MULTIMARKEROVÝ PŘÍSTUP V DIAGNOSTICE KARDIOLOGICKÝCH ONEMOCNĚNÍ S VYUŽITÍM PROTEINOVÝCH BIOČIPŮ

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA BIOCHEMICKÝCH VĚD MULTIMARKEROVÝ PŘÍSTUP V DIAGNOSTICE KARDIOLOGICKÝCH ONEMOCNĚNÍ S VYUŽITÍM PROTEINOVÝCH BIOČIPŮ DISERTAČNÍ PRÁCE HRADEC KRÁLOVÉ 2012 RNDr. MARTINA VAŠATOVÁ 1

2 Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. RNDr. Martina Vašatová.. 2

3 Moje největší poděkování patří školiteli prof. RNDr. Miloši Tichému, CSc., konzultantce Ing. Jaroslavě Vávrové, Ph.D. a prof. MUDr. Vladimíru Paličkovi, CSc., dr.h.c. za odborné vedení, cenné rady a připomínky, trpělivost, toleranci, pomoc a dobrou náladu při řešení této práce. Můj dík patří také kolektivu Ústavu klinické biochemie a diagnostiky za podporu, spolupráci a pohodovou atmosféru v laboratoři. Dále děkuji lékařům I. Interní kliniky, Oddělení klinické hematologie na II. Interní klinice a Transfuzního oddělení Fakultní nemocnice v Hradci Králové, obzvláště pak prof. MUDr. Radkovi Pudilovi, CSc., MUDr. Janu Horáčkovi, Ph.D., MUDr. Lucii Horákové, MUDr. Tomášovi Tomkovi, MUDr. Jaroslavu Duškovi, Ph.D. a MUDr. Vítu Řeháčkovi, za skvělou spolupráci na klinických studiích. Děkuji prof. MUDr. Jaroslavu Dršatovi, CSc. za důležité informace týkající se studia na Farmaceutické fakultě. 3

4 Obsah 1. Abstrakt Abstract Úvod Cíle práce Teoretická část Kardiální markery Historie Běžné kardiální markery Srdeční troponiny Funkce a biochemie troponinů Troponin a akutní koronární syndromy Metody stanovení troponinů CKMB izoenzym kreatinkinázy Myoglobin Natriuretické peptidy Nové markery ischemie nebo nekrózy myokardu Protein vázající volné mastné kyseliny (FABP) Funkce a biochemie FABP Metody stanovení FABP BB izoenzym glykogenfosforylázy (GPBB) Funkce a biochemie GPBB Metody stanovení GPBB Ischemií modifikovaný albumin (IMA) Volné mastné kyseliny (FFA) Karboanhydráza III (CA III) Markery zánětlivé reakce C-reaktivní protein (CRP) CD40 ligand (CD40L) Myeloperoxidáza (MPO) Pregnancy associated plasma protein A (PAPP-A) Placentární růstový faktor (PIGF)

5 Cholin Cytokiny a adhezní molekuly Proteomika a proteinové biočipy Multiplexní analýza proteinovými čipy Problémy proteinových biočipů Multianalytový přístup a některé klinické aplikace Akutní koronární syndromy Hypertrofická kardiomyopatie Monitorování léčby arytmií radiofrekvenční katetrovou ablací Kardiotoxicita cytostatik Experimentální část Metody Biočipový Evidence Investigator Cardiac array Kalibrace Analytické parametry soupravy Srovnání metod High-sensitivity troponin T Kalibrace Analytické parametry soupravy Materiál Pacienti Výsledky a diskuse Analytické parametry panelu Cardiac Array Vnitřní kontrola kvality - mezilehlá přesnost a správnost Linearita měření Opakovatelnost Ředění vzorků Citlivost metod Pokles luminiscence v čase Srovnání metod CKMB a MYO GPBB a FABP Zamražování vzorků a stabilita Kalibrace po zamražení

6 Zamražení vzorků Analytické parametry hs-ctnt Vnitřní kontrola kvality - mezilehlá přesnost a správnost Srovnání metod Klinické aplikace Kontrolní skupina dárců krve Akutní infarkt myokardu Hypertrofická kardiomyopatie Radiofrekvenční katetrové ablace Kardiotoxicita cytostatik Závěr Seznam literatury Publikace vztahující se k tématu disertační práce Publikace vztahující se k tématu disertační práce s IF Seznam všech publikací Seznam prezentací na vědeckých setkáních Použitá literatura Seznam zkratek Seznam obrázků a tabulek Přílohy

7 1. Abstrakt Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: RNDr. Martina Vašatová Školitel: prof. RNDr. Miloš Tichý, CSc. Název disertační práce: Multimarkerový přístup v diagnostice kardiologických onemocnění s využitím proteinových biočipů Úvod: Sledování biochemických markerů poškození myokardu hraje důležitou roli v diagnostice kardiovaskulárních onemocnění. U akutního infarktu myokardu (AIM) bez nebo s elevacemi ST segmentů (NSTEMI, STEMI) je zvýšení kardiálních biomarkerů jedním z hlavních diagnostických kritérií. European Society of Cardiology, American College of Cardiology Foundation, American Heart Association a World Heart Federation publikovali novou univerzální definici infarktu myokardu, která zahrnuje detailní návody pro použití kardiálních markerů při podezření na AIM. V první řadě je doporučeno stanovení kardiálních troponinů T a I (ctnt a ctni) jako markerů nekrózy myokardu a kvantifikace myoglobinu (MYO) a hmotnostní koncentrace MB izoenzymu kreatinkinázy (CKMB mass) při diagnostice reinfarktu. Kromě akutního koronárního syndromu může také docházet k poškození myokardu u jiných kardiovaskulárních onemocnění, během různých léčebných procedur a výkonů (např. perkutánní koronární intervence, radiofrekvenční ablace atd.) nebo při léčbě kardiotoxickými preparáty. Metody: V současnosti jsou pro kardiospecifické troponiny rychle vyvíjeny metody s vyšší analytickou citlivostí, nazývané high-sensitivní testy. A také se spektrum kardiálních markerů značně rozšiřuje a zahrnuje některé molekuly, které by mohly být potenciálně důležité pro diagnostiku kardiovaskulárních onemocnění a je vhodné jejich odzkoušení v rutinních aplikacích. Mezi tyto nové molekuly patří BB izoenzym glykogenfosforylázy (GPBB), srdeční typ proteinu vázajícího mastné kyseliny (h-fabp) a karboanhydráza III (CAIII). Pro měření vybraných kardiálních markerů: CKMB mass, MYO, CAIII, ctni, h-fabp, GPBB jsme použili biočipový systém Evidence Investigator (Randox) a dále jsme testovali novou high-senzitivní metodu pro kardiální troponin T (hs-ctnt) na analyzátoru Elecsys 2010 (Roche). Kardiální markery byly 7

8 hodnoceny u zdravých dárců krve a v různých skupinách pacientů s kardiovaskulárními onemocněními (akutní infarkt myokardu, hypertrofická kardiomyopatie, kardiotoxicita chemoterapie, radiofrekvenční ablace). Výsledky: Jak jsme předpokládali, u pacientů s akutním infarktem myokardu byly zvýšené sérové koncentrace všech kardiálních markerů. U radiofrekvenčních ablací naše data ukazují, že procedura způsobuje drobná poškození myokardu, která lze nejlépe monitorovat sledováním zvýšené koncentrace hs-ctnt. U pacientů s hypertrofickou kardiomyopatií jsou GPBB a h-fabp citlivějšími markery ve srovnání s troponinem I, CKMB mass a myoglobinem. Koncentrace GPBB dokonce koreluje s klinickým stavem. Naše další výsledky ukazují, že podávání chemoterapie u hematoonkologických malignit může být spjato s poškozením myokardu, které je manifestováno uvolněním GPBB z kardiomyocytů. Závěr: Multimarkerový přístup biočipové analýzy je aplikovatelný v biochemické diagnostice kardiovaskulárních onemocnění, může rozšířit naše informace a vhodně doplnit rutinní stanovení. 8

9 2. Abstract Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Kralove Department of Biochemical Sciences Candidate: RNDr. Martina Vasatova Supervisor: prof. RNDr. Milos Tichy, CSc. Title of Doctoral Thesis: Multimarker approach in diagnosis of cardiovascular diseases with using protein biochips Background: Measurement of biochemical markers of myocardial injury plays an important role in the diagnosis of cardiovascular disseases. Increase in some cardiac biomarkers is one of main diagnostic standard in acute myocardial infarction (AIM) with or without ST elevation (STEMI, NSTEMI). Recently, the European Society of Cardiology, the American College of Cardiology Foundation, the American Heart Association, and the World Heart Federation have published a consensus definition of myocardial infarction (AIM) that includes a detailed guideline for the assessment of biochemical markers in suspected AIM. The principal markers recommended in this setting include cardiac troponins (ctni and ctnt) as markers of myocardial necrosis and myoglobin (MYO) and creatine kinase MB isoenzyme (CK-MB mass) quantification in the diagnosis of reinfarction. Excluding acute coronary syndromes, myocardial injury may be found in patients with the other cardiovascular diseases, during therapeutic procedures and operations (e.g. percutaneous coronary intervention, radiofrequency ablation etc.) or in treatment with cardiotoxic drug. Methods: For cardiac troponins, in last time, methods on higher analytical sentitivity, so called high-sensitive tests, have been rapidly developed. The armamentarium of cardiac markers has expanded to include several molecules that could be potentially useful for diagnosis of acute coronary syndromes (AKS) and are awaiting validation for routine clinical applications. These novel analytes include glycogen phosphorylase BB isoenzyme (GPBB), heart-type fatty acid-binding protein (h-fabp) and carbonic anhydrase III (CA III). Evidence Investigator biochip system (Randox) was used to measure levels selected cardiac biomarkers including CKMB mass, ctni, MYO, h-fabp, CAIII and GPBB. In addition, we have tested a highly sensitive cardiac troponin T 9

10 (hs-ctnt) assay for Elecsys 2010 analyzer (Roche). Cardiac biomarker levels were measured in cohorts of healthy blood donors and various patient s groups with cardiovascular diseases (acute myocardial infarction, hypertrophic cardiomyopathy, cardiotoxicity of chemotheraphy, radiofrequency ablation). Results: As expected, in AIM patients we have observed statistically significant increases in the serum levels of the measured cardiac biomarkers. In radiofrequency ablation our data indicate that procedure causes the most significant increase of serum hs-ctnt concentration that could be used to monitor myocardial injury. In hypertrophic cardiomyopathy patients, GPBB and h-fabp levels are more sensitive markers compare to troponin I, CKMB mass and myoglobin levels, GPBB level was associated with clinical parameters. Our results suggest that administration of chemotherapy for hematologic malignancies could be associated with myocardial injury manifested by increased release of GPBB from cardiomyocytes. Conclusion: Multianalyte biochip-based assay is applicable for biochemical diagnosis of acute coronary syndromes and may add valuable information to standard single marker assays. 10

11 3. Úvod Kardiovaskulární onemocnění jsou celosvětově nejčastější příčinou úmrtí a invalidity mužů i žen. Pojem kardiovaskulární onemocnění zahrnuje velké množství jednotlivých chorob. Mezi nejzávažnější patří ischemická choroba srdeční, cévní mozková příhoda a srdeční selhání. Akutní koronární syndrom (klinická prezentace ischemické choroby srdeční) je jako nestabilní angina pectoris, infarkt myokardu bez elevace ST a infarkt myokardu s elevací ST hlavní příčinou hospitalizace a úmrtí pacientů. Kromě akutního koronárního syndromu může také docházet k poškození myokardu u různých kardiovaskulárních onemocnění, během léčebných procedur a výkonů (např. při perkutánní koronární intervenci, radiofrekvenční ablaci atd.) nebo při léčbě kardiotoxickými preparáty. Svým dopadem na morbiditu a mortalitu pacientů a také na ekonomickou stránku zdravotní péče předčí kardiovaskulární příhody všechna ostatní onemocnění. V Evropě v současné době umírá na choroby srdce a cév každý rok více než 4,3 miliónu nemocných, což představuje necelou polovinu všech úmrtí. Pokud se vše převede do ekonomického pohledu, odhaduje se, že celkové náklady na diagnostiku a léčbu kardiovaskulárních onemocnění v EU představují ročně 192 miliard eur, z toho 57 % činí přímé náklady na zdravotní péči, 21 % připadá na vrub poklesu produktivity práce a 22 % tvoří nepřímé náklady. Z tohoto důvodu je léčba a prevence kardiovaskulárních onemocnění hlavní prioritou zdravotnictví na celém světě (1,2). Pro diagnostiku poškození struktury myokardu existuje v dnešní době široké spektrum biochemických markerů. V první řadě jsou to kardiospecifické srdeční troponiny, které jsou preferovány pro průkaz nekrózy myokardu, ale jejichž stanovení je limitováno pomalou kinetikou v prvních hodinách po vzniku nekrózy buněk srdečního svalu. Dále se v klinické praxi využívá stanovení myoglobinu a CKMB mass jako kardiálních markerů, sice tkáňově nespecifických, ale s rychlejší kinetikou vzestupu než je pozorována u troponinů; pro hodnocení funkce myokardu se využívá stanovení natriuretických peptidů. Přesto v současné době prochází oblast laboratorní medicíny zabývající se kardiálními markery dynamickým vývojem a hledají se nové perspektivní molekuly využitelné pro kardiologickou diagnostiku. Rozšiřují se poznatky 11

12 o nových analytech, které by bylo možné využívat pro sledování ischemie či nekrózy myokardu, a které by postupně mohly výhodně doplnit spektrum již rutinně používaných kardiálních markerů. U některých z těchto látek se předpokládá, že by mohly dobře korelovat s klinickým stavem pacientů a že by se mohly stát dobrými prediktory rizika nebo markery pro kontrolu léčby. V oblasti analýzy kardiálních markerů se vyvíjí neustále citlivější metody, které jsou schopné zachytit i fyziologické nebo mírně zvýšené koncentrace a umožnit tak časnější diagnostiku akutních koronárních syndromů a jiných kardiovaskulárních komplikací. Kromě klasických analytických technik se s rozvojem proteomiky objevují biočipové analýzy, které umožňují simultánní stanovení více parametrů z jednoho vzorku. V současnosti jsou již komerčně dostupné některé biočipové aplikace pro stanovení panelu kardiálních markerů a postupně pronikají do oblasti klinické biochemie. Tato disertační práce se zabývá možným využitím nové high-senzitivní metody na stanovení srdečního troponinu T (hs-ctnt) a diagnostické soupravy Cardiac Array pro biočipový systém Evidence Investigator se spektrem analytů: MB izoenzym kreatinkinázy (CKMB), myoglobin (MYO), BB izoenzym glykogenfosforylázy (GPBB), srdeční typ proteinu vázajícího mastné kyseliny (h-fabp), karboanhydráza III (CAIII) a srdeční troponin I (ctni) u různých kardiovaskulárních onemocnění. 12

13 4. Cíle práce Předložená disertační práce se zabývá možným využitím multimarkerového přístupu v diagnostice kardiovaskulárních onemocnění. Cílem práce bylo sledovat analytické znaky a možné klinické využití nových metod pro stanovení kardiálních markerů u různých poškození myokardu: a) diagnostická souprava Cardiac Array pro biočipový systém Evidence Investigator se spektrem analytů: MB izoenzym kreatinkinázy (CKMB), myoglobin (MYO), BB izoenzym glykogenfosforylázy (GPBB), srdeční typ proteinu vázajícího mastné kyseliny (h-fabp), karboanhydráza III (CAIII) a srdeční troponin I (ctni), b) nová high-senzitivní metoda na stanovení srdečního troponinu T (hs-ctnt). 13

14 5. Teoretická část 5.1. Kardiální markery V dnešní době existuje velmi pestrá paleta biomarkerů poškození myokardu, které mají vztah k metabolismu kardiomyocytů a k průběhu různých patologických dějů. Využití většiny měřených analytů používaných jako kardiální markery je určitým způsobem omezeno, a proto je snaha nalézt a ověřit biomarker, který by se stal ideálním kardiálním markerem a vyhovoval potřebám klinické praxe. Měl by mít v kardiomyocytech vysokou koncentraci, být uvolňován časně po počátku ischemie, měl by přetrvávat zvýšený několik hodin, ale ne příliš dlouho, aby byla umožněna detekce recidivy poškození myokardu. Dále by měl být kardiospecifický a jeho hladina v krvi by měla korelovat s rozsahem poškození. Pro krátkodobé i dlouhodobé stanovení rizika nemocných by měla být také známá korelace mezi přítomností a nepřítomností laboratorního ukazatele v séru a prognózou nemocných. Z analytického hlediska by pak měla být pro jeho stanovení použita kvantitativní a dostatečně senzitivní metoda, i když by měla být také možnost semikvantitativního stanovení u lůžka pacienta (3) Historie Počátek využívání biochemických parametrů v diagnostice ischemického poškození myokardu se datuje do roku 1954, kdy Karmen et al. poprvé popsali uvolnění aspartátaminotransferázy (AST) z poškozených kardiomyocytů (4). Od té doby dochází k neustálému rozšiřování spektra biomarkerů využitelných k průkazu ischemie či nekrózy buněk srdečního svalstva. Následovalo stanovení aktivity dalších enzymů, především izoenzymů laktátdehydrogenázy (LD) a kreatinkinázy (CK). Vyvrcholením této etapy bylo zavedení srdečního izoenzymu CKMB do klinické praxe. Stanovení CK a CKMB se pak stalo po řadu let zlatým standardem při biochemické diagnostice akutního infarktu myokardu (AIM) (5,6). V posledních asi 15 letech probíhá rozšiřování spektra biochemických markerů srdečního poškození velmi dynamicky a kontinuálně. 14

15 Na poli kardiologické diagnostiky se v průběhu let objevovala řada molekul, jejichž stanovení přispívalo ke zpřesnění procesu diagnostiky onemocnění myokardu. Došlo k zavedení a postupné inovaci metod na stanovení myoglobinu (MYO), hmotnostní koncentrace CKMB (CKMB mass), srdečních troponinů (ctnt a ctni) i ke zvýšení citlivosti stanovení C-reaktivního proteinu (CRP) (6). V současné době jsou testovány a používány další biomarkery, které mají vztah k průběhu různých patologických dějů poškození myokardu od zánětlivých změn cévní stěny (prozánětlivé cytokiny IL-6, TNF-α) přes markery destabilizace koronárního plátu (myeloperoxidáza, adhezní molekuly), markery ruptury sklerotického plátu (CD40 ligand, PIGF, PAPP-A) až po markery ischemie (IMA, FFA, cholin) a nekrózy kardiomyocytů (ctn, CKMB mass, MYO, GPBB, h-fabp). Zatímco tato skupina parametrů ukazuje na patologické postižení struktury myokardu, je v klinické praxi používána pouze jedna skupina molekul odrážející funkci myokardu - natriuretické peptidy (BNP a NT-proBNP atd.) (7) Běžné kardiální markery Metody pro stanovení markerů nekrózy myokardu, které byly ještě na konci 90. let standardně doporučovány, jsou již v dnešní době považovány za obsolentní. Určení katalytické aktivity aminotransferáz, laktátdehydrogenázy a jejích izoenzymů, 3-hydroxybutyrátdehydrogenázy, kreatinkinázy a CKMB jako markerů srdečního poškození není vhodné pro nedostatečnou diagnostickou specificitu (8,9,10). Dnes je v první řadě doporučováno vyšetřování tkáňově specifických kardiálních troponinů, jejichž stanovení bylo v minulosti analyticky limitováno nízkou citlivostí metod. Rychlá detekce nárůstu koncentrace troponinu v prvních hodinách po vzniku nekrózy buněk srdečního svalu byla problémem vzhledem k pomalé kinetice tohoto markeru. V současnosti jsou analytické problémy diagnostických souprav řešeny a již jsou k dispozici vysoce senzitivní testy pro stanovení kardiálních troponinů (11,12). Průkaz srdečních troponinů přispěl k zavedení pojmu akutní koronární syndrom (AKS) a k redefinicím AIM v letech 2000 a 2007 (10,13). 15

16 Dále se v klinické praxi běžně využívá stanovení myoglobinu a CKMB mass jako kardiálních markerů, sice tkáňově nespecifických, ale s podstatně rychlejší kinetikou uvolnění do krve. Kromě markerů nekrózy myokardu se pro sledování funkce srdečního svalu používá stanovení natriuretických peptidů a některé markery zánětu, především CRP. Tyto markery se sledují v souvislosti s rozvojem aterosklerózy a predikcí rizika kardiovaskulárních komplikací a mortality Srdeční troponiny Troponinový komplex je imobilizovaný na tenkých filamentech kontraktilního aparátu příčně pruhovaných svalů. Je složen ze tří proteinů kódovaných odlišnými geny, které tvoří část srdečního kontraktilního aparátu. Tento komplex se podílí na regulaci svalové kontrakce a zahrnuje troponin I (ctni, 22 kda), troponin T (ctnt, 37 kda), troponin C (ctnc, 18 kda) a tropomyozin (5) Funkce a biochemie troponinů Funkce ctnt je strukturální, váže tropomyozin a ctnc. Při depolarizaci sarkolemy dochází k uvolnění iontů Ca 2+ z cytoplazmy. Ionty Ca 2+ se váží na ctnc a indukují konformační změny, které zvyšují afinitu ctnc k ctni, dochází ke změně tvaru tropomyozinového vlákna. Tím je umožněna vzájemná interakce aktinu a myozinu, která je závislá na dostupnosti ATP. Pokud je dostatek ATP i Ca 2+, interakce aktinu s myozinem se stále opakují a vyvolávají tím aktivní svalovou kontrakci. Pokud již není dostatek vápníku k navázání na ctnc, dochází k jeho konfirmačním změnám, tím je umožněna vazba ctni na aktin a inhibice aktivity aktinomyozinové Mg 2+ -ATPázy, dochází ke svalové relaxaci (5,14). Molekuly ctnt a ctni mají v myokardu a v kosterním svalu malé, ale zřetelné rozdíly ve skladbě aminokyselin a mohou být imunologicky rozlišeny. Troponin C je identický v srdečním i kosterním svalu, proto se pro diagnostiku AKS nevyužívá. V cytosolu se nachází 6,0-8,0 % ctnt a 2,8-6,0 % ctni (5). Většina troponinů je součástí kontraktilního aparátu a k jejich uvolnění dochází vlivem proteolytické degradace proteázami v myokardu a v krvi (kalpain I, kaspázy, matrixové 16

17 metaloproteinázy). Proteolýza troponinu se objevuje v myokardu jako následek ischemie vedoucí k post-translačním modifikacím působícím selektivní degradaci, tvorbu kovalentních komplexů, fosforylaci, oxidaci a N-terminální acetylaci (14). Proto je troponin vyskytující se v krvi pacientů heterogenní směsí volných, posttranslačně modifikovaných, degradovaných a zkrácených forem. Troponin I se v krvi nachází jako volný a ve formě komplexů hlavně ctni-ctnc, méně pak v komplexu s ctnt (ctnt-ctni-ctnc). Troponin T cirkuluje hlavně ve volné formě, ale byly popsány také fragmenty a komplexy (ctnt-ctni-ctnc) (8,14). Kinetika troponinu T je bifazická, s počátečním vrcholem (ctnt z cytosolu) za 12 hodin od poškození, pokračuje s dalším vrcholem za 3-5 dní, s postupným poklesem obvykle do 10 dní. Doba zvýšení ctnt odpovídá rozsahu AIM, u malého AIM může být kratší než 7 dní, zatímco u rozsáhlého transmurálního AIM může zvýšená hodnota ctnt přetrvávat až 21 dní. Dosažení časného vrcholu a jeho výška závisí na reperfúzi. Vylučování ctni je monofazické, chybí časný vrchol, protože ctni má malý cytosolový pool. Stejně jako u ctnt i u ctni je doba zvýšení velmi variabilní a závislá na rozsahu AIM (5) Troponin a akutní koronární syndromy V diagnostice akutních koronárních syndromů nebo při poškození myokardu jiné etiologie a patogeneze jsou při odpovídající klinické symptomatologii vyšší koncentrace ctn považovány za důsledek ireverzibilní nekrózy myokardu. V roce 2007 European Society of Cardiology (ESC), American College of Cardiology Foundation (ACCF), American Heart Association (AHA) a World Heart Federation (WHF) publikovaly místo původního doporučení (13) novou univerzální definici infarktu myokardu (10). V témže roce vyšla také nová doporučení National Academy of Clinical Biochemistry (NACB) a International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) (9,15), v nichž je přesně dáno použití biochemických markerů poškození myokardu. V první řadě jsou pro průkaz nekrózy myokardu doporučeny srdeční troponiny ctni a ctnt. Doporučení však požadují, aby byla jako hodnota cut-off používána hodnota 99. percentilu zdravé referenční populace stanovená s analytickou přesností (CV%) do 10 %. Tento požadavek na citlivost většina diagnostických souprav pro stanovení troponinu nesplňuje, i když v současné době již nově pronikají na trh soupravy 17

18 s nižšími limity detekce a kvantifikace (tzv. high-senzitivní metody), kterými už lze měřit nízké koncentrace troponinu s požadovanou přesností (11,12). V roce 2010 Thygesen et. al. publikovali v návaznosti na definici AIM (10) doporučení pro využití měření kardiálních troponinů v akutní kardiologické péči, kde jsou popisovány preanalytické, analytické i postanalytické faktory a interpretace stanovení srdečních troponinů (14). Podle všech dosud zveřejněných mezinárodních doporučení poskytují oba kardiální troponiny (ctnt i ctni) v diagnostice a při stratifikaci rizika dalšího vývoje kardiovaskulárních komplikací rovnocenné klinické informace (8,9,10,14). Zvýšení troponinů je známkou poškození myokardu, ale pouze klinické symptomy mohou ukazovat na etiologii uvolnění troponinu do krevního oběhu. Jen v případě akutního poškození myokardu způsobeného ischemií může být diagnostikován AIM. Nicméně existují i jiné patologické podmínky (Tab. 1), které vedou k poškození srdečního svalu a nesmí být zaměněny s AIM (10,14). Tab. 1: Příčiny možného zvýšení kardiálních troponinů při absenci ischemické choroby srdeční (10) kontuze srdce nebo jiné trauma zahrnující chirurgické zákroky těžké srdeční selhání, kardiogenní šok disekce aorty těžká stenóza aortální chlopně hypertrofická kardiomyopatie, tako tsubo kardiomyopatie tachy- a bradykardie, srdeční blok, elektrická kardioverze (defibrilace, radiofrekvenční ablace) rhabdomyolýza s poškozením myokardu plicní embolie, plicní hypertenze selhání ledvin akutní neurologické choroby, mozková mrtvice, subarachnoideální hemoragie infiltrativní onemocnění: amyloidóza, hemochromatóza, sarkoidóza, myokarditida, perikarditida toxické vlivy kriticky nemocní: respirační selhání, sepse popáleniny extrémní námaha 18

19 Zachycení prvního nárůstu troponinu v prvních hodinách po počátku akutní koronární příhody, je velmi důležité pro zahájení včasné reperfúze. Zvyšování citlivosti metod samozřejmě urychluje diagnostiku AKS, ale na druhou stranu odmaskuje daleko více chronických vzestupů koncentrace troponinu. Proto je důležité hodnotit kinetiku vzestupu a poklesu koncentrace ctn v několika následujících odběrech pro odlišení akutního a chronického poškození myokardu. Odběr vzorku by se měl provádět při příjmu pacienta a po dalších 6-9 (případně ještě po 12-24) hodinách. Akutní proces se manifestuje vzestupem koncentrace ctn, zatímco u chronických stavů (renální selhání, stabilní angina pectoris, chronického srdečního selhání atd.) zůstává ctn bez výrazných změn. Vysoce citlivými metodami se hledají hodnoty krátkodobých a dlouhodobých biologických variabilit (CVi, CVg) a kritické diference (RCV) pro stanovení kardiálních troponinů (Tab. 2) (16,17). Tab 2. Biologické variability kardiálních markerů (16,17). Hodnoty kardiálních troponinů byly získány high-senzitivními metodami (ctni Errena Singulex a hs-ctnt Roche), CVa - variační koeficient analytický, CVi - variační koeficient individuální, CVg - variační koeficient skupinový, II - index individuality, RCV kritická diference marker CVa, % CVi, % CVg, % II RCV, % čas akutní markery CK ,52 72,2 den CK-MB, aktivita 29 4,9 14 0,35 81,8 den CK-MB, mass 6, ,3 54,4 den myoglobin ,38 61,2 den ctni 8,3 9,7 57 0,21 +46, -32 hodina c TnT 53,5 48,2 85,9 0,84 84,6 hodina chronické markery myoglobin 6, ,80 35,0 týden CRP 5, , týden MPO ,2 100 týden BNP 8, , týden NT-proBNP 3, ,0 98 týden NT-proBNP 1, ,9 92 týden ctni ,39 +81, -45 týden ctnt ,4 315 týden 19

20 Metody stanovení troponinů Metody na stanovení srdečních troponinů používané v klinické praxi jsou vesměs založené na imunochemických principech. Používané soupravy na stanovení troponinu I jsou produkovány řadou výrobců a jak je u imunochemických metod obvyklé, odlišují se použitými protilátkami a způsoby detekce komplexů antigenprotilátka. Následky této skutečnosti jsou pro klinickou praxi nepříjemné, je třeba vzít na vědomí, že různé analytické systémy měření troponinů poskytují nesrovnatelné číselné výsledky, vykazují velmi odlišné hodnoty 99. percentilu a rozdílné hodnoty přesnosti měření. Logickým důsledkem jsou pak rozdílné počty pozitivních a negativních klinických klasifikací akutního koronárního syndromu (6). V roce 2008 byla publikována práce srovnávající 14 různých systémů na stanovení troponinu I od 10 různých výrobců (18). Všechny systémy měly různou použitou sestavu protilátek, kromě dvou systémů Abbott, ty však používaly různé detekční substráty a metody. U všech systémů byly odlišné meze detekce a rozhodovací limity. U 5 sytémů byly hodnoty 99. percentilu referenční populace nižší než trojnásobek meze detekce (LOD), což je analyticky nepříznivá skutečnost a pouze u 4 systémů pak bylo možné na úrovni koncentrace 99. percentilu dosáhnout přesnosti CV 10%. V roce 2010 bylo testováno 5 systémů na stanovení high-senzitivního ctni. Ani jeden nebyl schopen dosáhnout přesnosti CV 10% pro hodnotu 99. percentilu. Jen u jednoho systému byl 99. percentil větší než trojnásobek meze detekce (11). K vyšší úrovni harmonizace výsledků ctni by měla přispět návaznost metod na referenční standard SRM -NIST 2921 (19). Nejcitlivější metodou na stanovení ctni je imunoanalýza založená na počítání jednotlivých částic Erenna (Singulex, Alameda, USA) s limitem detekce 0,2 ng/l a CV<10% při koncentraci 0,78 1,6 ng/l (20). Takto senzitivní metodou je možné stanovit přesnou koncentraci ctni téměř u všech zdravých lidí. Distribuce koncentrací ctni u zdravých dárců krve je znázorněna na obrázku (Obr. 1). 20

21 Obr. 1: Naměřené koncentrace ctni metodou Erenna Singulex ve zdravé referenční populaci, převzato z (20). Produkce souprav ke stanovení ctnt je dosud omezena jen na jednoho výrobce. V roce 2010 byla publikována validace nové high-senzitivní metody využívající principu elektrochemiluminiscenční imunoanalýzy (ECLIA) (12). Metoda vykazuje mez detekce LOD=5 ng/l, rozsah měření ng/l a hodnotu 99. percentilu 14 ng/l, při které je přesnost CV=9,0% (n=616). Citlivost a reprodukovatelnost je dle požadavků doporučení (9,10,14) dostatečná, ale výsledky srovnání původní a nové generace metody nejsou v nízkých koncentracích troponinu T příliš uspokojivé. Na hladině cut-off původní metody (30 ng/l) dává ultrasenzitivní metoda přibližně o 75% vyšší výsledky, což může být způsobeno problémy s kalibračními materiály a jejich návazností na referenční materiál (12,21). Nově publikovaná data (22) o této metodě ukazují 100% diagnostickou senzitivitu a 100 % negativní prediktivní hodnotu (NPV) při naměřené koncentraci hs-ctnt menší než 3 ng/l. To umožní rychlé vyloučení AIM u těchto pacientů již v době přijetí pacienta podezřením na AIM (již do 3 hodin po nástupu bolestí na hrudi). Pro koncentraci 99. percentilu (cut-off=14 ng/l) je pak senzitivita 85,4%, specificita 82,4% a NPV 96,1%. Ve srovnání s předchozí generací metody je u hs-ctnt stanovení vyšší senzitivita, NPV a plocha pod ROC křivkou (Obr. 2), ale nižší specificita. 21

22 Obr. 2: ROC křivka hs-ctnt versus ctnt 4. generace, převzato z (22). 22

23 CKMB izoenzym kreatinkinázy MB izoenzym kreatinkinázy (CKMB) je tkáňově nespecifický marker nekrózy kardiomyocytů a v současnosti představuje náhradní alternativu v případech, kdy není k dispozici stanovení srdečních troponinů. Standardem je stanovení hmotnostní koncentrace CKMB (CKMB mass) imunochemickými technikami. Dříve používané stanovení aktivity CKMB se již nedoporučuje vzhledem k nižší diagnostické senzitivitě a speciticitě v porovnání s CKMB mass (9). CKMB se kromě myokardu v malé míře nachází i v kosterním svalstvu, bránici, děloze, prostatě a jiných orgánech. Pro rychlejší kinetiku vzestupu, ale hlavně vzhledem k poklesu sérových koncentrací po vzniku nekrotického ložiska v srdeční svalovině je zatím CKMB mass kardiomarkerem první volby k detekci reinfarktu v době, kdy v krvi ještě přetrvává vysoká koncentrace troponinů (10). K vzestupu koncentrace CKMB v krvi při nekróze kardiomyocytů dochází za 3 až 10 hodin po začátku onemocnění, koncentrace dosahuje maxima přibližně za 24 hodin a vrací se k normě do 48 až 72 hodin. Časování odběrů je obdobné jako u kardiálních troponinů (8) Myoglobin Myoglobin je cytosolový, kyslík vážící protein příčně pruhovaného svalstva. Vzhledem ke své nízké relativní molekulové hmotnosti (17 kda) uniká při nekróze rychle do lymfatického a krevního oběhu. K vzestupu koncentrací myoglobinu v krvi dochází již 1 až 2 hodiny po začátku onemocnění, koncentrace kulminují během 4 až 10 hodin a vracejí se k normě do 24 hodin. Stanovení myoglobinu se používá hlavně k časné diagnóze akutního koronárního syndromu (AKS) u nemocných, u kterých došlo k příznakům onemocnění v době, kdy ještě nedošlo k vzestupu koncentrace troponinů měřených méně citlivými metodami. Pro vyloučení diagnózy AKS je významná hlavně vysoká negativní prediktivní hodnota stanovení myoglobinu do 6 hodin po začátku onemocnění (přes 90%). Dále je myoglobin použitelným markerem k detekci reinfarktu v době, kdy v krvi přetrvává vysoká koncentrace ctn (8). Myoglobin je časný, ale orgánově nespecifický marker nekrózy myokardu. Vzestup jeho koncentrace v krvi však může být nespecificky podmíněn poškozením struktury kosterního svalstva. Jeho 23

24 stanovení je také limitováno u pacientů s poruchou funkce ledvin (falešně pozitivní výsledek u pacientů s renálním selháním) Natriuretické peptidy Natriuretické peptidy (NP) jsou v klinické praxi hodnoceny coby indikátory selhávání srdce jako pumpy bez ohledu na jeho etiologii. Do krevního oběhu se vyplavují jako projev aktivace jednoho ze základních neurohumorálních systémů regulace srdeční výkonnosti. Natriuretické peptidy jsou cirkulující hormony, významně zasahující do homeostázy vody a iontů. Jsou produkovány v řadě orgánů, klinicky nejvýznamnější je jejich syntéza v myokardu. Způsobují vzestup glomerulární filtrace, natriurézy a diurézy, v cévách vasodilataci společně s dalšími vasodilatačně působícími látkami (prostaglandiny). Blokují neurohumorální systém renin-angiotenzin-aldosteron a působí jako antagonisté adrenergního systému (sympatiku). Mezi NP patří několik strukturálně podobných peptidů: síňový NP (ANP), urodilatin (izoforma ANP), mozkový NP (BNP), NP typu C (CNP) a další. Mimo to byla popsána řada dalších peptidů s natriuretickými vlastnostmi (adrenomedulin, bradykinin) (8,23). Síňový natriuretický peptid (ANP) je syntetizován ve svalovině srdečních síní, méně komor, jako preproanp (151 AMK). Během transportu do sekrečních granulí v cytosolu síňových kardiomyocytů se odštěpuje signální peptid a vzniká proanp. Vlivem stimulu (zvýšení napětí stěny síní) je proanp štěpen na NT-proANP a aktivní ANP. Uvolnění ANP je okamžité, řádově v desítkách sekund až v minutách (8,23). Mozkový natriuretický peptid (BNP) není skladován analogickým způsobem a je za normálních okolností velmi málo syntetizován svalovinou síní a komor. Vzestup jeho koncentrace v krvi je dán rychlostí aktivace jeho syntézy v kardiomyocytech komor hlavně za patologických stavů. Nejsilnějším stimulem je tlakové přetížení komor. Vzestup koncentrace BNP v krvi je však velmi rychlý, řádově v minutách až desítkách minut. Tvorba prekurzorů BNP je obdobná jako u ANP (8,23). Podle dosud zveřejněných mezinárodních doporučení (9,24) poskytuje stanovení BNP i NT-proBNP rovnocenné klinické informace. Výsledek vyšetření přispívá především k diferenciální diagnostice kardiální a extrakardiální etiologie dušnosti. 24

25 U nemocných s klinicky dominující dušností se provádí odběr ihned při přijetí. Kontrolní vyšetření se pak provádí den po přijetí a s odstupem 1-2 týdnů. Výsledky vyšetření také přispívají ke stratifikaci rizika vývoje kardiovaskulárních onemocnění a srdečního selhání. Například Blankenberg et. al. ve studii MONICA (Monitoring of Trends and Determinations of Cardiovascular Disease) vyhodnotili potenciální přínos 30 biomarkerů desetiletého sledování rizika vývoje kardiovaskulárních onemocnění. Studie shrnovala 9 metabolických procesů ve spojení s aterosklerózou: lipidové biomarkery, markery funkce ledvin, metabolické markery diabetu a obezity, markery funkce cév a neurohumorální aktivity, markery zánětu, markery oxidačního stresu a antioxidanty, koagulační markery, markery angiogeneze a markery nekrózy. Markery BNP, NT-proBNP, ctni a CRP se zdají být nejlepšími prediktory rizika kardiovaskulárních příhod (25). V současnosti se běžně komerčně dostupnými soupravami stanovují ANP, BNP, jejich prekursory (probnp) a fragmenty (NT-proANP, NT-proBNP). V případě BNP, NT-proBNP a probnp jsou všechny formy v krvi přítomny současně. V různých analytických systémech se na výsledku podílí určitou mírou zkřížená reaktivita forem BNP, probnp nebo NT-proBNP. V současnosti neexistuje srovnatelnost mezi výsledky měřicích systémů a není ani dostupný primární referenční materiál (8,23). Dále se pak v souvislosti se srdečním selháním začínají na trhu objevovat testy pro další molekuly např. fragmenty NP, copeptin, galectin-3, ST2 receptor interleukinu-1 nebo matrixové metaloproteinázy (26,27). Některé z těchto molekul mají obdobnou diagnostickou senzitivitu a specificitu jako NP a mohou být užitečné při stratifikaci rizika u těchto pacientů Nové markery ischemie nebo nekrózy myokardu V současné době se kromě běžně používaných kardiálních markerů objevují nové molekuly, které mají potenciál stát se dobrými ukazateli poškození myokardu. Mezi nové markery ischemie a nekrózy myokardu patří: srdeční typ proteinu vázajícího mastné kyseliny (h-fabp), BB izoenzym glykogenfosforylázy (GPBB), ischemií modifikovaný albumin (IMA) a volné mastné kyseliny (FFA). 25

26 Kromě těchto molekul může být spektrum markerů ischemie a nekrózy myokardu doplněno o karboanhydrázu III (CA III), která slouží k odlišení poškození srdečního a kosterního svalu, protože se v kardiomyocytech nevyskytuje Protein vázající volné mastné kyseliny (FABP) Jedním z nových slibných kardiomarkerů je srdeční typ proteinu vázajícího mastné kyseliny (heart type fatty acid binding protein, h-fabp). Poprvé byl nalezen v séru po poškození myokardu v roce 1988 (28). Po několika studiích bylo objeveno jeho možné využití jako časného biochemického markeru poškození myokardu a ukazuje se, že by mohl být efektivnějším kardiomarkerem než myoglobin v prvních hodinách po vzniku infarktu myokardu (29,30,31) a možným markerem pro hodnocení prognózy po AKS (30). Hladina h-fabp vzrůstá 1-3 hod po propuknutí příznaků AIM, vrcholu dosahuje během 6-8 hodin a do fyziologických hodnot se jeho koncentrace vrací po 2 dnech. Vzestup h-fabp však není specifický jen pro nekrózu myokardu, ale jeho koncentrace se zvyšuje i při ischemii (32) Funkce a biochemie FABP Proteiny vázající mastné kyseliny jsou relativně malé cytoplazmatické proteiny (15 kda), náležící do rodiny intracelulárních lipidy transportujících proteinů. Hojně se vyskytují ve všech tkáních s aktivním metabolismem mastných kyselin. Mezi ně patří jaterní parenchym, střevo a především myokard, kde % energetické spotřeby zajišťuje metabolismus mastných kyselin lipidovou oxidací. Tyto proteiny obsahují aminokyselin a mají z % identickou sekvenci. Jejich terciální struktura se podobá škebli s otevřenými lasturami, mezi které se váže ligand pomocí interakcí se specifickými aminokyselinami uvnitř vazebné kapsy. Primární funkcí FABP je umožnit intracelulární transport mastných kyselin s dlouhými řetězci. Další funkce zahrnují regulaci genové exprese a předpokládanou ochranu buněk proti efektům lokálně vysoké koncentrace mastných kyselin s dlouhými řetězci během tkáňové ischemie. 26

27 Buněčná exprese FABP je primárně regulovaná na úrovni transkripce a je ovlivňována změnami v metabolismu lipidů např. během tkáňové ischemie, vytrvalostního tréninku, diabetu, orgánové hypertrofie nebo hypolipidemické léčby (29,33). Proteiny vázající mastné kyseliny byly detekovány ve všech lidských tkáních. Díky jednoduchým mutacím vznikly rozdílné izoformy těchto proteinů, které se liší fyzikálními vlastnostmi, hlavně izoelektrickým bodem. Zatím bylo identifikováno devět subtypů FABP, které se liší tkáňovou distribucí a poločasem života v intracelulárním prostředí (2-3 dny). Typy proteinů vázajících mastné kyseliny jsou pojmenovány podle tkání, kde byly poprvé objeveny. Některé formy jsou tkáňově specifické a jiné se mohou vyskytovat ve více různých tkáních. Tkáňově specifické jsou například mozkový (b-fabp) a střevní typ (i-fabp). Srdeční typ (h-fabp) se hojně vyskytuje v kardiomyocytech, méně v buňkách kosterního svalstva, distálních tubulů, specifických částí mozku, střeva, mléčné žlázy a placenty. Jaterní izoforma (l-fabp) je nejvíce zastoupená v hepatocytech, ale v nízkých koncentracích se nachází také v enterocytech a v buňkách proximálních ledvinných tubulů. Díky multiorgánové expresi některé tkáně obsahují více než jeden typ FABP, což je způsobeno koexpresí různých typů FABP v jedné buňce nebo zastoupením více typů buněk s expresí různých typů FABP ve tkáni (29,33) Metody stanovení FABP Pro stanovení izoforem FABP v biologických materiálech byly vyvinuty různé imunochemické metody. Existují také soupravy určené pro screeningová vyšetření. Tyto testy jsou založené na chromatografické imunoanalýze solubilního h-fabp z plné krve. Vzorek se aplikuje do zóny se specifickými protilátkami, pak prochází přes oblast s konjugátem, který obsahuje značené protilátky pro h-fabp. Nakonec se vzniklý imunokomplex zachytí v detekční linii a přebytek značených protilátek je zachycen v kontrolní zóně. Jedná se o rychlé, ale kvalitativní stanovení. Pro kvantifikaci h-fabp se využívají převážně sendvičové imunoanalýzy (29,31). 27

28 BB izoenzym glykogenfosforylázy (GPBB) Funkce a biochemie GPBB Glykogenfosforyláza ( -1,4-D-glukanortofosfát-D-glukosyltransferáza, EC ) je dimerický enzym složený ze dvou stejných podjednotek. V lidských tkáních jsou přítomny tři izoenzymy glykogenfosforylázy: GPLL, GPMM a GPBB. Izoenzym GPLL je obsažen především v jaterní tkáni a ve všech ostatních orgánech s výjimkou příčně pruhovaného svalstva, myokardu a mozkové tkáně. GPMM se vyskytuje převážně ve tkáních příčně pruhovaného svalstva a zřetelně méně v myokardu. Izoenzym GPBB je protein o délce 862 aminokyselin a molekulové hmotnosti 94 kda. Není orgánově specifický, kromě mozku a myokardu se nachází v malém množství také v leukocytech, slezině, ledvinách, močovém měchýři, testes, v zažívacím traktu a v aortě. (33). Izoenzymy GP jsou kódovány odlišnými geny a mohou také mít různé funkční a imunologické vlastnosti. Přibližně 80 % sekvence aminokyselin je u všech tří izoenzymů identických. Rozdíly ve struktuře jednotlivých forem jsou patrné hlavně na C-terminálním konci, který je katalytickou doménou enzymu. GPBB hraje důležitou roli v regulaci metabolismu cukrů. Katalyzuje první krok glykogenolýzy, v němž se glykogen konvertuje na glukóza-1-fosfát za využití anorganického fosfátu. Aktivita GP je allostericky regulována vazbou s AMP a fosforylací. Fyziologická role GP je poskytnout energetickou zásobu pro svalovou kontrakci. V kardiomyocytech je GP vázána s glykogenem a tvoří se sarkoplazmatickým retikulem makromolekulární komplex. Stupeň zapojení GP v tomto komplexu záleží v podstatě na metabolickém stavu myokardu. V případě tkáňové hypoxie je konvertována GP na svou aktivní formu za katalýzy fosforylázakinázou a následně je rozkládán glykogen. Tím GP přechází z formy strukturálně vázané na sarkoplazmatické retikulum do solubilní cytoplazmatické formy. Okamžitě tak vzniká velký koncentrační gradient GP v sarkoplazmatickém retikulu. Když se zároveň zvýší permeabilita buněčné membrány je GP uvolněna z buňky. Uvolnění GP z myokardu při hypoxii a nedostatku živin bylo pozorováno na izolovaných krysích nebo králičích srdcích. Míra uvolnění GP korelovala s obsahem zbytkového glykogenu. Experimentální navození glykogenolýzy 28

29 pomocí dávky adrenalinu nebo pokusy s poškozením membrány po podání imipraminu vedly k závěrům, že na uvolnění GPBB z myokardu je potřeba obou podmínek, jak navození glykogenolýzy tak i zvýšení permeability buněčné membrány. Obě podmínky jsou splněny během ischemie myokardu, proto je GPBB slibný analyt pro detekci ischemického poškození myokardu (34). Dosavadní pozorování ukazují, že GPBB je velmi citlivý marker myokardiální nekrózy a ischemie s časným vzestupem hodnot po AIM za 2-4 hodiny po začátku bolesti, vrcholu dosahuje za 6-20 hodin a k normě se navrací za 1-2 dny. Další studie ukazují, že ke zvýšení hodnot může dojít i v průběhu ischemie myokardu bez nekrózy například v průběhu perkutánních koronárních intervencí, aortokoronárních bypasů apod. (34,35) Metody stanovení GPBB Stejně jako u h-fabp jsou také metody stanovení GPBB založeny na imunochemických reakcích. Pro stanovení GPBB u lůžka pacienta existuje stripový test založený na principu chromatografické imunoanalýzy. Druhou již kvantitativní variantou je stanovení klasickou ELISA technikou, která naopak není vhodná pro statimové měření vzorků. Pro praktické využití je zapotřebí technologie, která kombinuje výhody obou předchozích metod. Zajišťuje kvantitativní analýzu a rychlou diagnostiku GPBB Ischemií modifikovaný albumin (IMA) Mezi nové markery odrážející stav myokardu patří také ischemií modifikovaný albumin (IMA). Během srdečního selhání vznikají kyslíkové radikály, které způsobují zánět a nekrózu myocytů. Předpokládá se, že během ischemie a reperfúze myokardu vytvořené volné reaktivní formy kyslíku jako jsou hydroxylové radikály či superoxid modifikují N-terminální konec molekuly albuminu (36). Stanovení ischemií modifikovaného albuminu je založeno na pozorování, že změněná molekula má sníženou svoji afinitu pro vazbu s kobaltem. Velmi rychle byl vyvinut test na měření vazebné kapacity albuminu pro kobalt albumin cobalt binding test (ABC test) (35,37,38). 29

30 Ke zvýšení hladiny IMA dochází v průběhu ischemie myokardu a to i v nepřítomnosti nekrózy. Tento fakt lze využít k odlišení bolestí na hrudi ischemického původu od bolestí jiné etiologie, ale nelze tímto testem odlišit ischemii od nekrózy myokardu. Další nevýhodou tohoto kardiomarkeru je i skutečnost, že ke zvyšování jeho hladiny dochází i při jiných patologických stavech. K nespecifickému vzestupu koncentrace IMA dochází také při jaterních chorobách, selhání ledvin, vytrvalostním běhu, ischemii centrálního nervového systému a gastrointestinálního traktu, ne však při ischemii kosterního svalstva (8,33). Důležité je rovněž správné načasování odběru krve. IMA má proti jiným markerům srdečního poškození velmi rychlou kinetiku vzestupu koncentrace. K růstu plazmatické hladiny dochází již po několika minutách ischemie a k normě se zvýšené hodnoty vracejí během 6 až 12 hodin (8). Pro klinickou praxi jsou důležité studie prokazující vztah zvýšení IMA u pacientů s ischemií myokardu. Bylo prokázáno, že ke zvýšení IMA dochází také po perkutánních koronárních intervencích (36). IMA vykazuje v souboru pacientů s bolestmi na hrudi dobrou diagnostickou senzitivitu, specificitu a vysokou negativní prediktivní hodnotu (37). Diagnostická senzitivita IMA je při přijetí nemocných v časné fázi AKS vyšší než pro ctn. Vyšetření je používáno k časnému vyloučení ischemie u nemocných s bolestí na hrudi a nízkou prevalencí akutního koronárního syndromu (8). Právě zde by tento marker mohl posloužit jako pomocný ukazatel k rozhodnutí, zda nemocného propustit domů, nebo ho hospitalizovat a dále podrobně vyšetřovat Volné mastné kyseliny (FFA) Volné mastné kyseliny, známé také jako neesterifikované mastné kyseliny, slouží jako fyziologicky důležitý energetický substrát po jejich uvolnění z adipocytů lipolýzou triglyceridů. Volné mastné kyseliny cirkulují v plazmě v koncentraci 0,1-1,0 mmol/l a jsou převážně vázané na albumin. Vysoké hladiny FFA jsou spojené s inzulinovou rezistencí, poškozením jater, arteriální hypertenzí, aterosklerózou a dysfunkcí myokardu. Některé klinické studie ukazují, že u pacientů se srdečním selháním a akutním koronárním syndromem roste hladina 30

31 volných mastných kyselin. Mechanismus zvýšení FFA po ischemii není zatím plně objasněn, předpokládá se, že se na něm podílí zvýšení katecholaminů v krvi, ischemií aktivovaná lipolýza tukové tkáně, hydrolýza lipidů v myokardu, změny metabolismu a energetického substrátu v myokardu (7). Měření volných mastných kyselin je výrazně limitováno intra-individuálním rozsahem, který je ovlivněn stravovacími návyky a stresovými situacemi. FFA jsou obvykle měřeny enzymatickou metodou, ve které jsou nejprve aktivovány acyl-coa (CoA)-syntetázou na acyl-coa. Ten je pak oxidován na enoyl-coa. V této reakci vzniká peroxid vodíku, který dál reaguje se substrátem za katalýzy peroxidázou, barevný produkt reakce je měřen fotometricky (39) Karboanhydráza III (CA III) Karboanhydrázy (CA) jsou zinečnaté enzymy, které katalyzují reverzibilní hydrataci oxidu uhličitého za vzniku hydrogenuhličitanu a vodíkového kationtu (CO 2 + H 2 O HCO H + ). U savců se vyskytuje 16 izoenzymů CA s rozdílnou subcelulární lokalizací a tkáňovou distribucí. Existují formy cytosolové, mitochondriální, vázané na membrány a sekreční. Tři formy CA jsou také známé jako tzv. CA related proteins (proteiny spojené s CA, CARP) (40). Karboanhydráza III (CAIII) není ve své podstatě kardiálním markerem. Je to hlavní cytoplazmatický protein (28 kda) kosterního svalstva, který zprostředkovává facilitovanou difúzi CO 2 do krevních kapilár. Vysoké koncentrace tohoto izoenzymu byly objeveny v adipocytech. V kardiologické diagnostice by mohla být CA III markerem používaným k odlišení poškození myokardu od kosterního svalstva, protože se v myokardu nevyskytuje. Kombinované určení sérové hladiny CA III a myoglobinu zvyšuje diagnostickou specificitu a senzitivitu stanovení myoglobinu jako časného markeru pro AIM. Při poškození myokardu by hladina CAIII měla zůstat v normě, zatímco sérová koncentrace myoglobinu by měla být zvýšená. Při poškození kosterní svaloviny je poměr MYO/CAIII přibližně 3:1. Oba analyty najednou se uvolňují při tělesné námaze a u pacientů s neuromuskulárním onemocněním (41,42). 31