HPLC ANALÝZA LÉČIV II.

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv HPLC ANALÝZA LÉČIV II. Diplomová práce Hradec Králové 2010 Markéta Juříčková

2 Prohlášení Prohlašuji, že tato diplomová práce je mým původním autorským dílem a veškeré myšlenky, data a jejich zdroje, z kterých jsem pro zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury. Diplomová práce vznikla za podpory grantu SVV dubna 2010 Markéta Juříčková 2

3 Poděkování Upřímně děkuji RNDr. Jaroslavu Sochorovi, CSc. za odborné vedení mé práce, ochotu a cenné rady. Dále děkuji za pomoc a informace ostatním pracovníkům katedry farmaceutické chemie a kontroly léčiv. 3

4 OBSAH 1. Úvod Teoretická část Chromatografické metody Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Základní části kapalinového chromatografu Zásobníky mobilní fáze Vysokotlaká čerpadla Tlumiče pulsů Dávkovací zařízení Chromatografická kolona Detektory Počítače Parametry chromatografického procesu Kvantitativní hodnocení léčiv pomocí HPLC Využití HPLC Úprava biologických vzorků Přímá injekce vzorku na kolonu Deproteinace vzorku Extrakce do organického rozpouštědla Extrakce vzorku na pevných fázích Extrakce iontových párů Hydrolýza konjugovaných léčiv Mikroextrakce tuhou fází (SPME) Vlastnosti kyseliny tiaprofenové Údaje získané z literatury (rešerše) Cíl práce Experimentální část Použitý materiál Příprava roztoků Chromatografické podmínky analýzy Izolace léčiva z biologického materiálu

5 5. Výsledky a diskuse Určení chromatografických podmínek Izolace kyseliny tiaprofenové metodou SPME Kvantitativní hodnocení ve vzorku plasmy Závěr Literatura 52 5

6 1. Úvod 6

7 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie High Performance Liquid Chromatography (HPLC) je jednou z nejvíce se rozvíjejících se analytických metod. Základy kapalinové chromatografie (LC) položil botanik Cvet již v roce První zařízení pro HPLC bylo vynalezeno až roku Byly vyvinuty vhodné stacionární fáze a citlivé detektory a bylo dosaženo reprodukovatelných průtoků mobilní fáze procházející kolonou pod vysokým tlakem. Mikroextrakce tuhou fází Solid Phase Microextraction (SPME) je jednoduchá sorpční a desorpční technika zakoncentrování analytu. Technika byla vyvinuta začátkem 90. let 20. století Januszem Pawliszynem a jeho spolupracovníky na Univerzitě Waterloo v kanadském Ontariu a během několika málo let se rozšířila do mnoha světových laboratoří. Lze ji zkombinovat s plynovou nebo kapalinovou chromatografií. 3) 1), 2) 7

8 2. Teoretická část 8

9 2.1. Chromatografické metody Chromatografické metody patří mezi metody separační, které zároveň umožňují analýzu směsí. Slouží jak ke kvalitativnímu tak kvantitativnímu hodnocení separovaných složek směsi. Při chromatografii dochází k dělení analyzovaných látek mezi dvěma fázemi stacionární (nepohyblivou) a mobilní (pohyblivou). Stacionární fáze může být tuhá nebo kapalná a zadržuje jednotlivé součásti analyzované směsi. Naopak mobilní fáze bývá kapalná nebo plynná a její schopností je vymývat jednotlivé součásti směsi z nepohyblivé fáze a unášet je ve směru toku. Principem separace je tedy různá afinita dělených látek ke stacionární a mobilní fázi. 4), 5) Rozdělení: 4), 5), 6), 7), 8) a) podle povahy mobilní fáze: plynová chromatografie (GC) mobilní fází je plyn kapalinová chromatografie (LC) mobilní fází je kapalina podle způsobu provedení: kolonová (sloupcová) - stacionární fáze je v koloně plošná (planární) - papírová (PC) - stacionární fáze je upravená celulóza - tenkovrstvá (TLC) - stacionární fáze je suspenze sorbentu v podobě tenké vrstvy b) podle principu separace: adsorpční (LSC) využívá rozdílné adsorpce molekul analytů na povrchu tuhé fáze s aktivními centry, stacionární fází je silikagel, oxid hlinitý rozdělovací (LLC) využívá rozdílné rozpustnosti (a tudíž i rozdílné distribuce) molekul analytů mezi dvěma zcela nemísitelnými kapalinami nebo u plynové chromatografie nosného plynu a kapaliny, stacionární fází je kapalina 9

10 iontově výměnná (IEC) využívá rozdílné výměnné adsorpce analytů (iontů) na povrchu iontového měniče, stacionární fází jsou iontoměniče (katexy nebo anexy) gelová permeační (GPC) využívá mechanického dělení molekul analytů v pórech gelu na základě jejich rozdílné velikosti c) podle způsobu vyvíjení: eluční nejčastěji, složky vzorku jsou na koloně vázány silněji než složky mobilní fáze. Vymývají se v pořadí podle intenzity interakce se stacionární fází a jsou vzájemně odděleny čistou mobilní fází. Mění-li se složení mobilní fáze s časem, jedná se o gradientovou eluci. vytěsňovací - zřídka, používá se mobilní fáze, která se na stacionární fázi váže silněji než složky vzorku. Složky vzorku jsou úplně vytěsňovány ze stacionární fáze a vycházejí z kolony před silně se sorbujícími složkami mobilní fáze. frontální téměř vůbec, na kolonu se zavádí vzorek kontinuálně, rozpuštěn v mobilní fázi. V čistém stavu lze získat pouze nejslaběji vázanou složku. d) podle účelu: analytická - k identifikaci a kvantifikaci jednotlivých složek zkoumané směsi preparativní (preparační) k rozdělení jednotlivých složek směsi od sebe 10

11 2.2. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Vysokoúčinná kapalinová chromatografie je separační metodou, kterou lze hodnotit separované složky směsi kvalitativně i kvantitativně. K jejím hlavním přednostem patří rychlost analýzy, vysoká selektivita, citlivost stanovení, minimální množství vzorku, možnost automatizace. HPLC záznam dává podrobné informace o identitě, obsahu a čistotě sledovaného vzorku. 4), 9) 2.3. Základní části kapalinového chromatografu Části kapalinového chromatografu zabezpečují transport mobilní fáze, dávkování vzorku, separaci látek a jejich detekci. Existují dva typy uspořádání stavebnicový (modulární) s možností flexibilní přestavby a kompaktní (skříňový) charakterizován fixním uspořádáním jednotlivých komponent přístroje. Při izokratické eluci je mobilní fáze vedena z jednoho ze zásobníků do vysokotlakého čerpadla. Při gradientové eluci se proudy z obou zásobníků mísí podle programu ve směšovači, který je umístěn před nebo za vysokotlakým čerpadlem. Čerpadlo tlačí mobilní fázi přes dávkovací zařízení na kolonu. Kolona je spojena s detektorem, který umožňuje přenos upraveného signálu do počítače. 10) 1), 2) Obr. 1: Schéma kapalinového chromatografu 11) 11

12 Zásobníky mobilní fáze 1), 2) Zásobníky mobilní fáze jsou skleněné nebo nerezové nádoby, které mají obsah do dvou litrů a jsou chráněny před světlem a otevřeným ohněm. Důvodem je práce s hořlavými a těkavými rozpouštědly. Je nutné používat odplyněná a chemicky čistá rozpouštědla. Odplynění lze provést buď héliem nebo ultrazvukem a nověji taky degaserem. Bublinky plynu by způsobily kolísání tlaku v chromatografickém systému. Nečistot se zbavíme přefiltrováním nebo použijeme rozpouštědla určená přímo pro HPLC. Částečky větší než 5 µm by mechanicky poškodily čerpadlo. 1), 2) Vysokotlaká čerpadla (pumpy) Pumpy mají tvar válce. Jejich úkolem je dopravovat mobilní fázi konstantním průtokem a s minimem tlakových pulsů, eventuálně zajistit mísení mobilní fáze pro gradientovou eluci. Čerpadla jsou rozdělována na pulsní a bezpulsní. Pulsní čerpadla mají malý objem pracovní komory a potřebný průtok je vytvořen opakovaným stlačením a vypuzením mobilní fáze z pracovní komory čerpadla. Bezpulsní mají velký objem pracovní komory ( ml) a umožňují provést řadu analýz bez opětného plnění, tím poskytují hladší průtok mobilní fáze, ale mají horší přesnost tvorby gradientu. Existují různé typy čerpadel pneumatická, s mechanickým pohonem, pracující na principu velkoobjemové injekční stříkačky, s malým objemem činné části, pístová a membránová Tlumiče pulsů 1) Princip tlumičů spočívá v zachycování tlakových nárazů, toho se dosáhne zapojením odporových (v sérii) nebo kapacitních (paralelně) elementů. Nevýhodou tlumičů je zavádění mrtvých prostor do systému. 12

13 Dávkovací zařízení 1), 4), 6) Dávkovací zařízení slouží k nadávkování roztoku vzorku na kolonu. To lze provést speciální injekční mikrostříkačkou, dávkovacím ventilem nebo autosamplerem. Dávkování mikrostříkačkou je již zastaralý způsob, který umožňoval dávkovat různé objemy. Používali se k tomu buď vhodná septa nebo bezseptová zařízení. Jednodušší však bylo dávkování při přerušení toku mobilní fáze stop flow. Vysokotlaké dávkovací ventily umožňují dávkovat i při tlaku 60 až 80 MPa. Dávkované množství je dáno objemem vnitřního prostoru ventilu nebo při zařazení dávkovací smyčky objemem smyčky. Autosamplery (automatické dávkovače) jsou spojené se zásobníkem vzorku, ve kterém jsou umístěny vialky uzavřené pryžovým septem nebo perforovanou zátkou z polypropylenu. Existuje několik typů konstrukčního spojení injekční stříkačky dávkovače se zásobníkem: a) Injekční stříkačka dávkovače je fixní a pohybuje se pouze zásobník vzorku pod zvednutou jehlou injekční stříkačky dávkovače, jejíž píst je ovládán speciálním krokovým motorem. b) Zásobník vzorků je fixní a pohybuje se raménko injekční stříkačky dávkovače. c) Zásobník i injekční stříkačka dávkovače jsou fixní, vialka je roboticky dopravena pod zvednutou jehlu injekční stříkačky dávkovače Chromatografická kolona 1), 4), 6) Kolona má rozhodující význam pro kvalitu chromatografické separace. Účinnost kolon závisí na kvalitě použitého sorbentu, na její délce a tvaru, na materiálu, z něhož je vyrobena, jejím vnitřním povrchu, na spojovacích součástech, ale i na způsobu plnění, velikosti mrtvých objemů v systému. Kolony pro HPLC jsou ocelové nebo skleněné trubice 5 30 cm dlouhé o vnitřním průměru 2 8 mm naplněné stacionární fází. Náplň kolony musí být homogenní a rovnoměrná. 13

14 Skleněné kolony jsou určeny pro tlaky do 10 MPa. Nejvhodnější jsou tlustostěnné trubice z borosilikátového skla, které odolávají i silně kyselým roztokům. Pro tlaky vyšší než 50 MPa se používá nerezová ocel. Platí, že čím menší je zrnění sorbentu, tím je kolona kratší, a čím je kolona kratší, tím bude nejspíš kvalitněji naplněna. Náplně kolon se připravují z pórovitých anorganických materiálů nebo z organických polymerů. Nejčastěji se používají sorbenty na bázi silikagelu nebo oxidů kovů (zejména oxidu zirkoničitého, dále oxidu titaničitého, oxidu hlinitého), buď bez úprav (normální fáze) nebo chemicky modifikované (reverzní fáze). Náplň konvenční kolony tvoří jednotlivé částice kulovitého tvaru o přesně definované velikosti, kdežto výplň monolitické kolony tvoří jeden kus pórovitého materiálu, který vzniká zesítěním polymerní směsi. Sorbenty: 1) nepolární uhlovodíkové řetězce (C 18, C 8 ) 2) středně polární skupiny NH 2, -CN 3) polární diolové skupiny Detektory 1), 4) Detektor slouží ke kvalitativní a kvantitativní analýze vzorku. Vlastnosti roztoku sleduje pomocí snímače. Signál jde pak přes zesilovač do zapisovače, který zaznamenává závislost intenzity daného signálu na čase. Požadavky na detektory jsou vysoké. Patří mezi ně vysoká citlivost, reprodukovatelnost, linearita odezvy v co nejširším rozmezí koncentrací, dostatečně velký poměr mezi šumem a měřenou hodnotou, nezávislost odezvy na změně složení mobilní fáze při gradientové eluci, univerzálnost. Přehled nejčastěji používaných detektorů: 1), 2), 5) Spektrofotometrické detektory Při HPLC analýze léčiv jsou spektrofotometrické detektory využívány nejčastěji. Vyznačují se značnou citlivostí (10-9 až g /ml) a mohou být použity při gradientové eluci. Proměřují absorbanci roztoku protékající celou 14

15 detektoru. V praxi se uplatňují hlavně UV detektory, případně UV VIS detektory. UV detektory s fixní vlnovou délkou (254 nebo 280 nm, při kterých absorbuje většina léčiv) jsou jednoduché a levné UV VIS detektory s proměnnou vlnovou délkou ( nm) jsou nákladnější, hodí se pro výzkum rapid scanning detektory snímají celé UV spektrum během pár sekund pomocí rotujícího zrcadla diode array detektory (detektory s diodovým polem) hodnotí látku současně při několika vlnových délkách, jsou řízeny počítači a výsledkem je trojrozměrný chromatogram Fluorimetrické detektory (fluorescenční) Fluorescenční detekce se využívá pro léčiva vykazující fluorescenci nebo látky, které lze reakcí s vhodnými činidly převést na fluoreskující deriváty. Mají vyšší citlivost než UV detektory (10-9 až g/ml), jsou selektivnější a lze je použít při gradientové eluci. Principem fluorescence je vybuzení elektronů na vyšší energetické hladiny pomocí excitační energie a měřeno je emisní záření vyzařované při návratu elektronů na základní hladinu. Tyto detektory se uplatňují při kontrole a ochraně životního prostředí. Elektrochemické detektory Elektrochemické detektory založeny na elektrochemické reakci (nejčastěji redoxní) probíhající na rozhraní elektroda roztok. Elektrody mohou být vyrobeny z uhlíkatého skla, uhlíku nebo rtuti. Detekují vztahy mezi elektrickými veličinami a koncentrací analyzované látky na základě změny vodivosti nebo změny náboje. Jsou velmi citlivé (10-9 až g/ml), ale nelze je většinou využít při gradientové eluci. 15

16 Refraktometrické detektory Při použití refraktometrů se měří rozdílný index lomu mezi mobilní fází a roztokem analyzované látky. Jsou univerzální, ale mají mnohem menší citlivost (10-6 g/ml) než předešlé detektory a nelze je využít při gradientové eluci. Další nevýhodou je nutnost udržování konstantní teploty pomocí termostatu. Měřený index lomu je totiž závislý na teplotě. Hmotnostní spektrometrie (MS) Molekuly léčiva jsou v hmotnostním spektrometru ionizovány různými způsoby - např. ionizace elektrosprejem, laserem, metodou APPI, APSI apod. Nabité částice jsou v magnetickém nebo vysokofrekvenčním poli separovány podle hmotnosti a náboje. Zaznamenáno je hmotnostní spektrum, což představuje četnost iontů ve vztahu k poměru hmotnost/počet nábojů. Spojení HPLC MS je vysoce selektivní a citlivé, ale ekonomicky náročné Počítače 2), 5) Počítač zpracovává signál přijatý z detektoru, dává možnost tisku, kontroluje a řídí chod celého chromatografu. Vše se ukládá do paměti, později je možno navodit stejné podmínky. Technika odstraňuje případné lidské chyby, umožňuje větší flexibilitu ve volbě parametrů a zajišťuje jejich maximální reprodukovatelnost. Výhodou je také možnost naprogramovat sled analýz na několik hodin. 16

17 2.4. Parametry chromatografického procesu 6), 12) Retenční čas Retenční čas je doba, která uplyne od nástřiku vzorku do dosažení maxima eluční křivky. Z retenčního času t R může být vypočítán retenční objem V R podle vzorce: V R = t R v kde v je průtoková rychlost mobilní fáze. Hmotnostní distribuční objem (retenční faktor, kapacitní faktor) Hmotnostní distribuční objem D m je definován jako poměr množství rozpuštěné látky ve stacionární fázi ku množství rozpuštěné látky v mobilní fázi. Vypočítá se dle vztahu: D m = K c (V s / V m ) kde K c je distribuční konstanta, V s objem stacionární fáze a V m objem mobilní fáze. Hmotnostní distribuční objem je tedy mírou retence solutu v koloně, tzn. čím je hodnota D m větší, tím více je solut v koloně zadržován a je eluován později. Faktor symetrie (faktor chvostování píku) Faktor symetrie píku A s se vypočítá ze vzorce: A s = w 0,05 / 2d kde w 0,05 je šířka píku v jedné dvacetině jeho výšky a d je vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině jeho výšky. Hodnota faktoru symetrie 1,0 značí úplnou (ideální) symetrii píku. 17

18 Rozlišení Rozlišení R s je vyjádření míry kvality separace dvou sousedních elučních křivek. Obecně je definováno: R s = 1,18 (t R2 t R1 ) / w h1 + w h2 kde t R2 a t R1 jsou retenční časy (t R2 > t R1 ), w h1 a w h2 jsou šířky píku v poloviční výšce. Rozlišení větší než 1,5 odpovídá rozdělení píků na základní linii Kvantitativní hodnocení léčiv pomocí HPLC 9) Základem kvantitativního hodnocení je plocha (výška) chromatografického píku. Pro zjištění obsahu a identifikaci látky ve směsi se využívá metoda vnějšího nebo vnitřního standardu. Metoda vnějšího standardu má dva kroky. Nejdříve se nastříkne roztok analyzovaného vzorku, pak roztok vnějšího standardu. Koncentrace vzorku se vypočítá z poměru vztahu koncentrace léčiva a plochy píku vzorku a standardu. Metoda vnitřního standardu je rychlejší a přesnější, neboť probíhá v jednom kroku. Na kolonu se nastřikuje směs roztoku vzorku a vnitřního standardu o přesně známém složení. Koncentrace se počítá z poměru plochy léčiva ku vnitřnímu standardu. Vnitřní standard musí splňovat určité požadavky - musí mít podobnou koncentraci jako zkoušená látka, musí být eluován v její blízkosti a musí být chemicky inertní. 18

19 2.6. Využití HPLC Využití HPLC je velmi široké, neboť umožňuje analyzovat látky typu anorganických iontů až po polymery včetně termolabilních a netěkavých sloučenin. 4) Možnosti užití: a) ve farmacii 1), 5) - k identifikaci, stanovení obsahu a čistoty léčiv - k analýze složených léčivých přípravků - k hodnocení stability léčiv (doba použitelnosti) - k analýze přírodních léčiv v rostlinném materiálu (obsah alkaloidů, glykosidů, vitamínů v droze) - v klinické praxi k monitorování hormonů, steroidů, léčiv a jejich metabolitů v tělních tekutinách (krvi, moči) - k dělení látek ve směsi - ke kontrole výroby ve všech stupních b) ke kontrole životního prostředí (pesticidů ve vodě, půdě, potravinách) c) v potravinářství ke sledování čistoty výrobků 19

20 2.7. Úprava biologických vzorků 2), 13) Biologický materiál (plazma, plná krev, moč, sliny) obsahuje velké množství endogenních látek a jen v nízkých koncentracích léčiva nebo jejich metabolity. Neboť endogenní látky působí při hodnocení rušivě, je nutné předčištění a zkoncentrování biologického vzorku před analýzou. Existuje několik způsobů úpravy vzorku pro chromatografii. Volba metody závisí na chemické struktuře, polaritě, rozpustnosti, ionizaci vzorku a druhu biologického materiálu Přímá injekce vzorku na kolonu Metoda přímé injekce, tj. bez předchozí úpravy, se využívá jen zřídka. Stanovované léčivo a jeho metabolity musí vykazovat fluorescenci nebo absorpci v UV oblasti, kde při dané vlnové délce minimálně interagují balastní látky z biologického vzorku. Rovněž koncentrace léčiva musí být dostatečně vysoká. Důvodem je malý objem biologických tekutin, který je vstřikován na kolonu (10 až 50 µl). Nevýhodou metody je rychlé znehodnocení kolony neeluovatelnými složkami vzorku. Tento jev lze však zpomalit použitím předklony nebo techniky column switching HPLC, která umožňuje předčištění, obohacení a kvantitativní stanovení vzorku přímo na kolonách chromatografu Deproteinace vzorku Bílkoviny přítomné v biologickém materiálu se při styku s mobilní fází mohou vysrážet na chromatografické koloně. Proto se musí před analýzou odstranit. Deproteinaci lze provést precipitací srážecími činidly, denaturací pomocí enzymů nebo ultrafiltrací na membránách. Deproteinace musí splňovat určité podmínky. Mezi ně patří kompletní odstranění proteinů, precipitát nesmí absorbovat sledované léčivo a deproteinační činidlo nesmí interagovat s léčivem ani ovlivňovat analýzu. 20

21 Extrakce do organického rozpouštědla (Liquid-liquid extraction, LLE) Extrakcí rozumíme rozdělení extrahované látky mezi dvě vzájemně nemísitelné kapaliny v rozdělovacím poměru K podle Nernstova zákona: celková koncentrace v organické fázi (mg/ml) celková koncentrace ve vodné fázi (mg/ml) Extrakční proces závisí na několika faktorech - fyzikálně chemické vlastnosti rozpouštědla, ph vodné fáze, vzájemný poměr fází, způsob a doba trvání extrakce a způsob předchozího zpracování vzorku. Výhodou této metody je jednoduchost provedení a extrakce širokého spektra organických látek, avšak nevýhodou je časová náročnost, tvorba emulzí, velký objem rozpouštědel a různá výtěžnost Extrakce vzorku na pevných fázích (Solid-phase extraction, SPE) Jedná se o extrakci sorpcí na pevnou fázi - sorbent. Tato metoda slouží k rychlému a účinnému předčištění, zakoncentrování a izolaci vzorku. Jde se o modifikaci sloupcové nebo tenkovrstvé chromatografie. Sorbenty jsou anorganické nebo organické látky porézní struktury. Musí splňovat určité požadavky - musí být nerozpustné v elučním roztoku a nesmí s ním reagovat, dále musí mít velkou sorpční kapacitu a reverzibilní sorpci. Dle fyzikálně chemických vlastností se pevné fáze dělí na polární a nepolární. Nejčastěji používanými polárními sorbenty jsou silikagel oxid hlinitý a oxid hořečnatý (Florisil). Mezi nepolární patří aktivní uhlí, celulóza a polymery polystyrenu (Amberlity XAD). Uvedené fáze mohou být plněny do jednorázových skleněných nebo plastových kolonek. Extrakce se provádí volným průtokem, tlakem (injekční stříkačkou) nebo podtlakem. Na kolonkách je sorpcí zachycen vzorek nebo balastní látka, která se takto oddělí od analytu. Extrakce pomocí kolonek je jednoduchá a rychlá, má dobrou výtěžnost a reprodukovatelnost. Díky sorbentům s navázanými fázemi je dosaženo maximální selektivity dělení látek při minimální spotřebě rozpouštědel. Z těchto 21

22 důvodů se jedná o nejvhodnější techniku pro izolaci léčiv a jejich metabolitů z biologických tekutin Extrakce iontových párů Jedná se o separační techniku pro extrakci iontových látek z vodných roztoků. Principem je tvorba komplexu (AB), který vzniká reakcí ionizované látky (A+) s párovým iontem opačného náboje (B-). Tento neionizovaný neutrální komplex může přejít do organického rozpouštědla (chloroform, methylenchlorid). Extrakce závisí na ph vodné fáze, na charakteru a koncentraci vzorku a párového iontu, na druhu organického rozpouštědla a na interakcích mezi ionty. Hlavní využití je v biomedicínské praxi, původně k separaci kyselých a bazických sloučenin, později ke stanovení katecholaminů a některých psychofarmak, ke stanovení léčiv v plazmě a moči Hydrolýza konjugovaných léčiv V živém organismu se endogenní i exogenní látky biotransformují, tím dochází mimo jiné ke změně jejich toxicity a biologické aktivity. V první fázi biotransformace vznikají konjugáty, které mohou být problémem při analýze. Jejich rozštěpení na původní látky lze provést kyselou (pomocí silných anorganických kyselin nejčastěji chlorovodíkové) nebo enzymovou hydrolýzou (pomocí specifických enzymů beta-glukuronidáz, sulfatáz). 22

23 2.8. Mikroextrakce tuhou fází (Solid Phase Microextraction, 3), 14), 15) SPME) SPME patří k moderním technikám přípravy vzorku, jež minimalizují čas a náklady. Vyžaduje pouze malá množství vzorku a nejsou potřeba organická rozpouštědla ani složitá aparatura. Vlákno, na které se sorbují sledované analyty je potaženo polymerním materiálem, v některých případech ve směsi s pevným sorbentem. Zachytí těkavé i netěkavé sloučeniny z plynných, kapalných a pevných vzorků. Složky vzorku jsou sorbovány do vrstvy pokrývající vlákno až do dosažení sorpční rovnováhy. Rovnovážný stav je závislý na koncentraci analytu ve vzorku, typu a tloušťce vrstvy polymeru pokrývající vlákno. Množství sorbovaného analytu závisí na distribuční (rozdělovací) konstantě, která udává poměr rovnovážných koncentrací složky v obou fázích, a na tloušťce polymeru. Analyty jsou poté desorbovány přímo do injektoru plynového chromatografu nebo pomocí SPME/HPLC adaptéru do kapalinového chromatografu. SPME/HPLC adaptér umožňuje kontakt mobilní fáze s vláknem, uvolnění sorbovaného analytu a jeho přenos na HPLC kolonu. Adaptér je složený ze šesti-cestného dávkovacího ventilu a desorpční komory, která nahrazuje nástřikovou smyčku kapalného chromatografu. Analyt může být eluován proudem mobilní fáze (dynamická desorpce) nebo v případě, že analyt je silněji sorbován na vlákně, lze vlákno máčet v mobilní fázi před nástřikem na kolonu (statická desorpce). Při extrakci je nutné dodržet určité podmínky pro dosažení přesnosti metody. Především dodržovat stejnou dobu vzorkování, teplotu a ph vzorku, používat konstantní velikost vialek, velikost vzorku a stejnou hloubku ponoru vlákna do vzorku. Důležitý je také výběr vhodného vlákna. Nepolární analyty jsou lépe extrahovány vlákny s nepolárním povrchem a naopak. Úpravou ph před extrakcí zvýšíme iontovou sílu roztoku a snížíme rozpustnost analytu. Tím se zvýší účinnost extrakce zejména u polárních a těkavých látek. Kyselé složky jsou lépe extrahovány v kyselém prostředí a bazické v bazickém. Míchání vzorku extrakci zkracuje a zlepšuje. 23

24 SPME vlákna vhodná pro HPLC: polydimethylsiloxane/divinylbenzene (PDMS/DVB) carbowax/v syntetické pryskyřici polyacrylate (PA) polydimethylsiloxan (PDMS) Obr. 2: Zařízení pro SPME 14) Obr. 3: Postup při mikroextrakci 14) 24

25 2.9. Vlastnosti kyseliny tiaprofenové 12), 16), 17) Název: (RS)-2-(5-benzoyl-2-thienyl)propionová kyselina Synonyma: (2RS)-2-(5-benzoylthiofen-2-yl)propanová kyselina Strukturní vzorec: Sumární vzorec: C 14 H 12 O 3 S Molekulová hmotnost: 260,31 Kyselina tiaprofenová je velmi účinné nesteroidní protizánětlivé léčivo patřící do skupiny profenů odvozené od kyseliny arylpropionové. Je prakticky nerozpustná ve vodě, snadno rozpustná v acetonu, v ethanolu 96% a v dichlormethanu. Biologický poločas má relativně krátký (1,5 2,5 hodin), ale umožňuje podání jen dvakrát denně, protože v synoviální tekutině vydrží potřebnou dobu. Typická dávka pro dospělé a mladistvé je 300 mg 2x denně. Biologická dostupnost je 90 %, metabolizuje se z 10 % játry na dva inaktivní metabolity a eliminuje se ve formě konjugovaných glukuronidů z 60 % močí a ze 40 % žlučí. Kyselina tiaprofenová se používá jako antiflogistikum, analgetikum a antirevmatikum. Je vhodná k léčbě revmatických kloubních onemocnění, všech typů mimokloubního revmatizmu, pooperačních zánětů, bolestech zad a páteře, bolestivých poranění pohybového ústrojí. Lze ji aplikovat perorálně (tablety, i retardované), rektálně a injekčně. 25

26 2.10. Údaje získané z literatury (rešerše) HPLC Sochor a kol. 18) vypracoval postupy LLE a SPE kyseliny tiaprofenové ze vzorků plné krve, která byly následně analyzována pomocí HPLC. Při SPE byla použita extrakční kolonka s C 18. LLE byl ke vzorku přidán pufr a dichlormethan. Mobilní fáze se skládala z methanolu a vody v poměru 70:30 a byla okyselena na ph 3. Analýza probíhala při vlnové délce 313 nm. Overbeke, Baeyens et al. 19) separovali enantiomery amidových derivátů kyseliny 2-arylpropionové (včetně tiaprofenové kyseliny) pomocí HPLC, kde stacionární fázi tvořila celulóza vázaná na silikagel. Byl použit acetátový a chloristý pufr. Mobilní fáze byla složena z methanolu a acetátového pufru (95:5) a upravena na ph 3 až 6. SPME de Oliveira, Cesarino, Bonato 20) extrahovali ibuprofen z moče pomocí SPME s následnou analýzou pomocí HLPC. Mobilní fází byl methanol upravený pomocí kyseliny fosforečné na ph 3. Průtok byl nastaven na 0,45 ml/min. Ke vzorku moči byl přidán ibuprofen, roztok byl hydrolyzován přidáním NaOH, poté neutralizován HCl a doplněn fosfátovým pufrem, konečné ph bylo v rozmezí 2,5-3,0. Extrakce probíhala na vlákně carbowax-templated, PA a PDMS/DVB. Desorpce byla provedena do mobilní fáze. Musteata, Pawliszyn et al. 21) se zabývali stanovením léčiv (mimo jiné také ibuprofenu) vázaných na plasmatické bílkoviny pomocí SPME. Použili vlákna PDMS a PA. Mobilní fáze byla směsí acetonitrilu a vody 10:90 nebo 90:10 s upraveným ph pomocí kyseliny octové. Vnitřním standardem pro ibuprofen byl warfarin. Zkoušené léčiva byla rozpouštěna ve vodě a methanolu v poměru 1:1. Heparinizovaná plasma 26

27 byla ředěna pomocí izotonického PBS pufru ph 7,4. Desorpce probíhala do roztoku acetonitrilu, vody a kyseliny octové (50:49:1). Rodríguez, Carpinteiro et al. 22) popsali SPME protizánětlivých léčiv (ibuprofen, naproxen, ketoprofen, diklofenak). Analýzu vodných vzorků provedli na vláknech PDMS/DVB, PA a dalších, vyhodnocení s pomocí metody GC-MS. 27

28 3. Cíl práce 28

29 Cílem diplomové práce bylo stanovit podmínky pro analytické hodnocení a mikroextrakci kyseliny tiaprofenové ze vzorku králičí plasmy. Tento úkol zahrnoval nalezení optimálních chromatografických podmínek pro HPLC analýzu, stanovení podmínek pro izolaci kyseliny tiaprofenové pomocí SPME a její kvantitativní hodnocení. 29

30 4. Experimentální část 30

31 4.1. Použitý materiál Léčiva a chemikálie kyselina tiaprofenová, Léčiva, Praha ČR methanol pro HPLC, Merck, Darmstadt Germany dihydrogenfosforečnan draselný č., Lachema, Brno ČR hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát p.a., Lachema, Brno ČR kyselina fosforečná 85 % p.a., Lachema, Brno ČR kyselina chloristá 70 % p.a., Merck, Darmstadt Germany destilovaná voda Biologický materiál králičí heparinizovaná plasma, Eldoret s.r.o., Praha ČR Chromatografický a extrakční materiál kolona LiChrosper 100 RP-18, 125 mm x 4 mm ID (5 µm), Merck, Darmstadt Germany kolona Discavery HS C18, 15 cm x 4,6 mm ID (5 µm), Supelco, Bellefonte USA vlákno PDMS/DVB 60 µm, výrobce: Supelco, Bellefonte USA, dodavatel: Sigma-Aldrich, Praha ČR držák pro SPME vlákno, výrobce: Supelco, Bellefonte USA, dodavatel: Sigma- Aldrich, Praha ČR Přístroje čerpadlo Spektra Systém P 1000, Thermo Separation Products, USA autosampler Spektra Systém AS 1000, Thermo Separation Products, USA UV detektor Spektra Systém UV 3000 HR, Thermo Separation Products, USA počítačový program ChromQuest , Thermo Electron 2003, USA spektrofotometr UV-2401 PC, Shimadzu, Columbia USA analytické váhy HR-120, A&D Company ltd., Japonsko ph metr Acidimetr 333, Druopta, Praha ČR elektromagnetická míchačka MM2A, Laboratorní přístroje, Praha ČR ultrazvuková lázeň K 10, Krainek s.r.o., Nové Zámky Slovensko 31

32 4.2. Příprava roztoků Fosfátový pufr 0,6805 g dihydrogenfosforečnanu draselného bylo rozpuštěno v 500 ml destilované vody a 0,8954 g hydrogenfosforečnanu sodného ve 250 ml destilované vody. Pufr byl připraven smícháním 88,9 ml prvního roztoku a 11,1 ml druhého roztoku. Kyselina fosforečná Kyselina fosforečná byla ředěna destilovanou vodou v poměru 1:1 nebo 1:10. Mobilní fáze Mobilní fáze byla připravena smísením 40 ml fosfátového pufru a 60 ml methanolu pro HPLC a okyselením naředěnou kyselinou fosforečnou na ph 3,0. 1 mg/ml roztok standardu kyseliny tiaprofenové 10 mg kyseliny tiaprofenové bylo rozpuštěno v 5 ml methanolu a poté bylo přidáno 5 ml mobilní fáze. 0,1 mg/ml roztok standardu kyseliny tiaprofenové K 1 ml připraveného 1 mg/ml methanolického roztoku kyseliny tiaprofenové bylo přidáno 4 ml methanolu a dále 5 ml mobilní fáze. 0,01 mg/ml roztok standardu kyseliny tiaprofenové Nejprve byl připraven methanolický roztok standardu o koncentraci 0,1 mg/ml. K 1 ml tohoto roztoku bylo přidáno 4 ml methanolu a 5 ml mobilní fáze. Plasma Plasma byla ředěna destilovanou vodou v poměru 1:9. 32

33 4.3. Chromatografické podmínky analýzy Analytické hodnocení bylo provedeno na koloně LiChrosper 100 RP-18, 125 mm x 4 mm ID (5 µm) od firmy Merck. Mobilní fázi tvořila směs methanolu a fosfátového pufru v poměru 60:40, upravená na ph 3,0 pomocí kyseliny fosforečné. Před analýzou byla mobilní fáze dána do ultrazvukové lázně na 15 minut. Rychlost průtoku mobilní fáze byla 0,7 ml/min, tlak na koloně 6 až 7 MPa. Množství nastřikovaného roztoku bylo 20 µl. Průběh analýzy byl detekován v UV oblasti spektrofotometrickým detektorem při vlnové délce 306 nm. Na kolonu byl dávkován 0,01 mg/ml roztok standardu (kyseliny tiaprofenové ve směsi methanolu a mobilní fáze v poměru 1:1). Pro kvantitativní hodnocení byla použita metoda vnějšího standardu. 33

34 4.4. Izolace léčiva z biologického materiálu Kyselina tiaprofenová byla izolována ze vzorku plasmy pomocí metody mikroextrakce tuhou fází. Pro extrakci bylo použito vlákno PDMS/DVB 60 µm od firmy Supelco. Nejprve bylo vlákno aktivováno ponořením do 5 ml methanolu na dobu 20 minut. Poté byla provedena sorpce na vlákno. Vzorek pro sorpci byl připraven následujícím postupem: k 0,5 ml plasmy bylo přidáno 0,5 ml 1mg/ml roztoku standardu a naředěno 4 ml destilované vody. Desorpce probíhala do 0,2 ml methanolu. Doba nezbytná pro sorpci byla experimentálně stanovena na 20 minut, pro desorpci na 15 minut. Po desorpci bylo ke vzorku přidáno 0,05 ml mobilní fáze, tím bylo dosaženo štíhlejšího píku, a roztok byl ihned dávkován na kolonu dle výše uvedených chromatografických podmínek. 34

35 5. Výsledky a diskuse 35

36 5.1. Určení chromatografických podmínek Nejprve bylo změřeno absorpční spektrum kyseliny tiaprofenové pomocí spektrometru UV-2401 PC. Pro analýzu byla stanovena optimální vlnová délka 306 nm. Při hledání vhodné kolony pro HPLC analýzu byly vyzkoušeny dvě kolony: kolona LiChrosper 100 RP-18, 125 mm x 4 mm ID (5 µm) od firmy Merck a kolona Discavery HS C18, 15 cm x 4,6 mm ID (5 µm) od firmy Supelco. Vybrána byla kolona LiChrosper 100 RP-18 z důvodu lepšího hodnocení. K nalezení optimální mobilní fáze (MF) vedla složitá cesta. Nápovědou pro první krok nám byly informace z rešerší. 18), 19) Počáteční MF se tedy skládala z methanolu a destilované vody v poměru 70:30. Směs byla upravena na ph 3,3 pomocí kyseliny chloristé. Průtok MF byl 0,4 ml/min. Nejprve byla pro analýzu použita kolona LiChrosper 100 RP-18. Methanolický roztok kyseliny tiaprofenové byl nastřikován v koncentraci 0,01 mg/ml a o objemu 20 µl. Poté byl změněn poměr organické a vodné fáze na 60:40 a dále 55:45. Těmito změnami bylo dosaženo jen prodloužení retenčního času a pík měl stále pozvolný nájezd. Začal být používán methanol pro HPLC, tím ale nebylo dosaženo žádných výrazných změn. Dalším krokem bylo neupravené ph MF, která měla hodnotu 6,1 při poměru fází 58:42. Kyselina tiaprofenová byla rozpuštěna v acetonitrilu. Nástup píku byl nepatrně menší. Poté byl použit ethanol jako rozpouštědlo, ale v tomto případě byl pík horší. Byla vyzkoušena jiná kolona, a to Discavery HS C18. Měnily se jednak poměry methanolu a vody, tak i složení MF. Při poměru methanol voda 70:30 byl pík neostrý. Proto byl vyzkoušen poměr 50:50 a 40:60. Nedošlo ke zlepšení tvaru píku. Jako MF byla použita také směs fosfátový pufr - voda methanol 20:20:60. Pík byl stále nevýrazný. Pro úpravu ph na 3,1 byla používána kyselina fosforečná, která se ukázala vhodnější. Nejlepšího výsledku bylo dosaženo s MF složenou z fosfátového pufru a methanolu 40:60 a upravenou 36

37 na ph 3,1. Za těchto podmínek byly zkoušeny průtoky MF od 1,0 do 1,4 ml/min. Nejlepší tvar píku byl u průtoku 1,3 ml/min. Tyto podmínky dosažené na koloně Discavery HS C18 byly aplikovány na původní kolonu LiChrosper 100 RP-18. Dále byla zkoušena změna vlnové délky na 295 nm a 313 nm, ale tato změna nebyla výrazná. Hodnota ph byla ještě snížena na 3,0, tím se dosáhlo štíhlejšího a vyššího píku. V dalším kroku byla kyselina tiaprofenová rozpuštěna ve směsi methanolu a mobilní fáze v poměru nejprve 3:1 a poté 1:1. Pík byl v obou případech štíhlý a bez pozvolného nástupu. Avšak nepatrně symetričtější pík byl při poměru 1:1. Nakonec byl upraven průtok MF kolonou. Při průtoku 0,7 ml/min bylo dosaženo retenčního času přibližně 6 minut. Vycházelo se z toho, že balastní látky z biologického materiálu se budou eluovat na začátku během prvních tří minut. Pro analytické hodnocení kyseliny tiaprofenové byly tedy stanoveny tyto podmínky: mobilní fázi tvoří směs methanolu a fosfátového pufru v poměru 60:40 upravená na ph 3,0 pomocí kyseliny fosforečné. Před analýzou byla MF odvzdušněna v ultrazvukové lázni na 15 minut. Průtok MF kolonou byl 0,7 ml/min. Jako standard se používal 0,01 mg/ml roztok kyseliny tiaprofenové, který byl připraven smícháním 1 ml 0,1 mg/ml methanolického roztoku kyseliny tiaprofenové se 4 ml methanolu a 5 ml mobilní fáze. Citlivost detekce Po určení chromatografických podmínek byla hodnocena citlivost detekce kyseliny tiaprofenové. Vzorek standardu byl postupně ředěn vždy o desetinu řádu. Nejmenší dobře hodnotitelná koncentrace kyseliny tiaprofenové byla 0,1 µg/ml. 37

38 Obr. 4: HPLC chromatogram methanolu, chromatografické podmínky viz kapitola Detector 1-306nm meoh2.dat mau mau Minutes Obr. 5: HPLC chromatogram 0,1 mg/ml standardu, chromatografické podmínky viz kapitola Detector 1-306nm 0,1st podruhe.dat tiaprofenová kyselina mau mau Minutes 38

39 Obr. 6: HPLC chromatogram 0,0001 mg/ml standardu, chromatografické podmínky viz kapitola ,0 Detector 1-306nm 0,0001st podruhe.dat 0,0-0,5-0,5-1,0-1,0 mau -1,5 tiaprofenová kyselina -1,5 mau -2,0-2,0-2,5-2,5-3,0-3, Minutes 39

40 5.2. Izolace kyseliny tiaprofenové metodou SPME Mezi rešeršemi 19), 20), 21), 22) zatím nebyla zkoušena metoda mikroextrakce tuhou fází kyseliny tiaprofenové. Našli jsme jen zmínku o SPME ibuprofenu 19), 20) z moči a také z plasmy. Proto jsme vycházeli z poznatků o kyselině tiaprofenové, které byly zjištěny při stanovování HPLC podmínek. Extrakce byla zkoušena na vlákně PDMS/DVB 60 µm od firmy Supelco. Před použitím bylo nutné vlákno aktivovat ponořením do methanolu na dobu 20 minut. Metoda byla zkoušena nejprve z vodného roztoku, teprve po stanovení optimálního času sorpce a desorpce byl použit vzorek plasmy. Vodný roztok pro sorpci se skládal ze 4,5 ml destilované vody a 0,5 ml 1 mg/ml methanolického roztoku kyseliny tiaprofenové a jeho ph bylo rovno 3,0. Jako standard byl použit 0,25 ml tohoto roztoku, tj. o koncentraci 0,1 mg/ml. Sorpce probíhala za stálého míchání na elektromagnetické míchačce. Médium pro desorpci tvořilo 200 µl methanolu, před dávkováním na kolonu bylo přidáno 50 µl mobilní fáze z důvodu větší symetrie píku. HPLC analýza probíhala za stanovených podmínek. Doby extrakce (sorpce a desorpce) byly určeny tak, aby byly časově nejkratší a zároveň s největší výtěžností. Vztah sorpce, desorpce a plochy píku je znázorněn v grafu 1. Poté byla provedena extrakce ve vzorku plasmy. Plasma byla ředěna 10x. K 0,5 ml plasmy bylo přidáno 0,5 ml 1 mg/ml roztoku standardu a zředěno na 5 ml destilovanou vodou. Sorpce byla zkoušena v rozmezí ph 6,6 (bez úpravy) až 2,8. K postupnému snižování ph byla použita kyselina fosforečná. Hodnota ph měla vliv na plochu píku (viz graf 2). Čím kyselejší ph, tím větší plocha píku. Nejvyšší a nejštíhlejší pík byl při ph 2,8. Postup při výpočtu výtěžku: Plocha píku vzorku po extrakci byla porovnávána s plochou píku standardu o koncentraci 0,1 mg/ml. Na kolonu bylo dávkováno 20 µl, což odpovídá 2 µg kyseliny tiaprofenové. Množství kyseliny tiaprofenové ve vzorku bylo vypočítáno přímou úměrou: 40

41 plocha standardu... 2 µg plocha vzorku.. X µg Desorpce byla provedena do 200 µl methanolu, před nástřikem doplněných mobilní fází na 250 µl. Množství kyseliny tiaprofenové získané po extrakci bylo vypočítáno opět přímou úměrou: 20 µl.. X µg 250 µl Y µg Vypočtené množství léčiva bylo přepočteno na 1 ml: 0,250 ml... Y µg 1 ml... Z µg Hodnota Z odpovídá výtěžku uvedeného v tabulce. Vypočtená koncentrace léčiva v 1 ml desorpčního roztoku byla vztažena na koncentraci léčiva ve vzorku: 0,1 mg/ml. 100 % Z mg/ml... výtěžek v % Tab. 1: Hodnoty pro sestavení grafu 1 vzorek sorpce (min) desorpce (min) plocha píku výtěžek (µg/ml) výtěžek v % ,56 11, ,13 13, ,69 14, ,55 11, ,92 11, ,51 16, ,32 17, ,46 19, ,9 16, ,76 17, ,69 15,69 41

42 Graf 1: HPLC chromatogram vztahu sorpce, desorpce a plochy píku ve vzorku vody s přídavkem kyseliny tiaprofenové Tab. 2: Hodnoty pro sestavení grafu 2 vzorek ph plocha píku výtěžek (µg/ml) výtěžek v % 1 2, ,74 9,74 2 3, ,92 7,92 3 3, ,78 5,78 4 4, ,01 3,01 5 5, ,93 0,93 6 6, ,84 0,84 Graf 2: HPLC chromatogram závislosti ph a plochy píku ve vzorku plasmy s přídavkem kyseliny tiaprofenové 42

43 Obr. 7: HPLC chromatogram vzorku vody po SPME, chromatografické podmínky viz kapitola UV nm voda4.dat mau mau Minutes Obr. 8: HPLC chromatogram vzorku vody s kyselinou tiaprofenovou po SPME, chromatografické podmínky viz kapitola UV nm vz9.4.dat tiaprofenová kyselina mau mau Minutes 43

44 Obr. 9: HPLC chromatogram vzorku plasmy po SPME, chromatografické podmínky viz kapitola UV nm plasma2.dat mau mau Minutes Obr. 10: HPLC chromatogram vzorku plasmy s kyselinou tiaprofenovou po SPME, chromatografické podmínky viz kapitola Detector 1-306nm p3,2.dat tiaprofenová kyselina mau mau Minutes 44

45 5.3. Kvantitativní hodnocení ve vzorku plasmy Kalibrační křivka Pro kvantitativní hodnocení kyseliny tiaprofenové ve vzorku králičí plasmy byla zvolena metoda vnějšího standardu. Z výsledků byla pomocí funkce lineární regrese sestavena kalibrační křivka. Hodnoty do kalibrační křivky byly získány sestavením řady roztoků s odstupňovanými koncentracemi kyseliny tiaprofenové. K 0,5 ml vzorku plasmy byl přidán daný počet µl 1 mg/ml roztoku kyseliny tiaprofenové, poté doplněno na 5 ml. Nakonec bylo upraveno ph na 2,8 kyselinou fosforečnou. Takto připravené roztoky byly upraveny metodou SPME a poté dávkovány na kolonu za výše uvedených podmínek. Kalibrační křivku tvoří graf závislosti koncentrace kyseliny tiaprofenové na velikosti plochy píku. Tab. 3: Hodnoty pro sestrojení kalibrační křivky koncentrace (µg/ml) plocha píku

46 Graf 3: Kalibrační křivka kyseliny tiaprofenové Regresní funkce : y = k x + q počet: bodů n = 7 Parametry regresní přímky a odhady jejich směrodatných odchylek směrnice absolutní člen k = 1,17E+3 ± 51 q = 1,39E+5 ± 2,4E+4 koeficient korelace reziduální odchylka R = 0,995 s rez = 4,04E+4 Závislost y na x byla prokázána na hladině významnosti 0,001 Kalibrační křivka má lineární průběh. Rovnice přímky je y = 1170x , koeficient korelace r = 0,

47 Modelový vzorek Jako modelový vzorek kyseliny tiaprofenové v plasmě byl připraven roztok o koncentraci 200 µg/ml. Celkem bylo připraveno 15 ml vzorku, který byl následně zmražen. Po 24 hod byl vzorek rozmražen a bylo odebráno 5 ml pro stanovení. Zbylých 10 ml bylo opět zmraženo. Další hodnocení bylo provedeno za 2 týdny. Izolační a chromatografické podmínky již byly popsány výše. Při mikroextrakci po 24 hod bylo zjištěna plocha píku , což odpovídá koncentraci 169,14 µg/ml a po 14 dnech byla plocha píku , tj. koncentrace 149,48 µg/ml. Koncentrace byla u modelových vzorků nižší a po 14 dnech byl patrný na HPLC chromatogramu náznak dalšího píku, může se jednat o rozklad léčiva. 47

48 Obr. 12: HPLC chromatogram z kalibrační křivky vzorek plasmy o koncentraci 500 µg/ml kyseliny tiaprofenové, chromatografické podmínky viz kapitola 4.3. Detector 1-306nm 25,0 p12,2.dat 25,0 22,5 tiaprofenová kyselina 22,5 20,0 20,0 17,5 17,5 15,0 15,0 mau 12,5 12,5 mau 10,0 10,0 7,5 7,5 5,0 5,0 2,5 2,5 0,0 0, Minutes Obr. 13: HPLC chromatogram z kalibrační křivky vzorek plasmy o koncentraci 50 µg/ml kyseliny tiaprofenové, chromatografické podmínky viz kapitola 4.3. Detector 1-306nm 25,0 p14.dat 25,0 22,5 22,5 20,0 20,0 17,5 17,5 15,0 15,0 mau 12,5 12,5 mau 10,0 10,0 7,5 7,5 5,0 2,5 tiaprofenová kyselina 5,0 2,5 0,0 0, Minutes 48

49 Obr. 14: HPLC chromatogram modelového vzorku po 24 hod, chromatografické podmínky viz kapitola 4.3. Detector 1-306nm model.dat tiaprofenová kyselina mau 6 6 mau Minutes Obr. 15: HPLC chromatogram modelového vzorku po 2 týdnech, chromatografické podmínky viz kapitola 4.3. Detector 1-306nm 12 zmrazeny vzorek2.dat tiaprofenová kyselina mau 6 6 mau Minutes 49

50 6. Závěr 50

51 V diplomové práci byly vypracovány optimální podmínky pro analytické hodnocení kyseliny tiaprofenové vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií a její izolaci z plasmy metodou mikroextrakce tuhou fází. Stanovené chromatografické podmínky byly hodnoceny na koloně LiChrosper 100 RP-18 od firmy Merck. Mobilní fázi tvořila směs methanolu a fosfátového pufru v poměru 60:40 upravena na ph 3,0 pomocí kyseliny fosforečné, její průtok kolonou byl 0,7 ml/min. Dávkováno bylo 20 µl vzorku. Detekce probíhala v UV oblasti při vlnové délce 306 nm. Pro izolaci kyseliny tiaprofenové ze vzorku bylo použito vlákno pokryté PDMS/DVB 60 µm od firmy Supelco. Nejprve byla kyselina tiaprofenová izolována z vodného vzorku, který měl ph 3,0. Výtěžek mikroextrakce byl 19,46 %. Biologický vzorek se skládal z 0,5 ml plasmy a 0,5 ml 1 mg/ml roztoku kyseliny tiaprofenové, doplněný vodou na 5 ml. Jeho ph bylo upraveno na hodnotu 2,8 kyselinou fosforečnou. Pro desorpci bylo použito 200 µl methanolu a před dávkováním na kolonu bylo přidáno 50 µl mobilní fáze. Optimální doba sorpce byla 20 minut a desorpce 15 minut. Extrakční účinnost bylo 9,74 %. Kvantitativní hodnocení kyseliny tiaprofenové ve vzorku králičí plasmy bylo provedeno s využitím kalibrační křivky a metody vnějšího standardu. 51

52 7. Literatura 52

53 1) Churáček, J., Jandera, P.: Úvod do vysokoúčinné kapalinové kolonové chromatografie, SNTL Praha ) Klíma, J., Grafnetterová, J.: Pokroky ve farmacii 7, Avicenum Praha ) SPME, Sigma-Aldrich, Praha ) Karlíček, R. a kol.: Analytická chemie pro farmaceuty, Karolinum Praha ) Klimeš, J. a kol.: Kontrola léčiv I., Karolinum Praha ) únor ) únor ) únor ) Klimeš, J. a kol.: Kontrola léčiv II., Karolinum Praha ) únor ) soceucinna.html, únor )Český lékopis 2009 (ČL 2009), Grada Publishing, a.s. Praha )Babjuk, J., Perlík, F., Šídlo, Z.: Bioanalytika léků, Avicenum Praha ) únor )Ulrich, S.: Solid-phase microextraction in biomedical analysis, J. Chromatogr. A, 2000 (902) )Hartl, J. a kol.: Farmaceutická chemie II., Karolinum Praha )AISLP verze , říjen )Sochor, J., Klimeš, J., Sedláček, J., Somolíková, B., Slovenčík, D.: HPLC analysis of tiaprofenic acid in the sample sof whole blood using L-L and S-L extractions, J. Liq. Chromatogr. Rel. Technol., 2000 (23) ) Van Overbeke, A., Baeyens, W., Van de Bossche, W., Dewaele, C.: Enantiometric separation of amide derivatives of some 2-arylpropionic acids by HPLC on a celulose-based chiral stationary phase, J. Pharm. Biomed. Anal., 1994 (12) ) de Oliveira, A. R., Cesarino, E. J., Bonato, P. S.: Solid-phase microextraction and chiral HPLC analysis of ibuprofen in urine, J. Chromatogr. B, 2005 (818)

54 21) Musteata, F. M., Pawliszyn, J., Qian, M. G., Wu, J. T., Miwa, G. T.: Determination of drug plasma protein binding by solid phase microextraction, J. Pharm. Sci, 2006 (95) ) Rodriguez, I., Carpinteiro, J., Quintana, J. B. Carro, A. M., Lorenzo, R. A., Cela, R.: Solid-phase microextraction with on-fiber derivatization for the analysis of anti-inflammatory drugs in water samples, J. Chromatogr. A, 2004 (1024)