SACHARIDY A JEJICH KONJUGÁTY

Transkript

1 SACHARIDY A JEJICH KNJUGÁTY Jitka Moravcová Ústav chemie přírodních látek, VŠCHT Praha, Technická 5, Praha 6, Jitka.Moravcova@vscht.cz bsah: 1. Úvod Typy interakcí sacharidů s proteiny Glykolipidy Glykoproteiny, proteoglykany a peptidoglykan... 9 Glykoproteiny... 9 Proteoglykany Peptidoglykan Biologická role sacharidů v glykoproteinech Interakce sacharidových epitopů s lektiny Taktika hledání analogů sacharidových epitopů Závěr Seznam použité literatury Úvod Před zhruba 20 lety se zdálo, že téma sacharidy je vyčerpané a hlavní pozornost poutaly nukleové kyseliny a proteiny. Nastala éra genetického inženýrství, klonování a sekvencování genomů. Postupem času se zjistilo, že buněčné rozpoznávání a adhezi buněk nelze vysvětlit jen pomocí těchto dvou kategorií sloučenin. Aby totiž skupina látek mohla zastávat funkci informačního systému v živém organismu, musí splňovat několik požadavků: a) možnost specifického kódování (informace musí být jednoznačná a musí být i dešifrovatelná s nízkou pravděpodobností špatné interpretace); b) šifrovací aktivní sekce biomolekuly musí mít malou velikost proto, aby její synthesa nebyla energeticky náročná; c) aktivní sekce musí být dobře prostorově přístupná; d) typ kódovací sloučeniny musí mít dostatečný potenciál pro rychlé strukturální změny. Všechny tyto znaky efektivně pracujícího kódovacího systému vykazují sacharidy. Jednoduché sacharidy jsou prakticky nevyčerpatelnou zásobárnou rozmanitých struktur, neboť kupříkladu každá hexosa nabízí pět hydroxylových skupin jiné molekule sacharidu ke tvorbě glykosidové vazby. Tak by 20 hexos mohlo teoreticky poskytnout 6, hexamerů, zatímco 20 aminokyselin pouze 1, Sacharidy jsou dále konformačně flexibilní, důležitá je zejména volná rotace kolem glykosidové vazby, přitom ale jednotlivé konformery mohou mít různou afinitu k vazebnému místu receptorudekodéru. Kromě lineárních oligomerů mohou tvořit i rozvětvené struktury, což je vlastnost v biologickém systému zcela unikátní. Sacharidy jsou tedy téměř ideální sloučeniny pro generování kompaktních jednotek s explicitními informačními 1

2 vlastnostmi. Za tímto účelem jsou v organismu vázány kovalentní vazbou na lipidy a proteiny nebo peptidy a studiu těchto biookonjugátů se věnuje posledních dvacet let obrovská pozornost. Sacharidy tvoří jen asi 1 % hmotnosti člověka, zatímco proteiny zhruba 15 % stejně jako lipidy, 5 % je anorganických solí a zbytek je voda. Nepočítámeli Dribosu a 2deoxyDribosu, je základních monosacharidů v lidském těle deset (br. 1), z nich kyselina neuraminová, D glukosamin a Dgalaktosamin se vyskytují ve formě svých Nacetylderivátů. Kyselina H H H H H H H Dglukosa (Glc) NHAc H H NacetylDglukosamin (GlcNAc) H H H H H H H Dgalaktosa (Gal) NHAc H H NacetylDgalaktosamin (GalNAc) H H H Dxylosa (Xyl) H CH H H H H Dglukuronová kyselina (GluA) H H H Lfukosa (Fuc) CH H H H H H Didouronová kyselina (IdoA) R9 R R5 NH 5 R4 R7 3 H 2 CH 1 sialové kyseliny 7acetyl 4acetyl Nglykolyl 8acetyl 9laktyl 8methyl 9acetyl 9fosfát 8sulfát R4,R5,R7,R8,R9 = H kyselina neuraminová Nacetyl kyselina Nacetylneuraminová (NeuAc, Neu5Ac, NANA) br. 1 Struktury základních monosacharidů lidského těla neuraminová tvoří celou řadu dalších derivátů, které se nazývají společným názvem kyseliny sialové a které ale u savců nejsou přítomny. Biosynthesa glykokonjugátů probíhá krok za krokem v endoplasmatickém retikulu a Golgiho aparátu (br. 2). Exogenní monosacharidy penetrují do buňky a jsou přeměněny do stavebních bloků, typicky do podoby glykosylnukleotidů, které jsou dále transformovány na oligosacharidy a navázány na lipidickou nebo proteinovou kostru. Těchto transformací se účastní celá řada glykosidas a glykosyltransferas. Jakmile se glykokonjugáty dostanou na povrch buňky, slouží jako ligandy pro receptory jiných buněk nebo pathogenů. 2

3 2. Typy interakcí sacharidů s proteiny Jako receptory se pro interakce se sacharidy uplatňují především proteiny a to prostřednictvím nevazebných interakcí, které mohou být typu vodíková vazba, asociace s kovy, nepolární a nebo iontová interakce. Důležité je, že při této interakci nedochází k žádné chemické transformaci sacharidu, a proto se netýká enzymů. becně jsou tyto interakce s monosacharidy slabé (K a 10 3 až 10 4 M 1 ), pokud má receptor multifunkční afinitu, může být interakce s oligosacharidem silnější (např. tzv. glycoside cluster effect, který projevují lektiny). Vodíkové můstky. Téměř nikdy se nejedná o jeden isolovaný vodíkový můstek, ale vždy o celou síť interakcí bidentálního br. 2 Biosynthesa glykokonjugátů charakteru s obecným motivem NH H =C, které se účastní pobočné řetězce aminokyselin, jako jsou Asn, Asp, Glu, Gln, Arg nebo His, a sacharidové hydroxylové skupiny i kyslík pyranosové kruhu (br. 3a). Účast molekul vody je zcela obvyklá. Asociace s kovy. Interakci nejčastěji zprostředkovává vápník a dále mangan (br. 3b). V případě Clektinů byla asociace s kovy přímo pozorována. Komplementární kontakt nepolárních ploch. I když jsou sacharidy především polárními sloučeninami, jsou schopny i nepolárních interakcí, neboť jedna ze stran molekuly sacharidu bývá více hydrofobní než druhá v případě Dgalaktosy je to strana B (jako strana A se označuje ta strana, kde se atomy uhlíku počítají od nižšího k vyššímu ve směru pohybu hodinových ručiček), která je například hydrofobnější než odpovídající B strana Dglukosy nebo Dmannosy, 3

4 protože konfigurace na atomu C4 je L a hydroxylová skupina směřuje nahoru do strany A (br. 3c). Z toho důvodu je Dgalaktosa skoro vždycky v nepolární interakci s aromatickým kruhem vhodné aminokyseliny. Tento fakt ukazuje na důležitost interakce elektronů s elektrony vazby CH. V případě oligosacharidů nastává dokonce interakce se dvěma pyranosovými kruhy a molekula sacharidu je tak uzavřen mezi dvě plochy. Iontová interakce. Uplatňuje se u nabitých sacharidů, tj. těch, které obsahují aminoskupinu, glukuronovou nebo idouronovou kyselinu či kyseliny sialové, přičemž karboxylová skupina je skoro vždy asociována s argininem. Tento typ interakce zodpovídá za afinitu aminoglykosidových antibiotik. Asn 232 H H Arg 151 H H H Ca 2+ Glu 193 H H H H H H H H HH H H H a) b) Asn 187 c) br. 3 Příklady interakcí monosacharidů s proteiny: a) vodíkové můstky, b) asociace s kovem, c) hydrofobní interakce 3. Glykolipidy Jsou součástí buněčných membrán a vyskytují se ve všech organismech. Po chemické stránce je to heterogenní skupina amfifilních molekul, které mají jednu nebo více molekul monosacharidů vázaných jako glykosidy na hydrofobní kostru acylglycerolu nebo ceramidu. Jejich úkolem je přispívat ke stabilizaci a vyšší pevnosti membrán a rovněž se uplatňují v buněčné komunikaci, při modulaci receptorů a nebo signální transdukci, diferenciaci, proliferaci a onkogenezi. 4

5 Mezi glykolipidy prokaryotů se řadí hopanoidy, mykoláty, lipoteichové kyseliny, lipoglykany, lipopolysacharidy a sfingoglykolipidy. Hopanoidy jsou glykosidy s rigidními pentacyklickými aglykony a v membráně pravděpodobně vážou cholesterol, a tím ji zpevňují (br. 4). Mykoláty jsou součástí obálky mykobakterií, kde fungují jako efektivní bariéra proti pronikání antibiotik a chemotherapeutik. Po chemické stránce jsou mykoláty estery (arabinogalaktanu) peptidoglykanu s tzv. mykolovými kyselinami (substituované alkyl hydroxymastné kyseliny). Lipoteichové kyseliny v cytoplasmatické membráně grampozitivních bakterií obsahují charakteristický alditol(glycerol)fosfátový řetězec (br. 4). Lipoglykany jsou lineární nebo rozvětvené polysacharidy vázané na glycerol a rovněž jsou fosforylovány. Protože se lipoteichové kyseliny a lipoglykany nevyskytují současmě v jedné a téže baktérii, předpokládá se, že jejich funkce jsou zaměnitelné. Lipopolysacharidy (LPS) jsou sloučeniny specifické pro gramnegativní bakterie, kde tvoří vnější povrch vnější membrány (br. 5). Lipopolysacharidy (br. 6) obsahují lipidickou část (lipid A), která je obecně tvořena acylovaným (1 6) aminodisacharidem, který může být fosforylován v poloze 1 a 4. Lipid A je dále v poloze 6 glykosylován polysacharidem, který se skládá z tzv. heterooligosacharidu jádra a specifického polysacharidu (Sforma LPS) nebo antigen chybí (Rforma LPS). Zatímco struktura jádra je víceméně rigidní, je struktura antigenu variabilní a specifická. LPS jsou endotoxiny, které vyvolávají u lidí a vyšších organismů septický šok. V USA se ročně vyskytne případů sepse ročně, z nich 20 50% je smrtelných pokud se ovšem rozvine septický šok, je úmrtnost 90 %. H H H H H R H R = CH 2 H, CH 2 NH 2, CH H X X X P( P ) n P H X = H, glykosyl H H H H H br. 4 Struktura hopanoidů a lipoteichových kyselin R 1 R 2 5

6 lipopolysacharid antigen periplasmatický prostor KD peptidoglykan lipid A plasmatická membrána br. 5 Buněčná obálka gramnegativní baktérie a struktura lipopolysacharidu Sepse je černou můrou lékařů, neboť o ní platí beze zbytku sarkastické pořekadlo, že operace se zdařila a pacient zemřel. Uvádí se, že úmrtí na sepsi v průběhu první světové války bylo hojnější než úmrtí vyvolaná bezprostředně zraněním. Nositelem toxicity je lipid A, který stimuluje hostitelskou buňku k nadprodukci endogenních mediátorů, např. cytokinů, které v malém množství aktivují imunitní systém hostitele, ale ve velkém vyvolají horečku, AbeAc Glc GlcNAc Man( Rha Gal Glc Gal) Gal n Glc 2 Hep HepP 3 Hep KD P KD NH H H H HN P br. 6 Struktura LPS baktérie Sallmonela typhimurium H H H H H H CH KD H H H H H Hep H H H H Abe tachykardii, vysoký tlak a následně smrt díky nefunkčnosti všech orgánů spojených s krevním oběhem. Pravděpodobnost úmrtí jasně koreluje s hladinou LPS v krevním séru, např. pro Neisseria meningitidis koncentrace 800 ng/ml dává 50% naději na přežití, zatímco hladina vyšší než ng/ml je 100% smrtelná. Některé lipidy A jsou toxické méně a slouží jako inspirativní matrice pro návrh nových 6

7 strukturální jednotku odpovídající lipidu A. Sfingolipidy vykazují i podobnou biologickou aktivitu jako lipid A, ačkoliv monomery glykosfingolipidů jsou biologicky neaktivní. Ukazuje se, že pravděpodobně existuje jakási supramolekulární struktura glykosfingolipidů, která je zodpovědná za jejich biologické a fyzikálněchemické vlastnosti. Povrch buněk eukaryotů je potažen sacharidovou vrstvou a tato tzv. glukokalix se skládá z glykolipidů, glykoproteinů a 7 P H galaktosyl H HN H H H H Me NH H HN P H E5531 mastná kyselina sfingosin (sfinganin) br. 8 Struktura neutrálního galaktosylceramidu léčiv. Celkem účinným zásahem do struktury lipidu A je náhrada esterových vazeb za nehydrolyzovatelné vazby etherové a lipid E5531 prochází klinickými zkouškami jako antagonista lipidu A. Glykosfingolipidy gramnegativních bakterií jsou formálně podobné LPS, neboť jsou složeny z ceramidu (sfinganin acylovaný mastnou kyselinou) glykosylovaného negativně nabitou pyranosou (br. 7). Pak tři molekuly glykosfingolipidů představují glykosylaminglykanů. Prominentní základní strukturou živočišných glykolipidů je ceramid, jehož aminoskupina je acylována mastnou kyselinou a hydroxylová skupina glykosylována. Tento typ sloučenin se nazývá glykosfingolipidy (br. 8) a objeveny byly ve 2. polovině 19. století. Podle struktury se dělí na neutrální a kyselé, kterým negativní náboj dodávají sialové nebo uronové kyseliny a dále sulfáty, fosfáty a fosfonáty mono a oligosacharidů. Nacházejí se v nervovém systému a mozku, příkladem je galaktosylceramid (br. 8) z mozku savců. Více glykosylované glykosfingolipidy jsou ve všech tkáních a nazývají se podle oligosacharidového řetězce, např.: ganglio ( DGal(1 H H H H H 18 H H N br. 7 Primární struktura glykosfingolipidu Sphingomonas paucimobilis

8 3) DGalNAc(14) DGal(14)DGlc), neolakto ( DGal(14) DGalNAc(13) D Gal(14)DGlc), isoglobo ( DGalNAc(13) DGal(13) DGal(14)DGlc) a další. Gangliosidy jsou kyselé glykosfingolipidy, které obsahují jednu nebo více sialových kyselin v poloze 3 nebo 6 Dgalaktosy nebo GalNAc kódovacího oligosacharidu (br. 9). Řada z nich jsou antigeny krevních skupin, mohou vyvolat autoimunitní poruchu, modifikují aktivitu funkčně naprosto rozdílných receptorů, např. gangliosid GM1 aktivuje nervový růstový faktor. Gangliosidy se účastní adhezních procesů, kde představují vazebná místa pro toxiny, viry H H gangliosid GM2 H H H H gangliosid GM3 H H NHAc H H HC H H H H HN H 12 H ( ) ( ) 16 H AcNH H ceramid NeuAc glukosylceramid br. 9 Struktura gangliosidu GM1, který je receptorem toxinu střevní cholery H H H H NHAc HC X H H H AcNH H a bakterie, kdy se cukerná část glykosfingolipidu váže na lektinový receptor pathogenu. Studie vztahu strukturaaktivita vedly k objevení řady látek použitelných jako léčiva, např. látka X je účinným antagonistou právě gangliosidu GM1. Poruchy v metabolismu gangliosidů mají obvykle fatální důsledky. Např. nedostatečná funkce hexosaminidasy A, která katalysuje biodegradaci gangliosidů, vede ke genetickému onemocnění nazvanému TaySachsova nemoc. Nebezpečně vysoká koncentrace gangliosidu GM2 v nervových buňkách mozku pak způsobí nevratné změny mentálních i fyzických schopností a dítě, které se zpočátku vyvíjí normálně, je postiženo slepotou, hluchotou, později dochází k atrofii a paralýze veškerého svalstva. Postižené dítě umírá obvykle kolem pátého roku věku. CtBu CtBu Sfingolipidy jsou nezbytné pro správnou funkci lidské kůže, kde přispívají ke vzniku permeační bariéry pro přenos vody. Tato bariéra je tvořena tenkou vrstvou tzv. keratinocytů, což je vysoce organizovaná lipidová matrice volných mastných kyselin, cholesterolu a ceramidů. 8

9 Hlavním a charakteristickým ceramidem je fytosfingosin (Dribo4hydroxysfingamin), který tvoří až 40 % z obsahu ceramidů a má v poloze 4 ceramidu další hydroxylovou skupinu, jejímž úkolem je pravděpodobně tvořit vodíkovou vazbu s molekulou vody, a tím ji ve struktuře kůže zadržovat. Mezi intenzivně studované glykolipidy patří glykosfingolipidy parazitů. dhaduje se, že 1/3 světové populace trpí střevními parazity. Zvláštností je to, jak se parazit adaptuje na přežití, neboť musí procházet během životního cyklu dramatickými změnami teploty, iontové síly, ph a rovněž různými imunitními systémy. Zdá se, že glykolipidy jako integrální součást povrchu parazita hrají důležitou roli v různých mechanismech nutných pro přežití. Hlísty využívají molekulární mimikry, aby zabránily imunogennímu rozpoznání, a jsouli poznány, snaží se obejít svoje zničení tím, že se aktivně účastní imunoregulačního mechanismu. V prvé řadě napodobují strukturu glykosfingolipidů hostitelského organismu, protože ty odpovídají za adhezi buněk. 4. Glykoproteiny, proteoglykany a peptidoglykan Jejich základní charakteristikou je kovalentní vazba sacharidů na peptid nebo protein. Glykoproteiny Jsou přítomny ve všech organismech a to jak v intracelulárním tak extracelulárním prostoru i v buněčných membránách (enzymy, antibody, receptory, hormony, cytokiny, strukturální proteiny). Jejich bohatým zdrojem je krevní sérum, které obsahuje více než 100 proteinů většinou glykosylovaných s výjimkou sérového albuminu. Glykoproteiny jsou polymorfní, což je svázáno se strukturou sacharidů: protein může nést různé oligosacharidy na stejném glykosylačním místě. Nejdříve převládal názor, že jde o náhodnou chybu při jejich synthese, teď se ale prokázalo, že za srovnávacích podmínek je populace glykoforem reprodukovatelná a regulovaná. Sacharidy v proteinech nemají jednotnou, unifikovanou funkci. bsah sacharidů je v nich různý pohybuje se od 1 hm% v kolagenu až po 99 hm% v glykogenu. Škála struktur vázaných sacharidů je pestrá a pokrývá mono, di, lineární i rozvětvené oligo a polysacharidy a jejich deriváty, a to i ve formě sulfátů nebo fosfátů. Nejčastěji jsou sacharidy vázány jako a Nglykosidy, ojediněle rovněž jako Cglykosidy, a nebo přes ethanolaminfosfát. Vazebným místem pro tvorbu Nglykosidů je asparagin a z jednoduchých sacharidů se váže nejčastěji Glu, Rha nebo GalNAc. Pro vznik glykosidů jsou využívány hydroxylové skupiny zejména serinu a threoninu, dále pak tyrosinu, hydroxyprolinu nebo hydroxylysinu. bvyklým vazebným místem je sekvence serin/threonin/prolin, které se říká mucinová doména. Z jednoduchých sacharidů jsou obvykle navázány GalNAc, GlcNAc, Fuc, Xyl, Glu, Gal, Man nebo Ara. Vazba přes ethanolaminfosfát využívá Ckoncové aminokyseliny 9

10 proteinu a dává stabilní, orientované připojení sacharidů na membránu obvykle na extracelulárním povrchu buňky. Toto spojení se nazývá glykosylfosfatidylinositolová (GPI) kotva (br. 10). H 2 N protein NH P Man H H H H H ethanolaminfosfát H H H GalNAc H H H GalGalGal H H H 2 N Gal R2 P diacylglyceroly R1 ceramid alkylacylglyceroly H mastné kyseliny br. 10 Minimální struktura GPI kotvy a některé strukturální variace Daleko častěji než monosacharidy jsou na glykoproteiny vázány oligosacharidy a to v těch nejrozmanitějších strukturách, jaké si dovedeme představit. Souborně se označují jako glykany. NGlykany becným motivem struktury Nglykanů je stálý pentasacharid jádra, který je připojen na asparagin (br. 11). Neskutečná diversita struktur Nglykanů má původ v tzv. tykadlových ( antennae ) oligosacharidech, které mohou být lineární i rozvětvené a připojené k jádru až v počtu pěti řetězců. Podle jejich struktury a způsobu připojení se rozeznávají čtyři základní skupiny tykadel: oligomannosa, komplexní, hybridní a nejnovější typ obsahující Dxylosu. Man( 16)[Man( 13)]Man( 14)GlcNAc( 14)GlcNAc( 1N) Asn pentasacharid jádra tykadlové oligosacharidy pentasacharid jádra Asn 10 br. 11 Schematická struktura Nglykanů

11 První typ obsahuje buď od dvou do šesti Dmannopyranosylových jednotek, nebo více jednotek (až devět) v kombinaci s Nacetylglukosaminem a nebo až jednotek jako v případě kvasinek. Komplexní Nglykany neobsahují žádnou Dmannosu kromě té vázané Skupina 1 Gal( 14)GlcNAc 1 Skupina 2 NeuNAc( 26)Gal( 14)GlcNAc 1 NeuNAc( 23)Gal( 14)GlcNAc 1 Gal( 3)Gal( 14)GlcNAc 1 Fuc( 2)Gal( 14)GlcNAc 1 Skupina 4 R Gal( 14)GlcNAc( 13) Gal( 14)GlcNAc 1 n RGal( 14)GlcNAc( 16)Gal( 14)GlcNAc 1 Skupina 3 NeuNAc( 23)Gal( 13)GlcNAc 1 NeuNAc( 26) 0,1 Gal( 13)GlcNAc 1 Fuc( 4) NeuNAc( 23)Gal( 13)GlcNAc 1 Fuc( 4) Gal( 14)GlcNAc 1 Fuc( 3) R Gal( 14)GlcNAc( 13) n NeuNAc( 23)Gal( 14)GlcNAc 1 NeuNAc( 28) NeuNAc( 23)Gal( 14)GlcNAc 1 n Fuc( 3) Skupina 5 NeuNAc( 23)Gal( 14)GlcNAc 1 S 3 (3 nebo 4)Gal( 14)GlcNAc 1 br. 12 Nejčastější struktury komplexních Nglykanů. Šipka naznačuje připojení na pentasacharid jádra. v jádře. bě Dmannosy jádra jsou glykosylovány až na pěti místech disacharidem Gal( 1 4)GlcNAc (Nacetyllaktosamin) s výhradně vazbou. Velice často je laktosaminová jednotka dále substituována přes sialové kyseliny nebo přímo (br. 12). ligosacharidy hybridních N glykanů spojují základní charakteristiky obou předchozích skupin Man( 16) jádra nese další jednu nebo dvě molekuly Dmannosy a Man( 13) má připojené jedno nebo dvě tykadlo typu, která se objevují v komplexních glykanech. Poslední skupina obsahuje charakteristicky Dxylosu vázanou na Dmannosu jádra vazbou 12 a často má ještě ( 13)vázanou Lfukosu na GlcNAc( 1N). Struktura Nglykanového cukerného epitopu je specifická pro buňku a je označována jako antigenní determinant. Jsou ve specifických cukerných epitopech jako např. antigeny krevních skupin H, A a B, které jsou složkami sfingolipidů na povrchu erythrocytů. Mají jen velmi malé rozdíly v určující struktuře tykadel, které ale mají dalekosáhlé důsledky. Sérum jedinců s krevní skupinou A obsahuje protilátky antib, zatímco krevní skupina B má protilátky antia. Skupina AB nemá protilátky žádné, neboť její erythrocyty nesou oba antigeny A i B. Lidé s krevní skupinou mají obě protilátky a jejich buňky neobsahují antigeny žádné. Antigen H je prekurzorem oligosacharidů A a B a je přítomen na povrchu buněk krevní skupiny. Struktura sacharidových epitopů jednotlivých krevních skupin je následující: H: Fuc( 12)Gal( 13 nebo 4)GlcNAc; A: GalNAc( 13)[Fuc( 12)]Gal( 13 nebo 4)GlcNAc; B: Gal( 13)[Fuc( 12)]Gal( 13 nebo 4)GlcNAc. 11

12 Glykany Tvoří rovněž velmi pestrou škálu cukerných motivů, které jsou navázány na hydroxylovou skupinu serinu nebo threoninu. Dělí se na dvě základní skupiny: glykany mucinového a nemucinového typu. První typ se nazývá mucinový proto, že byl poprvé identifikován v hlenu, a obsahuje až dvacet monosacharidů vázaných prostřednictvím N acetylgalaktosaminu. Formálně se glykany mucinového typu dělí na osm skupin podle NeuNAc( 26) 0,1 GalNAc( 1)Ser/Thr NeuNAc( 23) Gal( 13) 0,1 Gal( 14)GlcNAc( 13)Gal( 13)GalNAc( 1) Ser/Thr vazba na další oligosacharidy za vzniku antigenových determinantů sle x, Le x, Le y monosacharidů jádra (Gal, GalNAc, GlcNAc), na kterých jsou připojeny další tykadlové sacharidy (nejčastěji Fuc a NeuNAc). Základní struktura, GalNAc( 1)Ser/Thr, se nazývá Tn antigen a od něho se odvozuje řada glykanů (br. 13). bvykle tvoří klastry na krátkém úseku peptidové sekvence SerThrPro, které se taká říká mucinová doména. Důvodem je vyšší polarita mucinové domény a snadnější sterický přístup. Glykany nemucinového typu zahrnují větší výběr sacharidů jádra a místem glykosylace proteinu je opět hydroxylová skupina serinu nebo threoninu. Struktura jádra může být např.: Fuc( 1)Ser/Thr, Glc( 1)Ser, GlcNAc(( 1 )Ser/Thr, naopak Mann( 1)Ser/Thr není u savců běžná. 12 br. 13 Struktury některých glykanů generovaných z Tn antigenu. Rovněž glykany jsou pro organismus a jeho zdravotní stav velice důležité, neboť nesou antigeny krevních skupin, ale i antigeny rakovinných buněk a jsou rozpoznávací doménou pro buněčné interakce.proteoglykany Na proteiny jsou v nich vázány tzv. mukopolysacharidy, což jsou lineární glykosaminoglykanové polymery, které mají v řetězci 15 až několik set základních disacharidových jednotek. Vždy nesou záporný náboj a jejich základními jednotkami jsou N sulfátovaný Dglukosamin (GlcNS), GlcNAc a GalNAc, které se střídají s Gal, Dglukuronovou (GluA) nebo Lidouronovou (IdoA) kyselinou. Jsou zejména v pojivových tkáních, neboť tyto mukopolysacharidy jsou vysoce hydratované molekuly. Asi nejznámější je heparin, který se používá více než 60 let proti srážení krve, dále kyselina hyaluronová je součástí synoviální tekutiny očního sklivce nebo dermatansulfát přítomný v kůži (br. 14). Řada onemocnění jako je atherosklerosa, některé druhy rakoviny či Alzheimerova choroba se dávají do souvislosti s abnormalitami v biosynthese a opracování proteoglykanu.

13 GlcA( 13)GlcNAc( 14) H C H * H H NHAc n* hyaluronová kyselina IdoA( 13)GalNAc( 14) 3 S H * H H NHAc n* C dermatansulfát * H R H C R HN S 3 n IdoA( 14)GlcNAc( 14) heparin (R = H) a heparinsulfát (R = S 3 ) * br. 14 pakující se disacharidová jednotka některých mukopolysacharidů Peptidoglykan Je základním polymerem buněčných stěn gramnegativních i grampozitivních bakterií a H dříve se označoval jako murein. Jeho struktura má tři charakteristické základní složky: polysacharidovou matrici, pentapeptidový pobočný řetězec a mezipeptidové můstky (br. 15). Všechny peptidoglykany obsahují střídavě ( 14) vázaný N acetylglukosamin a N acetylmuramovou kyselinu (MurNAc) a to v počtu 5 45 jednotek. Struktura pentapeptidu je částečně proměnlivá, má obecnou sekvenci Ala DGluXaaDAlaD Ala, kde Xaa je Lys pro grampozitivní nebo mesodiaminopimelová kyselina pro gramnegativní bakterie. GlcNAc MurNAc NHAc H H H NHAc H NHAc H C H NHAc 3 H 3 C Ala Ala DGlu Xaa DAla DAla DAla DAla Xaa DGlu Ala CH 3 DGlu Xaa DAla DAla DAla DAla Xaa DGlu Ala CH 3 br. 15 Struktura peptidoglykanu grampozitivních a gramnegativních bakterií 13

14 Biologická role sacharidů v glykoproteinech Asi je příhodné si znovu zopakovat, že žádná unifikovaná funkce sacharidů navázaných na proteiny a peptidy není. Naopak mají řadu rozmanitých úkolů, z nichž některé jistě ani nejsou ještě známy. Vysoký obsah sacharidů v některých proteinech modeluje jejich fyzikálněchemické vlastnosti. Sialylace a sulfatace glykanů zvyšuje rozpustnost proteinů ve vodě. Proteoglykany se nacházejí v hlenovitých sekretech epitheliálních buněk; chrání jejich povrch tím, že zadržují vodu a fungují jako lubrikanty. V mimobuněčném prostoru způsobují elesticitu a zlepšují adhezi buněk. Krásným příkladem změn fyzikálních vlastností jsou protimrazové glykoproteiny antarktických ryb, které žijí stále ve vodě s teplotou 0 o C (br. 16). Ukázalo se, že tento glykoprotein způsobuje změnu tvaru ledových krystalků, které se vylučují jako malé drobné jehličky. Mají ochrannou a stabilizační funkci, dodávají proteinům vyšší tepelnou stabilitu. V současné době se poněkud pochybuje o významu glykanů jako ochranné vrstvičce proti rozpoznáváním proteasami nebo antibody. Mohou modulovat biologickou aktivitu a řada glykosylovaných enzymů je aktivnější. Mohou mít vliv i na sekundární strukturu peptidů. H H H H H H AcNH Thr Ala Ala br. 16 Struktura protimrazového proteinu n Nejdůležitější funkcí je jejich účast v řadě fyziologických a pathologických procesů, kde slouží jako rozpoznávací markery. Tak se účastní adheze infekčních buněk na buňku hostitelskou, zrání a směrování leukocytů, interakcí imunitního systému nebo tvorby a diferenciace rakovinných buněk a jejich metastáz a dalších životně důležitých pochodů. Porozumění tomu, jakými mechanismy sacharidy při těchto dějích vystupují, je velice důležité, protože rozpoznávání je vždy první fázi onemocnění a cíleně zasáhnout v tomto okamžiku je samozřejmě žádoucí. becně hledání inhibitorů tohoto děje sleduje dva základní motivy: aktivitu proti biosynthese glykokonjugátů a nebo interferenci s glykokonjugáty v procesu rozpoznávání. Přes obrovské úsilí vědců jsou zatím pokroky v hledání léčiv a vakcín na bázi sacharidů poněkud problematické. Důvodů je několik. Prozatím chybí metodika porovnatelná se synthesou peptidů na pevném nosiči, modifikace polyfunkčních molekul jsou vždy obtížné a drahé a sacharidy obecně mají dosti nevhodné vlastnosti pro použití jako léčiva: jejich afinita k proteinům je nízká a podávané orálně jsou inaktivní, protože jsou hydrolyzovány snadno enzymy in vivo. Mohou být proto podávány pouze injekčně pro léčbu akutních symptomů, ale i tak mohou podléhat 14

15 ataku glykosidas např. v séru. Afinitu k proteinům zvyšují do jisté míry polyfunkční interakce. Z uvedených důvodů je často výhodné nahradit sacharidy látkami, které napodobují jejich strukturu a funkci v procesu rozpoznávání, ale které mají lepší stabilitu, specificitu, afinitu a synthetickou dostupnost (viz dále). Porozumění procesu rozpoznávání a definování role sacharidů je proto velice důležité. Protože se na rozluštění sacharidového kódu účastní proteiny pomocí nevazebných interakcí, je přirozeně studium těchto interakcí sacharidů s proteiny prvním nezbytným krokem. Výjimečné místo patří v tomto směru interakcím s lektiny. 5. Interakce sacharidových epitopů s lektiny Lektiny jsou proteiny, které vážou mono a oligosacharidy reverzibilně a s vysokou specifitou, ale současně nevykazují žádnou katalytickou aktivitu a narozdíl od antibodů nejsou ani produktem imunitní reakce organismu. Každý lektin obsahuje typicky dvě nebo více domén rozpoznávající sacharidy (tzv. carbohydrate recognition domain, CRD), jinými slovy jsou di až polyvalentní. Proto také, když reagují s buňkami, např. erythrocyty, nejenže vážou sacharidy na jejich povrchu, ale vyvolávají i zesíťování buněk a jejich následné srážení, které se nazývá aglutinace. Tato vlastnost je charakteristická a základní pro všechny lektiny. Lektiny mohou stejným způsobem srážet polysacharidy nebo proteiny. ba děje, aglutinace a srážení, jsou inhibovány sacharidovými ligandy, pro které jsou lektiny specifické. Lektiny, resp. receptory lektinového typu, jsou ve všech organismech, od virů a bakterií přes rostliny až k živočichům a savcům. Tvoří heterogenní skupinu oligomerních proteinů, které se liší velikostí, strukturou i stereochemií svých CRD domén, ale lze vystopovat jisté podobnosti v sekvencích aminokyselin. Lektiny byly poprvé isolovány z rostlin, a to v roce 1919 z fazolí a dnes známe v luštěninách již více než 100 zástupců. Velice známý a klasický je konkavalin A z Canavalia ensiformis nebo toxin ricin z Ricinus communis. Je prakticky neuvěřitelné, že role lektinů v rostlinách je dodnes prakticky neznámá. Základními metodikami studia interakcí sacharidů s lektiny jsou NMRspektrometrie, krystalografie, hmotnostní spektrometrie, mikrokalorimetrie, počítačová chemie a zcela nová metodika surface plasmon resonance. V dalším textu bude uveden základní přehled o lektinech z hlediska jejich specifity k sacharidovým epitopům a funkce v živém organismu. Lektiny se formálně člení na jednoduché a mozaikové. Jednoduché mají molekulovou hmotnost pod 40 kda a vedle CRD mohou obsahovat další domény. Patří sem všechny rostlinné a z živočišných lektinů jen galektiny (dříve zvané Slektiny). Mozaikové lektiny obsahují několik druhů vazebných míst, z nichž jenom jedno má vlastnosti SRD. Patří sem virové hemoaglutininy na jedné straně a živočišné C, P a I lektiny na straně druhé. 15

16 Galektiny Tato rodina lektinů specifická pro Dgalaktosidy se obvykle nachází uvnitř buňky v cytoplasmě a buněčném jádru, někdy ale jsou přítomny i na buněčném povrchu a v extracelulárním prostoru. Galektiny mají afinitu i vůči Dglukosidům a laktose. Předpokládá se, že mají rozhodující roli při normálním rozvoji a dělení buněk. Zvýšená koncentrace galektinu3 přítomného na povrchu rakovinných buněk může být odpovědná za adhezi těchto buněk v cílových orgánech, kroku nezbytném pro tvorbu metastáz. Inhibitory tohoto procesu mohou mít účinky protimetastázové. Byly objeveny i protilátky proti galalektinům; např. sérum pacientů s Hodgkinsovým sarkomem obsahovalo v 50 % případů protilátku proti galektinu9, zatímco sérum zdravých osob či osob postižených jiným nádorovým onemocněním žádné takové protilátky neobsahovalo. Zdá se, že se otevírají nové therapeutické a diagnostické cesty i pro galektiny. CLektiny Tato rodina lektinů vyžaduje pro interakci se sacharidy přítomnost vápenatého kationtu. Dělí se na několik dalších podskupin. Endocytické lektiny jsou receptory vázané v buněčné membráně např. v játrech, a mají různou specifitu (Gal, GalNAc, Man, Fuc). V tradičním pojetí se považovaly za regulátory sérových glykoproteinů, ale dnes je jisté, že jejich funkce je mnohem komplexnější. Např. povrch makrofágů obsahuje lektinový receptor specifický pro Dmannosu a na něj se váže na D mannosu bohatý glykan z povrchu bakterie, kterou makrofág usmrtí tzv. lektinofagocytosou. Tento typ obrany, která není závislá na tvorbě protilátek, je znám jako součást vrozené imunity. Selektiny zprostředkovávají adhezi cirkulujících leukocytů na výstelku cévních stěn, což je první krok pro přenos leukocytů z cirkulačního systému a pro jejich další migraci do tkáně. Rozpoznávacím epitopem je terminální tetrasacharid, sialyllewisx (sle x ). Lselektin je pověstný jako naváděcí receptor, je přítomen na všech leukocytech a zabezpečuje recirkulaci lymfocytů tím, že je směruje do obvodových lymfatických uzlin. E a Pselektiny jsou vytvářeny na povrchu výstelky cévních stěn jen tehdy, jsouli tyto buňky aktivovány mediátory (např. interleukin2) uvolňovanými ze tkáně jako odpověď na poranění, ischémii nebo infekci. Afinita sle x je k různým selektinům různá, jak vyjadřují následující disociační konstanty (mm): E selektin, 0,7; Pselektin, 8; Lselektin, 4. PLektiny Tyto lektiny jsou specifické pro rozpoznávání Dmannosa6fosfátu a slouží pro nasměrování lysosomálních enzymů na místo určení. Pokud nemá enzym tento sacharidový epitop, pak není Plektiny rozpoznán a je vyloučen do mimobuněčného prostoru. 16

17 ILektiny Rodina Ilektinů je poměrně úzká a rozpoznává sialovou kyselinu při nejrůznějších interakcích buněk. Sialoadhesin a lektin CD22 jsou součástí imunitního systému. Jiné lektiny V poslední době byl objeveno několik intracelulárních lektinů, které se účastní biosynthesy glykoproteinů, jejich roztřídění a transportu na povrch buňky. Z nich lektin zvaný kalnexin je v endoplasmatickém retikulu, kde se váže na terminální Dglukosu nově tvořeného glykoproteinu a kontroluje tak správnost sestavení glykanu. Jeho úlohou je být jakousi gardedámou glykoproteinu. Příklady interakce sacharidů s lektiny Interakce sacharidů s lektiny řídí například adhezi virů a bakterií při infekcích. Zajímavým příkladem je úloha lektinu (někdy se tento typ nazývá obecně adhesiny) baktérie Escherechia coli K99. Tento organismus se váže na glykolipid nesoucí Nglykolylneuraminovou kyselinu. Zatímco střevní stěna nově narozených selátek obsahuje glykolipid s navázanou N glykolylneuraminovou kyselinou a je pro ně tato infekce často smrtelná, dospělá prasata už tento sacharidový epitop nemají, a tudíž neonemocní. Patogenní baktérie Helicobacter pylori, která způsobuje u člověka gastroduodenální vředy a pravděpodobně i rakovinu žaludku, rozpoznává na hostitelské buňce celou řadu sacharidů včetně 3 sialyllaktosy a oligosacharidu Lewis b. Nedávno bylo prokázáno v klinickém testu, že orální podání NeuNAc( 23)laktosy pacientům postiženým masivní infekcí touto bakterií, vyvolalo výrazný pokles počtu kolonií baktérie v trávicím traktu. Dalším příkladem specificky druhové interakce sacharidového epitopu s receptorem lektinového typu je oplodnění vajíčka savců, tedy i člověka. všem než oplodnění nastane, probíhají i jiné interakce. Spermie, která se ocitne v samičím reprodukčním ústrojí, je nejprve pomocí adhezinů přichycena na epitel např. vejcovodu, čímž se spustí kaskáda dějů nazvaných kapacitace. Dochází k redistribuci membránových proteinů, snižuje se obsah cholesterolu v membráně, vytváří se vazebná lektinová doména a aktivuje se motilita spermie. Vajíčko má na svém extracelulárním povrchu vrstvu glykoproteinů obsahující i Nglykany br. 17 Interakce vajíčka a spermie zvanou zóna pelucida (ZP), která představuje primární vazebné místo pro spermii, po navázání iniciuje děj zvaný akrosomální a posléze zabrání jiné spermii se na vajíčko zachytit. Hlavní složkou ZP jsou tři glykoproteiny označované 17

18 jako ZP1, ZP2 a ZP3, z nichž ten poslední odpovídá se druhovou specifitu interakce. Po interakci jeho glykanového epitopu na lektinový receptor spermie za účasti sekundárního vazebného místa dojde k uvolnění vápenatých kationtů, které následně spustí akrosomální děj ve spermii (br. 17). Tento děj umožňuje spermii proniknout ZP a následně i membránou vajíčka. 6. Taktika hledání analogů sacharidových epitopů Jak už bylo naznačeno v kapitole 4, komplexní sacharidy nemusejí být až tak ideálními kandidáty pro vývoj nových léčiv, proto hledání jejich mimetik, která budou stabilnější, aktivnější a strukturně jednodušší, je atraktivní předmět současného výzkumu. becně lze taktiku jejich hledání rozdělit do několika základních kroků: definování struktury přirozeného sacharidového epitopu a identifikace příslušného proteinu, studium orientace sacharidu ve vazebné doméně proteinu, definování základních strukturních znaků sacharidu nezbytných pro jeho přirozenou biologickou funkci, synthesa analogu a ověření jeho afinity k vazebnému místu proteinu. Často studovaným případem pro therapeutickou intervenci je interakce oligosacharidu sialylle x (sle x, br. 18) s Eselektinem a lze na něm dobře demonstrovat zásady uvedené výše. Interakce nastává hned zpočátku reakce organismu na poškození a představuje jeden z iniciačních kroků tvorby a směrování bílých krvinek, jehož sacharidovým epitopem je právě sle x. Chyba v tvorbě a nadprodukce leukocytů mohou mít pro organismus fatální následky. Mnohá zánětlivá onemocnění a to jak akutní (septický šok) tak chronická (asthma, arthritida) by Fuc H H H 3 C H Gal H H NHAc HC H H H H H GlcNAc H AcNH H NeuAc br. 18 Struktura oligosacharidu sle x mohla být léčena antagonisty této interakce. Dalším polem působnosti je chemotherapie nádorových onemocnění, protože je známo, že právě tato interakce je odpovědná za vysokou tendenci některých tumorů vytvářet metastáze. Na základě známé konformace sle x vázané na E a P selektiny odvozené z NMR měření doplněné výsledky krystalografických studií lektinových vazebných domén byly definovány důležité funkční skupiny v molekule, které jsou nezbytné pro vznik vazby na lektiny. Pro rozpoznání Eselektinem jsou rozhodující všechny tři hydroxylové skupiny na L 18

19 fukose, z nichž ty v poloze C3 a C4 koordinují vápenatý kation stejným způsobem jako D mannosa v doméně proteinů vázajících Dmannosu. Skutečně náhrada Lfukosy za Dmannosu nevede v tomto případě ke ztrátě vazebných schopností. Stejně důležitá je přítomnost volných hydroxylových skupin v poloze C4 a C6 Dgalaktosy a karboxylová skupina sialové kyseliny. Molekula GlcNAc nepřispívá k interakcím žádnou svojí funkční skupinou a může být principiálně nahrazena řadou bifunkčních spojovacích členů. Strana B Dgalaktosy i sialové kyseliny jsou pravděpodobně v kontaktu s nepolárními plochami vazebné domény Eselektinu a skutečně částečné nahrazení sacharidů aromatickými či jinými hydrofóbními jednotkami vedlo ke zvýšení afinity k Eselektinu. Takovým způsobem byly připraveny antagonisté sle x s velice dobrou aktivitou k Eselektinu (br. 19). H 3 C C C 10x CH 3 H H H H H H H 5x H H H N C ( ) 3 H H Aktivita sle x = 1 H H H H CNH CEt C Bn H H H 10x 1,1x H H H H H 20x C ( ) 3 CNH CN CNH(CH2 ) 13 CH 3 br. 19 Analogy sle x a jejich relativní aktivity vůči Eselektinu Jiným a rovněž velmi účinným přístupem k novým perspektivním strukturám je napodobovat polyvalentní charakter leukocytů tím, že se buď sle x nebo odvozená struktura zabuduje do liposomů nebo lineárních polymerů. Hlavně liposomy jsou v centru pozornosti díky své schopnosti doručit léčebné agens cíleně přímo do tkáně. Látky těchto (br. 20) a podobných struktur mají více než stonásobně vyšší afinitu k Eselektinu než má sle x, a proto jsou velice perspektivní skupinou potenciálních farmak. Jejich nevýhodou je samozřejmě v tomto okamžiku cena, ale i to, že často působí nespecificky. 19

20 HC H H H AcNH H spojka H H H H H H H H H Et NH H spojka H S N ) ( N 4248 H P C 17 H 35 C 17 H 35 br. 20 Polyvalentní analog sle x 7. Závěr Přehled glykokonjugátů a příklady v tomto textu uváděné jsou jen letmým pohledem na obsáhlou a neustále se vyvíjející oblast bádání a naznačují pouze směry, kterými se vývoj ubírá. Každá kapitola by si zasloužila samostatné pojednání a dokonce jsou témata, o kterých není ani zmínka, jako např. glykosidová antibiotika. Glykobiologie je bezesporu dnes vědním oborem na výsluní zájmu a nejlepším dokladem toho, jak je užitečné učit se od moudré matky přírody. 8. Seznam použité literatury 1. Bertozzi C. R., Kiessling L. L.: Chemical Glycobiology. Science 2001, 291, Danishefsky S. J., Allen J. R.: From the Laboratory to the Clinic: A Retrospective on Fully Synthetic CarbohydrateBased Anticancer Vaccines. Angew. Chem. Int. Ed., 2000, 39, Davis A. P., Wareham R. S.: Carbohydrate Recognition through Noncovalent Interactions: A Challenge for Biomimetic and Supramolecular Chemistry. Angew. Chem. Int. Ed., 1999, 38, Fulton D. A., Stoddart J. F.: Neoglycoconjugates Based on Cyclodextrins and Calixarenes. Bioconjugate Chemistry 2001, 12, Gabius H.J.: Glycohistochemistry: The Why and How of Detection and Localization of Endogenous Lectins. Anat. Histol. Embryol., 2001, 30, Kolter T., Sandhoff K.: SphingolipidsTheir Metabolic Pathway and the Pathobiochemistry of Neurodegenerative Diseases. Angew. Chem. Int. Ed., 1999, 38, Leffler H.: Introduction to Galectins, Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 1997, 9,

21 8. Lis H., Sharon N.: Lectins: CarbohydrateSpecific Proteins That Mediate Cellular Recognition. Chem. Rev., 1998, 98, Ritter T. K., Wong C.H.: CarbohydrateBased Antibiotics: A New Approach to Tackling the Problem of Resistance. Angew. Chem. Int. Ed., 2001, 40, Wassarman P. M., Jovine L., Litscher E. S.: A Profile of Fertilization in Mammals. Nat. Cell Biology, 2001, 3, E59E Wassarman P.M., Litscher E. S.: Towards the Molecular Basis of Sperm and Egg Interaction during Mammalian Fertilization. Cells Tissues rgans, 2001, 168, Wong C.H., Sears P.: Carbohydrate Mimetics: A New Strategy for Tackling the Problem of CarbohydrateMediated Biological Recognition. Angew. Chem. Int. Ed., 1999, 38, Wong C.H., Sears P.: Intervention of Carbohydrate Recognition by Proteins and Nucleic Acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, Zara J., Naz R. K.: The Role of Carbohydrate in Mammalian SpermEgg Interactions: How Important Are Carbohydrate Epitopes? Frontiers in Bioscience, 1998, 3,