Historie Bacillus cereus

Transkript

1 Bacillus cereus

2 Bacillus cereus

3 Historie Bacillus cereus První záznamy týkající se otrav z potravin způsobené rodem Bacillus pochází z roku 1906, kdy Lubenau popsal propuknutí onemocnění v sanatoriu, kde se u 300 pacientů a zaměstnanců objevily silné průjmy, křeče žaludku a zvracení. Přestože Lubenau pojmenoval microorganismus, které onemocnění vyvolalo, Bacillus peptonificans, vlastnosti, které u microorganismu popsal, se podobaly vlastnostem Bacillus cereus. V Evropě se pak objevila řada takovýchto onemocnění a v letech 1936 až 1943 Stockholmské ministerstvo zdravotnictví odhadovalo, že byl tento mikroorganismus tvořící aerobní spory příčinou onemocnění ve 117 případech z 367 zkoumaných.

4 Historie Bacillus cereus Do roku 1950 nebyl Bacillus cereus definitivně potvrzen jako příčina onemocnění z potravin. Stalo se tak až vyjasněním taxonomie rodu. Hauge popsal čtyři propuknutí nákazy v Norsku dohromady u 600 lidí. Zdrojem byla vanilková omáčka, která byla připravena den předem a uložena při pokojové teplotě. U této omáčky bylo později zjištěno 2,5*107 až 1,1*108 /ml buněk Bacillus cereus. Tyto klasické zprávy a mnohé další popisují onemocnění, pro které byl převládajícím příznakem průjem. Je známo, že je Bacillus cereus zodpovědný za dva odlišné typy onemocnění z potravin: průjmové onemocnění ( diarrhoeal syndrom ) s relativně delší inkubační dobou a onemocnění projevující se zvracením, tzv. emetický syndrom, který má rychlý začátek a byl poprvé popsán v roce 1971 ve Spojeném Království.

5 Charakteristika organismu Bacillus cereus je typická, v půdě žijící Gram-pozitivní, tyčinkovitá, betahemolytická bakterie. Některé kmeny jsou nebezpečné pro lidi a vyvolávají onemocnění z potravy, (foodborne illness), zatímco jiné mohou být prospěšné jako probiotika pro zvířata. Podle tvaru sporangia se člení do tří skupin Také se označuje jako syndrom čínské restaurace ( Fried Rice Syndrome). B. cereus je aerobní, a podobně jako další členové rodu Bacillus tvoří endospory. Serotypizace je založena na bičíkovém H antigenu

6 Systematické zařazení Scientific classification Kingdom Bacteria Phylum Firmicutes Class Bacilli Order Bacillales Family Bacillaceae Genus Bacillus Species Cereus

7 Sporulující kultura B.cereus barveno podle Grama

8 Růst a jeho kontrola Teplota: Optimum ºC. Některé kmeny mohou růst až do 55 ºC zatímco další rostou ještě při 4-5 ºC (mléčné výrobky) ph: minimum pro růst je 4.3 a maximum okolo 9,3. Atmosféra: Růst je optimální v přítomnosti kyslíku. Růst za annaerobních podmínek je pomalý s nízkou produkcí toxinů. Vodní aktivita: Minimální rozsah vodní aktivity k vegetativnímu růstu je 0,912 0,950.

9 Onemocnění vyvolaná B.cereus B.cereus tvoří několik enterotoxinů. Ojediněle může způsobovat onemocnění u imunokompromitovaných pacientů (meningitis, endokarditis, endophtalmitis, konjunktivitis nebo akutní gastroenteritis).je též původcem oportunních infekcí. otrava z potravin (enterotoxikóza) meningitís endokarditis konjunktivitis pneumonie sepse infekce ran

10 Diarhoeální (průjmové) onemocnění Inkubace: hodin po požití kontaminované potraviny Symptomy: bolest břicha, vodnatý průjem a občasné zvracení (podobné jako při infekci C. perfringens). Příčinou je požití vegetativních organismů nebo spor a jejich následné množení a produkce toxinu v zažívacím traktu (enterotoxin Nhe a/nebo hemolytický enterotoxin HBL) V Evropě dosti častý výskyt

11 Emetický syndrom Inkubace: 1-6 hodin po požití kontaminované potraviny Symptomy: nausea a zvracení,občas následované průjmem (výsledek požití již utvořeného toxinu: emetoxin ETE). Podobně jako u S. aureus. Velice časté v Japonsku

12 Probiotikum B. cereus soutěží s ostatními mikroorganismy jako je Salmonella a Campylobacter v trávícím traktu tak, že jeho přítomnost redukuje jejich počet. U hospodářských zvířat : kuřata, králíci a vepři některé neškodné kmeny B. cereus se užívají jako probiotická potravní aditiva ke snížení počtu salmonel ve střevech. Zlepšuje to růst zvířat a zároveň zvyšuje bezpečnost jejich masa pro lidskou výživu.

13 Vliv stáří kultury na barvení

14 Kriteria pro B. cereus Nařízení 1441/2007 Kapitola Sušená počáteční kojenecká výživa a sušené dietní potraviny pro zvláštní léčebné účely určené pro kojence do šesti měsíců věku plán odběru vzorků limity anal. metoda Bacillus cereus n/5 c/1 m=50 KTJ/g EN/ISO 7932 M= 500 KTJ/g - vyhovující, pokud jsou všechny zjištěné hodnoty m - přijatelný, pokud nejvýše c/n hodnot nachází mezi m a M a zbývající zjištěné hodnoty jsou m - nevyhovující, pokud je jedna nebo více zjištěných hodnot > M nebo se více než c/n hodnot nachází mezi m a M.

15 Identifikace podle ISO normy ČSN EN/ISO 7932 Na povrch tuhé selektivní půdy v Petriho miskách se očkuje určený objem zkušebního vzorku, stejně s epostupuje při očkování desetinásobných ředění vzorku. Plotny se inkubují aerobnw při 30 oc po h. Půda obsahuje kromě živin fenolovou červeň, polymyxin B a žloutkovou emulzi. Typické kolonie jsou velké, růžové a oobvykle obklopené zónou precipitace (tvorba lecitinasy) Konfirmace na agaru s ovčí krví hemolytická reakce

16 Biochemická charakteristika Identifikačním znakem pro B. cereus, B. thuringiensis, B cereus var. mycoides a v menší míře B. anthracis je schopnost syntetizovat lecithinasu, která způsobuje zamlženost ve žloutkovaječném bujónu a neprůhledné zóny opalescence okolo kolonií na tomto typu agaru. Stejně jako lecithinasa (α-toxin) druhu Clostridim perfringens, jsou tyto enzymy aktivovány Ca2+ a Mg2+ ionty, vykazují určitou termostabilitu, dávají Naglerovu reakci v lidském séru, lyzují erythrocyty a jsou neutralizovány specifickým sérem. Lecithinasovou reakci na žloutkovaječném agaru, avšak mnohem slabší a omezenou, vykazují i jiné druhy (B. laterosporus, B. polymyxa a B. macerans). K této reakci dochází v místě hned pod kolonií, a proto je viditelná pouze při odstranění narostlého mikroorganismu.

17 B.cereus produkuje fosfolipáza C hemolyzin - oxigenlabilní cereolysin, letální pro myš oxigenstabilní hemolysin enterotoxin - mimo jiné zvyšuje permeabilitu cév emetický toxin - termostabilní, odolný vůči ph, proteázám

18 Různé druhy z rodu Bacillus, zvláště ty z 1 morfologické skupiny, produkují hemolysiny. Primární hemolysin B. cereus, cereolysin, je oxygenlabilní, aktivuje se thioly a inaktivuje se cholesterolem a antistreptolysinem a je blízce příbuzný, není-li identický, s hlavním hemolysinem B. thuringiensis, thuringiolysinem. B. megaterium produkuje hemolysin podobný αhemolysinu Staphylococcus aureus

19 Virulenční faktory Diarhetické syndromy u pacientů jsou výsledkem účinku tří toxinů Hbl, Nhe a CytK. Geny nhe/hbl/cytk jsou lokalizovány na chromosomu bakterie. Transkripce těchto genů je řízena PlcR. Tyto geny se vyskytují také v taxonomicky příbuzných B. thuringensis a B. anthracis. Tyto enterotoxiny se tvoří v tenkém střevu hostitele, tak jsou chráněny před trávícími enzymy hostitele. Toxiny Hbl a Nhe mají porační aktivitu podobnou jako E. coli. Mají konformaci "beta-barrel" tak mohou pronikat do buněčných membrán vzhledem k hydrofobnímu exteriéru, tvoří póry s hydrofilním vnitřkem (interiérem). Výsledkem je ztráta buněčného membranového potenciálu a případně smrt buňky. CytK je pory tvořící protein příbuzný ostatním hemolysinům.

20 PlcR PlcR je regulátor transkripce u Bacillus cereus, který aktivuje genovou expresi tak, že se váže na sekvence nukleotidů označované jako PlcR box. Ke zjištění seznamu všech genů obsažených v PlcR regulonu byly pomocí mutagenese identifikovány shodné sekvence. Referenční kmen ATCC14579 byl kompletně sekvenován, shodné sekvence byly vyhledány a utvořen virtuální regulon. PlcR kontrola těchto genů byla potvrzena porovnáním genové exprese u referenčního kmene a jeho isogenního mutanta Δ-plcR využitím DNA chipů (microarray), lacz fuzemi a dalšími metodami proteomiky. Výsledný seznam obsahoval 45 genů kontrolovaných v 28 PlcR boxech. Čtyřicet proteinů řízených PlcR bylo exportováno,z nich 22 bylo sekretováno do media a 18 bylo vázáno nebo zachyceno na struktury buněčných obalů (membrána nebo peptidoglykanová vrstva).

21 Transkripční regulátor PlcR ( Phospholipase C regulator) kontroluje expresi většiny známých faktorů virulence.

22 Proteiny řízené PlcR Funkce těchto proteinů mají souvislost s výživou (fosfolipasy, proteasy, toxiny), s ochranou buňky (bakteriociny, toxiny, transportery, bioegenese buněčné stěny) a reakce na prostředí (dvou složkové sensory, proteiny chemotaxe, GGDEF regulátory). Ćtyři geny kódují cytoplasmatické regulátory. PlcR regulon zřejmě integruje velký počet environmentálních signálů, včetně nedostatku živin a reguluje transkripci genů umožňujících překonat tyto překážky, které brzdí růst B. cereus v hostiteli: dodávka živin, ochrana hostitele, jeho imuní obrana, a soutěž s ostatními druhy bakterií. PlcR je klíčovou složkou účinné adaptace B. cereus v prostředí hostitele.

23 Přehled PlcR regulonů

24 Vliv konservačních látek Růst je inhibován 0,26% sorbové kyseliny při ph 5,5 a 0, 39% sorbátem draselným při ph 6,6 Přídavek 0,2% propionátu vápenatého zabraňuje klíčení spor B.cereus v chlebu Nisin je běžně užíván k potlačení klíčení spor a růstu v tavených sýrech, mléčných desertech, konservách, uzeném mase a v pekárenských výrobcích s vysokou vlhkostí (3.75 μg/g)

25

26 Staphylococcus aureus úvod Byl popsán před více než 140 lety jako původce abscesů a o několik desítek let i jako původce alimentárních intoxikací. V patogenezi infekčních onemocnění lidí a zvířat se uplatňují i jiné druhy, SA má u stafylokokových infekcí a intoxikací dominantní postavení. Patogenita a virulence SA je způsobena schopností kmenů produkovat biologicky aktivní proteiny: syndrom toxického šoku exfoliativní toxiny enterotoxiny

27 Koagulasa-pozitivní stafylokoky Staphylococcus aureus Domain:Bacteria Říše: Eubacteria Kmen:Firmicutes Třída:Bacilli Řád:Bacillales Čeleď:Staphylococcaceae Rod:Staphylococcus Druh:aureus

28 Staphylococcus aureus

29 Stafylokoky tvořící hemolýzu

30 Výskyt Staphylococcus aureus je přirozenou součástí mikroflóry lidského těla. Člověk je stafylokoky kolonizován od prvních dnů života. Nejvíce jsou kolonizována kůže na rukou, perinea a sliznice dýchacího a zažívacího ústrojí. Přítomnost S. aureus lze prokázat v horních cestách dýchacích u 20 50% populace. Jejich přenašeči mohou být i zdraví jedinci, u kterých není vyvoláno žádné onemocnění. Nosičství stafylokoků organismus nijak nepoškozuje, ale naopak vede k poměrně dobré odolnosti vůči infekci. K onemocnění dochází jen při oslabení imunitního systému. S. aureus rovněž kolonizuje dýchací trakt hospodářsky významných zvířat. Nejčastěji se jedná o domácí prasata a drůbež. Vyskytuje se také u řady divoce žijících druhů.

31 Patogenita Stafylolyziny - patří sem hemolyzin alfa, beta, gama, delta. Jsou to cytotoxiny, které poškozují nejen erytrocyty, ale i buňky různých tkání. S. aureus a haemolyticus způsobují beta-hemolýzu. Leukocidin - zvyšuje permeabilitu membrány leukocytů Exfoliatin - je epidermolytický toxin typický pro S. aureus. Způsobuje syndrom opařené kůže (SSSS, Ritterův syndrom), což je toxická epidermolýza. Jedná se o těžké poškození kůže, při němž vznikají vodnaté puchýře, které postupně praskají a kůže se pak olupuje. Tekutina v puchýřích je sterilní.

32 Další faktory patogenity TSST-1 (toxic shock syndrome toxin) - jedná se o toxin syndromu toxického šoku, jehož hlavním projevem je multisystémový efekt ( horečka, difúzní erytrém, průjmy, hypotenze, selhání funkce jater a ledvin). Zvyšuje propustnost endotelu Enterotoxiny - způsobují stafylokokovou enterotoxikózu. Vyskytují se i v infikovaných potravinách, jsou termostabilní a odolné vůči kyselině chlorovodíkové v žaludku.

33 Další faktory patogenity Plazmokoaguláza (volná) - sráží fibrinogen. Vytváří ochranný fibrinový obal a napomáhá tím k tvorbě abscesů. Hyaluronidáza - je faktor invazivity. Napomáhá tvorbě flegmóny. Štěpí kyselinu hyaluronovou a pomáhá pronikání stafylokoků do mezibuněčných prostor. Stafylokináza - je fibrinolyzin, který rozpouští fibrinové sraženiny. Lipázy - hydrolyzují lipidy a způsobují tak lepší šíření do podkoží. Nukleáza - její úloha je zatím v patogenezi nejasná. Využívá se v laboratorní diagnostice. Penicilináza - je beta-laktamáza kódovaná plasmidem. Rozkládá betalaktamový kruh betalaktamových antibiotik.

34 Enterotoxiny Stafylokokové enterotoxiny jsou bazické proteiny rezistentní k proteolytickým enzymům zažívacího traktu. Odolávají účinkům varu po dobu 30 minut. Svými strukturními a biologickými vlastnostmi náležejí do skupiny stafylokokových a streptokokových pyrogenních toxinů označovaných jako superantigeny, které jsou schopny stimulovat větší množství T-lymfocytů než běžné antigeny. Superantigeny jsou aktivovány ve střevech, kde navodí odezvu, což je příčinou gastroenteritid spojených s dehydratací. Stafylokokové enterotoxiny jsou jednou z příčin bakteriální virulence, vyvolávají zvracení a mohou také zapříčinit toxický šok.

35 Typy enterotoxinů S. aureus produkuje 11 typů enterotoxinů (SE), přičemž doposud bylo identifikováno 20 sérologicky odlišných typů. Jedná se o malé jednořetězcové polypeptidy o velikosti kda. Syntéza je řízena chromozomálními nebo plastidovými geny. Enterotoxiny SEA, SEB, SEC, SED a SEE byly popsány již dříve, zatím co SEG, SEH, SEI a SEJ, jsou nověji popsané enterotoxiny.

36 Antigenní struktura peptidoglykan - je složka buněčné stěny. Navozuje v těle tvorbu interleukinu-1 a opsonizačních látek. Aktivuje komplement, má endotoxinovou aktivitu a působí jako chemotaktický faktor. Na peptidoglykanu je navázána kyselina teichoová a protein A. kyselina teichoová - navozuje tvorbu protilátek. protein A - se váže na Fc fragment IgG, čehož se pak užívá v diagnostice u tzv. koaglutinační reakce. Dále inhibuje opsonizaci a fagocytózu - má antifagocytární a antikomplementární účinek. adheziny - jsou kolonizační faktory. Způsobují adhezi stafylokoků na mezibuněčné nebo buněčné struktury (např. fibrinogen, fibronektin, kolagen, sialoprotein) BIOFILM vázaná koaguláza - je shlukovací faktor a zprostředkovává vazbu na fibrinogen.

37 Stafylokoková enterotoxikosa Koagulasa enzym tvořený bakteriemi, zvláště Staphylococcus aureus, který napomáhá tvorbě fibrinu z fibrinogenu při tvorbě sraženin (krevních). Test používá králičí fibrinogen.

38 Koagulasa Plazmakoaguláza je určujícím znakem druhu a obecně známkou patogenity. Jednoduchý protein přeměňující fibrinogen na fibrin. Srážení vyvolané koagulázou vede k akumulaci fibrinu okolo bakteriální buňky a ztěžuje tak hostitelským obraným agens zkontaktovat se s ní a zabránit tak fagocytóze. Plazmakoaguláza může přispívat k ohraničení zánětlivé reakce vytvořením fibrinového lemu kolem léze, která se přeměňuje ve stafylokokový absces. Podle produkce plazmakoagulázy se stafylokoky rozdělují do dvou velkých skupin: koaguláza pozitivní a koaguláza negativní stafylokoky. Koagulázový test se používá pro rozlišení S. aureus a S. epidermidis, který je koaguláza negativní.

39 Patogeneze Toxická dávka 0,1-1 µg enterotoxinu je schopna vyvolat onemocnění. Inkubační doba se pohybuje od 1 do 7 hodin. Nástup klinických příznaků je velmi rychlý a dramatický, bolesti hlavy, zvracení, bolesti břicha, vzácněji průjem. Úzdrava je rychlá, do 2 dní. Předpokládá se, že enterotoxiny stimulují lokální neuroreceptory v trávícím traktu, které prostřednictvím vagu stimulují centrum pro zvracení v mozku.

40 počet hlášených případů Bakteriální intoxikace

41 Kriteria pro St. aureus Nařízení 1441/2007 EU Kapitola 1. Kriteria bezpečnosti potravin 1.21 Sýry, sušené mléko a sušená syrovátka podle kritérií pro koagulázopozitivní stafylokoky, viz kapitola 2.2 Stafylokokové enterotoxiny: n = 5, Neprokázány ve 25 g, podle metody referenční laboratoře Společenství pro koagulázopozitivní stafylokoky

42 Kriteria pro St. aureus Kapitola 2.2 Mléko a mléčné výrobky Sýry vyrobené ze syrového mléka Sýry vyrobené z mléka, které bylo podrobeno nižšímu tepelnému ošetření než pasterizaci a zrající sýry vyrobené z pasterizovaného či silněji tepelně ošetřeného mléka nebo z pasterizované či silněji tepelně ošetřené syrovátky Nezrající měkké sýry (čerstvé sýry) vyrobené z pasterizovaného či silněji tepelně ošetřeného mléka nebo z pasterizované či silněji tepelně ošetřené syrovátky Sušené mléko a sušená syrovátka

43 Limity n= c=2 m 104 KTJ/g 100 KTJ/g 10 KTJ/g 10 KTJ/g M 105 KTJ/g 1000 KTJ/g 100KTJ/g 100KTJ/g Pokud jsou hodnoty > 105 KTJ/g musí být příslušná partie sýra vyšetřena na stafylokokové enterotoxiny. Kapitola 2.4 Produkty rybolovu Krunýře a lastury zbavené výrobky z vařených korýšů a měkkýšů se schránkami 100 KTJ/g 1000 KTJ/g

44 ČSN EN ISO Horizontální metoda stanovení počtu koagulázopozitivních stafylokoků Část 1: Technika s použitím agarové půdy podle Baird-Parkera Kultivace na živné půdě s K2TeO3 a žloutkovou emulzí. Typické černé nebo šedé kolonie obklopené zónou ptojasnění se konfirmují na přítomnost koagulasy

45 Vazba na potraviny Malá množství téměř na všech typech masa a drůbeže Uzenářské výrobky, šunka Mléko a mléčné výrobky Tvrdé sýry Zákusky, v Japonsku rýžové kuličky, zmrzlina (Maďarsko)

46 Vliv technologií Bakterie SA jsou velmi odolné k vnějšímu prostředí. Dobře přežívají v: suchém i kyselém prostředí, snáší vysoký obsah kuchyňské soli, chladírenské i mrazírenské teploty, aerobní i anaerobní prostředí. Nepřežívají sterilační ani pasterační teploty. Toxiny jsou velmi rezistentní!

47

48 Indikátorové mikroorganismy Indikace kontroly účinnosti antimikrobiálních technologických zákroků a hygieny prostředí Indikace fekálního znečištění Koliformní bakterie - zkvašují laktosu za vniku kyseliny a plynu Enterobacteriaceae zkvašování glukosy ukazatel při rozboru pitné vody Enterokoky

49 Enterobacteriacae

50 Standardní a patogenní mikroflora E. coli Klebsiella Enterobacter Proteus Serratia Salmonella Shigella Yersinia pathogennní E. coli Všechny jsou Gram negativní Fakultativně anaerobní Fermentují glukosu Oxidasa negativní Nitrát pozitivní

51 Nařízení 1441/2007 EU Kapitola 2.1 maso a výrobky z něj jatečně upravená těla skotu, ovcí, koz a koňovitých 1,5 2,5 log KTJ/cm jatečně upravená těla prasat 4,0 5,0 log KTJ/cm2 2.2 Mléko a mléčné výrobky Pasterizované mléko a další pasterizované tekuté mléčné výrobky 1 KTJ/ml, 5 KTJ/ml Sušené mléko a sušená syrovátka 10 KTJ/g (c = 0)

52 Nařízení 1441/2007 EU Zmrzlina a maražené méčné deserty 10 KTJ/g, 100KTJ/g Sušená počáteční kojenecká výživa a sušené dietní potraviny pro zvláštní léčebné účely určené pro kojence do šesti měsiců věku Nepřítomnost v 10 g Vaječné výrobky 10 KTJ/g nebo ml, 100KTJ/g nebo ml

53 Media pro identifikaci Testování na přítomnost nebo celkový počet indikátorových organismů ( coli-aerogenes - koliformní) v potravinách je prováděno standardně. Media s krystal. violetí, methyl červení, žlučovými solemi a laktosou jsou navržena pro koliformní,t.j. laktosa pozitivní bakterie. VRBA, jsou varianty klasikého MacConkey agaru Tato media jsou užívaná v posledních letech pro počet a izolaci koliformních org. Nové typy medií jsou pro E. coli založených na βglukuronidasové aktivitě se také užívají pro koliformy.

54

55