CVIČENÍ Z MIKROBIOLOGIE LS 2011/2012, předmět BOT/OBMSB

Transkript

1 CVIČENÍ Z MIKROBIOLOGIE LS 2011/2012, předmět BOT/OBMSB Vyučující: Zuzana Trojanová ( ) Michaela Sedlářová ( ) Barbora Mieslerová ( ) + Anna Zedková (laborantka) Podmínky k udělení zápočtu: Protokoly Zápočtový test termíny dle domluvy s vyučujícími

2 Mikrobiologické předměty a vybavení mikrobiologické laboratoře Katedry botaniky PřF UP v Olomouci jsou inovovány v rámci projektu OPVK Zvyšování konkurenceschopnosti studentů oboru botanika a učitelství biologie CZ.1.07/2.2.00/

3 Sobota Mikrobiologický rozbor pitné vody přeočkování Srovnání účinnosti dezinfekčních prostředků Hodnocení Hodnocení neděle Přeočkování neděle Neděle Mikroorganismy v půdě Stanovení citlivosti mikroorganismů na antibiotika Neděle Průkaz bakterií na povrchu kůže člověka - vyhodnocení Kultivace mikroorganismů ve visící kapce Izolace mikroorganismů křížový roztěr odpoledne Neděle Barvení mikroorganismů, mikroskopické - sledování mikroorganismů Bakterie mléčného kvašení -

4 MIKROBIOLOGICKÝ ROZBOR PITNÉ VODY filtrace 100 ml vody přes membránový filtr přenos 1 ml vody na agarovou plotnu ENTEROKOKY KOLIFORMNÍ B. a E. COLI Slanetz-Bartley agar 37 C (44-48 hod) TTC agar s tergitolem C (24-48 hod) PSYCHROFILNÍ B. MasoPeptonový Agar 22 C (do 72 h) MEZOFILNÍ B. MasoPeptonový Agar C (24-48 h) přeočkování červenohnědých kolonií žluč-aeskulin-azidový agar (BEA), 44 C 48 h přeočkování žlutých kolonií Tryptofan- Sojový Agar 36 C, až 24 h oxidázový test průkaz E. coli indol

5 3. ÚKOL - MIKROBIOLOGICKÝ ROZBOR PITNÉ VODY Cíl úkolu: Prokázat přítomnost bakterií obecného a fekálního znečištění pitné vody Pomůcky: TSA a TSB médium Provedení: 1. Vyhodnocení koliformních bakterií na TTC agaru s tergitolem 7 (počet žlutých KTJ na 1 ml). Narostlé kolonie přeočkujeme: A. na neselektivní TSA (36 C, až 24 hodin) - oxidázový test B. do neselektivního TSB (36 C, až 24 hodin) - test na E. coli 2. Vyhodnocení mezofilních a psychrofilních bakterií (tvar a počet KTJ v 1 ml vody)

6 4. TTC půda s tergitolem 7 - kultivace při teplotě 36+2 C 24 hod - stanovení KOLIFORMNÍCH BAKTERIÍ a ESCHERICHIA COLI Hodnotíme počet žlutých (okrových) kolonií (KTJ/ml) a jejich tvar

7 Po kultivaci membránového filtru se jako laktóza pozitivní bakterie počítají všechny charakteristické kolonie (bez ohledu na velikost), které vykazují tvorbu žlutého zbarvení média pod membránovým filtrem. Koliformní bakterie na TTC agaru s Tergitolem

8 Pokud vyrostly nějaké kolonie, jsou přeneseny křížovým roztěrem na neselektivní Tryptofan-Sojový agar (TSA), kultivace při 36 C 24-48h

9 Bacillus Charakteristika rodu Vegetativní buňky rodu Bacillus jsou aerobní, peritrichní tyčinky, rovné s oblým nebo hranatým zakončením a poměrně velkých rozměrů: (0,5 x 1,2μm) až (2,5 x 10μm). Tvorba katalasy. Je to rod grampozitivní Buňky se mohou vyskytovat samostatně nebo tvoří řetízky o počtu jednotek až stovek Významný taxonomický znak celé čeledi Bacilliaceae - tvorba jedné endospory, která se vyznačuje velkou odolností k vysokým teplotám, jedům, zářením a jiným nepříznivým podmínkám. Pro tvorbu endospor u rodu Bacillus je absolutně nezbytná přítomnost kyslíku. Spory jsou obvykle cylindrické, elipsoidní nebo sférické, ale je možné se u některých kmenů určitých druhů setkat i s tvarem ledvinovitým. Umístění spory v mateřské buňce (sporangiu) a zda mají spory vegetativní buňky větší šířku než vegetativní buňka (tj. zda je sporangium zduřelé) či ne je typické pro každý druh.

10 Rod Bacillus je rozsáhlý a v přírodě velmi rozšířený. Zástupci mohou rozkládat nejrůznější organické sloučeniny, mají bohatou enzymatickou výbavu - aktivní amylolytické enzymy, které štěpí škrob - pektolytické enzymy, které štěpí rostlinné pektiny - velmi aktivní proteolytické enzymy, takže se uplatňuje při aerobním a anaerobním rozkladu bílkovin. Kingdom: Phylum: Class: Order: Family: Genus: Bacteria Firmicutes Bacilli Bacillales Bacillaceae Bacillus

11 Řada druhů produkuje antibiotika polypeptidové povahy, z nichž některá se pomocí těchto bakterií vyrábějí průmyslově (např. bacitracin). Určité druhy slouží pro průmyslovou přípravu enzymů. Bakteriální amylasy získané z Bacillus subtilis se uplatňují v pivovarství a v textilním průmyslu proteinasy se používají především do pracích prostředků. Bacillus cereus - Gramovo barvení

12 Významné druhy rodu Bacillus Bacillus anthracis Je známá především jako původce onemocnění anthrax, v přírodě je to však půdní bakterie, která tvoří spory. Primárně je tato bakterie patogenem býložravých savců, nákazy u člověka jsou zaznamenávány především v rozvojových zemích, ve vyspělých zemích pak hrozí použití této bakterie v bioterorismu. Anthrax na obarvené mikrofotografii v slezinové tkáni

13 Bacillus cereus β- haemolytická bakterie, která může způsobovat onemocnění z potravin. Onemocnění vzniká po požití kontaminovaných potravin enterotoxinogenním kmenem a z kontaminovaných kosmetických přípravků, či očních kapek. Průjmová forma (8-24 hpi) se spojuje s konzumací masových pokrmů a omáček a je podobná otravě, kterou vyvolal Clostridium perfringens. Emetická fáze začíná 1 6 hodin po požití kontaminované potravy a je dávána do souvislosti s požitím rýžových pokrmů a těstovin. Podobnost s otravou, kterou způsobil Staphylococcus aureus. Převážně se vyskytuje vpůdě, ve vodě a na rostlinách. Kolonie Bacillus cereus na krevním agaru

14 Bacillus thuringiensis obsahuje tzv. cry toxiny, které mají insekticidní účinky na některé skupiny hmyzu a proto se užívá k produkci pesticidů a také geneticky modifikovaných (transgenních) rostlin. Bacillus thuringiensis

15 Bacillus subtilis běžně nacházený v půdě. Není považován za humánního patogena; může kontaminovat potravu, ale zřídka způsobuje jedovatost potravin. B. subtilis produkuje proteolytický enzym subtilisin. Spory mohou přežívat teplo, které se používá při úpravě potravin, je zodpovědný za vznik provázkovitosti v chlebovém těstě pevná, provázkovitá konzistence která je dána produkcí dlouhořetězových polysacharidů. Kolonie Bacillus subtilis na médiu

16 B. subtilis, syn. B. atrophaeus cíleně používaný ke zkoušení desinfekčních přípravků. Bacillus subtilis barvený na endospory

17 7. ÚKOL - Srovnání účinnosti dezinfekčních prostředků CÍL: Určit nejúčinější dezinfekční prostředek POMŮCKY: roztok desinfekčního prostředku, suspenze sporulujících mikroorganismů Bacillus subtilis, Pasteurova pipeta, zkumavky, tekuté médium /Masopeptonová půda/, termostat, skleněné pipety 10 ml, násadec na pipety Desinfekční prostředky: 10% Ajatin, 10% SAVO, 10% Incidur, 10% Chloramin PROVEDENÍ: Zkumavky popíšeme pořadovými čísly 1-5, poslední zkumavka je označena K jako kontrola. Ředění provedeme podle schématu A1 1% (9ml média a 1 ml 10% roztoku desinfekce) A2 0,1% (9 ml média a 1 ml protřepaného roztoku A1) A3 0,01% (9 ml média a 1 ml protřepaného roztoku A2) A4 0,001% (9 ml média a 1 ml protřepaného roztoku A3) A5 0,0001% (9 ml média a 1 ml protřepaného roztoku A4) K kontrola (10 ml média) Každou zkumavku naočkujeme 5 kapkami sporové suspenze Bacillus subtilis a zkumavky umístíme do termostatu při 37 C po dobu 24 hod.

18

19 Mikroorganismy v půdě, celulolytické bakterie

20 MIKROORGANISMY V PŮDĚ Půda je jedním z přirozených stanovišť mikroorganismů. Bakterie se vyskytují v půdě ve velkém množství i počtu jedinců. Mikroorganismy jsou rozhodujícím faktorem při vzniku půdy, ovlivňuji půdní strukturu, účastní se rozkladu organické hmoty. Produkuji řadu látek prospěšných pro rostliny (vitamíny, růstové látky), některé fixují vzdušný dusík. Jsou důležitými články v koloběhu uhlíku (Myxococcus, Pseudomonas, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium), dusíku (Azotobacter, Clostridium), síry (Thiobacillus), železa, manganu. Výskyt bakterii v půdě je dán množstvím živin a ostatními faktory prostředí (vlhkost, teplota, kyselost). Některé mikroorganismy se vyskytují v půdě přirozeně, jiné pouze v přítomnosti dostatečného množství živin.

21 KLASIFIKACE PŮDNÍCH BAKTERIÍ 1. Autochtonní přirozené půdní organismy, jsou po celý rok zastoupeny v relativně konstantním počtu Pseudomonas Agrobacterium Corynebacterium Mycobacterium Nocardia Autochtonní druhy - druhy mikroorganismů osídlující dané stanoviště od počátku. Zymogenní druhy - druhy, jejichž přítomnost závisí na aktuálně zvýšené koncentraci živin nebo dodání zvláštních látek (taky se označují jako allochtonní).

22 2. Zymogenní metabolicky aktivní druhy Vyskytují se ve vyšším počtu jen tehdy, je-li dostatečná zásoba živin. Vyznačují se mohutnou metabolickou aktivitou a podílejí se na procesech mineralizace půdy, zajišťují koloběh jednotlivých prvků v biosféře. Bacillus Mycobacterium Pseudomonas některé druhy Flavobacterium některé druhy Enterobacter -některé druhy Aeromonas sinice Nostoc, Anabaena

23 3. Patogenní bakterie baktérie patogenní pro rostliny nebo živočichy včetně člověka, do půdy se dostávají sekundárně z různých zdrojů a mohou v půdě přežívat značnou dobu. Kontaminují půdu, nemnoží se zde, přežívají ve formě endospory. Bacillus anthracis Pseudomonas aeruginosa Erwinia Clostridium tetani Agrobacterium

24 Pseudomonas Bakterie tyčinkovitého tvaru, gram-negativní, jeden nebo více polárních bičíků, aerobní nebo fakultativně anaerobní, nesporogenní, pozitivní katalázový test. Některé z nich jsou fluoreskující. Nejznámější druhy jsou P. aeruginosa (příležitostný lidský patogen); P. syringae (rostlinný patogen); P. putida (půdní druh); P. fluorescens (promotor růstu rostlin).

25 Pseudomonas aeruginosa oportunní lidský patogen. Pouze ojediněle vyvolává primární infekce, může však napadnout jakoukoliv tkáň nebo orgán (způsobuje infekce močových nebo dýchacích cest, gastrointestinální a oční infekce atd). Pseudomonas aeruginosa může vyvolávat infekce ran

26 Agrobacterium Rod gram negativních bakterií, které používají horizontálního přenosu genů, a tvoří nádory na rostlinách. V současné době mnoho druhů je reklasifikováno do rodu Rhizobium. Nejznámější je druh A. tumefaciens tvořící nádory na kořenech rostlin. Zástupci tohoto rodu mohou způsobovat humánní infekce u pacientů s oslabenou imunitou.

27 Corynebacterium Rod gram-pozitivních aerobních nebo fakultativně anaerobních bakterií, nepohyblivé, nesporulující, tyčinkovitého tvaru. Většinou nejsou patogenní pro člověka, ale jsou součástí běžné mikroflóry kůže. Vyskytují se na různých nikách, jako je půda, odpadky, rostliny, kůže. Např. Corynebacterium diphtheriae (původce záškrtu) je významný patogen člověka.

28 Mycobacterium (mykobakterie) rod nepohyblivých a nesporulujících bakterií ze samostatné čeledi Mycobacteriaceae, řazené k aktinomycetám. Jsou většinou považovány za grampozitivní. Mají však komplexní buněčnou stěnu, předpona myko odkazuje na fakt, že jejich buněčná stěna obsahuje vosky. Mykobakterie rostou obecně poměrně pomalu, jsou acidorezistentní ( acid fast ), tzn. zbarvení vyvolané činidly se nedá vymýt kyselinami. Mykobakterie jsou široce rozšířené organismy, typicky žijící ve vodě (i chlorované vodě) a zdrojích potravy. Někteří zástupci způsobují těžká onemocnění (tuberkulóza Mycobacterium tuberculosis, tuberkulóza skotu M. bovis a lepra Mycobacterium leprae), jsou obligátními patogeny a nemohou žít volně.

29 Nocardia (nokardie) rod grampozitivních aerobních bakterií, tyčinkovitého tvaru, z kmene aktinobakterií. Často však tvoří vláknité vzdušné mycelium. Jejich buněčná stěna je podobná stěně mykobakterií. Řadíme k nim asi 85 druhů. Nokardie se vyskytují po celém světě především v půdě bohaté na humus. Některé z nokardií jsou oportunisticky patogenní (původci nokardióz). Nokardie, které infikují člověka, se do těla dostávají z půdy. V ohrožení onemocnění jsou zejména pacienti se sníženou imunitou (infekce HIV, transplantace kostní dřeně, atp.)

30 Bacillus rovné grampozitivní sporulující tyčinkovité bakterie o velikosti 1x4 um, z čeledi Bacillaceae. Bakterie rodu Bacillus se využívají hlavně v medicíně, kde produkují antibiotika. Tvoří bělavé až hnědavé nepravidelné kolonie buněk. Tyto bakterie jsou aerobní, nebo fakultativně aerobní. Určité druhy slouží pro průmyslovou přípravu enzymů. Bakteriální amylasy získané z Bacillus subtilis se uplatňují v pivovarství a v textilním průmyslu proteinasy se používají především do pracích prostředků.

31 Bacillus anthracis Je známá především jako původce onemocnění anthrax, v přírodě je to však půdní bakterie, která tvoří spory. Primárně je tato bakterie patogenem býložravých savců, nákazy u člověka jsou zaznamenávány především v rozvojových zemích, ve vyspělých zemích pak hrozí použití této bakterie v bioterorismu. Anthrax na obarvené mikrofotografii v slezinové tkáni

32 Flavobacterium Gram-negativní, nepohyblivá, tyčinkovitá bakterie. Flavobakterie jsou nacházeny ve vodě a v půdě na rozličných stanovištích. Některé druhy mohou způsobovat choroby sladkovodních ryb. Flavobacterium psychrophilum

33 Clostridium rod bakterií volně žijících hlavně v mírně kyselých půdách. Je to anaerobní, sporulující, mezofilní, grampozitivní tyčinka. Fixuje vzdušný dusík a energii získává máselným kvašením. Využívá se při průmyslové produkci kyseliny máselné, na druhou stranu produkuje toxiny (Clostridium botulinum, Clostridium tetani - Bakterie produkuje neurotoxin tetanospasmin, což je podstatou procesu, v důsledku kterého dochází u infikovaných lidí k onemocnění tetanem. Clostridium pasteurianum žije v půdě, má schopnost vázati volný dusík

34 Erwinia Rod gramnegativních, fakultativně anaerobních tyčinkovitých bakterií z čeledi Enterobacteriaceae. Žijí saprofyticky, popřípadě jako paraziti zejména na rostlinách. Z více než 20 druhů jsou nejznámější Erwinia amylovora, Erwinia carotovora a Erwinia herbicola. Erwinia carotovora způsobující měkkou hnilobu hlíz bramboru

35 Podstatnou součástí buněčných stěn rostlinných buněk je celulosa (velmi odolný, nerozpustný polysacharid). V rostlinném materiálu je obvykle doprovázena dalšími obtížně odbouratelnými látkami, např. hemicelulosami, pektiny, ligniny, tuky a pryskyřicemi. Na rozkladu celulózy se podílí řada mikroorganismů, které ji štěpí exoenzymem celulázou na celobiosu a potom na glukosu. Zastoupeni aerobnich celulolytických bakterií je ukazatelem úrodnosti půdy. V intenzivně obdělávaných půdách se vyskytují zástupci rodů Cellvibrio, Cellfalcicula, Cytophaga, Sporocytophaga Ve středně obdělávaných myxobakterie Ve slabě obdělávaných půdách a v kyselých půdách převládají mikroskopické houby. Celulóza může být rozkládaná také za anaerobních podmínek.

36 Cytophaga Sporocytophaga

37 MYXOBAKTERIE Význam v případech, kdy je třeba určit původ fekálního znečištění. Myxobakterie jako významné celulolytické druhy se vyskytují mimo jiné v zažívacím traktu býložravců. Jejich zvýšený výskyt ve vodě tak může prokázat znečištění pocházející ze zemědělských provozů. Životní cyklus je specifický vyznačuje se tvorbou makroskopicky zřetelných plodniček. Ve vodě mohou přežívat poměrně dlouho (až rok), jejich počty zde klesají, neboť se zde rozmnožují jen v omezené míře.

38 8. ÚKOL - Mikroorganismy v půdě A. Celulolytické bakterie v půdě Cíl úkolu: Zjistit, zda se ve vzorcích půdy vyskytují celulolytické bakterie Pomůcky: půdní vzorky proseté sítem o velikosti ok asi 2 mm, nastříhané proužky filtračního papíru velikosti 4 x 1 cm, pinzeta, stříkačka s destilovanou vodou Provedení: Vzorky proseté zeminy dáme do Petriho misek, povrch zarovnáme. Mírně provlhčíme a na rovný povrch uložíme pinzetou paralelně vedle sebe několik proužků filtračního papíru. Kultivujeme při teplotě 26 C. Vyhodnocení: Hnědé, oranžové nebo zelené skvrny na povrchu papírků signalizují přítomnost celulolytických bakterií. Jejich účinkem se papír rozpadá a mizí Porovnáváme jednotlivé typy zemin. Humusem bohaté zeminy obsahují více celulolytických bakterií než půdy humusem chudé a bezstrukturní. V písčitých půdách se vyskytují málo.

39 B. Průkaz bakterií v půdě/zemině Cíl úkolu: Prokázat přítomnost mikroorganismů ve vzorcích půdy Pomůcky: Vzorky půdy, sterilní fyziologický roztok, zkumavky, dělené pipety na 10 ml, mikropipety, hokejky, agarová plotna MPA. Provedení: 1 g zeminy suspendujeme v 10 ml fyziologického roztoku a důkladně protřepeme. Ze suspenze přeneseme: 0,1 ml na povrch agarové plotny /MPA/ a rozetřeme hokejkou 1 ml roztoku z první zkumavky přeneseme do 9 ml fyziologického roztoku, protřepeme, přeneseme 0,1 ml na povrch agarové plotny /MPA/ a rozetřeme hokejkou (ředení možno opakovat) Naočkované plotny inkubujeme v bioinkubátoru při teplotě 26 C hod

40 9. ÚKOL - Stanovení citlivosti mikroorganismů na antibiotika Stanovení účinnosti antibiotik difuzní disková metoda Cíl úkolu: Stanovení citlivosti/rezistence bakterií k vybraným antibiotikům terčíkovou metodou, určení účinného antibiotika Pomůcky: zkumavky s tekutou půdou (MP bujón) a namnoženými kmeny bakterií (E. coli), kotoučky filtračního papíru Sensi-La-Dish (nasyceny antibiotiky dané koncentrace), sterilní MPA, sterilní hokejka, sterilní pinzety Provedení: Povrch agarové plotny MPA naočkujeme suspenzí bakteriálního kmene (100 μm) /např. S. aureus, E. coli, B. atrophaeus/ nebo roztokem vlastních bakterií a položíme barevné kotoučky Sensi disků v pravidelných vzdálenostech do kruhu. Petriho misku obrátíme dnem vzhůru a inkubujeme 24 h při teplotě 37 C.

41 Stanovení účinnosti přírodních antibiotik česnek Princip: Česnek obsahuje ALLIIN (S-allyl-L-cystein sulfoxid) Alliin je prekurzorem fytoanticipinu s názvem ALLICIN (diallylthiosulfinát), který vzniká po porušení pletiv působením enzymu alliinasy Pomůcky: sterilní MPA, bakteriální kultury na pevném nebo v tekutém médiu, klička nebo dávkovač, sterilní hokejka, sterilní pinzety, třecí miska, váhy, česnek (Allium sativum - český, čínský) Provedení: MPA očkujeme známými postupy /E. coli/, 0,5 g česnekového extraktu naneseme na svrchní víčko Petriho misky (allicin se odpařuje), přiklopíme naočkovaným agarem a dnem vzhůru inkubujeme 24 h při teplotě 37 C.

42 Normální mikroflóra sliznic a pokožky člověka

43 Normální bakteriální flóra kůže a sliznic Každý jedinec je po narození postupně osídlen mikroorganismy ze zevního prostředí Za normální se považují jen bakterie, even. plísně, (nikoliv viry pro jejich obligatorní intercelulární parazitismus) Povrch těla, který zahrnuje kůži, sliznice gastrointestinálního, urogenitálního a respiračního traktu, je trvalé kolonizován jen omezeným počtem druhů, jejich výběr je pro danou lokalitu charakteristický. V této lokalitě se tyto druhy jako patogeny vůči hostiteli nechovají. Vzájemný kvantitativní vztah mezi druhy je udržován v rovnováze = normální flóra, residentní flóra. Normální flóra ovlivňuje fyziologické funkce (vstřebávání, peristaltiku), produkuje vitamíny. Flóra transientní (přechodná), kdy sliznice je krátkodobě kolonizována druhem, který nevyvolává patologické změny Žádný z druhů patřících k normální flóře není primární patogen, ale v jiných lokalitách se může uplatnit jako podmíněný patogen

44 Význam normální flóry v protekci kůže a sliznic před invazí druhů s vyšší patogenitou je výsledkem souhry rozličných mechanismů, z nichž se nejvíce uplatňuje obsazení buněčných receptorů, kompetice o živiny, produkce bakteriocinů, vznik metabolických produktů inhibujících růst (kys. mléčná), změny prostředí (ph). U bezmikrobních jedinců se vyvíjí imunitní systém podstatně obtížněji a je proto zranitelnější zevní infekcí. Naopak trvalá přítomnost mikrobů na sliznicích představuje významné riziko infekce endogenní. U imunosupresí je větší riziko infekce endogenní než ohrožení infekcí z vnějšího prostředí. Před transplantacemi a u radikální imunosupresívní léčby obecné se toto riziko omezuje dekontaminací, tj. vyhubením veškeré residentní flóry. Po ukončení období hluboké imunosuprese se pak normální flóra obnovuje rekolonizací s využitím známých kmenů těch druhů, které se podílejí na normální flóře

45 Normální flóra kůže Normální osídlení je ovlivněno vlastnostmi kůže (vlhkost, umístění mazových a potních žláz) a kontaminací ze sousedních sliznic. Hlavní bakteriální druhy na kůži Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis, Staphylococcus aureus, Propionibacterium acnes. S. aureus nejčastěji na perineu, ale i na sliznici nosu. V oblastech s vyšším výskytem mazu propionibacteria, lipofilní korynebakterie Hlavní houbové druhy: Candida, Torulopsis, Pityrosporum Největší osídlení je v uzavřených oblastech (axila, meziprstní prostory na nohou, perineum), kde při vlhké zapářce je možný snazší průnik do hloubky.

46 Staphylococcus epidermidis Oportunní patogen, napadá oslabené pacienty. Dostane se do těla s předměty z umělé hmoty, velmi dobře adheruje na jejich povrch. Staphylococcus aureus Patogenní pro člověka a další teplokrevné živočichy. K onemocnění dochází při oslabení organismu. Zánětlivá ložiska v ranách, průnik do krve a další infekce v plicích, osrdečníku, mozkových blanách, kostech. Toxinózy. Mastitida. Napadení střev.

47 Propionibacterium acnes Je spjata s výskytem akné.

48 Candida Přemnožení způsobuje oslabený imunitní systém, užívání antikoncepčních pilulek, antibiotik, stres, špatná výživa, nadměrné množství cukru, alkoholu. Výtoky z pochvy, ekzémy, povleklý jazyk, onemocnění kůže, nehtů. Torulopsis

49 Respirační trakt Má více ekosystémů s charakteristickou flórou Nos, orofarynx (ústní část hltanu) a tonsily (mandle) jsou velmi hustě kolonizovány. V nosní dutině Staphylococcus epidermidis, méně často Coryneformní bakterie, v 10% Staphylococcus aureus Farynx, tonsily různé druhy ústních streptokoků a nepatogenní druhy neisserií Z druhů s vyšším patogenním potenciálem se tu přechodně mohou vyskytovat v závislosti na roční době a prostředí Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis a Haemophilus influenzae. V podmínkách jednotek intensivní péče a při změnách fyziologické funkce sliznice mohou kolonizovat horní cesty dýchací gramnegativní tyčky, zejména enterobakterie (klebsielly, escherichie), ale i pseudomonády. Tyto druhy mohou přecházet na sliznice dolních cest dýchacích, které jsou za normálních okolností sterilní. Staphylococcus aureus kolonizuje horní cesty dýchací s výjimkou nosu obvykle jen přechodně. Často se vyskytuje spolu s virovou infekcí.

50 Corynebacterium sp. Streptococcus pneumoniae Může způsobovat infekce plic (pneumonie), středouší (otidis media).

51 Neisseria meningitidis Běžně se nazývá meningokok způsobuje zánět mozkových plen (meningitidu), probíhá velmi rychle a bez léčby zabíjí do několika dnů Haemophilus influenzae druhotné záněty dýchacích cest, prvotní poškození sliznice způsobí jiný patogen především vir, často provází chřipku

52 Zažívací trakt Dutina ústní ústní streptokoky (Streptococcus albus), Streptococcus pneumoniae, nesporulující anaeroby (koky, Actinomyces) Povrch zubů bakterie tvoří podstatnou část zubního plaku. Kyseliny vznikající při bakteriálním metabolismu poškozují zubní sklovinu a vedou tak ke vzniku zubního kazu. Nejčastěji Streptococcus mutans. V jícnu se obvykle normální flóra neprokazuje, což je dáno patrně velmi rychlou pasáží obsahu do žaludku. V žaludeční dutině výrazné uplatnění HCl, výrazně omezuje výskyt bakterií v žaludečním obsahu. Dále mohou přejít acidoresistentní bakterie, plísně. Převažují druhy, které svým metabolismem neutralizují kyselé prostředí. Střevo osídlení střeva je odlišné podle způsobu výživy (vegetariáni), podle geografických oblastí (tropy). V tenkém střevě velmi nízká koncentrace bakterií (do 10 5 na 1 g). Malý obsah bakterií je způsoben rychlou peristaltikou a vlivem žluče. Ústní streptokoky, enterokoky (Enterococcus faecalis, E. faecium), enterobakterie (Enterobacteriaceae) a laktobacily.

53 Streptococcus mutans Lactobacillus sp. Enterococcus (Streptococcus) faecalis Jsou podmíněně patogenní, původci infekcí močových cest, žlučových cest, gynekologických zánětů, pooperačních komplikací.

54 Enterobacter sp. Mohou být původci akutních i chronických zánětů močových cest.

55 V tlustém střevě a stolici se hodnoty bakterií pohybují mezi bakterií v 1 g. Identifikováno více než 400 druhů bakterií, které je možno považovat za normální flóru tlustého střeva. 95% jsou striktní anaerobové Bacteroides, Fusobacterium, Eubacterium, Bifidobacterium, Clostridium. tyto svými metabolickými produkty inhibují růst jiných bakteriálních druhů (tvorbou kys. octové, máselné, mléčné). Enterokoky (Enterococcus faecalis, E. faecium). Dále Enterobacteriaceae Escherichia coli a laktobacily U kojenců v dobrých hygienických podmínkách je střevní sliznice kolonizována převážně laktobacily.

56 Fusobacterium Eubacterium Bifidobacterium

57 Clostridium difficle Escherichia coli Enterotoxikogenní kmeny mohou vyvolávat průjmy

58 Urogenitální trakt Z močových cest je normálně osídlena pouze sliznice přední části močové trubice Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, koryneformní tyčky, přechodně se může vyskytnout Escherichia coli a Proteus. Z patogenních druhů Neisseria gonorhoae (kapavka), Treponema palidum (syfilis) Na zevním genitálu žen se normálně vyskytuje flóra obdobná jako na kůži, převládají grampozitivní koky (Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Sarcina) a také Candida. Flora ve vagíně je ovlivněna hormonálně. Po porodu přetrvává osídlení laktobacily, v dětství až do puberty je ve vagině flóra podobná jako na zevním genitálu. S pubertou nastupuje osídlení laktobacily, které snižují ph a tím se snižuje možnost osídlení jinými bakteriálními druhy. Kromě laktobacilů nesporulující anaerobi, grampozitivní koky a fungi (Candida). Někdy ve vagině Streptococcus agalactiae riziko pro novorozence.

59 Proteus Sarcina Streptococcus agalactiae Může ohrozit zejména novorozence (nakazí se v průběhu porodu), - způsobuje meningitidy, sepse, pneumonie

60 ZUBNÍ PLAK = PŮVODCE ZUBNÍHO KAZU

61 5. ÚKOL - Průkaz bakterií na povrchu kůže člověka - Vyhodnocení: vyhodnocení minulého cvičení 1. Na agarové plotně spočítáme počet vyrostlých kolonií a popíšeme jejich morfologické vlastnosti. 2. Srovnáme počet kolonií vyrostlých z otisků neumytých rukou a umytých rukou po použití desinfekce 3. Z vybraných kolonií si připravíme nativní preparát, který prohlédneme velkým zvětšením mikroskopu a popíšeme. Tvar kolonií, tvar buněk pod mikroskopem.

62 TYPY BAKTERIÁLNÍCH KOLONIÍ

63 Bakterie kultivované z otisku prstu

64 10. ÚKOL - Izolace mikroorganismů křížový roztěr Cíl: seznámit studenty se způsobem získávání čistých kultur mikroorganismů Pomůcky: Bakteriologická klička, Petriho misky s živnou půdou, lihový kahan Postup: Ze suspenze mikrobů ve fyziologickém roztoku nebo přímo z vyrostlé kolonie na agaru odebereme bakteriologickou kličkou část populace a rozetřeme do několika /3-4/ vodorovných čar po povrchu agarové plotny. Kličku vyžíháme a po vychladnutí přiložíme na konec rozetřených čar a znovu rozetřeme do několika čar. Tento postup opakujeme několikrát a zakončíme vlnitou čarou. Kultivujeme v inkubátoru při příslušné teplotě.

65

66 Kultivace bakterií ve visící kapce = suspenze mikroorganismů visící na krycím skle, která se nedotýká podložního skla (s vybroušenou jamkou) používá se pro kultivaci a pozorování živých bakterií zejména k určení pohyblivosti (taxonomie) vytvoření malé vlhké komůrky kapka s bakteriemi je uzavřená mezi dvěma skly - to zabraňuje kontaminaci organismy z okolí a umožňuje kultivaci (vzorek nevyschne jako obyčejný vodní preparát)

67 11. ÚKOL - Barvení mikroorganismů, mikroskopické sledování mikroorganismů A. Zhotovení nativního preparátu Cíl: Pozorování bakterií pod mikroskopem Pomůcky: Odmaštěné podložní sklo, agarová miska s koloniemi bakterií, bakteriologická klička, voda, sterilní párátko, Lugolův roztok, lihový kahan, imerzní olej a objektiv. Provedení: Sterilním párátkem sejmeme vzorek hlenu z krčku povrchu zubu, resp. bakteriologickou kličkou přeneseme narostlé mikroorganismy z Petriho misky na podložní sklíčko s malou kapkou destilované vody nebo Lugolova roztoku. Rozmícháme a přímo párátkem rozprostřeme do kruhové plochy/průměr asi 15 mm/ Výsledky: Při velkém zvětšení mikroskopu pozorujeme bakterie různých tvarů (koky, tyčinky). Zakreslíme jednotlivé mikroorganismy.

68 Tyčinkovitý tvar bakterií (otisk prstu) Kokální tvar bakterií

69 B. Kultivace bakterií ve visící kapce Cíl: Pozorování živých bakterií Pomůcky: Odmaštěné podložní sklo s výbrusem, krycí sklo agarová miska s koloniemi bakterií (Bacillus subtilis), bakteriologická klička, kapátko destilovaná voda, vlhká komůrka, imerzní olej a objektiv. Provedení: Doprostřed krycího skla přeneste bakteriologickou kličkou suspenzi bakterií. Kapátkem do každého rohu krycího sklíčka kápněte malou kapku destilované vody a přiklopte podložním sklem s výbrusem. Otočte, přeneste do vlhké komůrky a kultivujte několik hodin při 37 C. Po kultivaci pozorujte pod mikroskopem.

70 C. Negativní barvení Cíl: mikroskopické stanovení pouzder a slizů bakterií Pomůcky: odmaštěná podložní skla, černá tuš, bakteriologická klička, sporulující kultura bakterie Bacillus atrophaeus Provedení : Na odmaštěné podložní sklo kápneme malé množství tuše zředěné destilovanou vodou 1:2. V této kapce dobře rozmícháme malé množství bakterií. Hranou dalšího podložního skla rozetřeme suspenzi po celé ploše a necháme volně na vzduchu zaschnout. NEFIXUJEME! Pozorujeme pod imerzí při zvětšení 1000x Výsledek: zapíšeme a zakreslíme do protokolu

71 Spirillum volutans Negativní barvení (Burriho metoda)

72

73 Bakterie mléčného kvašení

74 Bakterie mléčného kvašení Jsou schopny enzymatické přeměny sacharidů na kyselinu mléčnou (a současně další produkty jako kys. máselná, propionová, octová, aceton, ethanol, oxid uhličitý aj.). Vyskytují se jak volně v přírodě (např. odpadní vody, ovoce a ovocné šťávy), tak jsou záměrně součástí produktů potravinářského průmyslu mléčné a obilné výrobky, maso a rybí výrobky, pivo, víno, nakládaná zelenina, kysané zelí, siláž, kynuté těsto, slad a další. Jsou složkou přirozené mikroflóry v ústech, intestinálním traktu a vagíně mnohých živočichů včetně člověka. Základním tvarem mléčných bakterií je tyčinka, která může být různě deformovaná v závislosti na rodu a druhu bakterie.

75 Mléčné kvašení je jeden z nejvýznamnějších fermentačních procesů v potravinářské biotechnologii. Probíhá-li za vzniku pouze kys. mléčné, označuje se jako homofermentativní, vznikají-li vedle kys. mléčné i vedlejší produkty, nazývá se heterofermentativní. Homofermentativní mléčné kvašení probíhá dle rovnice: C 6 H 12 O 6 CH 3 CHOH COOH Heterofermentativní mléčné kvašení probíhá dle rovnice: C 6 H 12 O 6 CH 3 CHOH COOH + CH 3 COOH + C 2 H 5 OH + CO 2 + H 2 Mléčné bakterie se na základě jejich enzymatického vybavení rozdělují do tří skupin: 1) Obligátní homofermentativní bakterie 2) Obligátní heterofermentativní bakterie 3) Fakultativní homofermentativní bakterie

76 Čeleď Lactobacillaceae Čeleď Lactobacillaceae řadíme do domény Bacteria, kmenu Firmicutes, třídy Bacilli, řádu Lactobacillales. Čeleď Lactobacillaceae zahrnuje v současnosti tři rody klasických bakterií mléčného kvašení: Lactobacillus, Paralactobacillus, Pediococcus. Tato čeleď byla vyčleněna na základě sekvencování genomu pro 16S rdna ze skupiny grampozitivních bakterií s nízkým procentuálním obsahem G + C. Jsou tvořeny pravidelnými, nesporulujícími, grampozitivními tyčinkami nebo koky. Patří sem nepigmentující, mezofilní, chemoorganotrofní druhy, které rostou pouze na kompletním médiu. Jsou náročné na výživu vedle sacharidů jako zdroj energie a uhlíku vyžadují nukleotidy, aminokyseliny, vitamíny a jiné org. sloučeniny. Některé heterotrofní laktobacily se vyskytují jako nežádoucí kontaminace ve vinařství, pivovarnictví, drožďářství a při zpracování masných výrobků.

77 Lactobacillus plantarum Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii Pediococcus pentosaceus Pediococus acidilactici

78 Do rodu Lactobacillus patří zejména tyto druhy: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis (Lactobacillus lactis), Lactobacillus helveticus, Lactobacillus plantarum a další druhy. Buňky mají tvar pravidelných tyčinek, občas také koků. Vyskytují se jednotlivě i v řetízcích, někdy tvoří vláknité formy. Jsou grampozitivní, nesporulující, fakultativně anaerobní, občas mikroaerofilní Lactobacillus acidophilus

79 Čeleď Streptococcaceae Čeleď Streptococcaceae zahrnuje rody Streptococcus, Lactococcus a Lactovum. Patří sem patogenní, saprofytické i biotechnologicky využívané druhy. Buňky jsou kulovité nebo oválné, vyskytují se po dvou nebo v řetízcích rozmanité délky. Jsou grampozitivní, většinou fakultativně anaerobní, nepohyblivé a netvoří endospory. V mlékařském průmyslu jsou používány streptokoky: Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (synonymum Streptococcus thermophilus), Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetilactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris Streptococcus salivarius subsp. thermophilus,

80 Lactococcus lactis Lactococcus lactis subsp. cremoris

81 Čeleď Bifidobacteriaceae Bifidobakterie náleží do třídy - Actinobacteria (Aktinomycety), podtřída Actinobacteridae, řád Bifidobacteriales, čeleď Bifidobacteriaceae. Od ostatních bakterií mléčného kvašení se odlišují odlišnou metabolickou dráhou fermentace cukrů. Vedle kys. mléčné a octové produkují vitamíny jako thiamin a laktoflavin. Tvoří přirozenou součást střevní mikroflóry savců a prostřednictvím svých metabolitů se podílejí na potlačení nežádoucích mikroorganismů v zažívacím traktu, čehož se využívá při léčení zažívacích potíží. Jsou součástí mlékárenských výrobků na bázi jogurtů. Nejčastěji využívaní zástupci r. Bifidobacterium B. animalis (syn. B. lactis) součást trávicího traktu, Bifidobacterium bifidum - nachází se zejména v tlustém střevě a v pochvě.

82 Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium lactis

83 Kysané mléčné výrobky Kysané mléčné výrobky (též fermentované mléčné výrobky) je soubor všech mléčných produktů připravených z mléka za přídavku kysacích kultur neboli fermentujících bakterií. Nejčastěji se používají bakterie rodu Lactobacillus, Bifidobacterium, či Lactococcus. Mezi kysané mléčné výrobky patří jogurty, kysaná, acidofilní nebo jogurtová mléka, kysaná smetana. Kysané mléčné výrobky - jemná sraženina mléčných bílkovin - delší trvanlivost, rychlá stravitelnost - kysací kultury ze sterilního mléka a čistých kultur - anaerobní přeměna laktosy na kys. mléčnou, ph 3,8-4,6 Rozdělení dle mikrobiálních druhů: - mesofilní bakterie mléčného kvašení (smetanový zákys, podmáslí...) - termofilní bakterie mléčného kvašení (jogurt, acidofilní mléko...) - bakterie mléčného kvašení a kvasinky (kefír, kumys...) Bakterie mléčného kvašení se využívají také v průmyslu masném, tukovém, konzervárenském a pekárenském.

84 Jako monokultury se v mlékárenské výrobě používají mikroorganizmy, které obsahují jen jeden kmen jednoho druhu mikroorganizmů, popř. jestliže obsahují více kmenů jednoho druhu mikroorganizmů Jako směsné bakteriální kultury, - obsahují více druhů a kmenů bakterií Směsné kultury bakteriální a kvasinkové - obsahují více druhů a kmenů bakterií i kvasinek zkvašujících laktózu Některé monokultury jsou využívány k sestavování směsných kultur. Tyto směsné kultury se pak většinou nazývají podle výrobku, k jehož výrobě slouží kultura jogurtová (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Bifidobacterium bifidum) kefírová (Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactobacillus casei, Candida kefir) smetanová (Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetilactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris)

85 Probiotika Probiotika jsou bakterie a to převážně bakterie mléčného kvašení. Ne všechny mléčné bakterie však mají probiotické vlastnosti. Bylo navrženo přes dvacet kriterií, která by měla charakterizovat mikroorganizmy s probiotickými vlastnostmi. Odborníci se shodli na pěti znich: - jsou humánního (lidského) původu - nejsou patogenní -neničí se v kyselém prostředí a v přítomnosti žluči (nesmí být během průchodu zažívacím traktem zničeny nebo oslabeny) -neničí se během výrobního procesu a zůstávají životaschopné po celou dobu trvanlivosti potraviny - je prokázán jejich pozitivní vliv na zdravotní stav Příklad prokázaných účinků probiotik: - snižují účinek některých karcinogenních látek z mikroorganizmů - zvyšují odolnost vůči průniku infekcí (např. proti průjmovým onemocněním) - posilují intestinální mikroflóru při tlumení alergických reakcí - zlepšují kvalitu života pacientů se zánětlivým onemocněním střev

86 11. Úkol Barvení mikroorganismů, mikroskopické sledování mikroorganismů D. bakterie mléčného kvašení Cíl úkolu: Zaznamenat výskyt bakterií mléčného kvašení Pomůcky: Kysané mléčné výrobky/podmáslí, kyška /, jogurt, zředěný karbolfuchsin, Pasteurova pipeta, bakteriologická klička, kahan, odmaštěná podložní skla, imerzní objektiv a olej Provedení: Na odmaštěné podložní sklo přeneseme kapku mléčného výrobku /podmáslí, kyška /, nebo vyžíhanou bakteriologickou kličkou malé množství jogurtu a rozetřeme po povrchu sklíčka. Preparát necháme zaschnout, opatrně fixujeme nad plamenem a barvíme 5 minut zředěným karbolfuchsinem. Barvivo slejeme, opláchneme vodou a po osušení na vzduchu prohlížíme imerzním objektivem. Výsledek: Zaznamenáme v podobě obrázku do protokolu.

87

88