X-vázaný hyper-igm syndrom. Pacienti v České republice a přehled literatury

Transkript

1 X-vázaný hyper-igm syndrom. Pacienti v České republice a přehled literatury X-linked hyper-igm syndrome (CD40 ligand deficiency). Patients in the Czech Republic and literature review ALEŠ JANDA 1,2, LADISLAV KRÓL 1,3, TOMÁŠ KALINA 1,3, VLASTIMIL KRÁL 4, JITKA POHOŘSKÁ 4, ESTER MEJSTŘÍKOVÁ 1,3, ONDŘEJ HRUŠÁK 1,3, PETRA KESLOVÁ 1, RENATA FORMÁNKOVÁ 1, HELENA SCHNEIDEROVÁ 5, JIŘÍ LITZMAN 6, TOMÁŠ FREIBERGER 6,7, ANDREA POLOUČKOVÁ 8, ANNA ŠEDIVÁ 8, VERONIKA SKALICKÁ 9, KATARÍNA BERÁNKOVÁ 9, DANIELA ZEMKOVÁ 9, DALIBOR JÍLEK 4, PETR SEDLÁČEK 1, JAN STARÝ 1 1 Klinika dětské hematologie a onkologie 2. lékařské fakulty Univerzity Karlovy a Fakultní nemocnice v Motole, Praha 2 Centre of Chronic Immunodeficiency (CCI), University Medical Centre and University of Freiburg, Freiburg im Breisgau, Německo 3 Chilhood Leukemia Investigation Prague (CLIP), 2. lékařská fakulta Univerzity Karlovy a Fakultní nemocnice v Motole, Praha 4 Centrum imunologie a mikrobiologie, Zdravotní ústav, Ústí nad Labem 5 Dětská klinika, Fakultní nemocnice Brno, Brno 6 Ústav klinické imunologie a alergologie Fakultní nemocnice u sv. Anny, Lékařská Fakulta Masarykova univerzita, Brno 7 Genetická laboratoř, Centrum kardiovaskulární chirurgie a transplantace, Masarykova univerzita, Brno 8 Ústav imunologie 2. lékařské fakulty Univerzity Karlovy a Fakultní nemocnice v Motole, Praha 9 Pediatrická klinika 2. lékařské fakulty Univerzity Karlovy a Fakultní nemocnice v Motole, Praha SOUHRN Hyper-IgM syndrom (HIGM) je skupina vzácných a závažných vrozených imunodeficiencí, pro které jsou typické velmi nízké hladiny imunoglobulinů tříd IgG, IgA a IgE s normální nebo zvýšenou hladinou IgM. Příčinou onemocnění je porucha mechanismu izotypového přesmyku. Defekt postihuje signalizační dráhu molekuly CD40 nebo vnitřní signalizaci B-lymfocytů, případně buněčný DNA reparační mechanismus. Nejčastější poruchou je poškození ligandu pro CD40 (X-vázaný hyper-igm syndrom). Kromě humorální imunity je postižena i složka buněčná, takže pacienti jsou ohroženi oportunními infekcemi (především Pneumocystis jirovecii, CMV, kryptokoky nebo mykobakteriemi). Typické jsou časté recidivující respirační infekce a chronický průjem doprovázený neprospíváním. Více než u poloviny pacientů nalézáme chronickou neutropenii, dále se vyskytují artritidy, trombocytopenie, hemolytické anemie a nefritidy. Pacienti s deficitem CD40L jsou také zvýšeně ohroženi vznikem maligních onemocnění. Základem léčby jsou režimová opatření, antibiotická profylaxe a substituční léčba imunoglobuliny. Jediná kauzální terapie je alogenní transplantace hematopoetických buněk. V letech 1993 až 2011 bylo v České republice diagnostikováno pět pacientů s vrozeným deficitem CD40 ligandu. Tři pacienti byli po stanovení diagnózy indikováni k transplantaci hematopoetických buněk. V článku předkládáme přehled průběhu onemocnění, diagnostiky a léčby těchto pacientů. Klíčová slova: X-vázaný hyper IgM syndrom, deficit CD40L, dysgamaglobulinémie, průtoková cytometrie, transplantace hematopoetických kmenových buněk SUMMARY Hyper-IgM syndrome (HIGM) is a group of rare and serious primary immunodeficiencies. It is characterised by very low levels of IgG, IgA and IgE immunoglobulins whereas the level of IgM is normal or elevated. It is caused by impairment of immunoglobulin isotype switching. 34 Alergie 1/2012

2 Either the signalling pathway of CD40 molecule, intrinsic B-cell signalling or DNA reparation mechanism are defective. The most frequent defect lies in the gene coding for CD40 ligand (X-linked Hyper-IgM syndrome). Apart from humoral immunity also the T-cell function is affected. Thus, the patients suffer from infections caused by opportunistic pathogens (most frequently Pneumocystic jirovecii, CMV, Cryptococci, Mycobacteria). Recurrent respiratory tract infections are frequently seen. Chronic diarrhoea may be present as well and may associate with failure to thrive. More than a half of the patients suffer from chronic neutropenia. Arthritis, thrombocytopenia, haemolytic anaemia and nephritis are documented in some patients. Patients with CD40 ligand deficiency have increased risk of malignant diseases. The cornerstones of the therapy are preventive measures, antibiotic prophylaxis and immunoglobulin substitution. The haematopoietic stem cell transplantation is the only curative therapy currently available. Between 1993 and 2011 there were 5 patients with CD40 ligand deficiency diagnosed and treated in the Czech Republic. Three patients were indicated for haematopoietic stem cell transplantation. The authors present an overview of the disease s course, diagnostic process and treatment of these patients. Key words: X-linked hyper-igm syndrome, CD40 ligand deficiency, dysgammaglobulinemia, flow cytometry, haematopoietic stem cell transplantation Úvod Hyper-IgM syndrom (HIGM) je skupina vzácných vrozených imunodeficiencí charakterizovaná recidivujícími infekty a velmi nízkými hladinami imunoglobulinů třídy IgG, IgA a IgE s normální nebo zvýšenou hladinou IgM, resp. IgD. Příčinou onemocnění je porucha mechanismu izotypového přesmyku z IgM (nebo IgD) na ostatní izotypy (CSR, class-switch recombination), která může být doprovázena poškozením aparátu pro somatické hypermutace (SHM, somatic hypermutation). Defekt zasahuje signalizační dráhu molekuly CD40 nebo vnitřní signalizaci B-lymfocytů, případně buněčný DNA reparační mechanismus. HIGM se může vyskytovat i sekundárně, např. u vrozených zarděnek, malignity nebo při podávání fenytoinu (4,22,30,31). Existuje několik skupin HIGM syndromu. Do první skupiny onemocnění patří nejčastější forma HIGM: deficit molekuly CD40L (CD154), jejíž kódující gen je umístěn na X chromozomu (X-vázaný hyper-igm syndrom, X-HIGM, hyper IgM syndrom 1, HIGM 1; MIM#308220) (2). Signalizace v této dráze může být také poškozena defektem v molekule CD40 (HIGM 3, MIM#606843)(9). Patofyziologií těchto dvou onemocnění se zabýváme v textu níže. Spuštění signalizační kaskády cestou molekuly CD40 vede mimo jiné také k aktivaci NF-κB dráhy, která hraje důležitou roli při CSR. U pacientů s X-vázanou ektodermální dysplázií a imunodeficiencí (XL-EDA-ID, MIM#300291) jsou popisovány nízké hladiny IgG a IgA a zvýšené hladiny IgM odpovídající definici HIGM. Pacienti jsou kromě jiného zvýšeně vnímaví k mykobakteriálním infekcím. Onemocnění je způsobeno hypomorfní mutací v genu pro regulátor IKKγ (NEMO) hrající roli v aktivaci jaderného transkripčního faktoru NF-κB (41). Další příčiny HIGM souvisí s vnitřní signalizací B-lymfocytů. Proces CSR a SHM může být narušen poškozením genu pro aktivovatelnou cytidinovou deaminázu (AID, HIGM 2, MIM#605258)(34) nebo uracil-nglykosylázu (UNG, HIGM 5, MIM#608106) (16), které jsou exprimovány v germinálních centrech lymfatických uzlin. Tyto dvě formy HIGM se od poruchy v signalizaci CD40L-CD40 v klinickém obraze zásadně liší výraznou lymfadenopatií způsobenou hypertrofií germinálních center, zachovalou imunitou vůči oportunním patogenům a vyšším výskytem autoimunitních komplikací. Vzácnou příčinou HIGM mohou být homozygotní mutace v genu PMS2 (Post-Meiotic Segregation 2), který hraje roli při reparaci DNA a jehož poškození přispívá ke kancerogenezi (32). HIGM se může také vyskytovat u ataxie-teleangiektázie (29). Stručná charakteristika jednotlivých forem HIGM je uvedena v tab. 1. V dalším textu se budeme podrobněji věnovat pouze X-vázané formě onemocnění (deficit CD40L), která je nejčastější s incidencí 1: živě narozených dětí. Význam interakce CD40-CD40L (obr. 1) Receptor CD40 patří do rodiny povrchových receptorů TNF-α (tumor necrosis factor alfa) a kromě B-lymfocytů se vyskytuje například také na folikulárních dendritických buňkách, makrofázích, epiteliálních buňkách a neuronech. Tato molekula hraje důležitou roli při homeostáze a diferenciaci B-lymfocytů (obr. 1). Stimulace CD40 na povrchu B-lymfocytů v přítomnosti IL-4 vede k jejich aktivaci, proliferaci a růstu. Dochází také ke zvýšení povrchové exprese molekuly Fas, takže buňky jsou zároveň vnímavější k apoptóze spouštěné interakcí s Fas ligandem na T-lymfocytech. Aktivace CD40 je klíčová pro spuštění izotypového přesmyku těžkých řetězců imunoglobulinů (31). Ligand pro receptor CD40 (CD40L, CD154) se vyskytuje především na CD4+ T-lymfocytech, v menší míře také na CD8+ T-lymfocytech, monocytech a NK buňkách, bazofilech, žírných buňkách a eozinofilech. Neaktivované T-lymfocyty exprimují jen minimální množství tohoto proteinu. Interakce CD40-CD40L je také důležitá i při negativní selekci T-lymfocytů v thymu. CD40L je přítomen na povrchu zralých thymocytů a je v kontaktu s receptorem CD40, exprimovaném dendritickými buňkami a epitelovými buňkami thymu. Alergie 1/

3 Tab. 1: Charakteristika jednotlivých typů hyper-igm syndromu. Tabulka upravena podle (22,30) Postižený protein CD40L CD40 NEMO AID UNG neznámý kofaktor AID součást reparačního mechanismu DNA PMS2 Neznámý označení X-HIGM HIGM 1 HIGM 3 XL-EDA- ID HIGM 2 HIGM 5 HIGM dědičnost XL AR XL AR/AD AR?? AR? incidence 48 % 2 % 1 % 15 % 1 % 10 % 11 % 2 % 10 % příznaky bakteriální infekce oportunní infekce lymfadenopatie autoimunita +/- +/ nádory + - * * laboratorní parametry IgG v séru různé IgA v séru různé IgM v séru N/ N/ N/ N/ N/ N/ N/ CD27 + B buňky N** N** N? SHM různé N? N N N N Legenda: * u myšího modelu ung -/- incidence nádorů vyšší, u pacientů zatím nepozorováno, ** CD27 + u těchto pacientů exprimují pouze IgM a IgD. Zkratky: AD: autozomálně dominantní dědičnost; AID: aktivovatelná cytidinová deamináza; AR: autozomálně recesivní dědičnost; EDA-ID: ektodermální dysplázie a imunodeficience; HIGM: hyper-igm syndrom; N: normální; NEMO: esenciální regulátor NF-κB; PMS2: post-meiotic segregation 2 protein; SHM: somatická hypermutace; UNG: uracil-n-glykosyláza; XL: dědičnost vázaná na chromozóm X. V novorozeneckém období T-lymfocyty CD40L neexprimují (8,10), což koresponduje s absencí izotypového přesmyku imunoglobulinů v tomto období. CD40L se v T-lymfocytech objevuje přibližně měsíc po narození, jeho množství postupně stoupá a nejvyšších hodnot dosahuje v adolescenci (3,13). Exprese CD40L může být ovlivněna podávanými léky. Cyklosporin A snižuje přítomnost CD40L (11) prostřednictvím calcineurin-dependentních transkripčních faktorů NFAT, řídících expresi CD40L. Naopak kortikoidy expresi CD40L zvyšují (17). Gen CD40LG/TNFSF5 se skládá z 5 exonů (obr. 2), přičemž nejčastěji bývá poškozen 5. exon kódující extracelulární TNF-homologní část proteinu. Na prvním místě v typech poškození stojí záměna aminokyselin (missense mutace), která má za následek změnu konformace vedoucí k menší stabilitě proteinu a jeho rychlejší degradaci, nebo poškození vazebného místa pro molekulu CD40. Časté jsou také substituce vedoucí ke stop kodonu (nonsense mutace), malé inzerce nebo delece genu. Klinický obraz Pacienti s deficitem CD40L a CD40 mají velmi podobný fenotyp (tab. 1); deficit CD40 je ale extrémně vzácný. Většina pacientů s deficitem CD40L trpí již od časného dětství recidivujícími respiračními infekty. Pacienti jsou zvýšeně ohroženi oportunními infekcemi, zejména pneumonií způsobenou Pneumocysts jirovecii (PCP). V některých případech může být PCP prvním příznakem onemocnění. V etiopatogenezi plicních infekcí u těchto pacientů se mohou uplatnit také cytomegalovirus (CMV), kryptokokus nebo mykobakterie (včetně BCG). Častým nálezem je také chronický průjem provázený neprospíváním. V závažných případech je nezbytná parenterální výživa. Průjem je často spojen s kryptosporidiovou infekcí, která významně přispívá ke vzniku sklerotizující cholangoitidy, která patří k nejzávažnějším komplikacím nemoci, někdy i s fatálním průběhem. Incidence jaterních a biliárních obtíží se zvyšuje s věkem. Více než polovina 36 Alergie 1/2012

4 Zkratky: AID: aktivovatelná cytidinová deamináza; CSR: izotypový přesmyk; IKK: komplex IκB; MHC: molekula HLA II. třídy; SHM: somatická hypermutace imunoglobulinových genů; TCR: T-buněčný receptor; UNG: uracil-n-glykosyláza. Obr. 1: Interakce CD40-CD40L. pacientů trpí chronickou neutropenií, u těchto pacientů často nalézáme slizniční ulcerace v dutině ústní a v perianální oblasti. Pacienti s deficitem CD40L jsou také zvýšeně ohroženi vznikem maligních onemocnění. Kromě lymfomů to jsou především nádory jater a žlučových cest, které jsou u pacientů s primárními imunodeficiencemi nezvyklé a zřejmě souvisí s chronickou infekcí těchto orgánů. Autoimunitní onemocnění jsou u pacientů s deficitem CD40L častější než ve zdravé populaci, ovšem méně častá ve srovnání s autozomálně recesivními formami HIGM. Pacienti mívají artritidy, trombocytopenie, hemolytické anemie a nefritidy vyvolané imunními komplexy. Přibližně čtvrtina pacientů má chronickou anémii (22,31). Laboratorní parametry Deficit CD40L je charakterizován výrazně sníženou hladinou sérového IgG, IgA a IgE při normální nebo zvýšené hladině IgM a normálním počtu cirkulujících B-lymfocytů. Hladina IgM se zvyšuje s věkem, výrazněji u pacientů, u nichž je opožděno pravidelné podávání intravenózních imunoglobulinů (IVIg). Variabilita hladin IgM u členů rodin se stejným poškozením CD40L ukazuje, že stoupající hladina IgM souvisí zřejmě s chronickou antigenní stimulací a že není přímým důsledkem molekulárního defektu (24). Až 25 % pacientů má v čase diagnózy hladinu IgM dokonce nižší, než je věková norma (13). Výjimečně se vyskytují i pacienti s prokázaným deficitem CD40L, kteří mají přechodně normální hladiny imunoglobulinů (26). Většina B-buněk má naivní fenotyp (IgM + IgD + ), zastoupení paměťových (IgD - CD27 + ) B-lymfocytů je minimální (1). Celkový počet T-lymfocytů i T-lymfocytárních subpopulací je normální, stejně jako in vitro proliferativní odpověď na mitogenní stimulaci. Odpověď po stimulaci antigeny je však většinou snížená. Th1 odpověď je nižší spolu s nižší produkcí interferonu gama a porušenou sekrecí IL-12 buňkami prezentujícími antigen. V lymfatických uzlinách pacientů chybí germinální centra. Vyšetření pacientů s neutropenií často ukazuje na blok v myeloidní diferenciaci ve fázi myelocyt/promyelocyt při normální nebo zvýšené hladině G-CSF (31). Diagnostický postup Kromě běžných imunologických testů je základním laboratorním vyšetřením při stanovení diagnózy X-HIGM ověření produkce CD40L aktivovanými CD4 + T-lymfocyty. V současné době je k tomu standardně používána průtoková cytometrie. Buňky jsou několik hodin stimulovány phorbol-12- myristyl-13-acetátem (PMA) a ionomycinem. Vzhledem k tomu, že po aktivaci T-lymfocytů klesá povrchová Alergie 1/

5 Obr. 2: Gen CD40LG/TNFSF5. Šipkou jsou označena místa mutací, které byly nalezeny u našich pacientů: pacient č. 1 (pravděpodobně také pacient č. 2): c.733g > C, p.g226a (missense); pacient č. 3: c.665c > T, p.s222f (missense); pacient č. 4: c.800c > T, p.t254m (missense); pacient č. 5: c.290delc, p.l79yfsx4 (posun čtecího rámce v důsledku delece 1 nukleotidu vedoucí ke vzniku stop kodónu na 82. aminokyselinové pozici). exprese CD4, je třeba hodnotit přítomnost CD40L na CD3 + CD8 - buňkách (graf 2). Test je možné provést s použitím izolovaných mononukleárních buněk nebo přímo z plné krve (38). Variantou vyšetření je intracelulární detekce proteinu (25). Nespecifická stimulace T-lymfocytů je možná i pomocí monoklonální protilátky anti-cd3 (OKT-3). Před testem je potřeba ověřit dostatečný počet CD4+ T-lymfocytů v periferní krvi pacienta a během testu musí být jasně dokumentována správná aktivace T-lymfocytů (např. pomocí exprese CD69 nebo produkce interferonu gama). Výsledek by měl být vždy srovnán s kontrolním vzorkem a vztažen k věku pacienta. Vzhledem k minimální expresi CD40L u novorozenců není vyšetření v této věkové skupině možné. Teoreticky však lze vyšetřit krev prenatálně, a to mezi 19. a 28. týdnem těhotenství, kdy jsou fetální buňky schopné protein CD40L produkovat. Vyšetření však není spolehlivé a nelze je použít k definitivnímu určení diagnózy. Výsledek vyšetření může být falešně pozitivní, tj. exprese CD40L je normální. Tento výsledek ovšem nevylučuje poruchu funkce proteinu. Falešně pozitivní výsledek je dán vazbou fluorescenčně značených protilátek na rezidua CD40L. Stejně tak může být falešně pozitivní i stanovení proteinu pomocí Western-blotu. K definitivní diagnóze je tedy vždy třeba použít mutační analýzu genu TNFSF5. Ve vzácných případech může vlivem extrémní lyonizace a potlačení funkční alely genu (5) nebo díky chromozomální translokaci (15) dojít ke klinickým projevům X-HIGM i u žen. Léčba Na základě genotypu není možné přesně určit fenotyp ani prognózu pacienta. Průběh nemoci bývá vzhledem k postižení buněčné i humorální imunity velmi závažný. Dlouhodobá prognóza je u těchto pacientů horší než u pacientů s vrozenou poruchou tvorby imunoglobulinů (26). Odhaduje se, že třetí dekády života se dožije pouze polovina pacientů (12). Pravidelná imunoglobulinová substituce (intravenózní, IVIg, nebo subkutánní, SCIg) snižuje závažnost a frekvenci infekcí, v některých případech přispívá i ke korekci neutropenie. Vhodná je dlouhodobá profylaxe PCP podáváním co-trimoxazolu. Zásadní je prevence kryptosporidiové infekce pomocí filtrace pitné vody a včasná léčba této infekce, ideálně pre-emptivně po zjištění pozitivity ze stolice nebo žluči (PCR, mikroskopicky). Genová terapie není při použití nynější technologie možná. Exprese CD40L je pod přísnou kontrolou. Při vyšší expresi CD40L, která může při genové terapii s použitím virových vektorů nastat, hrozí vznik maligních nádorů. Jedinou kurativní metodou X-HIGM je v současné době transplantace hematopoetických buněk (HSCT) od zdravého dárce. V případě těžkého poškození jater 38 Alergie 1/2012

6 Tab. 2: Přehled pacientů s X-vázaným hyper-igm syndromem v České republice Pacient Klinické obtíže v době diagnózy Rok narození Hladina imunoglobulinů při prvním vyšetření, resp. diagnóze Exprese CD40L na CD3+CD8- lymfocytech při diagnóze Věk při stanovení diagnózy Hematologické abnormity při diagnóze a v průběhu sledování Léčba Současný stav IgM (g/l) IgG (g/l) IgA (g/l) IgE (ku/l) IC EC let 0.85*; 1,48** 0.44*; 0,8** 0,12*; 0.12** <150 recidivující respirační infekty (včetně bronchopneumonií) a otitidy, hepatopatie normální normální anémie, trombocytopénie, leukocytóza přechodně cotrimoxazol, pravidelná substituce IVIg 21 let; sklerotizující cholangitida při negativitě kryptosporidia ve stolici; nález antifosfolipidových protilátek (bez klinické sympto-matologie), pokračuje IVIg substituce 2 recidivující respirační infekty (včetně bronchopneumonií v dětství), veruky let 8,6 0,56 <0,05 <150 ND ND 0 0 zemřel ve 24 letech na bilaterální alární konfluentní bronchopneumonii (inf. agens nenalezeno); post mortem nález extramedulární hematopoézy a cor pulmonale 3 recidivující pneumonie, subklinická PCP roky 1,01 < 0,33 < 0,07 < 1 0 HSCT ve 4,5 letech věku, MUD, HLA shoda 10/10 6,5 let; klinicky v pořádku; nyní 2 roky po HSCT, smíšený chimerismus, mírná hepatopatie, pokračuje IVIg substituce 4 BCG lymfadenitida, neprospívání, PCP a CMV pneumonie měsíců 1,98 0,6 0,12 < 1 ND anémie, trombocytóza, leukocytóza HSCT ve 12 měsících věku, dárcem HLA-identická sestra, následně 3x DLI 5,5 let; klinicky v pořádku; 4,5 roky po HSCT, smíšený chimerismus 5 BCG lymfadenitida, recidivující respirační infekce měsíců 0,360*** 0,33 $ < 0,01 ND ND anémie, trombocytóza, leukocytóza co-trimoxazol, pravidelná substituce IVIg, indikován k HSCT 17 měsíců, probíhá HSCT Zkratky: ND, neprovedeno; IC, intracelulární; EC, extracelulární; PCP, pneumocystová pneumonie; BCG, vakcína Calmette-Guérin; CMV, cytomegalovirus; HSCT, transplantace kostní dřeně; MUD, nepříbuzný dárce kostní dřeně; DLI, infúze dárcovských lymfocytů. Symboly: vyšetření provedeno v 6 měsících (*), resp. ve 4 letech (**), věková norma hladiny IgM je 0,40 1,4 g/l (***), postvakcinační protilátky (anti-tetanový toxoid, anti-haemophilus influenzae, anti-pneumococcus pneumoniae) nedetekovatelné ($). je možno uvažovat i o kombinované transplantaci (játra, hematopoetické buňky) (14). V literatuře jsou k dispozici údaje o více než 60 transplantovaných pacientech (6,7,12,18 21,35 37,39,40). Většina publikací však představuje jednotlivé kazuistiky s optimistickými závěry. Pouze dvě studie dokumentují léčbu více pacientů. Gennery a spol. (12) publikovali největší multicentrickou retrospektivní studii shrnující výsledky transplantace u 38 pacientů provedených v Evropě v letech Pacienti byli transplantováni průměrně v osmi letech věku (nejstarší v 19 letech) a sledováni průměrně 3,5 roku po transplantaci. Přežití bylo 68 %. Všechna úmrtí byla spojena s těžkými infekcemi (Cryptosporidium spp., CMV, adenovirus, Aspergillus spp.), hlavním negativním prognostickým faktorem byly chronické plicní infekce spojené se strukturálními změnami (bronchiektázie) před transplantací. Na druhém místě ve velikosti souboru je práce publikovaná Tomizawou a spol. (39), která shrnuje výsledky HSCT u pacientů s X-HIGM u 7 japonských pacientů (3 19 let). Pacienti byli léčeni v letech , a sledováni s rozmezím 1 4,2 let). Dva pacienti (29 %) zemřeli z důvodu infekčních komplikací (aspergilóza, kryptosporidiová infekce), oba byli starší (15 a 17 let). Alergie 1/

7 Graf 1: Ukázka vyšetření povrchové exprese CD40L (CD154) na aktivovaných CD3+CD8- lymfocytech průtokovou cytometrií. Pacient č. 4 před transplantací kostní dřeně (0,61% CD3+CD8- buněk u pacienta exprimuje CD40L, u kontroly je to 25,5 %). Stimulace pomocí PMA a ionomycinu. Pacienti v České republice V České republice bylo dosud diagnostikováno 7 pacientů s HIGM. U jedné pacientky byl prokázán deficit AID (HIGM 2) (33), u druhé se genetickou příčinu nepodařilo objasnit (27,28); u 5 chlapců bylo zjištěno poškození CD40L (23). Základní charakteristika všech českých pacientů s CD40L deficitem je uvedena v tab. 2. Pacient č. 1 Pacient byl poprvé imunologicky vyšetřen v 6 měsících, kdy byl hospitalizován pro bronchopneumonii. Při imunologickém vyšetření byla zjištěna dysgamaglobulinémie (tab. 2). Vyšetření lymfocytárních subpopulací ukázalo normální nálezy. Pacientovi byly celkem třikrát aplikovány intravenózní imunoglobuliny. Vzhledem k tomu, že došlo ke vzestupu hladiny IgG (4,3 g/l), byla detekovatelná hladina IgA (0,12 g/l) a pacient byl bez infekcí, byla substituční léčba přerušena s pravděpodobnou diagnózou přechodné hypogamaglobulinémie kojenců. Během následujících 4 měsíců však došlo opět k poklesu hladiny IgG (nejnižší hladina 0,48 g/l), IgA bylo nedetekovatelné, hladina IgM kolísala mezi 0,95 g/l a 2,3 g/l, pacient však neměl žádné klinické známky imunodeficience. Až asi ve 3 letech se objevily častější nasofaryngitidy a sinusitidy, ve 4 letech bylo znovu započato se substituční imunoglobulinovou léčbou. Přes nasazení intravenózních imunoglobulinů se zvyšovala frekvence nasofaryngitid, dvakrát se objevila otitida. Vzhledem k častějším infekcím a suspektní diagnóze hyper-igm syndromu byla zahájena léčba profylaktickými dávkami co-trimoxazolu. Při této terapii se pacient klinicky zlepšil, ale asi 3 měsíce po nasazení antibiotické profylaxe došlo k vzestupu jaterních testů, a proto bylo od této profylaxe upuštěno. V sedmi letech věku chlapce bylo provedeno vyšetření povrchové exprese CD40L na aktivovaných CD3 + CD8 - T-lymfocytech, které prokázalo normální hodnoty (hladiny imunoglobulinů v tab. 2). Diagnóza X-HIGM byla potvrzena až molekulárně genetickým vyšetřením (obr. 2). Při pravidelné substituci imunoglobuliny je nyní frekvence infekcí respiračního traktu únosná, pacient dále neprodělal žádnou bronchopneumonii, objevilo se několik akutních otitid. Pacient nikdy netrpěl závažnějšími či chronickými průjmy ani ústními ulceracemi. Hladina IgA je nedetekovatelná, hladiny IgM bývají v referenčních mezích pro daný věk. Opakovaná vyšetření základních lymfocytárních subpopulací ukazují normální počty. Nikdy nebyla zaznamenána granulocytopenie. V průběhu sledování se postupně zvyšovala sérová aktivita jaterních enzymů, recentně byla prokázána sklerotizující cholangoitida, vyšetření kryptosporidia ze stolice bylo mikroskopicky opakovaně negativní. Vzhledem k jeho 40 Alergie 1/2012

8 Hmotnost, chlapci Hmotnost (kg) Věk (měsíce) Graf 2: Váhová křivka pacienta č. 4. Šipka ukazuje dobu stanovení diagnózy X-vázaného hyper IgM syndromu. nízké compliance, nepříznivé sociální situaci a nevyzrálé osobnosti není možné provést transplantaci kostní dřeně. Pacient č. 2 Tento chlapec je bratrancem pacienta č. 1 v mateřské linii. Byl poprvé imunologicky vyšetřen ve 21 letech pro opakované a rezistentní bradavice na nohou a rezistentní condylomata accuminata. V anamnéze popíral jakékoli častější nebo závažnější infekce. Při laboratorních testech jsme nalezli dysgamaglobulinémii (tab. 2). Přes výzvu k opakované návštěvě se pacient k imunologickému vyšetření nedostavil. Další vyšetření bylo provedeno až ve 24 letech, kdy byl odeslán v době hospitalizace pro plicní infiltraci nereagující na běžnou léčbu. Imunologické vyšetření opět prokázalo nízké hladiny IgG (0,78 g/l) a IgA (< 0,05 g/l) a vysokou hladinu IgM (4,62 g/l). Při vyšetření lymfocytárních subpopulací byl nalezen zvýšený počet CD3+ lymfocytů (94 %), jinak byl nález bez pozoruhodností. Brzy po tomto vyšetření pacient zemřel, pitva prokázala bilaterální purulentní bronchopneumonii, extramedulární hematopoézu v thorakálních uzlinách, játrech a ve slezině, dekompenzované chronické cor pulmonale. Etiologii bronchopneumonie se nepodařilo zjistit. Ani při imunologických vyšetřeních ani podle dostupné dokumentace se nikdy nepodařilo prokázat granulocytopenii. Retrospektivně po úmrtí pacienta udali rodiče častý výskyt infekcí včetně bronchopneumonií, zejména v dětství a pubertě. Pacient č. 3 Třetí pacient byl poprvé hospitalizován v 8 měsících věku pro bronchopneumonii, před stanovením diagnózy X-HIGM následovalo ještě 6 dalších hospitalizací pro recidivující infekce horních a dolních cest dýchacích (z toho třikrát pro bronchopneumonii, vždy vpravo). Jiné obtíže neměl. Byl řádně očkován, bez komplikací. Rodina se nacházela ve složité sociální situaci, chlapec bydlel v hygienicky nevyhovujících podmínkách. Ve 4 letech věku byla v séru zjištěna absence IgG a IgA při normální hladině IgM (tab. 2). V bronchiálním sekretu byla metodou PCR potvrzena přítomnost Pneumocystis jirovecii. Vzhledem k tomu, že nebyly přítomny klinické známky akutní pneumocystové pneumonie, byl pacient zajištěn profylaktickou dávkou co-trimoxazolu a byla zahájena substituce IVIg. Lymfocytární subpopulace byly početně v normě. Cytometrickým vyšetřením periferní krve byla prokázána minimální exprese CD40L aktivovanými CD3 + CD8 - lymfocyty. Diagnóza X-HIGM byla potvrzena molekulárně genetickým vyšetřením (obr. 2) a chlapec byl indikován k transplantaci kostní dřeně. V mezidobí pokračovala profylaxe co-trimoxazolem a IVIg. Matka i nevlastní bratr (jiný otec) jsou zdrávi, poškození genu CD40LG/TNFSF5 u nich nebylo prokázáno. Chlapec byl v listopadu 2009, ve věku 4,5 roku, transplantován štěpem kostní dřeně od nepříbuzného dárce. Nyní je 2 roky po transplantaci ve stabilizovaném stavu, užívá přechodně obyklou potransplantační antibiotickou Alergie 1/

9 profylaxi, stále je nutná imunoglobulinová substituce. Je přítomen smíšený chimerismus s výrazným podílem autologní krvetvorby. Pacient č. 4 (23) U čtvrtého pacienta se onemocnění manifestovalo BCG lymfadenopatií v levé axile ve třech měsících věku. Další očkování bylo odloženo. Hůře prospíval, od 6. měsíce nepřibýval vůbec (graf 2), dlouhodobě suše pokašlával, měl řidší žluto-zelené stolice, při normální tělesné teplotě. V 8 měsících věku byla při vyšetření sooru v dutině ústní u praktické lékařky zjištěna tachypnoe a chlapec byl odeslán k podrobnějšímu vyšetření. Zobrazení plic (rtg, HRCT) ukázalo rozsáhlé bilaterální nehomogenní infiltrativní změny, některá ložiska byla chronického charakteru. Vzhledem k trvající tachypnoe a snížené saturaci periferní krve kyslíkem byla nutná oxygenoterapie. V krevním obraze byla přítomna leukocytóza (37 tis./μl), C-reaktivní protein i sedimentace erytrocytů byly nízké, přítomna byla anémie a trombocytóza. Vyšetření kostní dřeně vyloučilo hematologickou malignitu. Chlapec byl léčen parenterálně klaritromycinem a gentamicinem, a perorálně co-trimoxazolem a flukonazolem. Laboratorním vyšetřením byla zjištěna významná hypogamaglobulinémie IgG a IgA, absence IgE a mírně zvýšené IgM (tab. 2). Průtoková cytometrie prokázala prakticky nulovou povrchovou expresi CD40L na aktivovaných CD3 + CD8 - lymfocytech (graf 1). Makroskopický nález při bronchoskopii byl normální, v bronchiálním sekretu i v krvi byla zjištěna metodou PCR přítomnost Pneumocystis jirovecii a CMV. Tři týdny byl chlapec léčen gancyklovirem, byla zahájena substituční aplikace IVIg. Dále jsme perorálně podávali klaritromycin a flukonazol. Pro granulocytopenii bylo aplikováno několik dávek G-CSF. Po celou dobu hospitalizace byl chlapec afebrilní, bez výrazných obtíží, s normálním poslechovým nálezem na plicích při trvající tachypnoe a suchém pokašlávání. Pro nízký perorální příjem byl zpočátku sondován, postupně se situace upravila a začal přibírat na váze. Molekulárně genetické vyšetření potvrdilo diagnózu X-HIGM (obr. 2). Matka je nosička onemocnění. Chlapec byl indikován k alogenní transplantaci kmenových buněk krvetvorby. Transplantace byla provedena ve 12 měsících věku pacienta, dárcem byla starší zdravá HLA-identická sestra. Pro částečné odhojení štěpu byly v potransplantační době opakovaně podány infúze dárcovských lymfocytů s nejednoznačným efektem. V současné době je chlapec 4 a půl roku po transplantaci, s normální nemocností, bez známek GvHD, užívá běžnou antimikrobní profylaxi, hladiny imunoglobulinů jsou v normě. Stále trvá smíšený chimerismus s výrazným podílem autologní krvetvorby, s nízkým procentem T-lymfocytů schopných exprese CD40L. Pacient č. 5 Poslední pacient s diagnózou X-HIGM se narodil v roce Pro hypertrofii plodu byl porod veden operační cestou. Poporodní období, stejně jako rodinná anamnéza byly bez pozoruhodností, chlapec byl standardně kalmetizován. Ve věku jednoho měsíce prodělal oboustrannou akutní otitidu, v 10 týdnech věku byla nutná krátká hospitalizace pro BCG lymfadenitidu. Afekce se spontánně zhojila bez nutnosti chirurgického nebo jiného terapeutického zásahu. V 6 měsících věku při hopitalizaci pro febrilní bronchitidu získal nozokomiálně rotavirovou infekci, která ustoupila bez komplikací. Po dimisi přetrvávalo pokašlávání a intermitentní subfebrilie. Od 3. měsíce věku se manifestoval v obličeji papulopustulózní ekzém, byly pozorovány známky neprospívání, průjmy však neměl. Vyšetření stolice neprokázalo kryptosporidiovou infekci. Absolvoval 3 dávky očkování hexavakcínou, byl očkován i Prevenarem. V 11 měsících věku byl chlapec opět hospitalizován pro infekci dolních dýchacích cest. V průběhu hospitalizace bylo indikováno imunologické vyšetření (tab. 2), které vedlo k diagnóze X-HIGM. Diagnóza byla následně potvrzena molekulárně geneticky (obr. 2). Matka a její matka jsou nosičkami onemocnění. Chlapec byl indikován k transplantaci kostní dřeně od nepříbuzného shodného dárce. Výkon nyní probíhá. Diskuze X-vázaný hyper IgM syndrom (X-HIGM nebo HIGM 1), respektive deficit CD40 ligandu, je velmi vzácné onemocnění, které může být snadno přehlédnuto. Klinický obraz nemusí být vždy nápadný, jediným příznakem mohou být nekomplikované recidivující respirační infekty, neprospívání (graf 2) či chronické průjmy. I pneumocystová pneumonie může mít zpočátku indolentní průběh. Lymfadenitidy po BCG očkování, dokumentované u dvou našich pacientů, budou nyní po ukončení celoplošné vakcinace zcela raritní. Při podezření na HIGM je zásadní vyšetření hladiny imunoglobulinů a pátrání po oportunních patogenech. Při nejednoznačném nálezu by se vyšetření imunoglobulinů mělo opakovat. Některé izotypy mohou být i přes defekt přesmyku přechodně přítomny, hladina IgM může být naopak nízká (pacient č. 1 a 5). V rámci diferenciální diagnostiky při nálezu nízké hladiny IgG, IgA a vysoké hladiny IgM u dětí je třeba myslet i na jiné vzácné vrozené anomálie (tab. 1), případně na sekundární příčinu. Diagnóza X-HIGM může být většinou stanovena vyšetřením exprese CD40L na aktivovaných T-lymfocytech. V některých případech (pacient č. 1) je však vyšetření neprůkazné a jedině molekulárně genetické vyšetření může přinést jednoznačnou odpověd (nyní dostupné i v České republice, v genetické laboratoři CKTCH Brno). V současnosti neexistují spolehlivá data o vztahu genotypu k fenotypu a všichni pacienti s klinickým a laboratorním obrazem X-HIGM a s geneticky prokázaným defektem v TNFSF5 jsou indikováni k alogenní transplantaci hematopoetických buněk. V době po odeslání tohoto článku do redakce byl v České republice diagnostikován další případ pacienta 42 Alergie 1/2012

10 s X-vázaným hyper-igm syndromem. Tento chlapec měl obtíže po podání BCG vakcíny objevila se krční lymfadenitida s kolikvací a opakovanou nutností punkce hnisu. Poté byl pacient bez větších klinických příznaků. Ve věku 36 měsíců se objevila postupně se zhoršující gingivostomatitida a aftózní stomatitida, ta byla důvodem imunologického vyšetření, které prokázalo neměřitelnou hladinu IgG a IgA s normální hladinou IgM (0,537 g/l, referenční meze 0,400 1,800 g/l). Při vyšetření lymfocytárních subpopulací byl nejpozoruhodnějším nálezem pokles CD27+IgM-IgD- (paměťových) B-lymfocytů (0,1 %, referenční meze 3,3 7,4 % z celkových B-lymfocytů). Po stimulaci ionomycinem a PMA byla u pacienta prokázána nulová exprese CD40L na CD3+CD8- lymfocytech. Molekulárně genetickým vyšetřením byla zjištěna rozsáhlá delece postihující první tři exony genu TNFSF5. Poděkování: Rádi bychom poděkovali kolegům z laboratoří prof. L. D. Notarangela a dr. G. de Saint Basil za ochotné provedení molekulárně genetických vyšetření u některých našich pacientů, a prof. MUDr. J. Bartůňkové, DrSc., MBA za cenné připomínky k textu. Práce byla podpořena z prostředků VZ FNM MZ a a částečně z grantu MZd č. NS/ Dr. Janda je stipendistou fellowship programu Evropské společnosti pro imunodeficience (ESID) financované firmou Baxter. LITERATURA 1. Agematsu K et al. Absence of IgD-CD27(+) memory B cell population in X-linked hyper-igm syndrome. J Clin Invest. 1998; 1024: Allen RC et al. CD40 ligand gene defects responsible for X- linked hyper-igm syndrome. Science. 1993; : Brugnoni D et al. Ontogeny of CD40L [corrected] expression by activated peripheral blood lymphocytes in humans. Immunol Lett. 1996; 491-2: Burtin P. [An example of atypical agammaglobulinemia (a case of severe hypogammaglobulinemia with increase of the beta-2 macroglobulin.]. Rev Fr Etud Clin Biol. 1961; 6: de Saint Basile G et al. CD40 ligand expression deficiency in a female carrier of the X-linked hyper-igm syndrome as a result of X chromosome lyonization. Eur J Immunol. 1999; 291: Dimicoli S et al. Complete recovery from Cryptosporidium parvum infection with gastroenteritis and sclerosing cholangitis after successful bone marrow transplantation in two brothers with X-linked hyper-igm syndrome. Bone Marrow Transplant. 2003; 327: Duplantier JE et al. Immunologic reconstitution following bone marrow transplantation for X-linked hyper IgM syndrome. Clin Immunol. 2001; 983: Durandy A et al. Induction by anti-cd40 antibody or soluble CD40 ligand and cytokines of IgG, IgA and IgE production by B cells from patients with X-linked hyper IgM syndrome. Eur J Immunol. 1993; 239: Ferrari S et al. Mutations of CD40 gene cause an autosomal recessive form of immunodeficiency with hyper IgM. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001; 9822: Alergie 1/ Fuleihan R, Ahern D, and Geha RS. Decreased expression of the ligand for CD40 in newborn lymphocytes. Eur J Immunol. 1994; 248: Fuleihan R et al. Cyclosporin A inhibits CD40 ligand expression in T lymphocytes. J Clin Invest. 1994; 933: Gennery AR et al. Treatment of CD40 ligand deficiency by hematopoietic stem cell transplantation: a survey of the European experience, Blood. 2004; 1033: Gilmour KC et al. Immunological and genetic analysis of 65 patients with a clinical suspicion of X linked hyper-igm. Mol Pathol. 2003; 565: Hadzic N et al. Correction of the hyper-igm syndrome after liver and bone marrow transplantation. N Engl J Med. 2000; 3425: Imai K et al. Female hyper IgM syndrome type 1 with a chromosomal translocation disrupting CD40LG. Biochim Biophys Acta. 2006; 17623: Imai K et al. Human uracil-dna glycosylase deficiency associated with profoundly impaired immunoglobulin class-switch recombination. Nat Immunol. 2003; 410: Jabara HH, Brodeur SR, and Geha RS. Glucocorticoids upregulate CD40 ligand expression and induce CD40L-dependent immunoglobulin isotype switching. J Clin Invest. 2001; 1073: Jacobsohn DA et al. Nonmyeloablative hematopoietic stem cell transplant for X-linked hyper-immunoglobulin m syndrome with cholangiopathy. Pediatrics. 2004; 1132: e Kato T et al. Successful bone marrow transplantation in a child with X-linked hyper-igm syndrome. Bone Marrow Transplant. 1999; 2310: Kawai S et al. Immunological reconstitution by allogeneic bone marrow transplantation in a child with the X-linked hyper-igm syndrome. Eur J Pediatr. 1999; 1585: Kikuta A et al. Nonmyeloablative stem cell transplantation for nonmalignant diseases in children with severe organ dysfunction. Bone Marrow Transplant. 2006; 3810: Kracker S et al. Immunoglobulin class switch recombination deficiencies. Clin Immunol. 2010; 1352: Kral V et al. A ten-month-old boy with serious lung finding and poor weight gain. Contribution of laboratory search for early diagnostics of hyper-igm syndrome. A case report. Allergy. 2007; 62: Kroczek RA et al. Defective expression of CD40 ligand on T cells causes X-linked immunodeficiency with hyper-igm (HIGM1). Immunol Rev. 1994; 138: Krol L et al. Signature profiles of CMV-specific T-cells in patients with CMV reactivation after hematopoietic SCT. Bone Marrow Transplant. 2011; 468: Levy J et al. Clinical spectrum of X-linked hyper-igm syndrome. J Pediatr. 1997; 1311 Pt 1: Litzman J, JL, and VT. Syndrom hyperimunoglulinémie M - klinický a laboratorní obraz u čtyř nemocných. Klin. Imunol. Alergol. 1998; 84: Moschese V et al. A novel form of non-x-linked hyperigm associated with growth and pubertal disturbances and with lymphoma development. J Pediatr. 2006; 1483: Noordzij JG et al. Ataxia-telangiectasia patients presenting with hyper-igm syndrome. Arch Dis Child. 2009; 946: Notarangelo LD et al. Defects of class-switch recombination. J Allergy Clin Immunol. 2006; 1174:

11 31. Ochs HD, Smith CIE, Puck JM. Primary immunodeficiency diseases: a molecular and genetic approach Oxford: Oxford University Press Peron S et al. Human PMS2 deficiency is associated with impaired immunoglobulin class switch recombination. J Exp Med. 2008; 20511: Quartier P et al. Clinical, immunologic and genetic analysis of 29 patients with autosomal recessive hyper-igm syndrome due to Activation-Induced Cytidine Deaminase deficiency. Clin Immunol. 2004; 1101: Revy P et al. Activation-induced cytidine deaminase (AID) deficiency causes the autosomal recessive form of the Hyper- IgM syndrome (HIGM2). Cell. 2000; 1025: Sakata N et al. Unrelated donor marrow transplantation for congenital immunodeficiency and metabolic disease: an update of the experience of the Japan Marrow Donor Program. Int J Hematol. 2004; 802: Sato T et al. Stem cell transplantation in primary immunodeficiency disease patients. Pediatr Int. 2007; 496: Scholl PR et al. Correction of neutropenia and hypogammaglobulinemia in X-linked hyper-igm syndrome by allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 1998; 2212: Thon V et al. [A simple method for the detection of CD154 (CD40L) on peripheral blood lymphocytes]. Epidemiol Mikrobiol Imunol. 2010; 593: Tomizawa D et al. Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation for seven children with X-linked hyper-igm syndrome: a single center experience. Am J Hematol. 2004; 761: Ziegner UH et al. Unrelated umbilical cord stem cell transplantation for X-linked immunodeficiencies. J Pediatr. 2001; 1384: Zonana J et al. A novel X-linked disorder of immune deficiency and hypohidrotic ectodermal dysplasia is allelic to incontinentia pigmenti and due to mutations in IKK-gamma (NEMO). Am J Hum Genet. 2000; 676: MUDr. Aleš Janda, MSc., PhD. Centrum für Chronische Immundefizienz (CCI) Universitätsklinikum Freiburg Breisacher Str Freiburg im Breisgau Německo ales.janda@uniklinik-freiburg.de 44 Alergie 1/2012