Cvičení č. 9 KULTIVACE A OČKOVÁNÍ MIKROORGANISMŮ

Transkript

1 Cvičení č. 9 KULTIVACE A OČKOVÁNÍ MIKROORGANISMŮ Syntetická definovaná media, jednoduché sloučeniny, známé složení, dodávány v práškové podobě Komplexní media vycházejí z živočišných tkání nebo rostlinných pletiv, často jsou přidávány enzymy - pepton, trypton

2

3 Rozdělení kultivačních médií podle růstu mikroorganismů: Univerzální média vyhovují požadavkům na výživu širokého spektra mikroorganismů (masopeptonový bujón a agar) Selektivní média zvýhodňují růst jednoho druhu nebo skupiny mikroorganismů (Sabouraudův agar; zvýhodňuje růst kvasinek a plísní, růst bakterií je potlačen nižším ph) (Selektivně) diagnostická média -roste na nich malá skupina organismů, jejichž růst se projeví biochemickou reakcí (Endův agar; potlačuje růst grampozitivních bakterií, skupina gramnegativních bakterií fermentujících laktózu vytváří červenorůžové kolonie, E. coli kovový lesk)

4 Základní a obohacené půdy Bujón a peptonová voda, živný agar (pepton, NaCl a voda, 1.5% agar) + přídavek bílkovin mozkosrdcová infuze, kyselý kaseinový hydrolyzát, enzymatický kaseinový hydrolyzát aminokyselin kvasniční autolyzát peptonu sojový pepton, tryptosa hovězí nebo koňské sérum, albumin, definovaná obohacovadla, směsi vitamínů, krev vejce koagulace teplem (mykobakterie) glukóza pro všechny kvasinky a plísně (Sabouraudův agar)

5 Šulova půda bovinné sérum kultivace mykoplazem

6 Krevní agar = základ většiny půd v klinické bakteriologii 5-10% defibrinované ovčí/koňské krve k ochlazenému agaru Identifikace bakterií podle hemolytické aktivity (rozkladu erytrocytů pod kolonií): α hemolýza (částečná) vzniká zelený verdoglobin (Streptococcus viridans) β-hemolýza kompletní rozklad červených krvinek v okolí kolonie (např. Streptococcus haemolyticus, S. pyogenes, Staphylococcus aureus) γ-hemolýza žádná hemolytická aktivita Přidáním určitých antibiotických látek docílíme selektivního růstu některých skupin bakterií (např. rodů Brucella, Campylobacter)

7 Modifikace krevního agaru Čokoládový agar vyrábí se tepelnou lýzou červených krvinek (krev se přidá do teplého agaru) kultivace meningokoků Thayer-Martinův agar čokoládový agar užívaný k izolaci Neisseria gonorrhoeae, původce kapavky Mueller-Hintonův čokoládový agar - Haemophilus parainfluenzae

8 Selektivní půdy Vyrůstají na nich pouze některé mikroorganismy, růst ostatních potlačen Složení: živný základ + inhibitory růstu specifických skupin MO Streptococcus Staphylococcus Krevní agar s 10% NaCl stafylokoky Löwenstein-Jensen médium malachitová zeleň mykobakterie Tekuté selektivně pomnožovací půda selenitová, půda tethrathionátová, půda s malachitovou zelení salmonely z potravin M. tuberculosis Alkalická peptonová voda ph 8.6 cholerová vibria Selektivní půdy s antibiotiky streptokoky, pseudomonády, neisserie, kampylobaktery

9 Diagnostické půdy Diagnostika na základě charakteristických vlastností metabolismu MO: štěpení substrátů (sacharidy, aminokyseliny) tvorba stanovitelných látek (H 2 S, indol) využití substrátů (citrát) růst v přítomnosti specifických látek Obsahují substrát a indikátor Půdy cukerné štěpení (zkvašování) cukrů, bromthymolová modř Deaminace fenylalaninu, dekarboxylace aminokyselin (lysinu, argininu) barevná změna bromkresolové červeně Štěpení močoviny vznik CO 2 a NH 4 -zvýšení ph, fenolová červeň Redukce nitrátů, hydrolýza hippurátu Ztekuceníželatiny, koagulace plazmy Tvorba H 2 S reakce s citrátem železitým - černé kolonie na agaru -kombinovaná půda dle Hajny (cukry) černavé zbarvení

10 Využití selektivních diagnostických chromogenních médií Salmonella Rappaporta Vassiliadis agar Listeria Oxford agar Bacillus cereus PEMBA agar Staphylococcus aureus ORSAB agar

11 Využití selektivních diagnostických chromogenních médií BGA - agar s brilantovou zelení a fenolovou červení laktóza +/- kultury McConkey agar, laktóza +, laktóza - kultura BGA laktóza + kultura E.coli (v základním segmentu patrná zpětná alkalizace média - červená skvrna) XLD agar (+xylóza, lyzin, deoxycholát sodný)

12 Test zkvašování cukrů a tvorby kyselin Zkumavka 1: nefermentuje. ph indikátor zůstává purpurový. Růst není vyloučen, kultura může využívat amino-kyselin jako zdroje energie (obvykle aerobně). Zkumavka 2A a 2B: Fermentace s tvorbou kyselin (žlutá barva) ale bez plynu. Zkumavka 2A malé množství kyselin, ale už se jedná o fermentaci. Zkumavka 3A a 3B: Fermentace s tvorbou kyselin (žlutá barva) a plynu (bublina v Durhamově zkumavce). Zkumavka 3B ukazuje alkalickou reakci v horní vrstvě; vzniká deaminací aminokyselin

13 Kombinované komerční diagnostické testy API test - Enterobacteriaceae ie_pro_farmaceuty/praktikum.html

14 Média podle konzistence tekutá (pomnožovací, bujóny) x tuhá (izolační, agary) -závisí na koncentraci extraktu z mořské řasy agar 1.5-2% agaru -přídavek k tekutému médiu před sterilizací -nalévání do sterilních skleněných nebo plastových Petriho misek, kde po ochlazení na okolo 40 C ztuhne, inkubace možná do 100 C Média podle umístění a. Živný bujón tekuté živné prostředí, obvykle v mikrobiologické zkumavce, případně Ehrlenmayerově baňce nebo jiné nádobě. b. Šikmý agar pevné médium ve zkumavce, která byla ponechána v šikmé poloze při tuhnuti. Výhodou oproti pevným médiím na Petriho miskách je snadnější transport a skladování. c. Hluboký agar pevné médium ve zkumavce, které tuhne při svislé poloze zkumavky. Používá se pro růst mikroaerofilníchbakterií vyžadujících méně kyslíku. Polotuhé hluboké agary obsahují 0,5-0,7% agaru a užívají se ke stanovení pohyblivosti bakterií (pohyblivé bakterie se pohybují směrem od místa inokulace). d. Petriho miska (plotna) pevné médium v Petriho misce. Vhodné pro zhodnocení čistoty kultury, izolaci čistých kultur, počítání mikroorganismů atd. Přenos a inokulace se provádějí pomocí sterilní bakteriologické kličky nebo očkovací jehly. V případě přenosu z tekutých médií používáme sterilní pipety.

15 Všechna média jsou před použitím sterilizována, obvykle autoklávováním. Nádoby obsahující kultivační média by neměly být otevřeny do doby než s nimi pracujeme a i potom by neměly být ponechány otevřené. Živná média se sterilizují autoklávováním a to buď po rozdělení do vhodných nádob (zkumavky, baňky) nebo se sterilizují ve větším objemu a pote se plní za sterilních podmínek do předem sterilizovaných nádob. Roztoky, které není možné zahřívat (např. cukry, antibiotika) se sterilizují filtrací přes membránové filtry o velikosti pórů 0,2 mm (do sterilní nádoby) a přidávají se k médiu těsně před použitím. Některá média se složkami citlivými na teplo je možno autoklávovat při 115 C. Tato teplota je dostačující pro jejich sterilizaci, protože tepelně odolné bakteriální endospory nejsou v kultivačních médiích obvykle přítomny. Jakmile jsou živná média sterilizována, mohou byt inokulována (naočkována) a inkubována za podmínek podporujících mikrobiální růst.

16 Kultivace anaerobních a kapnofilních druhů bakterií Standardní média, úprava atmosféry

17 Očkování mikroorganismů Kolonie je populace buněk, která vzniká z jedné buňky. Mnohé druhy bakterií rostou jako stejně vyhlížející kolonie. Různě vypadající kolonie jsou obvykle jiné druhy. Kolonie umožňují zhodnocení čistoty kultury, výskyt více než jednoho typu kolonie svědčí o kontaminaci kultury. Mikrobiální růst se v tekutých médiích projeví zakalením. Prvním krokem kultivace mikroorganismů je jejich přenesení z odebraného vzorku nebo dříve vytvořené kultury do čerstvého živného prostředí. Tomuto přenosu říkáme očkování (inokulace). Očkování musí být provedeno tak, aby během přenosu nedošlo k zavedení nechtěných mikroorganismů neboli kontaminaci ze vzduchu, rukou, dýchacích cest nebo pracovní plochy. Při očkování se užívá tzv. aseptická technika, což je sled kroků používaných k zabránění kontaminace sterilních předmětů nebo mikrobialních kultur během manipulace.

18

19 A. Očkování bakteriologickou kličkou - tekuté médium a. Očkovací kličku držte v jedné ruce a zkumavku s bakteriální kulturou v druhé ruce. Sterilizujte kličku důkladným vyžíháním v nesvítivé časti plamene (klička se rozžhaví do ruda). Kličku nechejte vychladnout (asi 30s). b. Malíkem ruky, která drží kličku, sejměte ze zkumavky víčko. (V případě použití zkumavek se šroubovacím víčkem je vhodné víčko předem mírně povolit). Víčko nepokládejte na podložku, ale stále ho držte. c. Zkumavku mírně nakloňte a ožehněte její hrdlo v plameni. Ponořte sterilní kličku do bakteriální kultury a do očka naberte suspenzi. d. Kličku vytáhněte ven, ožehněte hrdlo zkumavky a vraťte na ni víčko. Zkumavku umístěte do stojánku. Kličku stále držíte v ruce. e. Vezměte do ruky zkumavku se sterilním bujónem, odstraňte víčko a ožehněte hrdlo. Ponořte kličku s odebranou kulturou do bujónu a potom ji ze zkumavky vytáhněte. Ožehněte hrdlo zkumavky a vraťte víčko zpět. Vyžíhejte kličku

20

21 B. Očkování bakteriologickou kličkou - šikmý agar Postupujte obdobně jako u očkování bujónu, na šikmý agar očkujte jemným pohybem plochou očka kličky po povrchu agaru směrem ode dna nahoru, tak aby nedošlo k narušení agaru. Po naočkování zkumavku ožehněte, uzavřete víčkem a postavte do stojánku. Vyžíhejte kličku.

22 C. Očkování bakteriologickou kličkou - agar v Petriho misce Mírně odklopte víčko, vsuňte dovnitř kličku s odebranou kulturou a lehkým pohybem kreslete po povrchu agaru (čáry nebo vlnovku) plochou očka kličky. Vytáhněte kličku, zavřete víčko a kličku vyžíhejte.

23 D. Očkování ježkem -bujón v mikrotitrační destičce Suspenzi bakterií nalijte do sterilní vaničky, sterilní hroty ježka namočte do suspenze a naočkujte sterilní tekutou půdu v připravené mikrotitrační destičce (případně s ředící řadou antibiotik). Uzavřete víčkem. Ježka odložte do připravené dezinfekce.

24 E. Očkování do hlubokého agaru očkovací jehlou Kulturu odeberte očkovací jehlou. Vezměte do ruky zkumavku se sterilním masopeptonovým agarem, odstraňte víčko (stále držte v ruce s jehlou, neodkládat!) a ožehněte hrdlo zkumavky. Očkujte hluboký agar zapíchnutím jehly do středu agaru. Jehlu opatrně vytáhněte, tak že jí pohybujete ve stejné dráze jako při vpichu. Ožehněte hrdlo zkumavky a vraťte víčko zpět. Zkumavku vraťte do stojánku. Vyžíhejte jehlu.

25 F. Očkování suspenze pipetou Mírně odklopte víčko, vsuňte dovnitř pipetu s odebranou kulturou a suspenzi kápněte na povrch agaru, rozetřete skleněnou hokejkou. Skleněnou pipetu dezinfikujte, plastovou špičku mikropipety vyhoďte do speciálního odpadu.

26 Úkol č. 1. Křížový roztěr Pomůcky: Petriho misky s MPA, Bakteriologická klička, kahan, kultura bakterií Postup: Ze suspenze mikrobů ve fyziologickém roztoku nebo přímo z vyrostlé kolonie na agaru odebereme bakteriologickou kličkou část populace a rozetřeme do oválu nebo několika vodorovných čar po povrchu agarové plotny. Kličku vyžíháme a po vychladnutí přiložíme na konec rozetřených čar a znovu rozetřeme do několika čar. Tento postup opakujeme několikrát a zakončíme vlnitou čarou. Kultivujeme v inkubátoru připříslušné teplotě.

27 Mikroskopický průkaz bakterií Nativní preparát -pozorujeme buňky živé nebo obarvené Fixace a barvení bakterií - rychlé, šetrné usmrcení bakterií (např. v plameni) Barvení podle Grama -krystalová violeť, Lugolův roztok,safranin Barvení acidorezistentních b. dle Ziehl-Neelsena -karbolfuchsin, kyselý alkohol, malachitová zeleň Znázornění bakteriálních pouzder Burriho metoda -negativní znázornění tuší, karbolfuchsin Barvení bakteriálních spor dle Wirtze a Conklina -malachitová zeleň, karbolfuchsin nebo safranin

28 Postup při identifikace neznámého vzorku mikroorganismů 1/ Rutinní diagnostika laboratoř se zkušenými pracovníky -vytypování podezřelých kolonií po hodnocení morfologie na základních a selektivně diagnostických agarech, zaměřeno na potvrzení nebo vyloučení přítomnosti patogenních bakterií Např. diagnostika salmonel - vytypování podezřelých kolonií na selektivně diagnostickém agaru (XLD agar) a ty se konfirmují několika testy (pozitivní lyzindekarboxylasa, negativní tvorba ureasy a β-galaktozidasy), 2/ Využití sady komerčních testů (např. API) k identifikaci podezřelých kolonií 3/ Postupná identifikace krok za krokem -po hodnocení morfologie kolonií na agarových médiích barvení podle Grama nebo jiný diagnostický barvící postup, následuje posouzení základních fyziologických vlastností a enzymatické aktivity rychlými testy (např. OF test, pohyblivost, tvorba katalasy a oxidasy). Na základě získaných výsledků se volí další sestavy testů a to jak komerční sestavy, tak i další doplňkové testy

29 Úkol č. 2. Barvení bakterií karbolfuchsinem Cíl: barvením rozlišit málo viditelné bakterie z nativního preparátu Pomůcky: Odmaštěné podložní sklo, agarová miska s koloniemi bakterií, bakteriologická klička, voda, Ziehlův karbolfuchsin, lihový kahan, imerzní olej a objektiv. Provedení: Na odmaštěné podložní sklíčko kápneme kapku vody a do ní ožehnutou kličkou přeneseme malé množství bakteriální kultury a promícháme. Suspenzi kličkou rozetřeme na sklíčku tak, aby vznikl souvislý povlak. Necháme zaschnout na vzduchu a provedeme fixaci teplem /krátce 3 x protáhneme plamenem hořáku/. Bakterie se usmrtí a přichytí ke sklíčku, Nespálit!! Fixovaný nátěr barvíme ponořením do skleněné nádobky s barvivem asi 10s. Potom barvivo opláchneme vodou, preparát necháme zaschnout a pozorujeme olejovou imerzí, zvětšení 1000x. Výsledek: Jednotlivé bakterie zakreslíme do protokolu

30 Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisisae Bacillus subtilis

31 Ziehl-Neelsenovo barvení Zeihl-Neelsenovo barvení je metoda, jež se používá k průkazu tzv. acidorezistentních bakterií, konkrétně mykobakterií a nokardií a některých aktinomycet. Metodu objevili a popsali Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen. Jedná se o jednu z nejpoužívanějších metod diagnostiky tuberkulózy. Princip barvení Metoda je založena na principu, že acidorezistetní bakterie mají schopnost příjímat zahřátá barviva (karbolfuchsin), která se udrží ve stěně i po následném odbarvení kyselým alkoholem. Postup Preparát fixovaný nad plamenem se přelije koncentrovaným karbolfuchsinem. Opláchne se vodou. Preparát se odbarví kyselým alkoholem (1% HCl v 70% etanolu), dokud neodtéká s preparátu čirý alkohol. Opláchne se vodou a dobarví se buď metylenovou modří nebo malachitovou zelení. Acidorezistentní bakterie se jeví po výsledném barvení červeně (až růžově) na modrém (v případě metylenové modři) nebo zeleném pozadí (v případě malachitové zeleně) (viz obrázek).

32 Mycobacterium tuberculosis

33 Úkol č. 3 Negativní barvení Cíl: mikroskopické stanovení pouzder a slizů bakterií Pomůcky: odmaštěná podložní skla, černá tuš, bakteriologická klička, sporulující kultura bakterie Bacillus atrophaeus Provedení : Na odmaštěné podložní sklo kápneme malé množství tuše zředěné destilovanou vodou 1:2. V této kapce dobře rozmícháme malé množství bakterií. Hranou dalšího podložního skla rozetřeme suspenzi po celé ploše a necháme volně na vzduchu zaschnout. NEFIXUJEME! Pozorujeme pod imerzí při zvětšení 1000x Výsledek: zapíšeme a zakreslíme do protokolu

34 Spirillum volutans Negativní barvení (Burriho metoda)

35 Bacillus atrophaeus Negativní barvení (Burriho metoda)

36 CVIČENÍ Č. 10 Vyhodnocení minulého cvičení křížový roztěr BAKTERIE - PŮVODCI MLÉČNÉHO KVAŠENÍ

37 Bakterie mléčného kvašení mléčné kvašení =enzymatická přeměna sacharidů na kyselinu mléčnou (a současně další produkty jako kyseliny máselná, propionová, octová, aceton,ethanol, oxid uhličitý aj.) vyskytují se volně vpřírodě (např. odpadní vody,ovoce aovocné šťávy) součást produktů potravinářského průmyslu mléčné aobilné výrobky, maso arybí výrobky,pivo, víno, nakládaná zelenina, kysané zelí, kynuté těsto, slad adalší siláž složka přirozené mikroflóry v ústech, intestinálním traktu a vagíně mnohých živočichů včetně člověka základním tvarem mléčných bakterií je tyčinka, která může být různě deformovaná vzávislosti na rodu adruhu bakterie

38 Mléčné kvašení významný proces potravinářské biotechnologie Homofermentativní kvašení probíhá za vzniku pouze kyseliny mléčné C 6 H 12 O 6 CH 3 CHOH COOH Heterofermentativní kvašení - kromě k. mléčné vznikají i vedlejší produkty C 6 H 12 O 6 CH 3 CHOH COOH + CH 3 COOH + C 2 H 5 OH + CO 2 + H 2 Mléčné bakterie na základě enzymatického vybavení rozděleny do tří skupin: 1) Obligátní homofermentativní bakterie 2) Obligátní heterofermentativní bakterie 3) Fakultativní homofermentativní bakterie

39 Čeleď Lactobacillaceae taxonomickézařazení: doménabacteria, kmen Firmicutes,třída Bacilli, řád Lactobacillales zahrnuje v současnosti tři rody klasických bakterií mléčného kvašení: Lactobacillus, Paralactobacillus, Pediococcus tato čeleď byla na základě sekvenace genomu (16S rdna) vyčleněna ze skupinygrampozitivních bakterií snízkým procentuálním obsahem G+C pravidelné, nesporulující, G+ tyčinky nebo koky.patří sem nepigmentující, mezofilní, chemoorganotrofní druhy, které rostou pouze na kompletním médiu náročné na výživu vedle sacharidů jako zdroj energie auhlíku vyžadují nukleotidy,aminokyseliny,vitamíny ajiné organické sloučeniny některé heterotrofní laktobacily se vyskytují jako nežádoucí kontaminace ve vinařství, pivovarnictví, drožďařství apřizpracování masných výrobků

40 Lactobacillus plantarum Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii Pediococcus pentosaceus Pediococus acidilactici

41 Do rodu Lactobacillus jsou řazeny druhy: Lactobacillusacidophilus Lactobacillusbrevis Lactobacilluscasei subsp. casei Lactobacillusdelbrueckii subsp. bulgaricus Lactobacillusdelbrueckii subsp. lactis (Lactobacilluslactis) Lactobacillushelveticus Lactobacillusplantarum Buňky mají tvar pravidelných tyčinek, občas také koků. Vyskytují se jednotlivě ivřetízcích, někdy tvoří vláknité formy. Jsou G+, nesporulující, fakultativně anaerobní,některé mikroaerofilní Lactobacillus acidophilus

42 Čeleď Streptococcaceae zahrnuje rody Streptococcus, Lactococcus a Lactovum patří sem patogenní, saprofytické i biotechnologicky využívané druhy buňky jsou kulovité nebo oválné, vyskytují se po dvou nebo v řetízcích rozmanité délky. Jsou grampozitivní, většinou fakultativně anaerobní, nepohyblivé a netvoří endospory v mlékařském průmyslu jsou využívány: Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (syn. S. thermophilus), Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetilactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris Streptococcussalivarius subsp. thermophilus

43 Lactococcus lactis Lactococcus lactis subsp. cremoris

44 Čeleď Bifidobacteriaceae taxonomické zařazení: třída Actinobacteria, podtřída Actinobacteridae, řád Bifidobacteriales bifidobakterie se od ostatních bakterií mléčného kvašení se liší tím, že nefermentují cukry glykolýzou ani hexózamonofosfátovou cestou. Vedle kys. mléčné aoctové produkují vitamíny jako thiamin alaktoflavin. přirozená součást střevní mikroflóry savců, prostřednictvím svých metabolitů se podílejí na potlačení nežádoucích mikroorganismů v zažívacímtraktu, čehož se využívá přiléčení zažívacích potíží. součást mlékárenských výrobků na bázi jogurtů, nejčastěji zástupci r. Bifidobacterium: B. animalis (syn. B. lactis) součást trávicího traktu, Bifidobacteriumbifidum nachází se zejména vtlustém střevě avpochvě

45 Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium lactis

46 Kysané mléčné výrobky kysané mléčné výrobky (též fermentované mléčné výrobky) je soubor všech mléčných produktů připravených z mléka za přídavku kysacích kultur neboli fermentujících bakterií. Nejčastěji se používají bakterie rodu Lactobacillus, Bifidobacterium, Lactococcus. Mezi kysané mléčné výrobky patří jogurty, kysaná, acidofilní nebo jogurtová mléka, kysaná smetana. kysané mléčné výrobky -jemná sraženina mléčných bílkovin -delší trvanlivost, rychlá stravitelnost -kysací kultury ze sterilního mléka a čistých kultur -anaerobní přeměna laktózy na k. mléčnou, ph Rozdělení dle mikrobiálních druhů: -mezofilní bakterie mléčného kvašení (smetanový zákys, podmáslí...) -termofilní bakterie mléčného kvašení (jogurt, acidofilní mléko...) -bakterie mléčného kvašení a kvasinky (kefír, kumys...) bakterie mléčného kvašení se využívají také v průmyslu masném, tukovém, konzervárenském a pekárenském

47 Monokultury -v mlékárenské výrobě obsahují jeden nebo několik kmenů pouze jednoho druhu mikroorganismu Směsné bakteriální kultury -obsahují více druhů a kmenů bakterií Směsné kultury bakteriální a kvasinkové -obsahují více druhů a kmenů bakterií i kvasinek zkvašujících laktózu Některé monokultury jsou využívány k sestavování směsných kultur. Tyto směsné kultury se pak většinou nazývají podle výrobku, k jehož výrobě slouží kultura jogurtová (Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, L. acidophilus, Streptococcus salivarius ssp. thermophilus, Bifidobacterium bifidum) kefírová (Lactococcus lactis ssp. lactis, L. lactis ssp. cremoris, Lactobacillus casei, Candida kefir) smetanová (Lactococcus lactis ssp. cremoris, L. lactis ssp. lactis biovar diacetilactis, Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris)

48 Probiotika bakterie převážně mléčného kvašení s pozitivními účinky na organismus (naopak ne všechny mléčné bakterie však mají probiotické vlastnosti) Kriteria charakterizující MO s probiotickými vlastnostmi: -humánního (lidského) původu -nepatogenní -neničí se v kyselém prostředí a v přítomnosti žluči (nesmí být během průchodu zažívacím traktem zničeny nebo oslabeny) -neničí se během výrobního procesu a zůstávají životaschopné po celou dobu trvanlivosti potraviny -prokázán jejich pozitivní vliv na zdravotní stav Příklad prokázaných účinků probiotik: -snižují účinek některých karcinogenních mikroorganizmů -zvyšují odolnost vůči průniku infekcí (např. proti průjmovým onemocněním) -posilují intestinální mikroflóru při tlumení alergických reakcí -zlepšují kvalitu života pacientů se zánětlivým onemocněním střev

49 ÚKOL Č. 1. Bakterie jako původci mléčného kvašení Cíl úkolu: Zaznamenat výskyt bakterií mléčného kvašení Pomůcky: Kysané mléčné výrobky/podmáslí, kyška /, jogurt, zředěný karbolfuchsin, Pasteurova pipeta, bakteriologická klička, kahan, odmaštěná podložní skla, imerzní objektiv a olej Provedení: Na odmaštěné podložní sklo přeneseme kapku mléčného výrobku /podmáslí, kyška /, nebo vyžíhanou bakteriologickou kličkou malé množství jogurtu a rozetřeme po povrchu sklíčka. Preparát necháme zaschnout, opatrně fixujeme nad plamenem a barvíme 5 minut zředěným karbolfuchsinem. Barvivo slejeme, opláchneme vodou a po osušení na vzduchu prohlížíme imerzním objektivem. Výsledek: Zaznamenáme v podobě obrázku do protokolu.

50

51 STANOVENÍ CITLIVOSTI MIKROORGANISMŮ K ANTIBIOTIKŮM

52 ÚKOL Č. 2. Stanovení účinnosti antibiotik difuzní disková metoda Cíl úkolu: Stanovení citlivosti/rezistence bakterií k vybraným antibiotikům terčíkovou metodou, určení účinného antibiotika Pomůcky: Agarové plotny s MPA čerstvě naočkované různými druhy nepatogenních bakterií /možno použít i narostlé bakteriální kultury z minulého cvičení /, kotoučky filtračního papíru Sensi-La-Dish (nasyceny antibiotiky dané koncentrace), sterilní MPA, dávkovač, sterilní hokejka, sterilní pinzety Provedení: Povrch agarové plotny MPA naočkujeme suspenzí bakteriálního kmene /např. S. aureus, E. coli, B. atrophaeus/ a položíme barevné kotoučky Sensi disků v pravidelných vzdálenostech do kruhu. Petriho misku obrátíme dnem vzhůru a inkubujeme 24 h při teplotě 37 C. Výsledek: Odečítáme velikost inhibiční zóny u každého z použitých antibiotik (měření průměru inhibičních zón ve dvou na sobě kolmých směrech, průměrnou hodnotu zapíšeme do tabulky) a stanovíme nejúčinnější antibiotikum.

53

54

55 ÚKOL Č. 3. Stanovení účinnosti přírodních antibiotik česnek a cibule Princip: Česnek obsahuje ALLIIN (S-allyl-L-cystein sulfoxid) Alliin je prekurzorem fytoanticipinu s názvemallicin (diallylthiosulfinát), který vzniká po porušení pletiv působením enzymu alliinasy Pomůcky: sterilní MPA, bakteriální kultury na pevném nebo v tekutém médiu, klička nebo dávkovač, sterilní hokejka, sterilní pinzety, česnek (cibule) Provedení: MPA očkujeme známými postupy /Micrococcus luteus, E. coli, S. aureus/, malé množství česnekového/cibulovéhoextraktu naneseme na svrchní víčko Petriho misky (allicin se odpařuje), přiklopíme naočkovaným agarem a dnem vzhůru inkubujeme 24 h při teplotě 37 C. Výsledek: Odečítáme průměr inhibiční zóny známým způsobem a srovnáme obě zeleniny

56 CVIČENÍ č. 11. Stanovení citlivosti mikroorganismů na antibiotika Vyhodnocení experimentu : 1. Měříme velikost inhibiční zóny u jednotlivých disků napuštěných antibiotiky vždy ve dvou na sebe kolmých rovinách zprůměrovat pro každé AB 2008 B. Mieslerová, M. Sedlářová (KB PřF UP v Olomouci)

57

58 Vyhodnocení experimentu : 2. Zhodnotíme, zda látky v česneku a cibuli ovlivňují růst mikroorganismů 2008 B. Mieslerová, M. Sedlářová (KB PřF UP v Olomouci)

59 2 ALLIIN S-allyl-L-cystein sulfoxid alliinasa H 2 O ALLICIN diallylthiosulfonát + 2 pyruvát + 2 NH 3

60 Allicin fytoanticipin s baktericidními a fungicidními účinky Curtis et al. (2004) PMPP 65: 79-89

61 ANTIBIOTIKA Antibiotika jsou látky, které inhibují růst (množení) mikroorganizmů (navozují bakteriostázu), nebo je usmrcují (působí baktericidně). Jsou produkovány bakteriemi nebo houbami. Účinné jsou ijejich (semi) syntetické deriváty. Ze širšího hlediska se k nim řadí i jiné antimikrobiální látky, tj. chemoterapeutika (syntetické substance) sulfonamidy achinolony. Rozdělení na bakteriostatické a baktericidní není zcela přesné, protože mnoho bakteriostatických antibiotik působí ve vyšších koncentracích rovněž baktericidně (chloramfenikol u meningokokové infekce). Naopak některá baktericidní antibiotika neusmrcují určité bakterie ani ve vysokých koncentracích(penicilin Genterokoky). Jiným hlediskem je zařazení antibiotik do skupin podle farmakoterapeutického účinku: protistafylokoková, protipseudomonádová, antianaerobní,protituberkulozní aj. Vsoučasnosti je známo přes 6000 látek santibiotickým účinkem, ale jen asi 70 znich našlo uplatnění vhumánní aveterinární medicíně, ostatní mají příliš výrazné nežádoucí účinky nebo jsou pro pacienta toxické. Antibiotika působí především proti bakteriím, některá jsou však účinná také proti houbám a parazitickým prvokům. Z chemického hlediska jsou antibiotika různorodou skupinou látek, většinou však mají molekulovou hmotnost menší než 2000 daltonů B. Mieslerová, M. Sedlářová (KB PřF UP v Olomouci)

62 Historie Objev antibiotik spolu saplikací hygienických praktik ulékařů (např. mytí rukou apoužití sterilizovaných nástrojů) je jeden znejdůležitějších objevů v současné medicíně. Dnes banální zranění, jako je škrábnutí, ssebou dříve nesla riziko infekce asmrti. Již 2500 let př.n. l. používali včíně kléčbě infekcí obklady zplesnivého sojového mléka. První skutečně účinné objevené antibiotikum pocházelo z plísně. Francouzský doktor Ernest Duchesne zaznamenal už v roce 1896 fakt, že určité plísně rodu štětičkovec (Penicillium) ničí bakterie. Duchesne a jeho výzkum však zůstal zapomenutpo celou generaci. Alexander Fleming během svého výzkumu antibakteriálního působení lysozymu kultivoval baktérie na agarových plotnách a jedna z nich byla napadena plísní druhu Penicillium notatum. Fleming zaznamenal čistou zónu kolem plísňového podhoubí a pochopil, že plíseň vylučuje něco, co růst bakterií zastavilo. Ikdyž nebyl schopen sloučeninu izolovat, svůj objev vroce 1929 popsal ve vědecké literatuře. Protože plíseň byla rodu Penicillium, nazval tuto sloučeninupenicilin. Zároveň ve 30. letech 20. století německý vědec Gerhard Domagk zkoumal antibakteriální vlastnosti některých barviv. Jedním z nich byl sulfonamid zvaný prontosil B. Mieslerová, M. Sedlářová (KB PřF UP v Olomouci)

63

64 Použití Antibiotika se používají především kléčbě infekčních stavů, někdy však též preventivně (tzv.antibiotickáprofylaxe). V současnosti je však velkým problémem chybné použití antibiotik -zvláště pak použití nevhodného antibiotika (proti rezistetnímu původci) nebo předepsání antibiotik přiléčbě virových onemocnění, jako je rýma nebo chřipka. Při nedodržení celé předepsané dávky antibiotik, obvykle pro pacientův subjektivní pocit zlepšení, nejsou patogenní mikroorganismy zcela zničeny. Kromě selhání léčby vede toto chování k rozvoji antibiotické rezistence u neúplně zahubených populací bakterií. Antibiotika se uplatňují ivjiných oblastech, než je medicína. Podávání malých množství antibiotik hospodářským zvířatům zvyšuje jejich přírůstky. Také při kultivacích mikroorganismů v biotechnologických laboratořích se používají antibiotika, a to v tkáňových kulturách či růstových mediích za účelem potlačení nežádoucí bakteriální kontaminace (v selektivních médiích). Často se používá kontaminace několika antibiotik a antimykotik, aby došlo k pokrytí celéhospektra mikroorganismů B. Mieslerová, M. Sedlářová (KB PřF UP v Olomouci)

65 Mechanismus účinku Nejdůležitější vlastností antibiotik je selektivita jejich účinku, tzn. že zasahují struktury, které jsou specifické pro mikroorganismy a pacienta víceméně nepoškozují. Rozdělení antibiotik podle mechanizmu účinku Inhibice syntézy buněčné stěny Porucha funkce cytoplazmatické membrány Inhibice syntézy bílkovin Inhibice syntézy nukleových kyselin Peniciliny, cefalosporiny, monobaktamy, karbapenemy, vankomycin, bacitracin Amfotericin B, azoly, polyeny, polymyxiny Aminoglykozidy, chloramfenikol, makrolidy, tetracykliny, linkomycin Sulfonamidy, trimetoprim, chinolony, rifampicin, pyrimetamin 2008 B. Mieslerová, M. Sedlářová (KB PřF UP v Olomouci)

66 1) Inhibice syntézy buněčné stěny Bakterie, na rozdíl od živočišných buněk, mají cytoplazmatickou membránu krytou buněčnou stěnou, která se u jednotlivých kmenů liší svou stavbou, tloušťkou ikvalitou. Stavba buněčné stěny rozhoduje o způsobu barvení podle Grama a rozlišujepak mikroorganizmygrampozitivní agramnegativní Buněčná stěna je nezbytně nutná pro přežití mikroba. Udržuje jeho tvar a zabezpečuje optimální nitrobuněčné prostředí (vysoký intracelulární tlak). Její poškození (např. lysolem, detergenty) nebo inhibice tvorby některé z komponent vede kporuše její funkce, až klýze buňky.toje možné zejména ugrampozitivů. 2) Porucha funkce cytoplazmatické membrány Schopnost porušit integritu cytoplazmatické membrány bakterií (gramnegativů vlivem polymyxinů) nebo hub (vlivem polyenů, azolů, amfotericinu B) vede k úniku endogenních látek extracelulárně a knáslednémuzániku mikroorganizmu B. Mieslerová, M. Sedlářová (KB PřF UP v Olomouci)

67 3) Inhibice syntézy bílkovin Selektivita účinku je dána inhibicí syntézy bílkovin bakteriálními 70S ribozómy. Antibiotika inhibující syntézu bílkovin ovlivňují proces elongace peptidového řetězce různými mechanizmy 4) Inhibice syntézy nukleových kyselin Touto cestou působí chinolony, aktinomycin, mitomycin (DNA), rifampicin (mrna), trimetoprim, sulfonamidy (k. listová). Významnou vlastností některých antibiotik (aminoglykozidů a betalaktamů) je postantibiotický efekt (PAE). Tím se rozumí doba, po kterou přetrvává zástava množení bakterií za podmínek, kdy bakterie už nejsou vystaveny účinkům antibiotika (není měřitelná koncentrace antibiotika v tělesných tekutinách či tkáních). Podstata tohoto jevu není dosud spolehlivě vysvětlena B. Mieslerová, M. Sedlářová (KB PřF UP v Olomouci)

68

69 Citlivost bakterií k antimikrobiálním látkám Specifická, úzkospektrá antibiotika zasahují buď gramnegativní nebo grampozitivní, nebo dokonce jen některé bakteriální rody. Naproti tomu širokospektráantibiotika ničíširokéspektrummikroorganismů, častovčetně symbiotické mikroflóry na povrchu sliznic. Účinnost jednotlivých antibiotik však závisí také na umístění infekce aschopnosti pronikat danými tkáněmi až kložisku infekce. Ke správné antibiotické terapii je vhodné zjistit citlivost konkrétní patogenní bakterie kantibiotikům. Všechny bakterie totiž nejsou stejně citlivé aněkteré jsou dokonce rezistentní adané antibiotikum proti nim nepůsobí. Zjišťuje se proto tzv. minimální inhibiční koncentrace (MIC), což je koncentrace antibiotika, která zabrání růstu bakteriálních kolonií. Koncentrace, která bakterie usmrtí, se označuje jako minimální baktericidní koncentrace (MBC). Je zřejmé, že vpřípadě primárně baktericidních antibiotik se MBC rovná MIC. Vcelém průběhu terapie by vmístě infekce měla být taková koncentrace antibiotika, která odpovídá alespoň minimální inhibiční koncentraci B. Mieslerová, M. Sedlářová (KB PřF UP v Olomouci)

70 Stanovení citlivosti diskovou difúzní metodou - v okolí disku s antibiotikem nerostou žádné kolonie bakterie Staphylococcus aureus

71 Rizika antibiotické terapie jsou dána rezistencí mikroorganizmů, nežádoucími a toxickými účinky antibiotik. 1. Rezistence Rezistenceznamená odolnost mikroorganizmů vůči působení antibiotika. Rezistence primární odpovídá geneticky podmíněné necitlivosti bakterií na dané antibiotikum bez ohledu na eventuelní předchozí kontakt santibiotikem (například antibiotika, která narušují syntézu bakteriální buněčné stěny,jsou primárně neúčinná vůči mykoplasmám, které buněčnou stěnu nemají. ). Rezistence sekundární vzniká až v průběhu antibiotické terapie nebo následkem předchozího podávání antibiotika. V přítomnosti antibiotika se selektují rezistentní kmeny, které se nacházejí v každé velké bakteriální populaci. Rychlost rozvoje sekundární rezistence závisí na frekvenci mutací a na množství bakterií surčitým stupněm rezistence. Aby se nevyselektovaly rezistentní kmeny, muselo by být zničeno téměř 100 %infikujících organismů. Přežije-li malá část populace bakterií léčbu a může-li se reprodukovat, průměrná citlivost nové populace na dané antibiotikum bude mnohem menší než u původní populace, protože nová populace vyrostla z nemnohých organismů, které vydržely původní antibiotickouléčbu B. Mieslerová, M. Sedlářová (KB PřF UP v Olomouci)

72 2. Nežádoucí a toxické účinky Nežádoucí účinky se objevují přiobvyklých dávkách adoporučovaných farmakoterapeutických koncentracíchvplazmě. Toxické účinky vznikají po vysokých dávkách, vlivem vysokých plazmatických koncentrací, eventuálně při vyšší citlivosti hostitele. Toxické účinky bývají klinicky charakteristické, závislé na dávce, sdočasnými nebo trvalými následky.většinou se jim dá předejít nebo jejich klinické projevy zmírnit. Riziko je přijatelné u život ohrožujících onemocnění, není-li dostupné antibiotikum, které by poskytlo přisrovnatelném účinku záruku vyšší bezpečnosti vléčbě B. Mieslerová, M. Sedlářová (KB PřF UP v Olomouci)

73 Antibiotická rezistence se stala vážným problémem v rozvojových i vyspělých zemích. Vněkterých nemocnicích je míra antibiotikové rezistence mezi mikroorganismy natolik vysoká, že běžná antibiotika jsou pro léčbu infekcí prakticky nepoužitelná. To vede k častějšímu použití nových a dražších sloučenin, což vzápětí vede kdalšímu vzniku rezistence na tyto nové léky a k nekončící snaze vyvinout nová a odlišná antibiotika pro udržení předstihu před infekcemi. Kupříkladu Staphylococcus aureus, který byl úspěšně ničen penicilinem ještě ve 40. a50. létech 20. století, je dnes z90 %rezistentní na penicilin. Pro účinnou léčbu tak zbyl jen úzký výběr léků, jako je např. vancomycin. Situaci zhoršuje fakt, že geny kódující antibiotickou rezistenci mohou být přenášeny mezi bakteriemi (např. konjugací). Konjugující bakterie, které vůbec nebyly vystaveny působení antibiotik, pak získávají rezistenci od těch, co ji mají. Problém antibiotické rezistence narůstá, pokud jsou antibiotika použita na léčbu viróz (na něžneúčinkují), akdyž jsou široce používána preventivně (např. vkrmivech pro hospodářská zvířata). Těmito způsoby může rezistenci získat velké množství bakterií, znichž následně vzniknou nové odolné generace B. Mieslerová, M. Sedlářová (KB PřF UP v Olomouci)