Masarykova univerzita v Brně. Lékařská fakulta

Transkript

1 Masarykova univerzita v Brně Lékařská fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE 2009 Margita BARTKOVÁ

2 Masarykova univerzita v Brně Lékařská fakulta VYUŽITÍ METOD MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE PRO DETEKCI TOXOPLAZMA GONDII Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí diplomové práce: Ing. Dalibor Novotný, Ph.D. Autor: Margita Bartková Olomouc, duben 2009

3 Jméno a příjmení autora: Margita Bartková Název bakalářské práce: Využití metod molekulární biologie pro detekci Toxoplazma gondii Pracoviště: Fakultní nemocnice Olomouc, I. P. Pavlova 6, Oddělení klinické biochemie, úsek molekulární biologie Vedoucí bakalářské práce: Ing. Dalibor Novotný, Ph.D. Rok obhajoby bakalářské práce: 2009 Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

4 Souhrn: Závaţné komplikace parazitární infekce toxoplazmózy u pacientů s hlubokým imunodeficitem, imunosuprimovaných pacientů a gravidních ţen vyţadují k průkazu Toxoplazma gondii správně zvolený diagnostický postup. Při jeho výběru by se měla zohlednit skutečnost nedostatečné tvorby protilátek u těchto jedinců. Z tohoto důvodu je prakticky nezastupitelnou součástí laboratorní diagnostiky toxoplazmózy přímý průkaz deoxyribonukleové kyseliny Toxoplazma gondii pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR), na jejíţ moţnosti uplatnění poukazuje i tato práce. Klíčová slova: Toxoplazma gondii, toxoplazmóza, infekce, diagnostika, polymerázová řetězová reakce. Summary: Serious complications of parasitic toxoplasmosis infection in the patients with strong immunodeficiency, immunosuprimed patients and pregnant women need an appropriate diagnostic procedure for the Toxoplasma gondii detection regarding an insufficient antibody synthesis in these patients. For that reason a direct DNA Toxoplasma gondii detection by polymerase chain reaction (PCR) is an unsubstitutable part of laboratory diagnosis as presented in this work. Key words: Toxoplasma gondii, toxoplasmosis, infection, diagnostics, polymerase chain reaction. 4

5 Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením Ing. Dalibora Novotného, Ph.D. a uvedla v seznamu literatury všechny pouţité literární a odborné zdroje. V Olomouci dne

6 Poděkování Ráda bych poděkovala Ing. Daliborovi Novotnému, Ph.D. za trpělivost, cenné informace, připomínky a odbornou pomoc při vypracování mé bakalářské práce. 6

7 Obsah Seznam zkratek I. TEORETICKÁ ČÁST 1. Úvod Toxoplazma gondii Systematické zařazení Morfologie Ţivotní cyklus Epidemiologie Patogeneze a klinický obraz onemocnění Imunitní odpověď hostitele Získaná toxoplasmóza Reaktivace latentní toxoplasmózy Vrozená toxoplasmóza Terapie a prevence Terapie Prevence Současná diagnostika Sérologická vyšetření Histologické vyšetření Molekulárně biologické metody Polymerázová řetězová reakce (PCR) Princip PCR Postup při provádění PCR

8 7.3.1 Izolace Amplifikace Detekce produktů PCR Kontrola kvality PCR Dekontaminace Real-time PCR II. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 8. Použitá přístrojová technika, chemikálie, roztoky Přístroje a zařízení Roztoky, chemikálie a kity Ostatní materiál Provedení PCR analýz pro průkaz DNA Toxoplazma gondii Odběr a uchovávaní biologického materiálu Příprava pozitivní kontroly Izolace DNA Vlastní provedení PCR Metoda 1: Standardní PCR pro oblast genu TGR 1E Metoda 2: Real-time PCR pro 529-bp repetitivní fragment T.gondii Kontrola kvality Interní kontrola kvality Externí kontrola kvality Výsledky a diskuze Závěr Seznam použité literatury

9 Seznam zkratek DNA PCR rt PCR dntp T.gondii TE CNS AIDS HIV BAL RNA Taq polymeráza IC NK PK UNG SZU bp TA EHK MR CT deoxyribonukleová kyselina polymerázová řetězová reakce polymerázová řetězová reakce v reálním čase, real time PCR deoxyribonukleotidtrifosfát Toxoplazma gondii toxoplazmová encefalitida centrální nervový systém Acquired Immune Defficiency Syndrome Human Immunodeficiency Virus bronchoalveoální laváţ ribonukleová kyselina Termus aquaticus polymeráza interní kontrola negativní kontrola pozitivní kontrola uracil -N- glykosiláza Státní zdravotnický ústav počet párů bází tris-acetát externí kontrola kvality magnetická rezonance počítačová tomografie 9

10 I. TEORETICKÁ ČÁST 1. Úvod Toxoplazma gondii (T. gondii) protozoální parazit, je původcem poměrně rozšířené parazitární infekce toxoplazmózy. S tímto infekčním agens přišla do styku přibliţně jedna třetina světové populace. Pro zdravé osoby představuje nákaza T. gondii celoţivotní latentní infekci, většinou s asymptomatickým průběhem. Závaţné komplikace mohou nicméně nastat při jejím přenosu z matky na plod během gravidity, reaktivaci latentní formy u imunodeficientních jedinců, nebo primoinfekci imunosuprimovaných pacientů. Běţná diagnostika toxoplazmózy u imunokompetentních osob se opírá o sérologická vyšetření. Nedostatečná imunitní reakce rizikových skupin je však důvodem, proč by se diagnostika toxoplazmózy neměla zakládat na stanovení protilátek. Metodou volby je v tomto případě, pro svou vysokou specificitu, přímá detekce DNA T. gondii pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). Cílem práce je shrnutí zkušeností získaných při zavádění PCR metody a následné zhodnocení naměřených dat pro klinickou praxi. Specifické cíle práce: 1) spoluúčast na zavedení metod na principu PCR a rt PCR (real-time PCR) pro detekci T. gondii ve vzorcích biologického materiálu, 2) zhodnocení uvedených metod z hlediska jejich vyuţití pro běţnou diagnostickou praxi, 3) přehled a zhodnocení výsledků získaných v rutinním provozu DNA laboratoře. Práce je strukturovaná do dvou částí. První část je teoretická a zabývá se základními informacemi o T. gondii z hlediska její morfologie a vývojového cyklu. Samostatné kapitoly jsou věnované parazitární infekci toxoplazmóze, které základně informují o klinických projevech toxoplazmózy, její diagnostice a léčbě. Pro práci je stěţejní kapitola předkládající informace o molekulárně biologických metodách. Tato část je z praktického hlediska podrobněji rozvedena v druhé experimentální části práce. Ta kromě postupu prováděných analýz obsahuje vyhodnocení výsledků na konkrétním souboru pacientů, a výčet předností a úskalí přímé diagnostiky T. gondii pomocí PCR. 10

11 2. Toxoplazma gondii 2.1 Systematické zařazení Parazitický prvok T. gondii byl poprvé nalezen v roce 1908 francouzskými vědci Nicollem a Manceauxem u severoafrického hlodavce Ctenodactylus gundi, od něhoţ je odvozeno druhové jméno parazita (29). Popsání ţivotního cyklu T.gondii (Hutchison, 1965), bylo určující pro jeho systematické zařazení. V současnosti je prvok T. gondii řazen do čeledi Sarcocystidea, řádu Eimeriida, třídy Coccidea, kmene Apicomplexa (12). 2.2 Morfologie T. gondii můţe existovat ve třech různých ţivotních formách: tachyzoity, bradyzoity a sporozoity. Jednotlivé ţivotní formy se liší svým výskytem v určitých fázích nákazy i infekčností při přenosu na dalšího hostitele (25). Tachyzoity vegetativní forma, rohlíčkovitého nebo oválného tvaru o velikosti μm, napadají kterýkoliv typ savčí buňky kromě bezjaderných erytrocytů ihned po primoinfekci (obr. 1). Rozmnoţují se asexuální formou reprodukce. Masivně zaplavují hostitele, čímţ aktivují tvorbu protilátek schopných brzdit další mnoţení tachyzoitů. Tato forma je zodpovědná za akutní fázi onemocnění. Po aktivaci imunitního systému je parazit zatlačován do různorodých tkání mezihostitele a transformován na další formu - bradyzoit (6, 25). Obr. 1. Toxoplazma gondii, shluky tachyzoitů Převzato z 11

12 Bradyzoity klidová, pomalu se mnoţící forma uvnitř buňky, morfologicky podobná tachyzoitům. Hostitelská buňka obsahující stovky aţ tisíce bradyzoitů se označuje jako tkáňová cysta, zpravidla má velikost μm (obr. 2). Tkáňové cysty jsou schopny přeţívat v tkáni hostitele po celý jeho ţivot. Jsou typické pro latentní stádium infekce (33). Obr. 2. Toxoplazma gondii, tkáňová cysta s bradyzoity Převzato z Oocysty- jsou výsledkem pohlavního mnoţení parazita, mají kulovitou nebo lehce oválnou formu o velikosti μm. Po vyloučení z definitivního hostitele v nezralé formě dozrávají sporulací ve vnějším prostředí, a tím se stávají infekčními. Během tohoto procesu se z oocysty uvolní dvě sporocyty obsahující čtyři sporozoity o velikosti 2 8μm (6, 29). 2.3 Životní cyklus Ţivotní cyklus T. gondii je charakterizován střídáním sexuálního a nesexuálniho vývoje parazita, přičemţ k úplnosti vývojového cyklu potřebuje parazit kromě hlavního hostitele i mezihostitele. Hlavním hostitelem T. gondii jsou výhradně kočkovité šelmy. V jejich střevních epitelových buňkách probíhá celý ţivotní cyklus parazita, zakončený sexuálním mnoţením, jehoţ výsledkem jsou oocysty. Do vnějšího prostředí se oocysty uvolňují fekáliemi infikované kočky po dobu 7-20 dnů, a v průběhu 2-3 dnů dozrávají sporulují (18). V oocystě se vytvoří dvě sporocysty, z níţ kaţdá obsahuje čtyři 12

13 sporozoity. Teprve teď se stává oocysta plně infekční pro další kočku nebo jiného ţivočicha, včetně člověka. Oocysty jsou značně rezistentní a ve volné přírodě si zachovávají infekčnost téměř rok (25). K nákaze mezihostitele dochází nejčastěji alimentární cestou, a to buď infikováním zralou oocystou (stádium sporozoitů) nebo tkáňovou cystou (stádium bradyzoitů). U mezihostitele probíhá nesexuální vývoj parazita. Sporozoity z obou typů tkáňových cyst pronikají do buněk střevního epitelu mezihostitele a mění se v rychle se mnoţící tachyzoity, typické pro akutní fázi infekci. Krevní a lymfatickou cestou se dostávají do kosterní a srdeční svaloviny, mozku, jater, lymfatických uzlin a dalších tkání či orgánů. V této fázi sehrává důleţitou roli imunitní odezva napadeného mezihostitele, která posléze zpomalí mnoţení tachyzoitů transformací na bradyzoity, tvořící tkáňovou cystu. Vzniklé tkáňové cysty obsahují stovky aţ tisíce bradyzoitů. Podmínkou pro dokončení vývojového cyklu T. gondii je pozření kteréhokoliv infekčního vývojového stádia prvoka vnímavou kočkou. V jejím zaţívacím traktu opět dochází k sexuálnímu vývoji parazita, vzniku oocysty, která odchází s fekáliemi, a k následné nákaze nového mezihostitele. Celý cyklus se tedy opakuje. (6, 16, 33). 13

14 3. Epidemiologie Infekce parazitickým prvokem T. gondii patří poměrně k rozšířeným infekcím. V latentní formě postihuje přibliţně jednu třetinu světové populace. V České republice (ČR) je toxoplazmóza patrně nejčastěji se vyskytující parazitární nákazou vůbec. Výsledky sérologických vyšetření ukazují, ţe % naší populace přišlo do styku s antigeny T. gondii (13). Nejvyšší incidence je udávána ve věku let (5). U zdravých imunokompetentních jedinců toxoplazmóza není rizikem. Ohroţující je ale pro imunodeficientní jedince: novorozence, pacienty po orgánové transplantaci, jedince infikované virem humánní imunodeficience a onkologické pacienty. U HIV pozitivních osob je výskyt toxoplazmózy v ČR vyšší neţ u ostatní populace a je poměrně častou příčinou úmrtí (21). Další rizikovou skupinou jsou gravidní ţeny, u kterých můţe dojít k trasplacentánímu přenosu infekce na plod a způsobit vrozenou formu toxoplazmózy. Odhaduje se, ţe vrozená toxoplazmóza se vyskytuje u 0,1 % všech novorozenců, coţ představuje v ČR asi 90 infikovaných dětí ročně (20). K nákaze mezihostitele dochází nejčastěji alimentární cestou - syrovým nebo nedostatečně tepelně zpracovaným masem, vzácně syrovým mlékem infikovaných zvířat, potravinami či vodou, kontaminovanýma rukama, transplacentárně při primoinfekci matky, vzácně také transfuzí nebo transplantací orgánu od infikovaného dárce (11). Šíření nákazy závisí na ţivotních zvyklostech obyvatelstva a silně kolísá vlivem sociálních, profesních a jiných faktorů. Další faktory, které udávají směr onemocnění, jsou patogenita zdroje nákazy (tkáňové cysty jsou v porovnání s oocystami méně patogenní), virulence kmene T. gondii, a vnímavost jedince, který přišel do styku s parazitem (29). 14

15 4. Patogeneze a klinický obraz onemocnění K nákaze člověka můţe dojít několika způsoby: zralou oocystou, která zkontaminovala půdu, potraviny nebo vodu nebo tkáňovou cystou vytvořenou v orgánech mezihostitele. Člověk se infikuje nejčastěji pozřením nedostatečně tepelně upraveného masa obsahujícího tkáňové cysty. Dalším způsobem je transplacentární přenos na plod z matky infikované krátce před otěhotněním nebo během gravidity. Podle způsobů a doby přenosu infekce pak rozeznáváme toxoplazmózu získanou (postnatální), a vrozenou (prenatální). V závislosti na stavu imunitního systému můţe toxoplazmová infekce postihnout kterýkoliv orgán (16, 20). 4.1 Imunitní odpověď hostitele U imunokompetentních jedinců má infekce zcela benigní průběh. V akutní fázi onemocnění reaguje organizmus hostitele aktivací nespecifické imunity. Významnou roli zde mají aktivované neutrofily, které vedou k produkci interleukinu 12 (IL 12), interferonu gama (INF γ), a tumor nekrotizujícího faktoru alfa (TNF α). Ty jsou nezbytné k iniciaci specifické imunity v podobě T lymfocytů (29). První protilátky třídy IgM, IgA a IgE se objevují od druhého týdne po infikování parazitem, protilátky třídy IgG stoupají pozvolna (20). Všechny tyto aktivované sloţky brání dalšímu mnoţení tachyzoitů. Dochází k jejich transformaci na bradyzoity, které se encystují. V podobě tkáňových cyst (jejich stěna je tvořená zbytky membrány napadené buňky) unikají pozornosti imunitního systému hostitele. Nastává rovnováha mezi hostitelem a parazitem, a infekce se dostává do latentní fáze. Závaţné poruchy imunitního systému provázené poklesem T lymfocytů a dalších sloţek imunitního systému však tuto rovnováhu poruší. Dojde k ruptuře tkáňových cyst a k opětovné přeměně bradyzoitů v rychle se mnoţící tachyzoity. Proběhne reaktivace latentní formy toxoplazmózy (29). 4.2 Získaná toxoplazmóza Většina získaných infekcí u zdravého jedince má asymptomatický průběh. Uvádí se, ţe u 95 % nakaţených je jedinou známkou proběhlé infekce sérokonverze (20). Inkubační doba je obvykle kolem 1-3 týdnů a nemoc probíhá v akutní formě s následným přechodem do celoţivotní latence (10). Formy získané toxoplazmózy se liší podle toho, který orgán je postiţen. Nejčastěji se setkáváme s uzlinovou, oční nebo mozkovou toxoplazmózou. Uzlinová forma toxoplazmózy se projevuje zduřením mízních uzlin podčelistních, podpaţních nebo uzlin ve slabinách. Souběţně se mohou objevit nespecifické příznaky jako je únava, bolest kloubů, teplota, nebo jiné příznaky podobné chřipkovým onemocněním. Tyto příznaky během několika týdnů spontánně vymizí a infekce ustupuje do latentní formy (13). Oční forma se vyznačuje zánětlivým 15

16 postiţením očního aparátu, nejčastěji zánětem sítnice, většinou se ale jedná o vrozenou formu toxoplazmózy, která nebyla zavčas rozpoznána (9). Mozková forma toxoplazmózy se projevuje zejména u imunodeficitních osob. Výrazné symptomy jako generalizovaná lymfadenopatie, makulopapilózní exantém, hepatitida, encefalitida, myozitida, případně myokarditida se u imunokompetentních jedinců projeví výjimečně (4, 21, 24). 4.3 Reaktivace latentní toxoplazmózy Hlavní příčinou reaktivace latentní toxoplazmózy je oslabení obranyschopnosti napadeného organizmu. Můţe se tak dít v důsledku imunosupresivní či cytostatické terapie nebo v důsledku syndromu získaného imunodeficitu (u pacientů s AIDS). Reaktivace latentní infekce má za následek postihnutí řady orgánů, nejčastěji CNS, coţ vede k toxoplazmové encefalitidě (TE) s loţiskovým postiţením mozku. K potvrzení loţiskových lézí se pouţívají zobrazovací techniky: CT počítačová tomografie, nebo MR magnetická rezonance. TE postihuje přibliţně % všech pacientů s AIDS, častý výskyt je také u jedinců po alogenní transplantaci (21). Včasná diagnostika a léčba je vzhledem k vysoké mortalitě pacientů s TE velmi důleţitá. Kromě mozkové toxoplazmózy můţe dojít vzácně k postiţení vnitřních orgánů (myokarditída, pneumonie, hepatitida), dále k postiţení oka nebo kůţe (20). 4.4 Vrozená toxoplazmóza Toxoplazmová infekce postihující ţenu během gravidity nebo krátce před ní můţe vést k trasplacentárnímu přechodu infekce na plod. Primoinfekce proběhne u matky zpravidla asymptomaticky, nebo s obrazem lehkého chřipkového onemocnění. K přenosu na plod dochází asi ve 40 % (13). Rozsah poškození závisí na řadě faktorů, jako je virulence kmene parazita, velikost infekčního inokula nebo intenzita imunitní odezvy infikované ţeny. Četnost onemocnění souvisí s trimestrem, ve kterém ţena onemocněla akutní toxoplazmózou. Poměr mezi frekvencí přenosu infekce a závaţností poškození je obrácený (5). U ţen, které byly infikovány v prvním trimestru a nebyly léčeny, je riziko prenatální infekce 15 %, přičemţ poškození plodu je nejzávaţnější (13). Mnoţící se parazit způsobuje u plodu zánětlivou reakci s tkáňovými nekrózami, které se mohou později aţ kalcifikovat. Časté jsou samovolné aborty, nebo se děti rodí mrtvé či s těţkým postiţením (tzv. Sabinova triáda). Tato triáda zahrnuje chorioretinitidu, hydrocefalus a mozkovou kalcifikaci (9). V dalších dvou trimestrech těhotenství riziko přenosu infekce roste, přičemţ rozsah postiţení se výrazně sniţuje. Ve druhém trimestru je výskyt kongenitální infekce 54 % (23). Ve třetím trimestru je četnost infekce plodu 65 %, ale průběh onemocnění je téměř asymptomatický (13). Následky se mohou projevit aţ v dětském nebo dorosteneckém 16

17 věku, kdy se klinicky manifestují jako oční forma toxoplazmózy, hluchota, strabizmus, epilepsie, nebo jiné neurologické poruchy včetně psychomotorické retardace (23). Tab. 1. Přehled klinických forem toxoplazmózy (13) 17

18 5. Terapie a prevence 5.1 Terapie Asymptomatická a uzlinová forma toxoplazmózy u imunokompetentních jedinců nevyţaduje specifickou léčbu, infekce sama přechází do latentní formy. Léčba se zahajuje u těhotných ţen, a dětí s kongenitální infekcí, imunodeficientních jedinců, při oční formě toxoplazmózy, a u jedinců se závaţnými klinickými projevy (20). Základními preparáty jsou pyrimethamin (např. Daraprim), sulfadiazin a spiramycin. Sulfadiazin zatím není v ČR registrován a nahrazuje se cotrimozaxolem (10). Preparáty pyrimethamin a sulfadiazin mají hematotoxické účinky, oba jsou blokátory kyseliny listové a během terapie je proto nutné sledovat pacientův krevní obraz, popřípadě léčbu doplnit o leukovorin (20). U HIV pozitivních pacientů je definitivní potvrzení toxoplazmové infekce obtíţné, léčba se zahajuje terapeutickým pokusem v souvislosti s neurologickými symptomy, s hodnotou CD4+ T lymfocytů < 100/ μl a kompatibilním rentgenovým nálezem. Pro akutní terapii těchto pacientů je doporučován pyrimethamin v kombinaci se sulfadiazinem. Obdobná léčba je indikována i u hematoonkologických pacientů (21). U primoinfekce během gravidity se k zabránění přenosu nákazy na plod indikuje spiramicyn. Pokud je prokázán přenos primoinfekce na plod, je ţenám po 18. týdnu těhotenství indikována kombinace pyrimethaminu, sulfadiazinu a lekovorinu (10). V léčbě oční toxoplazmózy se u lehčích forem provádí monoterapie klindamycinem (13). Profylaktickou léčbou imunodeficientních pacientů se zabrání reaktivaci chronické formy toxoplazmózy (21). Terapie obecně působí na tachyzoity a nezajišťuje vymýcení infekce. Její účinek spočívá v urychlení přechodu infekce do latentní fáze a v redukci poškození pacienta (20). 5.2 Prevence Základem prevence je zabránit kontaktu člověka s oocystami nebo tkáňovými cystami. V tomto ohledu je důleţitá informovanost veřejnosti o podstatě nákazy a způsobech přenosu. Zdůrazňuje se důsledné dodrţování hygienických opatření při práci s půdou, dostatečná tepelná úprava masa a mléka, ochrana potravin a vody před kontaminací oocystami, při domácím chovu koček kaţdodenní likvidace a dezinfekce jejích výkalů. Důleţité je vyloučit z krmiva pro kočky syrové maso a zamezit jejímu přístupu na dětská hřiště (11). V rámci prevence kongenitální nákazy je důleţitý včasný sérologický screening těhotných ţen. Je-li na začátku těhotenství prokázán nízký titr protilátek třídy IgG s vysokou aviditou, svědčí to o latentní infekci, a těhotnou ţenu není nutné dále sledovat. V případě ţe protilátky nejsou prokázány, měla by ţena 18

19 během gravidity dodrţovat zvýšená hygienická opatření a podstoupit další sérologická vyšetření. V ČR není screening na toxoplazmózu povinný (20). Účinná očkovací látka vhodná k imunizaci lidí je zatím ve fázi výzkumu. Onemocnění toxoplazmovou infekcí podléhá v ČR povinnému hlášení (25). 19

20 6. Současná diagnostika Laboratorní diagnostika toxoplazmózy sestává z řady různých metod a jejich vhodnou kombinací lze potvrdit nebo vyvrátit toxoplazmovou infekci. Současná diagnostika se opírá převáţně o sérologické vyšetření, ve specifických případech je nutné ji doplnit přímým průkazem DNA T. gondii pomocí PCR., histologickým vyšetřením nebo izolací T. gondii na vnímavém laboratorním zvířeti (3). 6.1 Sérologická vyšetření K základním sérologickým testům patří komplement fixační reakce (KFR), případně nepřímá imunofluorescence (NIFR). Pro přesnější určení fáze infekce se provádí stanovení specifických protilátek třídy IgM, IgA, IgE, IgG metodou Enzyme Linked ImmumoSorbent Assay (ELISA) a stanovení avidity IgG protilátek. Při akutní toxoplazmóze hladiny protilátek IgM, IgA a IgE prudce stoupají, zatímco hladiny IgG jsou nízké nebo nulové. Délka tvorby protilátek IgM je variabilní, zpravidla ale vymizí do 9 měsíců po infekci. Protilátky IgA vymizí jako první a jejich stanovení je důleţité pro včasný záchyt akutní toxoplazmové infekce. Po odeznění akutní fáze jsou titry celkových protilátek stabilní, postupně dojde k poklesu IgA a IgM, zatímco protilátky IgG mají hladinu vysokou. Pro latentní formu toxoplazmózy je charakteristická vysoká avidita IgG a nízké titry IgG, které přetrvávají často po celý ţivot (15). Sérologické metody jsou základem pro diagnostiku toxoplazmózy u imunokompetentních jedinců. U různých forem toxoplazmózy a určitých rizikových skupin pacientů je interpretace sérologických vyšetření poměrně obtíţná a vyšetření se řídí standardní doporučenou metodikou (15). U imunodeficientních pacientů mají tyto testy omezenou senzitivitu, příkladem jsou pacienti s reaktivovanou oční formou nebo imunodeficientní pacienti s diseminovanou infekcí, u nichţ imunoglobuliny třídy IgM, IgA, a IgE typické pro akutní infekci a vrozenou toxoplazmózu nejsou zvýšené (2). 6.2 Histologické vyšetření Histologické vyšetření patří k metodám přímého průkazu T. gondii. Z bioptického materiálu (lymfatická uzlina, placenta, likvor, biopsie tkání, bronchoalveoální laváţ - BAL) se zhotovují preparáty pomocí klasického barvení hematoxylin-eosinem. Další metodou je imunoperoxidázová technika s pouţitím antisér proti T. gondii. Vzhledem k obtíţnému získávání materiálu má histologické vyšetření vyuţití spíše v diagnostice postmortální (19). 20

21 7. Molekulárně biologické metody V současnosti se diagnostika T. gondii rozšířila o molekulárně bilogické metody, které umoţňují prokázání DNA T. gondii zejména u imunokompromitovaných jedinců (pacienti s AIDS, onkologičtí pacienti po imunosupresivní či cytostatické terapii, transplantovaní pacienti), gravidních ţen, novorozenců, jejíţ matky prodělaly infekci v těhotenství, a u pacientů s významnými klinickými příznaky (3). Přímý průkaz infekčních agens pomocí molekulárních biologických metod je zaloţen na výběru specifického úseku nukleové kyseliny mikroorganismu s takovým pořadím bází (adenin, guanin, thymin, cytosin), které je pro hledaného původce typické. Přítomnost specifického úseku nukleové kyseliny v biologickém materiálu lze povaţovat za průkaz příslušného mikroorganismu (1). Průkaz DNA T. gondii lze provést z poměrně širokého spektra bilogického materiálu, jako je plná krev, likvor, plodová voda, (BAL), kostní dřeň a další. 7.1 Polymerázová řetězová reakce (PCR) V přímé diagnostice mikrobiologických patogenů je jednou z nejčastěji pouţívaných metod tzv. polymerázová řetězová reakce (PCR). Reakce byla popsána roku 1983 Kary Mullisem jako in vitro metoda pro enzymatickou syntézu definované sekvence DNA. Je povaţována za standardní metodu detekce některých nekultivovatelných nebo obtíţně kultivovatelných patogenů. Vyuţívá se její rychlosti při urgentních vyšetřeních a při sledování léčby pacienta (1). 7.2 Princip PCR Vlastním principem polymerázové řetězové reakce je in vitro namnoţení (amplifikace) specifického úseku nukleové kyseliny DNA. Praktické provedení reakce spočívá v cyklickém střídání denaturace dvouřetězcové nukleové kyseliny, připojení (annealing) specifických komplementárních oligonukleotidů (primerů) a jejich extenzi (prodlouţení) termostabilní polymerázou. Oligonukleotidové primery hybridizují s protichůdnými vlákny denaturované DNA, od jejichţ 3'- konců je zahájena syntéza komplementárních řetězců. Syntéza nové DNA je katalyzována DNA polymerázou, v reakčním prostředí jsou přítomny deoxyribonukleotidy, které představují stavební kameny pro nově syntetizovanou DNA (26). 21

22 Obr. 3. Princip polymerázové řetězové reakce 3 fáze 1. cyklu (26) 7.3 Postup při provádění PCR Izolace Prvním krokem v PCR je izolace - uvolnění nukleových kyselin z buněk pomocí různých lyzačních postupů. Nukleová kyselina mikroorganismu se můţe nacházet extracelulárně, intracelulárně nebo je integrovaná do buněčného genomu hostitele. Ve zpracovávaných vzorcích není v čisté formě, ale většinou společně s nadbytkem buněčné nukleové kyseliny hostitele, proteinů, solí, lipidů a jiných chemických sloučenin i potenciálních inhibitorů reakce (28) Amplifikace Prvním teplotním krokem je úvodní denaturace, tedy zvýšení teploty obvykle na C, kdy dojde k oddělení komplementárních řetězců dvouvláknové DNA. Důleţitá je kompletní denaturace templátu, v případě, ţe dojde pouze k částečné denaturaci, molekuly DNA velice rychle renaturují, a to vede k nespecifické vazbě primerů a moţným falešným výsledkům. Vlastní polymerázová řetězová reakce je tvořena opakovanými reakčními cykly. Kaţdý cyklus se skládá ze tří kroků, které jsou charakterizovány odlišnými teplotami. Prvním krokem je denaturace (91 95 C), 22

23 kdy dochází k rozvolnění dvouvláknové DNA a vzniku dvou jednovláknových templátových molekul DNA. Následuje annealing (50 72 C), tzn. připojení primerů na obě komplementární vlákna DNA. Posledním krokem je extenze (72 C), kdy jsou syntetizovány nové komplementární řetězce DNA pomocí DNA polymerázy a deoxyribonukleosidtrifosfátů (dntp). Taq DNA polymeráza (Thermus aquaticus DNA polymeráza) syntetizuje při této teplotě DNA rychlostí přibliţně 60 bází za sekundu. Nově syntetizované řetězce slouţí jako templáty pro další cyklus. Ten je pak zahájen zvýšením teploty - denaturací, kdy opět dojde k oddělení nasyntetizovaných řetězců DNA. Během několika málo cyklů začnou v roztoku převaţovat amplifikované molekuly o určité velikosti ohraničené z obou stran primery. Obvykle se pro amplifikaci vyuţívá 20 aţ 35 cyklů, přičemţ v kaţdém cyklu se mnoţství molekul oproti předcházejícímu zdvojnásobí. Z celé molekuly DNA, která je pro reakci pouţita, je tedy amplifikován pouze úsek mezi dodanými primery. Délka amplifikovaného úseku DNA je dána vzájemnou polohou primerů a dosahuje obvykle několika desítek aţ tisíc bází (1, 14, 26). Závěrečná extenze se provádí po posledním cyklu (obvykle 72 C) a slouţí k dokončení syntézy a k renaturaci jednořetězcových produktů. Reakční směs - Master Mix (MM) obsahuje pufr, primery, dntps, Mg 2+ (hořečnaté ionty) a Taq DNA polymerázu. Templátová nukleová kyselina (templát) se k MM přidává na závěr. Templátem můţe být DNA nebo RNA. RNA je navíc nutné před vlastní amplifikací reverzně transkribovat do jednovláknové cdna, k ní je pak druhé komplementární vlákno přidáno amplifikující DNA polymerázou. Mnoţství DNA jako výchozího materiálu je velmi nízké, teoreticky postačuje jedna molekula. Objem reakční směsi je obvykle mezi 20 a 100 µl (26). Primery jsou syntetické oligonukleotidy o velikosti nukleotidů, sekvence a koncentrace primeru významně ovlivňuje výsledek PCR (14). Deoxyribonukleosidtrifosfáty( dntp), se pouţívají ve formě Na + nebo Li + solí. Volné Mg 2+ ovlivňují aktivitu enzymu. Termostabilní Taq DNA polymeráza pochází z termofilního mikroorganismu Thermus aquaticus. Enzym odolá teplotě téměř 100 C. Její aktivitu inhibují porfyriny, heparin, methanol, detergenty a některé kovy (14, 26). Hodnota ph je dána reakčním pufrem. Obvykle odpovídá ph 8, 3-9, 0. Pufr obsahuje mm Tris-HCl, maximálně 50 mm KCl, případně další látky, které mohou v některých případech ovlivnit senzitivitu a specificitu PCR reakce (26). 23

24 7.3.3 Detekce produktů PCR DNA fragmenty vzniklé PCR reakcí jsou běţně detekovány pomocí elektroforézy v agarózovém gelu. Nukleové kyseliny migrují v agarózovém gelu vlivem působení stejnosměrného elektrického pole a rychlost této migrace je nepřímo úměrná dekadickému logaritmu počtu párů bází. Větší fragmenty se tedy pohybují pomaleji, menší rychleji (14, 26). Další způsob detekce PCR produktů je sekvenování, nebo hybridizace se značenými oligonukleotidovými sondami (34). Pro vizualizaci DNA fragmentů se z fluorescenčních látek nejčastěji pouţívá ethidium bromid, který vytváří komplex s DNA. Tento komplex absorbuje UV světlo o vlnové délce nm. Pro zvýšení citlivosti detekce DNA produktu lze pouţít SyberGreen. Tato fluorescenční látka je asi 8-10x citlivější neţ ethidium bromid (14) Kontrola kvality PCR Pro zajištění správnosti výsledků je v laboratoři prováděna pravidelná vnitřní kontrola kvality. V molekulárně biologických metodách se skládá z pozitivní, negativní a inhibiční kontroly (tzv. inhibiční zkoušky). Externí hodnocení kvality se pouţívá pro porovnání vlastních výsledků s jinými laboratořemi. 1. Pozitivní kontrola izolace a amplifikace Pozitivní kontrola umoţní kontrolovat řádný průběh izolace a amplifikační reakce, a musí být řazena ke kaţdému běhu PCR. Pro tento účel se pouţívá buněčná kultura příslušného mikroorganismu nebo pozitivní biologický materiál. 2. Negativní kontrola izolace a amplifikace Negativní kontrola musí být opět řazena ke kaţdému běhu PCR. Nejčastěji se pouţívá destilovaná voda nebo je moţné vyuţít izolaci z negativního biologického materiálu. Její význam spočívá v kontrole toho, zda nedošlo ke kontaminaci během izolace, nebo ke kontaminaci amplifikační směsi. 3. Kontrola inhibice Ve vyšetřovaném materiálu se můţe vyskytovat řada látek způsobujících inhibici polymerázové řetězové reakce. Přítomnost nejrůznějších inhibitorů DNA polymerázy můţe vést k falešně negativním výsledkům. K nejčastěji se vyskytujícím inhibitorům patří hemoglobin, bilirubin, heparin, quanidin, dextransulfát sodný, triglyceridy, glukóza. Amplifikace interní kontroly probíhá v jedné reakční zkumavce s testovanou DNA. Pokud nedojde k amplifikaci interní kontroly (IC), lze předpokládat inhibici PCR. Pouţití interní kontroly amplifikace vyloučí vydávání falešně negativních výsledků při průkazu extrahumánního genomu v klinickém materiálu (2). 24

25 Dekontaminace Moţným problémem v diagnostickém vyuţití PCR technik je riziko kontaminace a falešná pozitivita zapříčiněná vysokou citlivostí těchto metod. Běţnými zdroji kontaminace jsou poměrně velká mnoţství cílových molekul DNA nebo RNA, které jsou přítomné ve vyšetřovaných vzorcích, popř. kontaminace reagencií pro PCR. Nejčastější příčinou kontaminace je však kumulace produktů PCR reakcí v laboratoři. Dochází k tomu při opakovaných amplifikacích stejných cílových sekvencí. Amplikony mohou kontaminovat reagencie, pipety a ostatní laboratorní zařízení. Riziko lze sníţit důsledným prostorovým oddělením jednotlivých operací, pouţíváním laminárních boxů, důsledným pouţíváním pipetovacích špiček s filtry, zabraňujícím kontaminaci mechaniky pipet (14). Kontaminaci amplikonem lze zamezit i pouţitím chemických preamplifikačních dekontaminačních kroků. Jedním z nich je přidání enzymu UNG do reakční směsi. Ten ještě před amplifikací způsobí rozpad případných amplikonů, nedegraduje však templátovou nukleovou kyselinu ve vzorku (1). Dodrţování ochranných mechanismů je nedílnou součástí vnitřní kontroly kvality. I přes veškeré úsilí však nelze úplně zabránit amplifikaci neţádoucích fragmentů nukleových kyselin. 7.4 Real-time PCR PCR v reálném čase je zaloţena na kombinaci PCR amplifikace se současnou detekcí amplikonů pomocí sond značených fluorescenčním barvivem. Sondy zaznamenávají mnoţství PCR produktu během reakce zvýšením své fluorescenční aktivity. Přírůstek syntézy PCR produktu lze sledovat v reálním čase. Fluorescence je měřena během kaţdého cyklu PCR a její intenzita je přímo či nepřímo úměrná mnoţství amplifikátu přítomného v reakční směsi. Výstupem je amplifikační křivka (horní část obr. 2) zobrazující závislost signálu fluorescence na počtu cyklů. K identifikaci produktu slouţí postamplifikační analýza tzv. křivky tání a vyhodnocení píků tání (ve spodní části obr. 2). Průsečíky amplifikačních křivek se základní linií se nazývají crossing points (Cr); zjednodušeně platí, ţe čím niţší je hodnota Cr, tím větší je počet terčových kopií ve vzorku. K identifikaci produktu slouţí postamplifikační analýza tzv. křivky tání (závislost fluorescence na teplotě) a vyhodnocení píků tání (ve spodní části obr. 2). Kvantitativní rt PCR v současnosti nachází široké pouţití ve vědeckých a stále více také v klinických laboratořích. Pokud jsou dodrţeny metodické pokyny pro provádění rt PCR, je tato metoda také velmi přesná a spolehlivá (35). 25

26 Fluorescence -d(f2/f1)/dt Fluorescence (F2/F1) 1,2 (A) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0, Počet cyklů 0,4 (B) 0,2 0,0-0, Teplota ( C) Obr. 4. Ukázka amplifikačních křivek (A) a píků tání (B) při kinetické PCR (22) (A) Tři amplifikační křivky s různými hodnotami Cr (1, 2, 3). Na ose y vynesena fluorescence v měřícím kanále F2 (bezrozměrná), korigovaná na fluorescenci v kanále F1. (B) Tři píky tání s totoţným vrcholem (teplotou tání, Tm). Na ose y zobrazena záporná změna fluorescence s teplotou (bezrozměrná), na ose x teplota ( C). 26

27 II. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 8. Použitá přístrojová technika, chemikálie, roztoky 8.1 Přístroje a zařízení analytické digitální váhy BBL 53 ( Boeckel, Německo) digitální kamera C-3040 ZOOM (Olympus Optical Co.Ltd., Japonsko) elektroforetická vana Mini-Sub Cell GT (Bio-Rad Laboratories, USA) hlubokomrazící box T738 (Forma Scientific, Inc., USA) chladnička Samsung Calex (Slovensko) laminární box BH, třída II, biohazard (Labcaire System LTD, Anglie) mikrocentrifuga EBA 12 (Hettich, Německo) mikrocentrifuga Z160 M (Hermle, Německo) mikrovlnná trouba Micro 1 MW-M800 (Tescoma, ČR) ph metr PRÄCITRONOC MV 870 (Německo) suchý termostat Genius Digital Dry Bath MD 02 (Major Science, USA) termocyklér LightCycler, příslušenství, software, verze 3.5 (Roche, Švýcarsko) termocyklér PTC-200 (MJ Research, USA) UV transiluminátor TVR-312A (Spectroline Ltd., USA) vortex MS2 Minishaker (Ika, Německo) zdroj napětí ST305 (Apelex, USA) 8.2 Roztoky, chemikálie a kity etanol, 96 %, pro biotechnologie (Amresco, USA). sterilní voda, bez DNáz, RNáz, pro molekulární biologii (Sigma, USA) QIAamp DNA Blood Mini Kit, pro 250 izolací (Qiagen, Německo) - Lyzační pufr AL 27

28 - Promývací pufr AW1 - Promývací pufr AW 2 - Eluční pufr AE - QIAGEN proteáza - Kolonky se separační vrstvou - Centrifugační kolonky - QIAamp DNA Mini Kit, pro 250 izolací (Qiagen, Německo) - Lyzační pufr AL - Promývací pufr AW1 - Promývací pufr AW 2 - Eluční pufr AE - QIAGEN proteináza K - Kolonky se separační vrstvou - Centrifugační kolonky - LightCycler Fast Start DNA Master HybProbe (Roche, Švýcarsko) - LightCycler FastStart Enzyme - LightCycler FastStart Reaction Mix - MgCl 2,25 mm - Sterilní H 2 O minerální olej, pro molekulární biologii (Sigma, USA) UNG (Uracil-N glykosiláza), termolabilní (1 U/μl), (Roche, Švýcarsko) primery T1, T2 pro oblast genu TGR1E ( Generi Biotech, ČR) primery IC 291, IC 292 pro beta globinový gen (Generi Biotech, ČR) primery Tox-9, Tox-11 pro 529-bp repetitívní oblast genu (TIB Molbiol, Německo) fluorescenční sondy Tox-Hp-1, Tox-Hp-2 pro 529-bp repetittivní oblast genu (TIB Molbiol, Německo) DNA Molecular Weight Marker VIII, velikostní marker bp (Roche, Švýcarsko). PCR agaróza, (Serva, Německo) ethidium bromid (1 % vodní roztok), (Serva, Německo) 28

29 Gel Loading Solution (0,01 g bromfenolová modř; 8,0 g sacharóza; 20,0 ml 0,1 mol/l EDTA o ph 8,0; 0,1 g SDS barvící roztok, GelRed, (Labmark, ČR) 5xTA pufr: 243, 3 g Tris; 57, 1 ml ledová kyselina octová; ph 8,0; doplnit destilovanou vodou na objem 1l 1xTA pufr: 200ml 5xTA pufr, 800ml destilované vody TRIS, Tris- hydroxymetylaminometan, 7-9 (Sigma, USA) EDTA, etylendiamintetraoctová kyselina, dvojsodná sůl, pro biotechnologie (Amresco, USA) PBS purf, 10 mm Na2HPO4, 150 mm NaCl, 2 mm KCl, 2 mm KH2PO4, ph=7,4 SDS, laurylsulfát sodný (Sigma, USA) sacharóza, bez DNáz, RNáz (Sigma, USA) 8.3 Ostatní materiál odběrový systém Greiner (Rakousko), pro odběr krevních vzorků zkumavky, Eppendorf 1,5 ml, pro molekulární biologii (Greiner, Rakousko) zkumavky, Eppendorf 0,5 ml, sterilní, tenkostěnné, pro PCR (Dispolab, ČR) sterilní pipetovací špičky s filtrem, 10, 20, 200 a 1000 µl (Greiner, Rakousko) LC PCR Cappilaries (Roche, Švýcarsko)- skleněné kapiláry pro Light Cycler 29

30 9. Provedení PCR analýz pro průkaz DNA T. gondii 9.1 Odběr a uchovávaní biologického materiálu K vyšetření PCR na průkaz DNA T. gondii byly pacientům odebírány vzorky: - nesráţlivé krve (odběrový systém Greiner, s přídavkem K 3 EDTA) - plodové vody (sterilní zkumavka, odběrový systém Greiner) - likvoru (sterilní zkumavka, odběrový systém Greiner) - BAL (sterilní zkumavka) Odebraný biologický materiál byl při teplotě 2-25 ºC do jedné hodiny transportován do laboratoře a následně vyšetřen nebo uskladněn při -20 ºC. 9.2 Příprava pozitivní kontroly Jako pozitivní kontrola byly pouţity tachyzoity virulentního kmene T. gondii. Virulentní kmen byl pasáţován na vnímavém laboratorním zvířeti bílé myši. Z její břišní dutiny pak byla získaná ascitická tekutina s ţivými namnoţenými tachyzoity T. gondii. Pozitivní kontrolní materiál byl získán z Národní referenční laboratoře pro toxoplazmózu v Státním zdravotnickém ústavu (SZU) Praha. 30 µl suspenze tachyzoitů bylo promyto 2970 µl PBS pufru. Promývání se provádělo 3x a po posledním promytí bylo k sedimentu přidáno 2970 µl fyziologického roztoku. Promyté tachyzoity byly skladovány při -20 ºC, nebo při -70 ºC při dlouhodobém uchovávání. Počet tachyzoizů v 1 ml testovaného vzorku byl stanoven počítáním v Bürkerově komůrce dle metodiky pro stanovení počtu leukocytů. Suspenze promytých tachyzoitů byla naředěna nesráţlivou krví na koncentraci 10² / 1 ml, 10¹ / 1 ml, 1 / 1 ml, 10ˉ¹ / 1 ml. Následně byly naředěné vzorky izolovány dle protokolu pro izolaci č. 1 QIAamp DNA Mini Kit (Německo), a protokolu č. 2 QIAamp DNA BLOOD Mini Kit (Německo), amplifikovány dle protokolu pro standardní PCR TGR 1E, a nakonec elektroforeticky detekovány. Z výsledku vyplynulo, ţe izolace provedené oběma izolačními soupravami dosahuje reakce s mezí detekce 10 tachyzoitů v 1 ml tekutého biologického materiálu (tab. 2). 30

31 Tab. 2. Přehled výsledků PCR naředěných tachyzoitů Číslo vzorku Ředění Tachyzoitů (počet/ml) Výsledky PCR Izolace č. 1 Výsledky PCR Izolace č ² ¹ ˉ¹ Izolace DNA Izolace DNA T. gondii z nesráţlivé krve byla provedena za pouţití soupravy QIAamp DNA BLOOD Mini Kit (Qiagen, Německo). Kit je určen pro izolaci a purifikaci celkových DNA (genomové, virové, mitochondriální). Vzorky plné krve byly před izolací vytemperovány na teplotu místnosti. Se vzorky pacientů byl současně izolován i kontrolní materiál. Jako negativní kontrola byla pouţita sterilní voda a jako pozitivní kontrola suspenze promytých tachyzoitů, naředěných v poměru 1 : 10 nesráţlivou krví. Na dno 1,5 ml mikrozkumavky bylo pipetováno 20µl QIAgen proteázy a 200µl vzorku. Směs byla řádně promíchána a po přidání 200µl AL pufru byl obsah zkumavky nejméně 15 s vortexován na homogenní roztok. Inkubace probíhala 10 min při 56 ºC, poté bylo přidáno 200µl 96 % etanolu a směs byla opět řádně promíchána vortexem na homogenní roztok. Celý objem (620 µl) byl nanesen na QIAamp Mini kolonku umístěnou v centrifugační zkumavce. Následovalo odstřeďování při rpm po dobu 1 min. Kolonka byla opatrně vyjmuta ze zkumavky a umístěna do nové centrifugační zkumavky. Na kolonku byl nanesen AW1 pufr o objemu 500 µl a následovala centrifugace při rpm po dobu 1 min. Kolonka byla vyjmuta a opět umístěna do nové centrifugační zkumavky. Na kolonku byl nanesen AW2 pufr o objemu 500 µl a následovala centrifugace při rpm po dobu 3 min. Kolonka byla vyjmuta a umístněna do sterilní 1,5 ml eppendorfky. Na povrch kolonky byl nanesen AE pufr o objemu 50 µl a po inkubaci trvající 2 min při teplotě místnosti proběhlo závěrečné odstřeďování při rpm po dobu 1 min. Vzorky izolátů DNA byly přímo pouţity do PCR. 31

32 K izolaci DNA TG z plodové vody a likvoru byla poţita souprava QIAamp DNA Mini Kit. Vzorky plodové vody a likvoru jsou chudé na buňky a vyţadovaly proto před vlastní izolací DNA úpravu. Ta spočívala v centrifugaci materiálu při otáčkách rpm po dobu 5 min. K izolaci byla pouţita souprava QIAamp DNA Mini Kit. Na dno 1,5 ml mikrozkumavky bylo pipetováno 20µl QIAgen proteinázy a 200µl vzorku, který se pipetoval ze dna zkumavky a obsahoval tak peletu buněk vzniklou centrifugací. Směs byla řádně promíchána a po přidání 200µl AL pufru byl obsah zkumavky nejméně 15 s vortexován na homogenní roztok. Dále se průběh izolace zcela shoduje s izolačním protokolem pro soupravu DNA BLOOD Mini Kit (viz předcházející odstavec). 32

33 10. Vlastní provedení PCR 10.1 Metoda 1: Standardní PCR pro oblast genu TGR 1E Vybraná oblast genomu T. gondii: gen TGR 1E. Funkce tohoto genu není doposud známa. Gen obsahuje mnohonásobnou repetitivní sekvenci (30-35 kopií). Jde o standardní PCR s oligonukleotidovými sekvencemi označenými jako T1 a T2 (17). Délka amplifikovaného úseku je 191 bp. Sekvence pouţitých primerů: T1 5`ATG GTC CGG CCG GTG TAT GAT ATG CGA T - 3` T2 5` TCC CTA CGT GGT GCC GCA TTG CCT - 3` Pro kontrolu inhibice polymerázy byla pouţita koamplifikace části beta globinového genu. Délka amplifikovaného úseku je 362 bp. Sekvence pouţitých primerů: IC `ACA GAA CTG TGT TCA CTA GC - 3` IC ` CAT CAG GAG TGG ACA GAT CC - 3` Na PCR byl pouţit kit LightCycler Fast Start DNA Master HybProbe (Roche, Švýcarsko). Master Mix obsahující FastStart enzym a dntps byl připraven přidáním 60 µl enzymu 1b do rekčního mixu 1a. Celkový objem reakční směsi a vyizolované DNA byl 25 µl. Sloţení reakční směsi (pro jeden vzorek) - Master Mix 2, 5 µl - MgCl 2 (25 mm) 2, 5 µl - Primer T1 (10 pmol/ µl) 1, 0 µl - Primer T2 (10 pmol/ µl) 1, 0 µl - Primer IC329-1 (10 pmol/ µl) 1, 0 µl - Primer IC329-2 (10 pmol/ µl) 1, 0 µl - UNG 0, 5µl - Sterilní H 2 O 10, 5µl - Izolát DNA 5, 0 µl - Celkový objem 25, 0 µl 33

34 Reakční směs byla převrstvena kapkou minerálního oleje a krátce stočena na mikrocentrifuze. Amplifikační reakce proběhla v termálním cykléru s teplotním profilem: Inkubace Úvodní denaturace 20 ºC / 10 min 94 ºC / 3 min Následovalo 40 cyklů: Denaturace Annealing Extenze 94 ºC / 30 sec 60 ºC / 30 sec 72 ºC / 30 sec Závěreční extenze 72 ºC / 7 min Chlazení do vypnutí cykléru 4 ºC Po ukončení PCR reakce byly její produkty detekovány elektroforetickým dělením. Jako dělící médium byla pouţita speciální 2 % agaróza SERVA rozvařená v 1 x TA pufru, ph 8,0. Na gel se nanášelo 10 µl PCR produktu a 2 µl Gel Loading Solution. Velikostní marker (DNA Molecular Weight Marker VIII) měl fragmenty od 19 bp do 1114 bp. Elektroforéza probíhala přibliţně 20 min při napětí 120 V/cm a teplotě 25 ºC. Fragmenty byly vizualizovány 10 min roztokem ethidium bromidu 10 g/l v 1 x TA pufru. Odečet byl proveden pod UV světlem při 312 nm. Amplifikační reakcí byl získán produkt o velikosti 191 bp, charakteristický pro cílovou sekvenci TGR 1E pouze u PK, produkt 362 bp charakteristický pro IC byl získán u všech vzorků, kromě NK. Výsledky prováděné PCR analýzy byly povaţovány za validní (Obr. 5). 34

35 Obr. 5. Elektroforetická detekce PCR produktů na agarózovém gelu 10.2 Metoda 2: Real-time PCR pro 529-bp repetitivní fragment T.gondii Pro rt PCT byly zvoleny primery repetitivního 529-bp fragmentu, které se vyznačují častým opakováním v genomu T. gondii ( x). K detekci byly pouţity fluorescenční hybridizační sondy značené fluoresceinem (FL) a LC Red 640, (27). Sekvence pouţitých primerů: Tox-9 5`- AGG AGA GAT ATC AGG ACT GTA G-3` Tox- 11 5`- GCG TCG TCT CGT CTA GAT CG-3` Sekvence pouţitých fluorescenčních sond: Tox-HP-1 Tox-HP-2 5`- GAG TCG GAG AGG GAG AAG ATG TT-[FL]-3` 5`- [Red 640]-CCG GCT TGG CTG CTT TTC CTG-Ph-3` 35

36 Izolace biologického a kontrolního materiálu pro analýzu rt PCR byla prováděna dle popisu (9.3 Izolace DNA). Amplifikace a následná detekce produktu probíhala v integrovaném uzavřeném systému LightCycler (Roche, Švýcarsko). V tomto systému jsou oba kroky spojeny do jednoho a jsou monitorovány a detekovány v reálném čase za pomoci fluorescenčních technik. Výstupem proběhlé analýzy byla amplifikační křivka zobrazující závislost signálu fluorescence na počtu cyklů. Identifikace produktu se prováděla odečtem fluorescence ve vybraném fluorescenčním kanálu F2 při 640 nm. Při vyhodnocení je důleţitý cyklus, ve kterém byl zaznamenán přírůstek fluorescence. Vyhodnocení výsledků je součástí softwaru LightCycleru. Sloţení reakční směsi (pro jeden vzorek) - Master Mix 2, 0 µl - MgCl 2 (25 mm) 2, 4 µl - Primer Tox-9 (0, 5μmol/ µl) 1, 0 µl - Primer Tox-11 (0, 5 μmol/ µl) 1, 0 µl - Proba Tox-HP-1(0, 25 μmol/ µl) 0, 5 µl - Proba Tox-HP-2 (0, 25μmol/ µl) 0, 5 µl - UNG 0, 5 µl - Sterilní H 2 O 7, 1 µl - Izolát DNA 5, 0 µl - Celkový objem 20, 0 µl Reakční směs byla napipetována do skleněných kapilár a krátce stočena na mikrocentrifuze. Amplifikační reakce proběhla v LightCycleru s teplotním profilem: Inkubace Úvodní denaturace 20 ºC / 1 min 95 ºC / 10 min Následovalo 50 cyklů: Denaturace Annealing Extenze 95 ºC / 10 s 56 ºC / 20 s 72 ºC / 20 s Chlazení 4 ºC / 30 s Rychlost teplotního přechodu byla 20 ºC / s 36

37 Vyhodnocení rt PCR analýzy: Změřená data, která byla vyhodnocena softwarem LighCycleru, uváděla vzestup fluorescence u všech vyšetřovaných vzorků včetně jedné NK z dubletu, coţ svědčilo o falešné pozitivitě. Po důkladné dekontaminaci pomůcek pouţitých k provedení PCR analýzy a výměně komponent vzatých k přípravě reakčního mixu byla analýza provedena opakovaně. Naměřené výsledky však opět vypovídaly o falešné pozitivitě u všech vyšetřovaných vzorků. NK, byla analyzována v dubletu, u jednoho z dubletu NK, byl zaznamenán přírůstek fluorescence v 35 cyklu amplifikace, druhý vzorek NK vyšel negativní. Naředěné tachyzoity 10³ / 1 ml, byli detekované v 17 cyklu amplifikace, tachyzoity 10² / 1 ml ve 20 cyklu amplifikace, a 10¹ / 1 ml v 23 cyklu amplifikace. Všechny vzorky pacientů vyšetřované v dubletu, vykazovali pozitivitu v 33 cyklu amplifikace (Obr. 6). Obr. 6. Záznam amplifikační křivky rt PCR pro 529bp repetitivní fragment 37

38 10.3 Kontrola kvality Interní kontrola kvality S kaţdou sérii vyšetřovaných vzorků byl souběţně vyšetřován vzorek označený jako pozitivní kontrola (PK), který obsahoval naředěné tachyzoity kmene T. gondii v přibliţné koncentraci tachyzoitů/ml. Tato pozitivní kontrola slouţila jako kontrola izolace a amplifikace. Při verifikaci metody bylo opakovaně dosaţeno meze detekce 10 tachyzoitů na mililitr biologického materálu. Další kontrolou byla negativní kontrola (NK), ve které byla templátová DNA nahrazena sterilní vodou, a byla rovněţ zpracována s kaţdou sérii vyšetřovaných vzorků. Pomoci NK byla kontrolována falešná pozitivita výsledků. Kontrola inhibice byla prováděná koamplifikací části lidského genu pro beta globin probíhající současně s amplifikací oblasti TGR 1E genu Externí kontrola kvality Od roku 2007 jsou metodou standardní PCR jednou ročně zpracovávány externí kontroly kvality (EHK), které jsou součástí mezilaboratorního porovnání. EHK byli na vyţádání zaslané německou společností INSTAND e. Jednalo se vţdy o tři neznámé vzorky, ve kterých byla prokázána nebo neprokázána DNA T. gondii. Naší laboratoří byla DNA T. gondii ve vzorkách EHK stanovena vţdy správně (obr. 7), (obr. 8). Obr. 7. Výsledkový protokol EHK Toxoplazma gondii z roku

39 Obr. 8. Certifikát EHK pro Toxoplazma gondii s roční platností 39

40 11. Výsledky a diskuze Toxoplazmóza je známá jiţ více neţ 80 let. I přesto je její diagnostika v řadě případů stále značně obtíţná. Vzhledem k závaţným klinickým projevům u imunodeficientních jedinců a nepříznivému dopadu na plod v případě akutní infekce během gravidity, je důleţitá přímá laboratorní diagnostika T. gondii molekulárně biologickými metodami. Proto jsme se na našem oddělení snaţili o zavedení PCR metody pro rychlou detekci DNA T. gondii. Pro provedení PCR diagnostiky je naprosto zásadní vhodný výběr oblasti genu pro amplifikaci. V současné době je známo několik oblastí genu T. gondii, které se vyuţívají k PCR diagnostice. Na základě literární rešerše (27) jsme vybrali primery pro oblast genu TGR 1E, a pro 529 bp repetivní fragment T. gondii (17). Metoda standardní PCR pro oblast genu TGR 1E byla zaváděna dle optimalizovaného postupu (17). Izolace DNA z plné krve byla provedena soupravou QIAamp DNA BLOOD Mini Kit. Izolace DNA z likvoru, plodové vody a BAL byla provedena soupravou QIAamp DNA Mini Kit. Současně se vzorky pacientů byla izolována suspenze naředěných tachyzoizů jako pozitivní kontrola, a sterilní voda jako negativní kontrola. Do PCR reakční směsi byla přidána UNG, která před amplifikací způsobí rozpad eventuálně přítomných amplikonů a zabrání tak falešně pozitivním výsledkům. UNG působí během úvodní inkubace při teplotě 20 ºC, v úvodním denaturačním kroku je potom vysokou teplotou inaktivována (1). Pro kontrolu inhibice PCR byly dále do reakční směsi přidány primery pro část humánního beta globinového genu. Ten je povaţován za vnitřní kontrolu pokud nedojde k jeho amplifikaci, lze předpokládat inhibici PCR. Pro vizualizaci DNA fragmentů byla pouţita fluorescenční látka ethidium bromid, která však pro své mutagenní účinky byla v průběhu zavádění metody nahrazena barvícím roztokem GelRed. Všechny vzorky vyšetřované PCR analýzou byly zpracovávány v dubletu. Výsledek byl povaţován za validní jenom v případě detekce IC u kaţdého vzorku. Při verifikaci metody bylo opakovaně dosaţeno meze detekce 10 tachyzoitů v 1 ml tekutého biologického materiálu. Mez detekce, sloţení reakční směsi i teplotní profil reakce byl vzhledem k povaze vyšetření dostačující. Metoda standardní PCR pro oblast genu TGR 1E byla zavedena do praxe pro rutinní kvalitativní diagnostiku T. gondii. Primery pro oblast 529-bp repetitivního fragmentu T. gondii byly vybrány pro vyšší diagnostickou citlivost a přesnost především u biologického materiálu s nízkou koncentrací DNA T. gondii (7). K amplifikaci a detekci byla zvolena rt PCR, která díky citlivým hybridizačním sondám umoţňovala detekci pod 10 tachyzoitů na 1 ml klinického vzorku, čímţ se oproti standardní PCR posunula mez detekce o jeden řád. Provedení rt PCR však poskytovalo falešně pozitivní výsledky u všech vzorků, včetně NK. Pro odstranění příčiny falešné pozitivity, bylo uděláno několik opatření, včetně 40