chorob technologií proteinových biočipů. Čas Lék čes. 2009; 148 (12): Ulrychova M, Horáková L, Tichý M et al. Využití technologie proteinových biočipů pro stanovení kardiálních markerů u pacientů s akutním infarktem myokardu. Klin Biochem Metab. 2008; 4: Horacek JM, Tichy M, Jebavy L et al. Use of multiple biomarkers for evaluation of anthracycline-induced cardiotoxicity in patients with acute myeloid leukemia. Exp Oncol. 2008; 30(2): Pudil R, Pařízek P, Tichý M et al. Use of the biochip microarray system in detection of myocardial injury cause by radiofrequency catheter ablation. Clin Chem Lab Med. 2008; 46 (12): Vavrova J, Friedecky B, Ulrychova M et al. Vyšetřování tyreoidních hormonů na systému Randox Evidence Investigator technikou microarray. Klin Biochem Metab. 2007; 4: Firemní materiály [online]. Dostupné na www: < 55. Claudon A, Vergnaud P, Valverde C et al. New automated multiplex assay for bone turnover markers in osteoporosis. Clin Chem. 2008; 54: Backen AC, Cummings J, Mitchell C et al. Fit-for-purpose validation of SearchLight multiplex ELISAs of angiogenesis for clinical trial use. J Immun Methods. 2009; 342: Firemní materiály [online]. Dostupné na www: < 58. Firemní materiály [online]. Dostupné na www: < 59. Ellington A, Kullo IJ, Bailey KR et al. Measurement and quality control issues in multiplex protein assays: a case study. Clin Chem. 2009; 55: Di Serio F, Amodio G, Ruggieri E et al. Proteomic approach to the diagnosis of acute coronary syndrome: preliminary results. Clin Chim Acta. 2005; 357: Varnava AM, Elliott PM, Sharma S et al. Hypertrophic cardiomyopathy: the interrelation of disarray, fibrosis, and small vessel disease. Heart. 2000; 84:

81 62. Maron BJ, Gardin JM, Flack JM et al. Prevalence of hypertrophic cardiomyopathy in a general population of young adults. Echocardiographic analysis of 4111 subjects in the CARDIA study. Coronary artery risk development in (young) adults. Circulation. 1995; 92: Hardarson T, De la Calzada CS, Curiel R et al. Prognosis and mortality of hypertrophic obstructive cardiomyopathy. Lancet. 1973; 2: Marian AJ. Pathogenesis of diverse clinical and pathological phenotypes in hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 2000; 355: Cambronero F, Marín F, Roldán V et al. Biomarkers of pathophysiology in hypertrophic cardiomyopathy: implications for clinical management and prognosis. Eur Heart J. 2009; 30: Zen K, Irie H, Doue T et al. Analysis of circulating apoptosis mediators and proinfl ammatory cytokines in patients with idiopathic hypertrophic cardiomyopathy: comparison between nonobstructive and dilated-phase hypertrophic cardiomyopathy. Int Heart J. 2005; 46: Varol E, Ozaydin M, Sahin M et al. vwf levels as a circulating marker of endothelial dysfunction in patients with hypertrophic cardiomyopathy. Indian Heart J. 2005; 57: Dimitrow PP, Undas A, Bober M et al. Plasma biomarkers of endothelial dysfunction in patients with hypertrophic cardiomyopathy. Pharmacol Rep. 2007; 59: Stroud RE, Deschamps AM, Lowry AS et al. Plasma monitoring of the myocardial specific tissue inhibitor of metalloproteinase- 4 after alcohol septal ablation in hypertrophic obstructive cardiomyopathy. J Card Fail. 2005; 11: Ho CY, Seidman CE. A contemporary approach to hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 2006; 113: e858 e Elliott K, Watkins H, Redwood CS. Altered regulatory properties of human cardiac troponin I mutants that cause hypertrophic cardiomyopathy. J Biol Chem. 2000; 275: Sato Y, Taniguchi R, Nagai K et al. Measurements of cardiac troponin T in patients with hypertrophic cardiomyopathy. Heart. 2003; 89:

82 73. Pop GA, Cramer E, Timmermans J et al. Troponin I release at rest and after exercise in patients with hypertrophic cardiomyopathy and the effect of betablockade. Arch Cardiol Mex. 2006; 76: Morady F. Radiofrequency ablation as treatment for cardiac arrhythmia. N Engl J Med. 1999; 340: Stevenson WG, Ellison KE, Lefroy DC et al. Ablation therapy for cardiac arrhythmias. Am J Cardiol. 1997; 80: 56G-66G. 76. Emkanjoo Z, Mottayden M, Givtaj N et al. Evaluation of post-radiofrequency myocardial injury by measuring cardiac troponin I levels. Int J Cardiol. 2007; 117: Manolis AS, Vassilikos V, Maounis T et al. Detection of myocardial injury during radiofrequency catheter ablation by measuring serum cardiac troponin I levels: Procedural correlates. J Am Coll Cardiol. 1999; 34: Haines DE, Whayne JG, Walker J et al. The effect of radiofrequency catheter ablation on myocardial creatine kinase activity. J Cardiovasc Electrophysiol. 1995; 6: Shan K, Lincoff AM, Young JB. Anthracycline-induced cardiotoxicity. Ann Intern Med. 1996; 125: Jones RL, Swanton C, Ewer MS. Anthracycline cardiotoxicity. Expert Opin Drug Saf. 2006; 5: Gottdiener JS, Appelbaum FR, Ferrans VJ et al. Cardiotoxicity associated with high dose cyclophosphamide therapy. Arch Intern Med. 1981; 141: Morandi P, Ruffini PA, Benvenuto GM et al. Cardiac toxicity of high-dose chemotherapy. Bone Marrow Transplant. 2005; 35: Ganz WI, Sridhar KS, Ganz SS et al. Review of tests for monitoring doxorubicin-induced cardiomyopathy. Oncology. 1996; 53: Meinardi MT, van der Graaf WT, van Veldhuisen DJ et al. Detection of anthracycline-induced cardiotoxicity. Cancer Treat Rev. 1999; 25: Pudil R, Horacek JM, Strasova A et al. Monitoring of the very early changes of left ventricular diastolic function in patients with acute leukemia treated with anthracyclines. Exp Oncol. 2008; 30: Horacek JM, Jakl M, Horackova J et al. Assessment of anthracycline-induced cardiotoxicity with electrocardiography. Exp Oncol. 2009; 31:

83 87. Bryant J, Picot J, Baxter L et al. Use of cardiac markers to assess the toxic effects of anthracyclines given to children with cancer: a systematic review. Eur J Cancer. 2007; 43: Mavinkurve-Groothuis AM, Kapusta L, Nir A et al. The role of biomarkers in the early detection of anthracycline-induced cardiotoxicity in children: a review of the literature. Pediatr Hematol Oncol. 2008; 25: Dolci A, Dominici R, Cardinale D et al. Biochemical markers for prediction of chemotherapy-induced cardiotoxicity: Systematic review of the literature and recommendations for use. Am J Clin Pathol. 2008; 130:

84 10. Seznam zkratek ABC albumin vázající kobalt (albumin binding cobalt) ACCF American College oc Cardiology Foundation AD ředící roztok (Assay diluent) AHA American Heart Association AIM akutní infarkt myokardu AKS akutní koronární syndrom AMK aminokyselina ANP antriální natriuretcký peptid ANT antracyklíny AP angina pectoris AST aspartátaminotransferáza ATP adenosintrifosfát BNP mozkový natriuretický peptid CA III karboanhydráza III CARP cabronic anhydrase related protein (protein spojený s CA) CCD charge-coupled device CD40L CD40 ligand CK kreatinkináza CKMB MB izoenzym kreatinkinázy CKMB MASS MB izoenzym kreatinkinázy (hmotnostní koncentrace) CoA koenzym A CRP C reaktivní protein CT chemoterapie ctnc troponin C ctni troponin I ctnt troponin T CV variační koeficient ECLIA elektrochemiluminiscenční imunoanalýza EKG elektrokardiografie ELISA sendvičová enzymoimunoanalýza ESC European Society of Cardiology 84

85 F fyziologický roztok FFA volné mastné kyseliny GP glykogenfosforyláza GPBB BB izoenzym glykogenfosforylázy HD-CT vysokodávková chemoterapie h-fabp srdeční typ proteinu vázajícího mastné kyseliny HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie hs high-senzitivní IFCC Internationa Federation of Clinical Chemistry IL interleukin IMA ischemií modifikovaný albumin LD laktátdehydrogenáza LOD limit detekce MALDI matrix assisted laser desorption / ionization MPO myeloperoxidáza MS hmotnostní spektrometrie MYO myoglobin NACB National Academy of Clinical Biochemistry NALIA Nanodot Array Luminometric Immunoassay NP natriuretický peptid NPV negativní prediktivní hodnota NSTEMI akutní infarkt myokardu bez elevací ST NT-proBNP N-terminální pro BNP PAPP-A pregnancy associated plasma protein A PIGF placentární růstový faktor POCT point of care testing RCV kritické diference RFA radiofrekvenční ablace STEMI akutní infarkt myokardu s elevacemi ST TNF tumor nekrotizující faktor TOF time of flight WB promývací pufr (wash buffer) WHF World Heart Federation 85

86 11. Seznam obrázků a tabulek Obrázky Obr 1. Naměřené koncentrace ctni metodou Erenna Singulex ve zdravé referenční populaci Obr 2. ROC křivka hs-ctnt versus ctnt 4. generace Obr 3. Passing-Bablokova regrese - porovnání metod CK-MB mass Obr 4. Passing-Bablokova regrese - porovnání metod MYO Obr 5. Passing-Bablokova regrese - porovnání metod h-fabp Obr 6. Passing-Bablokova regrese - porovnání metod GPBB Tabulky Tab 1. Příčiny možného zvýšení kardiálních troponinů při absenci ischemické choroby srdeční Tab 2. Biologické variability kardiálních markerů Tab 3. Výsledky hodnocení interní kontroly kvality pro Evidence Investigator Cardiac Array Tab 4. Koncentrace kontrol udávaná výrobcem Tab 5. Průměrná hodnota naměřených koncentrací Tab 6. Linearita Tab 7. Opakovatelnost Tab 8. Ředění vzorků Tab 9. Závislost poklesu naměřené koncentrace na čase Tab 10. Koncentrace kardiálních markerů u zdravých kontrol 86

87 12. Přílohy I. Vasatova M, Pudil R, Tichy M, Buchler T, Horacek JM, Haman L, Parizek P, Palicka V. High-sensitivity troponin T as a marker of myocardial injury after radiofrequency catheter ablation. Ann Clin Biochem. 2011; 48: II. Vašatová M, Holečková M, Bartošková I, Tichý M, Friedecký B. Kardiální troponin T ultrasenzitivní metodou porovnání metod. Klin Biochem Metab. 2010; 18 (39), 4: III. Vašatová M, Tichý M, Pudil R, Horáková L, Tomko T, Řeháček V. První zkušenosti se stanovením kardiálního troponinu T high-sensitivní metodou Klin Biochem Metab. 2010;18 (39), 1, p IV. Vašatová M, Tichý M, Horáček JM, Pudil R, Horáková L, Palička V. Multianalytový přístup k diagnostice srdečních chorob technologií proteinových biočipů. Čas Lék čes. 2009; 148 (12): V. Ulrychová M, Horáková L, Tichý M, Horáček JM, Pudil R. Využití technologie proteinových biočipů pro stanovení kardiálních markerů u pacientů s akutním infarktem myokardu. Klin Biochem Metab. 2008; 16 (37), 4: VI. Horáková L, Pudil R, Tichý M, Ulrychová M, Vojáček J. Kardiospecifické markery v průběhu akutního infarktu myokardu zkušenosti s využitím proteinových biočipů. Interv Akut Kardiol. 2010; 9, 4: VII. Pudil R, Vasatova M, Lenco J, Tichy M, Fucikova A, Horacek JM, Vojacek J, Stulik J, Palicka V. Plasma glycogen phosphorylase BB is associated with pulmonary artery wedge pressure and left ventricle mass index in patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clin Chem Lab Med. 2010; 48:

88 VIII. Horacek J, Vasatova M, Tichy M, Pudil R, Jebavy L, Maly J. The use of cardiac biomarkers in detection of cardiotoxicity associated with conventional and high-dose chemotherapyfor acute leukemia. Exp Oncol. 2010; 32, 2: IX. Pudil R, Tichý M, Lenčo J, Horáček JM, Ulrychová M, Fučíková A, Vojáček J, Stulík J, Palička V. Hladiny markerů poruchy struktury myokardu u pacientů s hypertrofickou kardiomyopatií. Interv Akut Kardiol. 2009; 8, 4: X. Pudil R, Pařízek P, Tichý M, Haman L, Horáková L, Ulrychová M, Vojáček J, Palička V. Use of the biochip microarray system in detection of myocardial injury cause by radiofrequency catheter ablation. Clin Chem Lab Med. 2008; 46 (12): XI. Horacek JM, Tichy M, Jebavy L, Pudil R, Ulrychova M, Maly J. Use of multiple biomarkers for evaluation of anthracycline-induced cardiotoxicity in patients with acute myeloid leukemia. Exp Oncol. 2008; 30(2): XII. Horacek JM, Pudil R, Tichy M, Jebavy L, Strasova A, Ulrychova M, Zak P, Maly J. Cardiac troponin I seems to be superior to cardiac troponin T in the early detection of cardiac injury associated with anthracycline treatment. Onkologie. 2008; 31 (10): XIII. Vašatová M, Pudil R, Tichý M, Fučíková A, Lenčo J. Pozitivní hodnoty highsenzitivního kardiálního troponinu T u pacientů s hypertrofickou kardiomyopatií. Labor Aktuell. 2010; 3:

89 I. High-sensitivity troponin T as a marker of myocardial injury after radiofrequency catheter ablation Vasatova M, Pudil R, Tichy M, Buchler T, Horacek J M, Haman L, Parizek P, Palicka V Ann Clin Biochem. 2011; 48:

90 90

91 91

92 92

93 II. Kardiální troponin T ultrasenzitivní metodou porovnání metod Vašatová M, Holečková M, Bartošková I, Tichý M, Friedecký B Klin Biochem Metab. 2010; 18 (39), 4:

94 94

95 95

96 96

97 97

98 III. První zkušenosti se stanovením kardiálního troponinu T high-sensitivní metodou Vašatová M, Tichý M, Pudil R, Horáková L, Tomko T, Řeháček V Klin Biochem Metab. 2010; 18 (39), 1:

99 99

100 100

101 101

102 IV. Multianalytový přístup k diagnostice srdečních chorob technologií proteinových biočipů Vašatová M, Tichý M, Horáček JM, Pudil R, Horáková L, Palička V Čas Lék čes. 2009; 148 (12):

103 103

104 104

105 105

106 106

107 107

108 108

109 V. Využití technologie proteinových biočipů pro stanovení kardiálních markerů u pacientů s akutním infarktem myokardu Ulrychová M, Horáková L, Tichý M, Horáček J M, Pudil R Klin Biochem Metab. 2008; 16 (37), 4:

110 110

111 111

112 112

113 113

114 VI. Kardiospecifické markery v průběhu akutního infarktu myokardu zkušenosti s využitím proteinových biočipů. Horáková L, Pudil R, Tichý M, Ulrychová M, Vojáček J Interv Akut Kardiol. 2010; 9, 4:

115 115

116 116

117 117

118 118

119 119

120 VII. Plasma glycogen phosphorylase BB is associated with pulmonary artery wedge pressure and left ventricle mass index in patients with hypertrophic cardiomyopathy Pudil R, Vasatova M, Lenco J, Tichy M, Fucikova A, Horacek JM, Vojacek J, Stulik J, Palicka V Clin Chem Lab Med. 2010; 48:

121 121

122 122

123 123

124 VIII. The use of cardiac biomarkers in detection of cardiotoxicity associated with conventional and highdose chemotherapy for acute leukemia Horacek J, Vasatova M, Tichy M, Pudil R, Jebavy L, Maly J Exp Oncol. 2010; 32, 2:

125 125

126 126

127 127

128 IX. Hladiny markerů poruchy struktury myokardu u pacientů s hypertrofickou kardiomyopatií Pudil R, Tichý M, Lenčo J, Horáček JM, Ulrychová M, Fučíková A, Vojáček J, Stulík J, Palička V Interv Akut Kardiol. 2009; 8, 4:

129 129

130 130

131 131

132 132

133 X. Use of the biochip microarray system in detection of myocardial injury cause by radiofrequency catheter ablation Pudil R, Pařízek P, Tichý M, Haman L, Horáková L, Ulrychová M, Vojáček J, Palička V Clin Chem Lab Med. 2008; 46 (12):

134 134

135 135

136 136

137 XI. Use of multiple biomarkers for evaluation of anthracycline-induced cardiotoxicity in patients with acute myeloid leukemia Horacek JM, Tichy M, Jebavy L, Pudil R, Ulrychova M, Maly J Exp Oncol. 2008; 30 (2):

138 138

139 139

140 140

141 XII. Cardiac troponin I seems to be superior to cardiac troponin T in the early detection of cardiac injury associated with anthracycline treatment Horacek JM, Pudil R, Tichy M, Jebavy L, Strasova A, Ulrychova M, Zak P, Maly J Onkologie. 2008; 31(10):

142 142

143 143

144 XIII. Pozitivní hodnoty high-senzitivního kardiálního troponinu T u pacientů s hypertrofickou kardiomyopatií Vašatová M, Pudil R, Tichý M, Fučíková A, Lenčo J. Labor Aktuell. 2010; 3:

145 145

146 146