KMENOVÉ BUÒKY OTÁZKY PLASTICITY, REGENERACE A STÁRNUTÍ

Transkript

1 KMENOVÉ BUÒKY OTÁZKY PLASTICITY, REGENERACE A STÁRNUTÍ S. FILIP, J. MOKRÝ SOUHRN Jedním z nejspornějších problémů v současné biologii a medicíně je existence plasticity kmenových buněk. Termínem plasticita se míní fenotypový potenciál kmenových buněk, který je širší než jsou fenotypy diferencovaných buněk jejich původních tkání. Mnoho laboratoří již podalo důkaz o existenci plasticity kmenových buněk, ale vznikla celá řada námitek k prezentovaným výsledkům. Prezentujeme některé z námitek zpochybňujících údaje o plasticitě kmenových buněk. Tyto sporné otázky uvedeme do kontextu s tradičním pohledem na potenciál kmenových buněk a diverzifikaci buněčných fenotypů u dospělých a stárnoucích buněčných fenotypech. Vzhledem k malému prostoru se nebudeme zabývat plasticitou embryonálních a nádorových kmenových buněk. Naopak chceme v našem sdělení poukázat na některé otázky a problémy spojené s plasticitou kmenových buněk v dospělém organizmu a na úzký vztah k procesům regenerace a stárnutí. Z dosavadních experimentálních výsledků můžeme říci, že kmenové buňky pravděpodobně mají klíčovou úlohu v těchto procesech. Vzhledem k tomu, že se jedná o rychle se rozvíjející obor, je velmi obtížné najít jasné vysvětlení pro nastolené otázky, a proto se omlouváme, že některé prezentované závěry potřebují další vysvětlení a hlubší studium dané problematiky. Toto sdělení představuje určitou sondu a úvod do diskuse určené celé řadě odborníků. ABSTRACT Stem cells plasticity, regeneration and aging questions. One of the most controversial problem in biology and medicine is the existence of stem cells plasticity. The term plasticity, as it is understood, is the potential of stem cell fenotypes that is much broader that fenotypes of differentiated cells of their original tissues. Many laboratories have documented the existence of stem cell plasticity, however, there are still many objections to the reported results. Here, we present some of these objections to the reported results. Here, we present some of these objections questioning the data on stem cell plasticity in the context with the traditional view on stem cell potential and diversification in adult and aging cell fenotypes. As there is not enough space, we will not discuss the plasticity of embryonal and tumour stem cells. Instead, we wish to point out some problems associated with plasticity of stem cells in an adult organism and show their close relation to processes of regeneration and aging. Recent experimental results indicate that stem cells may have a key role in these processes. With regard to rapid developments in biology and medicine, some answers to the problems that seemed to be resolved according to the current state of knowledge, would have to be changed. This communication is just meant as an introduction and a probe for discussion for many concerned scientist. KLÍÈOVÁ SLOVA kmenové buňky plasticita fúze transdiferenciace regenerace stárnutí buněčná terapie KEY WORDS stem cells plasticity fusion transdifferentiation regeneration aging cells therapy ÚVOD Jedním z nejdiskutovanějších problémů v současné biologii a medicíně je existence plasticity kmenových buněk. V úvodu si ale musíme upřesnit některé základní pojmy, jako je definice kmenových buněk, fúze buněk a transdiferenciace. Na kmenové buňky a plasticitu kmenových buněk se tedy musíme dívat odlišně, a to z pohledu embryogeneze, dospělého organizmu nebo procesu regenerace a stárnutí. Zde musíme také připomenout, že dále se budeme věnovat výhradně problematice plasticity kmenových buněk v dospělém organizmu. Kmenové buňky jsou schopny produkovat diferencované elementy, samy si však uchovávají nezralý fenotyp. Jejich trvalá přítomnost ve tkáních však nabízí možnost využít spontánní procesy organizmu uplatňující se při reparaci tkání [7]. Kmenové buňky jsou odpovědné za vznik a udržování terminálně diferencovaných buněčných ÈES GER REV 2005; 3(4) 51

2 definice kmenové buňky plasticita populací v tkáních, které se kontinuálně obnovují. Molekulární báze pro asymetrické dělení a specifikaci profilu vyzrávajících buněk se snadněji sleduje u nižších mnohobuněčných organizmů než ve tkáních savců. Poněvadž existence a obnova tkání je nemyslitelná bez kmenových buněk, znamená to, že kmenové buňky se jako unikátní buněčná populace uplatnily a osvědčily v časných fázích evoluce při formování mnohobuněčných organizmů. Podobné principy, regulující aktivitu kmenových buněk, zajišťující jejich sebeobnovu a udržující počet kmenových buněk na konstantní úrovni, se uplatňují u rostlin i u savců. Úkolem současné vědy je identifikovat např. povrchové markery použitelné pro odlišení kmenových buněk od buněk progenitorových. Kultivace buněk a tkání lze využít pro studium asymetrického dělení jednotlivých buněk. Rovněž je důležité identifikovat geny, které regulují vyzrávání jednotlivých buněčných typů. Informace získané při studiích kmenových buněk v normálních tkáních mohou osvětlit různé patologické stavy, zvláště metaplazii, u níž přeprogramování kmenových buněk může způsobit konverzi potomstva z jedné diferenciační cesty k jiné [33] a vznik nádorů, při němž je porušena rovnováha mezi proliferací a diferenciací [4,5,27]. Nové poznatky o kmenové buňce posunuly naše poznání dále, ale zatím se nám nepodařilo přesněji kmenovou buňku definovat. Přesná definice kmenové buňky zůstává v současné době problematická. Kmenové buňky představují jedinečnou populaci buněk, jejímž úkolem je vytvoření základů jednotlivých tkání a orgánů, udržení jejich struktury a funkce v mnohobuněčném organizmu; jsou generovány na samém začátku ontogeneze a přetrvávají v tkáních i v dospělosti [7]. Kmenové buňky jsou nediferencovanými elementy (bez specializace), které se mohou samy neustále obnovovat [23,30]. Definice kmenové buňky uspořádává základní principy ve vývojové biologii při vývoji živého organizmu, kde hrají důležitou roli jak vnitřní, tak vnější faktory. Vliv vnějších a vnitřních faktorů na další osud kmenových buněk si teprve začínáme uvědomovat. Termínem plasticita se míní fenotypový potenciál kmenových buněk, který je širší, než jsou fenotypy diferencovaných buněk jejich původní tkáně. V několika posledních letech byly publikovány studie, které naznačovaly, že některé populace kmenových buněk u dospělého jedince mohou vlastnit fenotypový potenciál širší, než mají typy buněk jejich výchozích tkání [17,28, 39]. Přesto tyto studie mnoho vědců nepřesvědčily a ti prohlašují, že existuje dostatečný důvod ke skepsi [8]. KMENOVÉ BUÒKY PLASTICITA, TRANSDIFERENCIACE, FÚZE Proč byly zprávy o plasticitě kmenových buněk přivítány s velkou skepsí? Pravděpodobně tušíte, že toto může být klíčovým problémem k pochopení vztahu plasticity kmenových buněk, procesu regenerace a stárnutí. Nejdříve se ale podívejme na současný názor na kmenové buňky a jejich fenotypovou diverzifikaci [2,13,25,39]. Definice: kmenové buňky jsou samy se obnovující nediferencované buňky mající schopnost následně produkovat velká množství diferencovaných buněk. To, co odlišuje různé populace kmenových buněk, je jejich potenciál vytvářet četné typy specifických buněk, jinými slovy, zda kmenové buňky jsou totipotentní, multipotentní nebo unipotentní. Jak se kmenové buňky uplatňují v procesech regenerace a stárnutí? Jsou to převáženě totipotentní, multipotentní nebo jiné kmenové buňky? Podle obvyklé definice jsou pluripotentní kmenové buňky ty, které produkují velké množství buněčných fenotypů, např. mezenchymální kmenové buňky (MSCs mesenchymal stem cells). Multipotentní jsou tkáňově specifické, např. hemopoetické kmenové buňky (HSCs hematopoietic stem cells), které mají omezenější potenciál a jsou prekurzorem pro všechny krevní linie. Představitelem unipotentní kmenové buňky je spermatogonie. Tradiční model fenotypové diverzifikace buněk je založen na přísné hierarchii podskupin kmenových buněk s individuálními buněčnými liniemi, vznikajícími cestami progresivní a jednosměrné diferenciace [1,2,20,24]. Tento tradiční model předpokládá, že nezvratné vazební kroky v průběhu embryonálního vývoje mají za následek omezenou distribuci tkáňově specifických populací kmenových buněk v příslušných dospělých tkáních [1,2,24]. Toto předpokládané třídění kmenových buněk se zakládá na víře, že kmenové buňky v dospělých tkáních jsou ve své kapacitě omezeny tak, aby produkovaly pouze fenotypy diferencovaných buněk. Tato představa má také přímý vztah k pochopení procesu regenerace a stárnutí. Lze říci, že proces regenerace a stárnutí je úzce spojen a má svoje kvalitativní úrovně začínající embryonálním vývojem a končící smrtí organizmu. Tkáňově specifické kmenové buňky plní své funkce včetně obnovy diferencovaných elemen- 52 ÈES GER REV 2005; 3(4)

3 tů po celou dobu života organizmu až do pozdního stáří. Přestože jsou kmenové buňky velice často považovány za velmi citlivou populaci buněk náchylnou na poškození, je nutno upřesnit, že toto platí pouze pro aktivované a proliferující kmenové buňky. V normální tkáni se však kmenové buňky nacházejí v klidovém stavu, v němž je jejich metabolizmus takřka nulový. V tomto stavu jsou kmenové buňky odolné vůči poškození. Díky této skutečnosti lze také kmenové buňky s úspěchem izolovat i z tkání odebraných post mortem [26], zatímco diferencované elementy s aktivním metabolizmem odumřou a podléhají autolýze. Důkaz naznačující, že tkáňově odvozené kmenové buňky mohou mít širší potenciál, než jak se předpokládalo, zpochybňuje tuto základní premisu. Akceptování plasticity kmenových buněk by mohlo vést ke změně standardního názoru na diverzifikaci buněčných fenotypů [9,12,40]. KMENOVÉ BUÒKY PLASTICITA A HETEROGENITA Proces stárnutí má celou řadu otázek, které souvisejí s možností vyčerpání poolu kmenových buněk, se snížením schopnosti regenerace, nahromaděním ireverzibilních změn v rámci tkáňové rovnováhy, mikroprostředí (niche) a kmenových buněk. V celém průběhu života organizmu dochází k pochodům, které přinášejí rozpaky. Je to buněčná fúze a transdiferenciace. Jedním z hlavních argumentů používaných ke zpochybnění zpráv o plasticitě kmenových buněk je, že experimenty zaměřené na průkaz transdiferenciace dospělých progenitorů byly ve skutečnosti průkazem buněčné fúze [15,19,42]. Tato otázka se také dostala do popředí při pozorováních, která popisují pochody, kdy tkáňově odvozené kmenové buňky mohou podstupovat fúzi s jinými buněčnými typy [37,41,42]. Na základě novějších studií o buněčné fúzi se došlo k závěru, že fenomenologie buněčné fúze může vysvětlit dřívější zprávy o plasticitě kmenových buněk. Kromě toho je důkaz buněčné fúze popisován jako zrušení platnosti koncepce o transdiferenciaci kmenových buněk [22,41]. V současné době i přes tyto rozporuplné poznatky není jasné, proč by buněčná fúze a transdiferenciace měly být protichůdnými jevy [9]. Proces regenerace a stárnutí podle posledních pozorování obsahuje nové pojetí, které souvisí s plasticitou kmenových buněk. ÈES GER REV 2005; 3(4) 53

4 hemangioblast příčiny šedivění Další cestou, jak porovnávat plasticitu kmenových buněk, je přijmout nové poznatky a nabídnout další nebo alternativní interpretaci z pohledu plasticita heterogenita [19,39]. Je plasticita kmenových buněk prostou iluzí nebo je obrazem vysokého stupně heterogenity mezi populacemi kmenových buněk v dospělých tkáních? Je tento fenomén spojen s procesem stárnutí? Jsou mechanizmy odpovědné za regeneraci a procesy stárnutí shodné s procesy plasticity kmenových buněk? Je hypotéza, která zachovává hierarchickou strukturu tradičního modelu diverzifikace kmenových buněk, správná? Je tedy proces stárnutí závislý na tomto hierarchickém uspořádání? Další možností je přiznat, že plasticita kmenových buněk existuje, ale pak omezit její prevalence a sféru působnosti [24], a tudíž zachovat většinu základních principů tradiční teorie kmenových buněk. Při určování, jaký význam mají tyto různé hypotézy pro chápání buněčného potenciálu u dospělých, je důležité pochopit biologické implikace každého modelu. Oba modely, jak tradiční, tak jeho varianta vývojový model heterogenity, vyžadují naprostou věrnost hierarchické, jednosměrné a ireverzibilní dráze při diferenciaci buněk. Tím, že je posun v profilu kmenových buněk prezentován jako limitovaný model plasticity a snaží se udržet rozlišení mezi podskupinami kmenových buněk, tj. pluri-, multi-, unipotentní, dochází k celé řadě problémů a žádný z těchto modelů nemůže uspokojivě vysvětlit, jak vzniká diferencovaná tkáň, proces reparace a stárnutí. KMENOVÉ BUÒKY REGENERACE, PROCES STÁRNUTÍ V dospělém organizmu je generování nově diferencovaných buněk významně zvýšené jako odpověď např. na hojení rány. Obecně byl akceptován názor, že kmenové buňky vycítí poškození tkáně a z dálky migrují do místa poranění [14,21,38]. Nicméně bylo pozorováno, že aktivace imunitní odpovědi zvyšuje regeneraci buněk, k níž dochází, když jsou tkáně nebo buňky hostiteli transplantovány [16,29]. Ve studii, která se zabývala analýzou srdeční tkáně u mužů, kterým bylo transplantováno ženské srdce, bylo největší množství Y-pozitivních kardiomyocytů v místech akutní rejekce [18]. Dalším důkazem je průkaz, že monocyty se mohou diferencovat v endotelové buňky u nově vzniklých cév, které se tvoří v poraněných končetinách během regenerace [14]. Zde je také znovu otevřená otázka existence multipotentní kmenové buňky hemangioblastu, který umožňuje vznik hemopoetické i endotelové buněčné linie [32]. Je zde určitý precedens, že regenerovaná tkáň nevzniká vždy z kmenových buněk podle drah hierarchické diferenciace. Toto může mít také za následek špatné pochopení procesu stárnutí, který také nemusí být vázán na hierarchické dráhy. Jeden z markantních příznaků stárnutí organizmu je šedivění vlasů. V nedávné době se prokázalo, že k těmto změnám dochází v důsledku změn buněčného mikroprostředí uvnitř vlasové cibluky, které vedou ke ztrátě melanocytů zodpovědných za zabarvení vlasu [6]. Zde musíme také připomenout některé další otázky, které souvisí s procesem stárnutí, zastoupením a aktivitou kmenových buněk ve stáří. Proč by měly mít diferencované buňky kapacitu měnit se na jiné diferencované fenotypy? Proces stárnutí je součástí evoluce. Během evoluce, jak vznikaly složitější organizmy, vznikaly také odlišné typy specializovaných buněk. Vznikají nové diferencované fenotypy přímo z kmenových buněk? Existují diferencované fenotypy, které podstoupily změnu a daly základ vzniku nových fenotypů? Jsou tyto dvě dráhy propojené transdiferenciací? Mohou mít časně vzniklé fenotypy větší kapacitu k transdiferenciaci? Myslíme si, že úvaha o transdiferenciaci má signifikatní důsledky pro biologii kmenových buněk. Zde si musíme také položit otázku: Jaký je důkaz, že existuje skutečně rozdíl mezi diferenciací kmenových buněk a transdiferenciací? Musíme přiznat, že čára mezi normální diferenciací a transdiferenciací byla udělána proto, že výsledky plasticity nejsou jednotné. V experimentech tušíme širší potenciál kmenových buněk [3,8,25]. V současné době lze pro regeneraci poškozeného myokardu použít hematopoetické a mezenchymové kmenové buňky získané z kostní dřeně. Lidská kostní dřeň obsahuje 1 2 % hematopoetických kmenových buněk a méně než 0,05 % mezenchymových kmenových buněk. Reparaci poškozeného myokardu lze navodit aplikací autologních buněk kostní dřeně [34,35, 36], autologních svalových buněk [10,11] a také aplikací některých cytokinů, např. SCF a G-CSF [36]. Každá z uvedených metod má svoje výhody a nevýhody. Při aplikaci buněk kostní dřeně se předpokládá jak reparace myokardu, tak jeho revaskularizace. Naopak při aplikaci svalových buněk je podíl revaskularizace významně menší. Zatím experimentální otázkou zůstává použití 54 ÈES GER REV 2005; 3(4)

5 cytokinů, kde pravděpodobně 1 z limitujících faktorů bude jejich systémová toxicita. Buňky určené po reparaci myokardu můžeme aplikovat následujícími způsoby: intrakoronární katetrizační technikou transendokardiální a transepikardiální technikou. Buněčná terapie reprezentuje novou metodu léčby poškozené tkáně myokardu. V současné době ale stále existuje řada otázek týkajících se skutečného přínosu HSCs z kostní dřeně v reparaci myokardu po infarktu. Zatím se neví, které buňky nebo jaký humorální faktor vede k regeneraci poškozeného myokardu. Ve stáří může buněčná terapie představovat jednu z možností léčby celé řady onemocnění, např. infarktu myokardu, Parkinsonovy nemoci, cukrovky a dalších [7]. ZÁVÌR Na závěr našeho krátkého sdělení chceme poukázat na subjektivní předpojatost v biologii kmenových buněk, která se potom dále rozvíjí v buněčné terapii. Problém plasticity kmenových buněk se v rovině buněčné terapie stává ještě obtížněji řešitelný. Dokladem za celou řadu léčebných aplikací je použití buněk kostní dřeně u nemocných s infarktem myokardu [31,36]. Práce vznikla za podpory výzkumného záměru MZO LITERATURA 1. Alison MR, Poulsom R, Forbes S, Wright NA. An introduction to stem cells. J Pathol 2002; 197: Anderson DJ, Gage FH, Weissman, IL. Can stem cells cross lineage boundaries? Nat Med 2001; 7: Björnson CR, Rietze RL, Reynolds BA et al. Turning brain into blood: a hematopoietic fate adopted by neural stem cells in vivo. Science 1999; 283: Buick RN, Pollack MN. Perspectives on clonogenic tumour cells, stem cells and oncogenes. Cancer Res 1984; 44: Cairns J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature 1975; 255: Commo S, Gaillard O, Bernard BA. Human hair greying is linked to a specific depletion of hair follicle melanocytes affecting both the buld and the outer root sheath. Br J Dermatol 2004; 3: Filip S, Mokrý J, Hruška I. Adult stem cells and their importance in cell therapy. Folia Biologica 2003; 49: Filip S, Mokrý J, Karbanová, J, Vávrová J, English D. Local envirometal factors determine hematopoietic differentiation of neural stem cells. Stem Cells Dev 2004; 13: Filip S, English D, Mokrý J. Issues in stem cell plasticity. J Cell Mol Med 2004; 8: Fuchs S, Baffour R, Zhou YF et al. Transendocardial delivery of autologous bone marrow enhances collateral perfusion and regional function in pigs whit chronic experimental myocardial ischemia. J Am Coll Cardiol 2001; 37: Fuchs S, Weisz G, Kornowsi R et al. Catheter-based autologous bone marrow myocardial injection in no-opinion patients with advanced coronary artery disease: a feasibility and safety study. Circulation 2002; 106: Goodell MA. Stem cell plasticity: befuddled by the muddle. Curr Opin Hematol 2003; 10: Graf T. Differentiation plasticity of hematopoietic cells. Blood 2002; 99: Harraz RG, Jiao C, Hanlon HD et al. CD34( ) blood-derived human endothelial cell progenitors. Stem Cells 2001; 19: Hawley RG, Sobieski DA. Somatic stem cell plasticity: to be or not to be. Stem Cells 2002; 20: Krause DS, Theise ND, Collector MI et al. Multiorgan, multi-lineage engraftment by a single bone marrow derived stem cell. Cell 2001; 105: Krause DS. Plasticity of marrow derived stem cells. Gene Ther 2002; 9: Laflamme MA, Myerson D, Saffitz JE, Murry CE. Evidence for cardiomyocyte repopulation by extracardiac progenitors in transplanted human hearts. Circ Res 2002; 90: Lakshmipathy U, Verfaillie C. Stem cell plasticity. Blood Rev 2005; 19: Lemischka I. A few thoughts about the plasticity of stem cells. Exp Hematol 2002; 30: Mahmood A, Lu D, Wang L et al. Treatment of traumatic brain injury in female rats with intravenous administration of bone marrow stromal cells. Neurosurgery 2001; 49: Medvinsky A, Smith A. Fusion brings down barriers. Nature 2003; 422: Morrison JS, White MP, Zock Ch, Anderson DJ. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell 1999; 96: Orkin SH, Zon LI. Hematopoiesis and stem cells: plasticity versus developmental heterogenity. Nat Immunol 2002; 3: Orlic D, Kajstura J, Chimenti S et al. Mobilized bone marrow cells repair the infracted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci 2001; 98: Palmer TD, Schwartz PH, Taupin P et al. Progenitor cells from human brain after death. Nature 2001; 411: Pierce BG, Speers WC. Tumours as caricatures of the process of tissue renewal: prospects for therapy ÈES GER REV 2005; 3(4) 55

6 by directing differentiation. Cancer Res 1988; 48: Poulsom R, Alison MR, Forbes SJ, Wright, NA. Adult stem cell plasticity. J Pathol 2002; 197: Quaini F, Urbanek K, Beltrami AP et al. Chimerism of the transplanted heart. N Engl J Med 2002; 346: Quesenberry PJ, Abedi M, Aliotta J et al. Stem cell plasticity: an overview. Blood Cells Mol Dis 2004; 32: Quesenberry PJ, Dooner G, Colvin G, Abedi M. Stem cell biology and the plasticity polemic. Exp Hematology 2005; 33: Robb L, Elefanty AG. The hemangioblast an elusive cell captured in culture. Bioessays 1998; 20: Slack JMW Epithelial mataplasia and the second anatomy. Lancet 1986; 2: Strauer BE, Brehm M, Zeus T et al. Intracoronary, human autologous stem cell transplantation for myocardial regeneration following myocardial infarction. Dtsch Med Wochensche 2001; 126: Strauer BE, Brehm M, Zeus T et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circulation 2002; 106: Strauer BE, Kornowski R. Stem cell therapy in perspective. Circulation 2003; 107: Terada N, Hamazaki T, Oka M et al. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous fusion. Nature 2002; 416: Theise ND, Nimmakayalu M, Gardner R et al. Liver from bone marrow in humans. Hepatology 2000; 32: Verfaillie CM. Adult stem cells: assessing the case for pluripotency. Trends Cell Biol 2002; 12: Wagers AJ, Sherwood RI, Christensen JL, Weissman IL. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science 2002; 297: Wang X, Willenbring H, Akkari Y et al. Cell fusion is the principal source of bone-marrow-derived hepatocytes. Nature 2003; 422: Wurmser AE, Gage FH. Cell fusion causes confusion. Nature 2002; 416: do redakce doručeno dne přijato k publikaci DOC. MUDR. STANISLAV FILIP, PH.D. 1 DOC. MUDR. JAROSLAV MOKRÝ, CSC. 2 1 ONKOLOGICKÁ A RADIOTERAPEUTICKÁ KLINIKA LF UK A FN HRADEC KRÁLOVÉ 2 ÚSTAV EMBRYOLOGIE A HISTOLOGIE LF UK, HRADEC KRÁLOVÉ FILIP@FNHK.CZ DOC. MUDR. STANISLAV FILIP, PH.D. (1961) Promoval na LF UK v Hradci Králové (1986). Po promoci nejprve působil jako lékař v zařízeních ministerstva obrany ( ), poté jako odborný asistent a později vedoucí katedry vojenské radiobiologie Vojenské lékařské akademie JEP v Hradci Králové ( ); posléze přešel do FN Hradec Králové na Radioterapeutickou kliniku (1994) a v současnosti je vedoucím lékařem lůžkového oddělení Onkologické a radioterapeutické kliniky (1999 ). V roce 1988 obhájil disertaci na téma Diagnostika časných stadií periferní diabetické angiopatie pomocí měření rychlosti pulzové vlny ultrazvukem a v roce 2002 se habilitoval v oboru vnitřní nemoci. Složil atestaci 1. stupně z hygieny a epidemiologie (1989), atestaci 1. stupně z vnitřního lékařství (1992) a atestaci z hematologie a krevní transfuze (1995). Je autorem dvou monografii (Intenzivní cyklická chemoterapie karcinomu prsu s podporou progenitorovými buňkami krvetvorby, Galén/Karolinum 2000), řady publikací, článků v impaktovaných časopisech a přednášek s radioterapeutickou a onkologickou tematikou. Absolvoval několik stáží v západoevropských lékařských institucích zaměřených na hematoonkologickou problematiku. Je členem České lékařské společnosti JEP, České hematologické společnost, České společnosti pro radiobiologii, European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT), Multinational Association of Supportive Care in Cancer (MASCC) a European Stem Cell Club (ESCC). 56 ÈES GER REV 2005; 3(4)