UPLATNĚNÁ CERTIFIKOVANÁ METODIKA. č. 99/2018

Transkript

1

2 UPLATNĚNÁ CERTIFIKOVANÁ METODIKA č. 99/2018 Kvalitativní detekce Listeria monocytogenes pomocí metody MOL-PCR Autoři Mgr. Nikol Reslová, Mgr. Veronika Huvarová, Mgr. Petr Králík, Ph.D. Uvedená certifikovaná metodika je výstupem projektu Bezpečnostního výzkumu MV ČR VI Zveřejňování této metodiky či jejích částí podléhá omezením vyplývajících z požadavků MV a MO ČR. Osvědčení o uplatnění certifikované metodiky: Příloha č. 20 k čj. MO / Vydalo: Agentura vojenského zdravotnictví AČR VÚ 6848, Hradec Králové, 2018 ISBN

3 Oponenti certifikované metodiky: Mgr. Martina Grochová Státní ústav jaderné, chemické a biologické ochrany, v.v.i. Prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D. Mendelova univerzita v Brně

4 PŘEDMLUVA Listeria monocytogenes (LM) je grampozitivní, nesporulující, tyčinkovitá, všudypřítomná bakterie vyskytující se v půdě, vodě a potravinách (Sauders et al., 2012). Osídluje trávicí trakt lidí i zvířat. Je to významný potravinový patogen kontaminující převážně mléko a mléčné výrobky, čerstvou zeleninu nebo syrové maso, ale také krmiva. LM je odolná vůči nízkým teplotám a množí se i při 4 C (Farber and Peterkin, 1991). Může tak docházet k primární kontaminaci syrových potravin nebo k sekundární kontaminace v průběhu vaření a uchování hotových pokrmů. Onemocnění se zoonotickým potenciálem způsobené touto bakterií se nazývá listerióza (McLauchlin et al., 2004). U zdravých lidí, stejně jako u domácích zvířat (zejména skotu a ovcí), zůstává toto onemocnění neodhaleno, většinou totiž probíhá bezpříznakově. Infekční dávka je různá, při dostatečné funkci imunitního systému organismu nemusí dojít k onemocnění (asymptomatičtí nosiči), eventuálně se projevuje pouze mírnými příznaky (nevolnost, zvracení, průjem), vyvolanými LM množícími se v buňkách střevní sliznice, ale nepronikajícími dále do organismu. Je-li však organismus oslabený např. stářím, nemocí, nebo v průběhu těhotenství, může docházet k šíření listérií lymfatickými a krevními cévami do tkání. To se projevuje meningitidami, dochází k infekci placenty nebo plodových obalů a může dojít k septikémii, která vede k smrtelnému poškození plodu nebo může způsobit potrat. Předpokládá se, že zhruba u 1-10 % lidské populace tvoří LM součást střevní mikroflóry, aniž by vyvolala klinické onemocnění (Goulet et al., 2006; Ramaswamy et al., 2007). Infikované osoby však vylučují bakterie ve výkalech po dobu až několika měsíců. Většina případů lidské listeriózy se tak jeví jako sporadická a zdroj a cesta infekce jsou obvykle neznámé; avšak souvislost LM s několika rozsáhlými ohnisky výskytu onemocnění po požití kontaminovaných potravin naznačuje, že primárním zdrojem bakterie mohou být právě kontaminované potraviny (Farber and Peterkin, 1991).

5 I) CÍL METODIKY Předkládaná metodika nabízí rychlý a standardizovaný postup detekce přítomnosti bakterie Listeria monocytogenes, respektive její nukleové kyseliny (DNA), ve vzorku. Tato metodika může být součástí komplexní multiplexní detekce patogenů, která umožňuje detekovat v jedné reakci až několik desítek různých patogenů, přičemž jako templátová DNA může být použita izolovaná DNA různého původu, např. z tkání a trusu zvířat, z prostředí, vody nebo surovin a potravin živočišného i rostlinného původu určených pro lidskou spotřebu. Metodika je využitelná jako vhodný komplexní nástroj pro skríninkové testy na široké spektrum patogenů. II) VLASTNÍ POPIS METODIKY 1 Popis MOL-PCR systému Průkaz přítomnosti LM je založen na detekci specifické sekvence vyskytující se v genomu tohoto druhu. Jedná se o multiplexní MOL-PCR systém (Reslová et al. 2018), kde detekce probíhá prostřednictvím hybridizace dvou specifických modulárních detekčních sond, neboli MOLig, bezprostředně vedle sebe k cílové sekvenci a jejich následné ligaci v jednu komplexní sekvenci; ta je amplifikována a specificky vychytána na povrch magnetických mikrosfér prostřednictvím hybridizace TAG/anti-TAG sekvencí (syntetické sekvence obsahující pouze báze T, A a G specifické pouze pro daný typ mikrosfér). Modularita MOLig (Obr. 1) spočívá v tom, že kromě cílově specifické sekvence nesou také sekvenci pro vazbu univerzálních PCR primerů a TAG sekvenci pro vazbu k anti-tagu na povrchu magnetických mikrosfér. Jednotlivé sety mikrosfér (dostupných 50 setů) se odlišují koncentrací dvou vnitřních fluoroforů, což umožňuje jejich vzájemné rozlišení a tak identifikaci specifického cíle vyvázaného na jejich povrchu. Samotné kvalitativní vyhodnocení probíhá prostřednictvím odečtení fluorescenčního signálu mikrosfér a na jejich povrchu přichycených fluorescenčně značených produktů MOL-PCR.

6 Obr. 1: Schéma průběhu MOL-PCR reakce a MAGPIX analýzy. Pho = fosfátová skupina umožňující ligaci; černě = sekvence specifická pro zachycovaný cíl; šedě = vazebná sekvence pro univerzální PCR primery; TAG = sekvence komplementární k anti-tagu na mikrosférách; červeně = fluorescenční reportér. Do každé reakce je přidána interní kontrola, která upozorní na falešně negativní výsledek v důsledku přítomnosti inhibitorů ovlivňujících průběh reakce. 1.1 Cíl gen rnc Pro detekci LM byl jako detekovaný cíl zvolen chromozomální gen rnc kódující ribonukleázu III (Toledo-Arana et al., 2009). Tento gen je součástí oblasti kódující 23S podjednotku rrna a je specifický pro detekci této bakterie (Rodríguez-Lázaro et al., 2004). MOLigo sondy pro detekci genu rnc byly testovány na ověřeném kmenu ze sbírky zoopatogenních mikroorganismů Výzkumného ústavu veterinárního lékařství v Brně: Listeria monocytogenes CAPM 5879 (sérovar 1/2b). Sekvence MOLig: Tučně = sekvence pro vazbu univerzálních PCR primerů; podtrženě = sekvence specifická pro LM; malá písmena = TAG sekvence MTAG-A027 umožňující specifickou vazbu k mikrosférám; PHO = fosfátová skupina. LM_M1: 5 - PHO-ATGTGATTTCCTCGTTCATTTACCATCTCACTTCTTACTACCGCG - 3 (45) LM_M2: 5 - ACTCGTAGGGAATAAACCGTaagatgatagttaagtgtaagttaGAGCCGCTTAGTACGTGA AAA - 3 (65) Těmito sondami je možné detekovat část genu rnc v rozsahu bp (Acc. No. CP ), délka sekvence specifické pro CJ = 46 bp. Celková délka produktu ligace detekčních sond = 110 bp. 1.2 Interní kontrola Interní kontrola (IC) je přidávána do každé reakce. Slouží nejen k odhalení falešně negativních výsledků v důsledku inhibice MOL-PCR reakce, ale také jako pozitivní kontrola. IC byla navržena tak, aby pro všechny MOL-PCR systémy mohl být použit stejný pár IC MOlig

7 a stejná sada univerzálních PCR primerů; jedná se tedy o univerzální IC. Při přípravě IC byla použita nekompetitivní syntetická sekvence založená na DNA sekvencích dvou vyhynulých druhů; konkrétně se jedná o mitochondriální DNA vakovlka tasmánského (Thylacinus cynocephalus, Acc. No. FJ ) a ptáka moa (Dinornis struthoides, Acc. No. AY ). Tato kontrolní syntetická sekvence o délce 150 bp byla převzata z Mikel et al. (2016), syntetizována de novo a klonována do plazmidu. Takto připravený konstrukt je zcela arteficiální a podobná sekvence se nevyskytuje v žádném známém živočišném, rostlinném, či bakteriálním druhu. IC je tedy možné použít pro jakýkoliv templát či matrici. IC je skladována při teplotě -20 C ± 4 C ve 2 ml zkumavkách se šroubovacím víčkem do vypotřebování. Sekvence MOLig: Tučně = sekvence pro vazbu univerzálních PCR primerů; podtrženě = sekvence specifická pro IC; malá písmena = TAG sekvence MTAG-A014 umožňující specifickou vazbu k mikrosférám; PHO = fosfátová skupina. IC_2_M1 5 - PHO- ATTAGCACAATGAATAATCATCGTCTCACTTCTTACTACCGCG- 3 (43) IC_2_M2 5 - ACTCGTAGGGAATAAACCGTattgtgaaagaaagagaagaaattTATACACACGCAATCACCA C- 3 (64) Tyto sondy jsou komplementární k úseku kontrolní syntetické sekvence o délce 43 bp. Celková délka produktu ligace detekčních sond, a tím i amplikonu = 107 bp. 1.3 Sekvence univerzálních primerů: Univerzální primery byly převzaty z publikace Thierry et al. (2013). Reverzní primer je značen fluoroforem BODIPY-TMRX, který v reakci slouží jako reportérová molekula značící výsledný produkt. uni FW: 5 CGCGGTAGTAAGAAGTGAGA 3 (20) uni REV: 5 BODIPY-TMRX - ACTCGTAGGGAATAAACCGT 3 (20)

8 Tato sada univerzálních primerů amplifikuje všechny produkty ligace. Výsledná délka amplikonu odpovídá délce jednotlivých produktů ligace (~ 110 bp). 2 Předmět a působnost Tato metodika slouží ke kvalitativní detekci LM na základě detekce vybraného genu při komplexní analýze vzorků pocházejících z trusu zvířat, prostředí a potravin pro lidskou spotřebu, prostřednictvím MOL-PCR. 3 Podstata zkoušky Multiplexní oligonukleotidová ligační polymerázová řetězová reakce (MOL-PCR) s interní kontrolou (IC). Komplexní a simultánní detekce demonstrována v multiplexu čítajícím 5 bakteriálních a 5 parazitárních systémů - Salmonella enterica, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Escherichia coli (EHEC), Taenia saginata, Trichinella spiralis, Toxoplasma gondii a Giardia intestinalis.. Kvalitativní detekce probíhá prostřednictvím odečtení fluorescenčního signálu vzorku oproti negativní kontrole. 4 Přístroje a pomůcky DNA Engine Dyad Peltier Thermal Cycler (Bio-Rad, USA) Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader (Bio-Rad, USA) Bio-Plex Manager TM MP software (Bio-Rad, USA) Bio-Plex Manager TM 6.1 software (Bio-Rad, USA) Ultrasonic Cleaning Bath (BioTech, Česká republika) Sada pipet: s rozsahem nastavitelným od µl (s chybou do 5%) s rozsahem nastavitelným od µl (s chybou do 5%) s rozsahem nastavitelným od µl (s chybou do 5%) s rozsahem nastavitelným od 5 50 µl (s chybou do 5%) s rozsahem nastavitelným od 0,5 10 µl (s chybou do 5%) Špičky s filtrem k pipetám s příslušným rozsahem Sterilní mikrozkumavky o objemu 0,2 ml x 96 se separátními víčky (Bioplastics, Nizozemsko) PCR deska s jamkami na objem 0,2 ml (Bioplastics, Nizozemsko)

9 Chladnička (do 5 C) Mrazicí box (-20 C) Centrifuga MiniSpin Vortex V-1 Plus 5 Chemikálie a roztoky 5.1 Ligáza Hifi Taq DNA Ligase a 10X Hifi Taq DNA Ligase Reaction Buffer (New England BioLabs, USA), katalogové číslo M0647 S. Ligázu s pufrem je nutné skladovat při teplotě -20 C. Za normálních podmínek stabilní do data exspirace. 5.2 Master Mix 2X EliZyme TM HS Robust MIX (Elisabeth Pharmacon, Česká republika), katalogové číslo EZ6060. Master Mix je doporučeno skladovat při teplotě -20 C a neměl by být dlouhodobě vystavován světlu. V případě skladování Master Mixu při teplotě 4 C je stabilita deklarována po dobu jednoho měsíce. Za normálních podmínek je Master Mix stabilní do data exspirace. 5.3 Voda pro MOL-PCR Pro ředění všech komponent MOL-PCR reakce se používá voda PCR H2O (Top-Bio, Česká republika), katalogové číslo P242. Skladovat při pokojové teplotě. 5.4 Ředění MOLig a PCR primerů Specifická MOLiga a univerzální PCR primery se dodávají v lyofilizovaném stavu od firmy Generi-Biotech (Česká republika). Podle návodu uvedeného výrobcem jsou na pracovišti rozpuštěny v PCR vodě tak, aby výsledná zásobní koncentrace byla 100 pmol/µl. Sondy i primery jsou evidovány a uloženy v mrazničce při teplotě cca -20 C ± 4 C. Při přípravě ligačního premixu se používá pracovní roztok o koncentraci MOLig 1 pmol/µl, jak je uvedeno v odstavci 5.5. Při přípravě PCR premixu se používá pracovní roztok o koncentraci univerzálních primerů 10 pmol/μl, jak je uvedeno v odstavci Příprava ligačního premixu Pro reprodukovatelnou kvantitativní detekci pomocí MOL-PCR je doporučeno připravit si alikvoty premixů pro 100 reakcí skládající se ze všech komponent kromě ligázy a templátové

10 DNA. Premixy se skladují při cca -20 C ± 4 C. Alikvoty premixů lze opakovaně zamrazovat a rozmrazovat maximálně však 5. Jednotlivé složky je doporučeno přidávat podle uvedeného pořadí: Složka 1 reakce 100 reakcí ( rezerva) PCR voda doplnit objem 100 doplnit objem Výsledná koncentrace 10X Hifi Taq DNA Ligase 2,5 μl 250 μl 1X Reaction Buffer MOLigo sondy LM_M1 2 0,125 µl 2 12,5 µl 5 nm každá a LM_M2 pro cíl (1 pmol/µl každá) MOLigo sondy IC_2_M1 2 0,125 µl 2 12,5 µl 5 nm každá a IC_2_M2 pro IC (1 pmol/µl každá) Směs MOLig x1 0,125 µl x1 12,5 µl 5 nm každá (1 pmol/µl každá) IC plazmid 10 4 /μl 0,1 µl 10,0 µl kopií Hifi Taq DNA Ligase 0,5 µl 50 µl DNA 2,5 µl 100 2,5 μl celkem 25 μl 2500 μl x 1 = počet dalších MOLigo sond v multiplexní reakci 5.6 Příprava PCR premixu Pro reprodukovatelnou kvalitativní detekci pomocí MOL-PCR je doporučeno připravit si alikvoty premixů pro 100 reakcí skládající se ze všech komponent kromě produktů ligace, které je vždy nutno využít čerstvé. Premixy se skladují při cca -20 C ± 4 C. Alikvoty premixů lze opakovaně zamrazovat a rozmrazovat maximálně však 5. Jednotlivé složky je doporučeno přidávat podle uvedeného pořadí: Složka 1 reakce 100 reakcí ( rezerva) PCR voda 5,25 µl 525 µl Výsledná koncentrace 2X EliZymeTM HS Robust MIX 12 μl 1200 μl 1X Primer uni FW 0,15 µl 15 µl 0,0625 μm (10 pmol/μl) Primer uni REV-BODIPY (10 pmol/μl) 0,6 µl 60 µl 0,25 μm Produkt ligace 6 µl μl

11 celkem 24 μl 2400 μl 5.7 Magnetické mikrosféry MagPlex Microspheres (12,5 x 10 6 mikrosfér/ml; Luminex Corp., USA), katalogové číslo MC100XX-01 (XX = 12-78, dle seznamu dostupných setů od firmy Luminex Corp.). Potažené mikrosféry v 1X TE pufru je nutno skladovat v chladničce při teplotě 4 C a chránit před světlem. Za normálních podmínek jsou stabilní déle než 1 rok. Před každým použitím je nutno mikrosféry řádně vortexovat a sonifikovat asi 30 s. 5.8 Roztoky pro hybridizaci Roztoky, které jsou součástí kuličkového mixu (odstavec 5.9) se připravují za použití ultračisté vody. Výsledné roztoky je třeba přefiltrovat 0,22 μm filtrem a rozalikvotovat do zkumavek o objemu 50 ml. Z důvodu předcházení kontaminací je pak vhodné používané roztoky měnit každé 3 měsíce. Příprava hybridizačních roztoků a jejich skladování: Složka Katalog. č. Výsledná Množství/250 ml ph Skladování koncentrace MES Sigma-Aldrich M2933 0,1 M 4,88 g 4,5 4 C (USA) NaCl Carl-ROTH 3957 (Německo) 5 M 73,05 g pokojová teplota 100X TE pufr SERVA (Německo) 1X 2,5 ml 8,0 pokojová teplota 5.9 Příprava kuličkového mixu Kuličkový mix se připravuje čerstvý pro konkrétní počet vzorků v reakci a ihned upotřebí k hybridizaci MOL-PCR produktů k povrchu magnetických mikrosfér; kuličkový mix se nepřipravuje a neuchovává ve formě premixu. Podle počtu MOLig v reakci (očekávaných cílů) se přidává příslušný počet specifických setů mikrosfér. Jednotlivé složky je doporučeno přidávat podle uvedeného pořadí: Složka 1 reakce 100 reakcí ( Výsledná rezerva) koncentrace 0,1 M MES 2,5 μl 250 μl 0,05 M 5 M NaCl 0,8 µl 80 µl 0,8 M Směs potažených MagPlex Microspheres mikrosfér/set mikrosfér/set

12 1X TE pufr doplnit objem 100 doplnit objem celkem 5 μl 500 μl 5.10 Příprava hybridizační reakce Hybridizační reakce se připravuje čerstvá pro konkrétní počet vzorků v reakci a ihned probíhá specifická hybridizace MOL-PCR produktů k povrchu mikrosfér; hybridizační reakce se nepřipravuje a neuchovává ve formě premixu. Jednotlivé složky je doporučeno přidávat podle uvedeného pořadí: Složka 1 reakce 100 reakcí ( rezerva) Kuličkový mix 5 μl 500 μl MOL-PCR produkt 10 µl µl celkem 15 μl 1500 μl 5.11 Analyzační pufr Roztok se připravuje za použití ultračisté vody. Výsledný roztok analyzačního pufru je třeba přefiltrovat 0,22 μm filtrem a rozalikvotovat do zkumavek o objemu 5 ml, které slouží na jedno použití. Nutno skladovat v chladničce při teplotě 4 C. Složení a příprava analyzačního pufru: Složka Katalog. č. Výsledná Množství/250 ml ph koncentrace 1 M Tris-Cl Sigma T1503 a 10 mm 2,5 ml 8,0 0,5 M EDTA Amresco E522 0,1 mm 50 μl 5 M NaCl Carl ROTH mm 4,5 ml 100% Tween 20 Alpha Diagnostic Intl 0,02 % 50 μl Inc TW ultračistá H2O Millipore 242,9 ml a = zásobní Trizma base neobsahuje Cl -, ten je doplněn během úpravy ph pomocí HCl kyseliny 5.12 Kalibrační a verifikační kity pro MAGPIX Kalibrační kit MAGPIX Calibrator Kit, RUO, 25 Uses (Luminex Corp., USA), katalogové číslo MPX-CAL-K25 a verifikační kit MAGPIX Performance Verification Kit, RUO, 25 Uses (Luminex Corp., USA), katalogové číslo MPX-PVER-K25. Oba kity je doporučeno skladovat při teplotě 4 C a chránit před světlem. Za normálních podmínek jsou kity stabilní do data exspirace. Před každým použitím je nutno všechny složky kitů řádně vortexovat a sonifikovat asi 30 s. Bio-Plex Manager TM MP software sám naznačí, kdy je třeba

13 provést kalibraci a verifikaci přístroje; kalibrace se provádí asi jednou týdně, verifikace po každém spuštění přístroje před analýzou vzorků Drive fluid MAGPIX Drive Fluid (Luminex Corp., USA), katalogové číslo MPXDF-4PK. Drive fluid je doporučeno skladovat při pokojové teplotě. Za normálních podmínek stabilní do data exspirace Roztoky pro údržbu přístroje MAGPIX Údržbové rutiny přístroje i samotná analýza vyžadují doplnění dh2o, 70% isopropanolu, 0,1 N NaOH a 15% sava do kolonek v přístroji. Roztoky se připravují za použití ultračisté vody. Výsledné roztoky se skladují při pokojové teplotě a užívají se až do úplné spotřeby. Složka Katalog. č. 100% isopropanol NaOH Savo Original PENTA (Česká republika) PENTA (Česká republika) Unilever SAVO (Nizozemsko) Výsledná koncentrace Množství/250 ml 70% 180 ml 0,1 N 0,1 g 15% 37 ml Skladování pokojová teplota pokojová teplota pokojová teplota 6 Postup zkoušky 6.1 Bezpečnostní opatření Provedení metody nevyžaduje žádné zvláštní bezpečnostní opatření. 6.2 Okolní podmínky zkoušky Provedení metody nevyžaduje kontrolu žádných limitních podmínek. 6.3 Množství vzorku Do každé jamky je napipetováno 22,5 μl ligačního premixu a 2,5 μl templátové DNA. Po ligaci se 6 μl produktu přenese k 18 μl PCR premixu. Dále je 10 μl výsledného MOL-PCR produktu přidáno k 5 μl kuličkového mixu a před samotnou analýzou je celý objem reakce navýšen 45 μl analyzačního pufru na 60 μl.

14 6.4 Slepý pokus kontrola Jako negativní kontrola (no template control, NTC) je do MOL-PCR reakce přidána PCR voda v ekvivalentním množství k templátové DNA, tedy 2,5 μl. kontrola musí být použita v každém experimentu Pozitivní kontrola Jako pozitivní kontrola slouží IC. Plazmid i MOLiga pro IC se přidávají do každého ligačního premixu a musí být použita v každém experimentu. 6.5 Replikáty Každý vzorek se analyzuje nejméně v duplikátu a připravují se alespoň dvě NTC na jeden multiplexní ligační mix. 6.6 Kalibrace měřícího prostředku před zkouškou Po spuštění přístroje je třeba vždy provést několik úkonů. Nejprve se sací jehla promyje a sonifikuje v destilované vodě (dh2o). Zkontroluje se naplnění kontejnerů pro Drive fluid a odpad (waste container). V Bio-Plex Manager TM MP softwaru se postupně navolí údržbové rutiny: Calibration and Verification (dle potřeby), Verification a Prime. Po skončení analýz se před vypnutím přístroje vždy provádí rutina Shut Down. 6.7 Provedení zkoušky Ligační protokol Přístroj: DNA Engine Dyad Peltier Thermal Cycler (Bio-Rad, California, USA) 1 cyklus Úvodní denaturace 95 C (10 min) 20 cyklů Denaturace 95 C (30 s) Ligace 59 C (1 min) Hold a 10 C a uchování do dalšího zpracování; nutno zpracovat během jednoho dne PCR protokol Přístroj: DNA Engine Dyad Peltier Thermal Cycler (Bio-Rad, California, USA) 1 cyklus Úvodní denaturace 95 C (2 min) 40 cyklů Denaturace 95 C (15 s) Annealing/ Elongace 60 C (15 s) 72 C (15 s) Hold a 10 C a uchování do dalšího zpracování

15 6.7.3 Hybridizační protokol Přístroj: DNA Engine Dyad Peltier Thermal Cycler (Bio-Rad, California, USA) 1 cyklus Úvodní denaturace 94 C (1 min) Pomalé ochlazování 94 C - > 25 C rychlost 0,1 C/s Hold a 10 C a uchování do dalšího zpracování; nutno zpracovat během jednoho dne Analýza Přístroj: Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader (Bio-Rad, California, USA). Analýza probíhá při pokojové teplotě a měření 96-ti jamkové desky trvá asi 45 minut. Naměřené hodnoty jsou zobrazeny v Bio-Plex Manager TM 6.1 softwaru (Bio-Rad, USA), odkud jsou hrubá data exportována do Excelu, kde jsou jednoduchým výpočtem vyhodnocena. 7 Výpočet a vyjádření výsledku 7.1 Hodnocení výstupu Od naměřených hodnot mediánu intenzity fluorescence (MFI) se odečte hodnota blanku 30 MFI (empiricky stanovená hodnota). Jednotlivé MFI hodnoty vzorků se podělí MFI hodnotou negativní kontroly NTC. Je-li výsledný poměr (P) vyšší než 3 a hodnota MFI daného vzorku vyšší než 50, vzorek je pozitivní. Pvzorku = MFIvzorku / MFINTC Kvalitativní hodnocení Kvalitativní hodnocení se provádí podle následující tabulky: Cíl IC Celkový výsledek Pozitivní (+) Pozitivní (+) Vzorek je pozitivní na LM Pozitivní (+) ( ) Vzorek je pozitivní na LM ( ) Pozitivní (+) Vzorek je negativní na LM ( ) ( ) Vzorek je inhibován

16 Vzorek je považován za pozitivní, pokud je pozitivní alespoň v jednom opakování. 8 Validace 8.1 Specificita Navržené sekvence MOLig byly porovnány pomocí algoritmu BLAST ( Sekvence specifická pro cílový úsek byla 100% identická s referenčními sekvencemi zastoupenými v databázi a současně nevykazovala identitu s jinými organismy. Specificita MOLig byla testována na různých sbírkových kmenech (viz. tabulka níže) a byla také ověřena v Reslová et al. (2018) na celé řadě bakteriálních i parazitárních patogenů, konkrétně u Salmonella enterica, Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica, Escherichia coli (EHEC), Taenia saginata, Trichinella spiralis, Toxoplasma gondii a Giardia intestinalis. Specificita převzatých univerzálních primerů byla ověřena na 13-ti genotypech Bacillus anthracis v případě Thierry et al. (2013), ale mimo jiné také na 11-ti sérotypech Escherichia coli (STEC) v publikaci Woods et al. (2016).

17 Výsledky testování detekčního systému pro LM na různých sbírkových kmenech: Sbírkové kmeny Salmonella enterica CAPM 5439 Salmonella enterica CAPM 5445 Salmonella enterica CAPM 5456 Salmonella enterica CAPM 6324 Campylobacter jejuni CAPM 6313 Campylobacter jejuni CAPM 6316 Campylobacter jejuni CAPM 6341 Campylobacter jejuni CAPM 6352 Escherichia coli CAPM 6009 Escherichia coli CAPM 6120 Escherichia coli CAPM 6130 Escherichia coli CAPM 5905 Escherichia coli CAPM 5928 Escherichia coli CAPM 6556 Escherichia coli CAPM 5969 Escherichia coli CAPM 5933 Escherichia coli CAPM 5224 Escherichia coli CAPM 5357 Escherichia coli CAPM 5358 Escherichia coli CAPM 5399 Escherichia coli CAPM 6113 Yersinia enterocolitica CAPM 6154 Yersinia enterocolitica CAPM 5671 Yersinia enterocolitica CAPM 5908 Yersinia enterocolitica CAPM 6458 Yersinia enterocolitica CAPM 6459 Listeria monocytogenes CAPM 5576 Listeria monocytogenes CAPM 5577 Listeria monocytogenes CAPM 5879 Yersinia pseudotuberculosis CAPM 5763 Yersinia pseudotuberculosis CAPM 6495 Yersinia ruckeri CAPM 6095 Listeria grayi CAPM 5887 Listeria ivanovii CAPM 5884 Listeria seeligeri CAPM 5885 Streptococcus agalactiae CAPM 5668 Streptococcus pneumoniae CAPM 5361 Klebsiella pneumoniae CAPM 6241 Enterococcus faecalis CAPM 5613 Enterobacter aerogenes CAPM 5634 Pseudomonas aeruginosa CAPM 5717 Arcanobacterium haemolyticum CAPM 5948 Corynebacterium kutscheri CAPM 6492 Corynebacterium pseudotuberculosis CAPM 6558 Erysipelothrix rhusiopathiae CAPM 5014 Dermatophilus congolensis CAPM 6439 Staphylococcus epidermidis CAPM 5657 Staphylococcus hyicus CAPM 6346 Staphylococcus aureus CAPM 6566 Staphylococcus saccharolyticus CAPM 6146 L. monocytogenes Pozitivní Pozitivní Pozitivní

18 8.2 Citlivost/limit detekce (LOD) LOD je určena jako koncentrace, kterou je pomocí daného testu možné detekovat s 95% mírou pravděpodobnosti. Pokud bereme v úvahu Poissonovu distribuci, nejnižší teoreticky možný LOD pro MOL-PCR je 1 ng templátové DNA pro cílový gen. Tento limit detekce byl stanoven experimentálně v multiplexním formátu, kdy byla izolovaná DNA naředěna na koncentraci od 4 ng/µl do 4 pg/µl. Vstupní množství DNA do reakce je 2,5 µl, do každé reakce tak byla přidávána DNA v koncentraci od 10 ng do 0,01 ng/µl. 8.3 Optimalizace reakčních podmínek Koncentrace jednotlivých MOLig byla optimalizována tak, aby nedocházelo k nespecifickým reakcím s jinými MOLigy v multiplexní ligaci a zároveň vznikalo co nejvíce ligačních produktů. Koncentrace univerzálních primerů byla optimalizována tak, aby nedocházelo k amplifikaci jednoho cíle na úkor druhého a aby zároveň vznikal fluorescenčně značený produkt ve zvýšené míře. IC byla optimalizována tak, aby byly přednostně amplifikovány a detekovány cílové sekvence. Tvorba primer-dimerů a nespecifických produktů byla zkontrolována pomocí meltingové analýzy. Funkčnost optimalizovaných reakčních podmínek byla ověřena v monoplexních i multiplexních formátech reakce, přičemž nejvyšší testovaná úroveň multiplexu čítala 11 systémů (Reslová et al., 2018). 8.4 Kruhový test Vzorky pro kruhový test byly připraveny na VÚVeL v podobě koncentračního gradientu izolované DNA s ohledem na empiricky stanovenou citlivost multiplexní MOL-PCR reakce 1 0,1 ng templátové DNA pro daný cíl (Stucki et al., 2012; Thierry et al., 2013). MOL-PCR i analýza byly provedeny a vyhodnoceny podle postupu popsaného v této certifikované metodice. Hodnota S (stopové množství) představuje koncentraci cílové DNA na hranici limitu detekce. Vzorek Vzorek po izolaci DNA Kvalitativní detekce LM VÚVeL VVetÚ Hlučín VFU Brno ÚVN Praha Z Neředěný X 5X ředěný X 10X ředěný + + +

19 S 100X ředěný Ex + 10X ředěná DNA S. aureus K+ IC (1 ng/μl) NTC Výsledky kruhového testu potvrdily použitelnost metodiky v rutinní laboratorní praxi. 9 Operativní řízení jakosti Je řešeno: 1) pomocí negativní kontroly 2) interní kontrolou (IC) III) SROVNÁNÍ NOVOSTI POSTUPŮ Vzhledem k tomu, že nejsou k dispozici jednotné a srovnatelné metodické přístupy získávání dat o prevalenci LM u hospodářských zvířat a krmiv a použití různých analytických metod neumožňuje získání srovnatelných údajů (EFSA, 2017), je vypracování a využití další validované metody pro detekci tohoto patogenu účelné. Představená metodika je oproti dříve publikovaným postupům inovativní svým vysokým stupněm multiplexu, schopného kombinovat detekci několika nezávislých cílů a interní kontroly. Tato kombinace tak umožňuje rychlý skrínink vyšetřovaného vzorku na předpokládané spektrum patogenů, jejichž výskyt je vázaný na danou matrici a současně umožňuje vyloučit falešně negativní výsledek v důsledku přítomnosti inhibitorů. Zároveň jsou pro tuto metodiku stanoveny parametry limitu detekce. Na základě rychlé a spolehlivé kvalitativní detekce je pak možno vybrané vzorky vykazující pozitivitu podrobit kvantifikační analýze pomocí real time PCR a determinovat tak infekční dávku. Předložená metodika byla vyvinuta s ohledem na její budoucí diagnostické uplatnění. Proto u ní byla provedena kompletní optimalizace, otestována specificita a citlivost, propracován systém kontrol a hodnocení. Funkčnost byla ověřena pro monoplexní i vysoce multiplexní účely. Předložený MOL-PCR systém umožňuje komplexní přístup k detekci bakterie LM a je použitelný pro široké využití ve veterinární i humánní oblasti. IV) POPIS UPLATNĚNÍ CERTIFIKOVANÉ METODIKY

20 Metodika je určena k rychlému skríninku a monitoringu výskytu bakterie Listeria monocytogenes. Navržený postup je vhodný pro kontrolu ze vzorků trusu a stěrů. V) SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY Deshpande, A., Gans, J., Graves, S.W., Green, L., Taylor, L., Kim, H.B., Kunde, Y.A., Leonard, P.M., Li, P., Mark, J., Song, J., Vuyisich, M., White, P.S A rapid multiplex assay for nucleic acid-based diagnostics. Journal of Microbiological Methods 80, , doi: /j.mimet EFSA, The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in EFSA Journal 15, 228. Farber, J. M., & Peterkin, P. I Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen. Microbiological reviews, 55(3), Goulet, V., Jacquet, C., Martin, P., Vailant, V., Laurent, E., de Valk, H Surveillance of human listeriosis in France Euro. Surveill. 11(6): McLauchlin, J., Mitchell, R., Smerdon, W. J., & Jewell, K Listeria monocytogenes and listeriosis: a review of hazard characterisation for use in microbiological risk assessment of foods. International Journal of Food Microbiology, 92(1), Mikel, P., Vasickova, P., Tesarik, R., Malenovska, H., Kulich, P., Vesely, T., Kralik, P Preparation of MS2 Phage-Like Particles and Their Use As Potential Process Control Viruses for Detection and Quantification of Enteric RNA Viruses in Different Matrices. Frontiers in Microbiology 7. doi: /fmicb Ramaswamy, V., Cresence, V.M., Rejitha, J.S., Lekshmi, M.U., Dharsana, K.S., Prasad, S.P., Vijila, H.M Listeria review of epidemiology and pathogenesis. J. Microbiol. Immunol. Infect. 40(1):4-13. Reslová, N., Huvarová, V., Hrdý, J., Kašný, M., Králík, P A novel perspective on MOL- PCR optimization and MAGPIX analysis of in-house multiplex foodborne pathogens detection assay. Scientific Reports. Sauders, B. D., Overdevest, J., Fortes, E., Windham, K., Schukken, Y., Lembo, A., &Wiedmann, M Diversity of Listeria species in urban and natural environments. Applied and Environmental Microbiology, AEM Stucki, D., Malla, B., Hostettler, S., Huna, T., Feldmann, J., Yeboah-Manu, D., Borrell, S., Fenner, L., Comas, I., Coscolla, M., Gagneux, S Two New Rapid SNP-Typing Methods for Classifying Mycobacterium tuberculosis Complex into the Main Phylogenetic Lineages. Plos One 7, doi: /journal.pone Thierry, S., Hamidjaja, R.A., Girault, G., Löfström, C., Ruuls, R., Sylviane, D A multiplex bead-based suspension array assay for interrogation of phylogenetically informative single nucleotide polymorphisms for Bacillus anthracis. Journal of Microbiological Methods 95: doi: /j.mimet

21 Woods, T. A., Mendez, H.M., Ortega, S., Shi, X., Marx, D., Bai, J., Moxley, B.A., Nagaraja, T.G., Graves, S. W., Deshpande, A Development of 11-Plex MOL-PCR Assay for the Rapid Screening of Samples for Shiga Toxin-Producing Escherichia coli. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 6, doi: /fcimb

22