UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Analytické hodnocení účinných látek kapalinovou chromatografií IV. Diplomová práce Hradec Králové 2013 Kristýna Ježíková

2 Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Tato práce nebyla použita k získání jiného či stejného titulu Kristýna Ježíková

3 Děkuji doc.rndr. Jaroslavu Sochorovi, CSc. za cenné rady a připomínky při vypracování diplomové práce.

4 ABSTRAKT Analytické hodnocení účinných látek kapalinovou chromatografií IV. Diplomová práce Kristýna Ježíková Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv, Heyrovského 1203, Hradec Králové V této diplomové práci byly optimalizovány podmínky vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzních fázích ke stanovení indometacinu v králičí krevní plasmě. HPLC analýze předcházela mikroextrakce tuhou fází indometacinu. Pro mikroextrakci bylo použiváno vlákno, které bylo potaženo polydimetylsiloxanem/divinylbenzenem (PDMS/DVB) s šířkou 60 μm. Vlákno bylo ponořeno do vzorku. Vzorek krevní plasmy byl upraven na hodnotu ph na 2,7. Doba sorpce byla stanovena na 30 minut a doba desorpce byla 10 minut. Jako desorpční medium byla mobilní fáze. Mobilní fáze byla tvořena methanolem s vodou v poměru 75:25, ph mobilní fáze bylo upraveno na ph 3. Průtok mobilní fáze byl 0,7 ml/mil. Pro detekci byla zvolena vlnová délka 220 nm. Pro kvantitatívní vyhodnocení byl vybrán vnitřní standard kyseliny flufenamové. Sestrojená kalibrační přímka byla ověřena analýzou modelových vzorků. Byl určen detekční a kvantitativní limit pro indometacin i pro kyselinu flufenamovou.

5 ABSTRACT Analytical determination of active compounds by liquid chromatography IV Diploma thesis Kristýna Ježíková Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové,Department of Pharmaceutical Chemistry and Drug Control,Heyrovského 1203, Hradec Králové In this thesis, conditions were optimized for the reversed-phased highperformance liquid chromatography for quantitative evaluation of indomethacin in a rabbit plasma. Before the determination of indomethacin a solid phase microextraction was made. The fiber was coated with polydimethylsiloxane/divinylbenzene (PDMS/DVB) with a thickness of 60 μm. The fiber was immersed in the sample. The plasma was adjusted to ph 2.7. Sorption time was set at 30 minutes and desorption time was 10 minutes. Indomethacin was desorpted in the mobile phase. The mobile phase consisted of methanol with water (75:25) and ph was adjusted to a value of 3. The flow rate was 0,7 ml / min and detection was carried out at a wavelength of 220 nm. For linearity a calibration curve was costructed. Calibration curve was controled and verified by analysis of model samples prepared. The detection limit and quantitative limit were calculated for indomethacin and flufenamic acid.

6 OBSAH 1. ÚVOD TEORETICKÁ ČÁST VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE - HIGH PERFORMACE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) ÚVOD HPLC SLOŽENÍ KAPALINOVÉHO CHROMATOGRAFU POJMY A VÝPOČTY PRO HPLC MIKROEXTRAKCE TUHOU FÁZÍ - SOLID PHASE MICROEXTRACTION (SPME) TEORIE SPME MODIFIKACE SPME PRINCIP SPME PODMÍNKY PRO SPME DALŠÍ MOŽNOSTI EXTRAKCE LÉČIV EXTRAKCE ORGANICKÝMI ROZPOUŠTĚDLY- LIQUID-LIQUID EXTRACTION (LLE) EXTRAKCE TUHOU FÁZÍ - SOLID PHASE EXTRACTION (SPE) DEPROTEINIZACE NESTEROIDNÍ ANTIFLOGISTIKA VLASTNOSTI NESTEROIDNÍCH ANTIFLOGISTIK FYZIKÁLNĚ CHEMICKÉ VLASTNOSTI PŘEHLED NESTEROIDNÍCH ANTIFLOGISTIK FENAKY...29

7 2. 5. INDOMETACIN DEFINICE A VLASTNOSTI FARMAKOLOGICKÉ ÚČINKY POUŽITÍ INDOMETACINU ANALÝZA INDOMETACINU V LITERATUŘE CÍL PRÁCE PRAKTICKÉ PROVEDENÍ POUŽITÝ CHROMATOGRAFICKÝ MATERIÁL, PŘÍSTROJE, POMŮCKY, CHEMIKÁLIE, LÉČIVA A BIOLOGICKÝ MATERIÁL ANALÝZA INDOMETACINU VYSOKOÚČINNOU KAPALINOVOU CHROMATOGRAFII IZOLACE INDOMETACINU Z KREVNÍ PLASMY MIKROEXTRAKCÍ TUHOU FÁZÍ VÝSLEDKY A DISKUZE VÝBĚR CHROMATOGRAFICKÝCH PODMÍNEK PRO HPLC OPTIMALIZACE PODMÍNEK PRO MIKROEXTRAKCI TUHOU FÁZÍ PRO EXTRAKCI INDOMETACINU VÝBĚR VNITŘNÍHO STANDARTU KALIBRAČNÍ KŘIVKA MODELOVÉ VZORKY URČENÍ DETEKČNÍHO A KVANTITATIVNÍHO LIMITU ZÁVĚR LITERATURA...65

8 1. ÚVOD Vysokoúčinná kapalinová chromatografie je separační metoda s možností kvalitativního a kvantitativního hodnocení separovaných složek směsi. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie je metoda, která se využívá se pro stanovení léčiv a endogenních látek v biologickém materiálu. Monitorování léčivých látek je zvláště důležité u léčiv, jejichž nežádoucí účinky by mohly vést k závažnému poškození organismu. Při monitorování léčivých látek, se využívá vysoké citlivosti a selektivity této metody, které jsou podmíněny výběrem vhodného typu detektoru. Před vlastní analýzou HPLC obvykle dochází k izolaci léčiva z biologického prostředí použitím jedné z extrakčních technik. Při extrakci jsou odstraněny endogenní balastní látky, které by mohly narušit průběh následné analýzy léčiva. V průběhu analýzy HPLC dochází k separaci léčiva od metabolitů a následnému určení množství léčiva v biologickém materiálu. 8

9 2. TEORETICKÁ ČÁST VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE - HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) ÚVOD HPLC Chromatografické metody jsou separační metody, které se využívají v analýze léčiv. Jsou to metody, které umožňují analýzu směsí, kvalitativní a kvantitativní hodnocení separovaných složek směsi. Při chromatografii dochází k dělení analyzovaných látek mezi dvěma fázemi, stacionární fáze je nepohyblivá (nazývána sorbent) a druhá je mobilní pohyblivá. Mezi fázemi dochází v průběhu chromatografického procesu k postupnému, mnohokrát opakovanému vytváření rovnovážných stavů dělených látek mezi stacionární fází, která je vázaná v koloně a mobilní fází, kterou jsou unášeny separované látky. K separaci dochází na základě různé afinity dělených látek ke stacionární a mobilní fázi. [1] Chromatografické metody lze rozčlenit podle charakteru mobilní fáze a podle podstaty separačního procesu. Podle charakteru separačního procesu jsou chromatografické metody rozřazeny: ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE- K separaci dochází na základě rozdílné adsorbovatelnosti dělených látek na aktivní povrch adsorbentu. ROZDĚLOVACÍ CHROMATOGRAFIE- druh kapalinové chromatografie, principem separace je rozdílná rozpustnost dělených látek ve dvou vzájemně nemísitelných kapalinách, přičemž kapalina použitá jako stacionární fáze je zakotvena na vhodném nosiči. IONTOVĚ VYMĚNNÁ CHROMATOGRAFIE (IEC)- druh kapalinové chromatografie, při čemž stacionární fází jsou iontoměniče - katexy nebo anexy. Principem separace je rozdílná afinita dělených látek, které se nachází v iontové formě, k iontovýměnným skupinám iontoměniče. Různá afinita separovaných látek je dána rozdílnými hodnotami 9

10 disociačních konstant ionogenních skupin, rozdílnou velikostí iontů a rozdílným mocenstvím iontů. GELOVÁ CHROMATOGRAFIE- při kapalinové chromatografie jsou analyzované látky separovány na základě velikosti molekul. Kolony jsou plněné gely s určenou velikostí pórů. [1][5] AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE využívá biospecifických interakcí mezi dvojicemi látek. Jedná se o vysoce specifický typ chromatografie, kdy jsou molekuly rozpoznávány činidlem vázaným na stacionární fázi. [33] VYUŽITÍ HPLC Kapalinová chromatografie se používá při identifikaci léčiv, stanovení obsahu a ověřování čistoty. Pomocí HPLC lze hodnotit stabilitu léčiv podle chromatogramu, na kterém je patrný hlavní pík analyzovaného léčiva a menší píky rozkladných produktů. Při monitorování léčiv a jejich metabolitů v tělních tekutinách je nutné před analýzou HPLC izolovat léčivo z tělních tekutin použitím vhodně zvolené extrakce. [1] SLOŽENÍ KAPALINOVÉHO CHROMATOGRAFU Zásobníky mobilní fáze obsahují mobilní fázi nebo rozpouštědla, ze kterých je mobilní fáze připravena. Mobilní fáze musí být odplyněna a přefiltrována pomocí degaseru, vakuové filtrace a sonikace za použití ultrazvukové lázně, kdy dochází k rozptýlení mikrobublinek plynu v solventu. Čerpadlo (pumpa) - jeho funkcí je udržování stálého průtoku a udržování konstantního tlaku mobilní fáze. Injektor (nástřikové zařízení) - Šesticestný dávkovací ventil se smyčkou definovaného nebo volitelného objemu. Nastřikovaný objem se řídí rozměry kolony. Nejčastěji se dávkuje volitelný objem pomocí autosampleru. Autosamplery jsou automatická dávkovače, které jsou spojené se zásobníkem vzorku s vialkami. Vialky (mikronádobky) jsou uzavřené pryžovým uzávěrem nebo perforovanou zátkou z polypropylenu. Existuje několik druhů konstrukčního spojení injekční stříkačky dávkovače.[2] 10

11 Kolony- V chromatografii jsou používány trubice nebo kapiláry naplněné sorbentem. Sorbent interaguje různými způsoby se složkami vzorku, které putují kolonou v mobilní fázi. Mezi hlavní typy interakcí patří vodíkové můstky, van der Waalsovy síly, interakce dipól-dipól, interakce π elektronů a iontové síly. Pro výběr sorbentu je určující, zda chromatografie probíhá na normální nebo reverzní fázi. Normální fáze je tvořena polárními skupinami oxidu hlinitého nebo silikagelem. Jako mobilní fáze jsou používány méně polární rozpouštědla např. heptan nebo chloroform. Pro chromatografii na reverzní fázi se jako sorbent používá chemicky modifikovaný silikagel, který vzniká kovalentní vazbou hydrofobních skupin na povrch silikagelu. Nepolární chemicky vázané fáze jsou tvořeny skupinami butylu (C 4), oktylu (C 8), oktadecylu (C 18) a fenylu. Silikagel má slabě kyselý povrch, který je chemicky stabilní v rozsahu ph 2-8. Jestliže je ph nižší dochází k odstranění navázaných skupin, při vyšším ph dojde k rozpuštění silikagelu, tím i ke snížení životnosti kolony. Vzhledem k omezené stabilitě těchto kolon jsou používány i sorbenty tvořené polymery, které jsou kompatibilní v celém rozsahu ph, ale stále mají nižší účinnost než silikagelové kolony. Jako mobilní fáze se používají směsi polárních rozpouštědel jako např. metanol-voda nebo acetonitril-voda. Chromatografie na reverzní fázi je dnes mnohem častěji aplikována než chromatografie na normální fázi. Rozšiřuje se i použití sorbentů na bázi oxidu zirkoničitého, které jsou odolné ph, vysokým teplotám i tlakům. [2] [3] V současné době jsou používány monolitické kolony. Monolitické kolony jsou tvořeny jediným kusem pórovitého materiálu, který zaplňuje vnitřek separační kolony. Výhodou monolitů jsou jejich hydrodynamické vlastnosti. Monolitické kolony mají dva typy pórů: velké póry (makropóly) a středně velké póry (mesopóry). Makropóly zajišťují rychlý konvektivní tok mobilní fáze skrz monolit. Mesopóry poskytují monolitu dostatečný povrch a tím vysokou separační kapacitu. Tato struktura umožňuje provozování monolitické kolony při značně vysokých rychlostech mobilních fází bez přílišného zvýšení tlaku a zároveň bez ztráty separační účinnosti, čehož se využívá pro separaci 11

12 makromolekul (bílkoviny, syntetické polymery). Podle chemické podstaty a způsobu přípravy se dělí na anorganické monolity, makroporézní polymerní monolity a stlačitelné monolity. Hlavní výhodou monolitických stacionárních fází oproti klasickým plněným kolonám je možnost jednotlivě a systematicky měnit a optimalizovat vnitřní strukturu monolitů podílející se významnou měrou na výsledné chromatografické separaci. [2] [4] Při výběru vhodné stacionární fáze jsou rozhodující určité faktory např. vysoká účinnost separace a symetrický tvar píku, dlouhodobá životnost, reprodukovatelnost, rychlost separace, citlivost kolony a selektivita. Kolona je chráněna pláštěm z ocele, plastu nebo skla. [3][5] Detektory - na použitém detektoru závisí citlivost chromatografické analýzy: SPEKTROFOMETRICKÝ DETEKTOR - měří absorbanci eluátu v oblasti vlnových délek od 190 do 800nm. Velikost odezvy je dána Lambert- Beerovým zákonem, který vyjadřuje vztah mezi tloušťkou absorbující vrstvy, koncentrací a absorbancí. K detekci léčiv se může použít UV detektor s fixní vlnovou délkou. Zdrojem záření může být výbojka rtuťová (254nm), kadmiová (229nm) a zinková (214nm).UV-VIS detektor s proměnlivou vlnovou délkou, který umožňuje výběr z několika vlnových délek. Detektory s diodovým polem (DAD) snímají celé spektrum v reálném čase bez přerušení chromatografické separace. Detektorem je pole fotodiod, které umožňují detekci analytu při jakékoliv zvolené vlnové délce a porovnání spektra s knihovnou spekter. [6] FLUORIMETRICKÝ DETEKTOR- výhodné použití v případech, kdy analytické léčivo vykazuje fluorescenci. Jestliže léčivé látky nevykazují fluorescenci lze je vhodnými deriváty převést na fluoreskující deriváty. ELEKTROCHEMICKÝ DETEKTOR- při hodnocení léčiv se využívá děje, při němž dochází k elektrochemické reakci probíhající na rozhraní elektroda- eluent. Nelze je použít při gradientové eluci. REFRAKTOMETRICKÝ DETEKTOR- analyzované léčivo je vyhodnoceno na základě rozdílného indexu lomu mezi čistou mobilní fází a eluátem vytékajícím z kolony [1] 12

13 Spojení HPLC s hmotnostní spektrometrií (MS)- Hmotnostní spektrometrie je fyzikálně chemická metoda určování hmotností atomů, molekul a jejich částí po převedení na kladné nebo záporné ionty. Při vhodné interpretaci výsledků měření má metoda velmi dobrou vypovídací schopnost o struktuře analyzovaných látek. Metody hmotnostní spektrometrie patří k nejdokonalejším a nejmodernějším analytickým metodám. Umožnují kvantitativní, kvalitativní analýzu a také analýzu izotopického složení jednotlivých prvků, ze kterých je vzorek složen. Hmotnostní spektrometrie je metoda všestranná a vysoce senzitivní a její využití má budoucnost především pro identifikaci proteinů a peptidů a stanovování proteinových profilů jak v biologii, tak i v medicíně. [7] 13

14 POJMY A VÝPOČTY PRO HPLC Retenční čas a retenční objem- Měření retence v eluční chromatografii se vyjadřuje retenčním časem (t R ) přímo definovaným polohou vrcholu píku na chromatogramu. Z retenčního času lze vypočítat retenční objem (V R ) pomocí vzorce: t R retenční čas v- průtoková rychlost Hmotnostní distribuční poměr (D m ) je definován vztahem: [8] Účinnost kolony a zdánlivý počet teoretických pater- Účinnost kolony se vyjadřuje jako počet pater N. Čím větší je počet pater, tím méně je rozmývána zóna separované látky při průchodu kolonou a pík na chromatogramu je užší. Pro jednu kolonu je počet pater pro různé látky různý. K výpočtu je používán následující vzorec: ( ) ( ) N- počet pater t R - retenční čas Wb- šířka píku u základní W h/2 - šířka píku v polovině výšky píku Koeficienty 16 a 5,54 vyplývají z aproximace chromatografického píku Gaussovou funkcí. 14

15 Výška patra (H)- výškový ekvivalent teoretického patra H slouží k porovnání účinnosti kolon různé délky. Vypočítá se jako poměr délky kolony L a počtu pater N. Separační faktor α - Nutnou podmínkou pro úspěšnou separaci dvou látek je odlišná distribuční konstanta mezi stacionární a mobilní fázi. Mírou této rozdílné interakce je separační faktor α, který je vyjádřen poměrem kapacitních faktorů nebo může být přepsán jako poměr retenčních časů (t R ) Rozlišení R S - Hodnota Rs vyjadřuje míru separace dvou látek, je tedy parametrem charakterizující míru oddělení dvou sousedních píků. Tuto hodnotu lze zjistit z chromatogramu t R1, t R2 retenční časy W b1, W b2 šířka píků u základny Lze odvodit i další vztah pro rozlišení R S v závislosti na počtu pater N, separačním faktorem α a retenčním faktorem k. V tomto vzorci jsou dosazeny tři na sobě nezávislé členy účinnost, selektivita a kapacita. Ty mohou být ovlivněny složením mobilní fáze, ph mobilní fáze, náplň kolony a změnou teploty kolony. Vztah platí pouze tehdy, pokud se nezmění experimentální podmínky. Pro dosažení optimálních podmínek musí být hodnota R S větší než 1,5. 15

16 Van Deemterova rovnice určuje vliv průtokové rychlosti mobilní fáze na účinnost kolony, používá se ke stanovení optimálního průtoku mobilní fáze. A turbulentní difúze B molekulární difúze C odpor proti přenosu hmoty ve stacionární i mobilní fázi Poměr signálu k šumu ovlivňuje přesnost stanovení obsahu. [8 ] [9] H výška píku h - rozpětí šumu Kvantitativní charakteristika chromatografického píku je jeho plocha nebo jeho výška. Ke kvantitativnímu určení analyzovaného léčiva se používají poměry ploch nebo výšek píků analytu a standardu. Při měření se může použít metoda vnitřního nebo vnějšího standardu. Vnější standard je nastříknut na kolonu samostatně. Vnitřní standard je přidán k analyzované látce, a proto vnitřní standard musí být látka chemicky inertní, která je nastřikována v podobné koncentratraci jako analyt a eluována v blízkosti píků analyzovaných látek. [32] 16

17 2. 2. MIKROEXTRAKCE TUHOU FÁZÍ - SOLID PHASE MICROEXTRACTION (SPME) TEORIE SPME Mikroextrakce tuhou fází vyvinul Janusz Pawliszyn na Univerzitě Waterloo Ontario v Kanadě roku Mikroextrakce je metoda přípravy vzorků založená na izolování a zakoncentrování organických látek z plynného, kapalného nebo pevného prostředí. Mikroextrakce byla vyvinuta jako metoda přípravy vzorku bez použití organických rozpouštědel. Vzorek může být izolován z velkého objemu (vzduch v místnosti nebo voda). SPME využívá malého množství extrakční fáze. Extrakční fáze může být tvořena pevným polymerním materiálem, obvykle porézní pro zvětšení sorpční vrstvy (SPME) nebo alternativně vysokomolekulární polymerní kapalinou v případě liquid-phase microextraction (LPME). [10,11] Tuhá fáze SPME je složena z 1cm dlouhého křemenného vlákna, které je pokryté polymerní vrstvou. Vlákno je umístěno v duté ocelové jehle, která vlákno chrání před mechanickým poškozením. Posunutím pístu se vlákno vysunuje do vzorku nebo nad hladinu vzorku. Analyt se sorbuje do vrstvy pokrývající vlákno. Po dosažení sorpční rovnováhy je vlákno zasunuto dovnitř jehly. Při použití plynové chromatografie (GC; Gas Chromatography) je jehla zavedena do injektoru plynového chromatogramu, kde je analyt tepelně desorbován a nesen na GC kolonu. V případě použití HPLC je vzorek z vlákna desorbován do rozpouštědla a následně nastřikován na kolonu. [12] Spojení SPME a plynové chromatografie se používá k analýze organických látek s nízkou polaritou. SPME ve spojení s kapalinovou chromatografií LC/MS k analýze termálně nestabilních a velmi polárních látek, kde se nedá použít spojení GC-MS. SPME spojená s GC se používá pro analýzu v různých oborech zahrnující životní prostředí, analýzu léčiv a potravin, toxikologii a forénzní vědy. [13] 17

18 MODIFIKACE SPME SPME je dostupná v těchto modifikacích -přímá extrakce, headspace extrakce a mikroextrakce s membránou. V přímé extrakci je vlákno ponořené v matrix (se vzorkem). Extrakce probíhá přímo z vzorku matrix na extrakční fázi. K urychlení exrakce, je třeba určité míchání, které usnadňuje kontakt analytu s vláknem obzvláště ve velkých objemech. Pomocí HS-SPME jsou analyty extrahovány z plynné fáze uzavřené nad povrchem pevného či kapalného vzorku. Původním důvodem pro tuto modifikaci byla potřeba chránit vlákno od nepříznivých vlivů zapříčiněnými netěkavými, vysokomolekulárními částicemi obsaženými ve vzorku jako jsou například bílkoviny. Headspace modifikace umožňuje úpravu vzorku, včetně ph, bez rizika poškození vlákna. Často používané pro těkavé látky. SPME extrakce s ochranou membránou využívá oddělení vlákna od vzorku. Hlavním důvodem použití membránové bariéry je ochrana polymeru vlákna před příměsí vysokomolekulárních komponent, v případě analýzy znečištěných vzorků. Extrakční proces je pomalejší než přímá extrakce, protože analyty difundují přes membránu před tím, než dosáhnou k polymerní vrstvě vlákna. [10] Pro účely stanovení analytu pomocí HPLC bylo vyvinuto zařízení in-tube SPME. Jedná se o otevřenou trubicovou kapiláru, která je uvnitř potažena vrstvou polymeru. Při této technice dochází k automatizaci, kdy jsou kapalné vzorky extrahovány do sorbentu uvnitř kapilár, desorbovány mobilní fází nebo rozpouštědlem a následně nastřikovány na kolonu. [11] 18

19 PRINCIP SPME Rovnovážný stav SPME metody závisí na koncentraci analytu ve vzorku a na typu a tloušťce polymeru, který pokrývá křemenné vlákno. Množství sorbovaného analytu závisí na distribuční konstantě a na tloušťce vrstvy polymeru. Selektivita extrakčního procesu je ovlivněna typem polymeru pokrývajícím vlákno. Těkavé látky vyžadují silnější vrstvu polymeru a slabší vrstva pro sorpci středně těkavých analytů. U kapalných vzorků je množství analytu sorbovaného na vlákně při dosažení rovnováhy přímo úměrné množství analytu ve vzorku: n= množství analytu sorbovaného na vláknu C 0 = počáteční koncentrace analytu ve vzorku K fs = rozdělovací koeficient pro analyt (polymer- vzorek) V f = objem pokrytí V s = objem vzorku Z tohoto vzorce vyplývá lineární vztah mezi počáteční koncentrací analytu ve vzorku a množství analytu, který se sorbuje vláknem. Materiály používané k pokrytí křemenného vlákna se volí s ohledem na co nejvyšší hodnoty K fs, což umožňuje vysokou sorpční schopnost vlákna se selektivním efektem. Hodnota K není většinou dostatečně vysoká na to, aby se analyt zcela extrahoval z matrice, a proto je SPME metodou rovnovážnou. Pokud je objem vzorku V s dostatečně velký, množství analytu extrahovaného na vlákně nezávisí na objemu vzorku. [12] 19

20 PODMÍNKY PRO SPME Podmínky by měly být zvolené s ohledem na analyzovanou látku a matrix, ze které jsou získávány vzorky (plazma, sérum, moč a plná krev). Prvním krokem je výběr vlákna. Chemické a fyzikální vlastnosti vlákna jsou klíčové pro dělící proces. [14] VÝBĚR VLÁKNA Pro zachycení analytů na vlákno je důležitá tloušťka, porozita a také polarita vlákna. Extrakce analytu polymerní vrstvou mohou probíhat dvěma procesy sorpce, buď jsou molekuly sorbovány polymerní vrstvou, nebo jsou sorbovány na povrch polymerní vrstvy. Proces sorpce závisí na charakteru SPME polymerní vrstvy. Průmyslově jsou vyráběny dva typy vláken. První skupinu představují homogenní polymery potažené polydimethylsiloxanem (PDMS) a polyakrylátem (PA). Na obou typech tohoto vlákna jsou molekuly sorbovány polymerní vrstvou. Druhá skupina povrchů zahrnuje typy vláken potažené heterogenními polymery. Vrstva jednoho polymeru obsahuje suspendované porézní částice jiného polymeru v zesíťované polymerní fázi. Na tomto typu vláken jsou analyty zachyceny na povrchu pórů, výtěžnost závisí na velikosti povrchu. Polydimethylsiloxan/ divinylbenzen (PDMS/DVB) - tento typ vlákna obsahuje velké a střední póry. Přítomnost DVB částic v PDMS zvyšuje sorpci malých analytů a také zlepšení afinity pro polární analyty. Carbowax/divinylbenzen kopolymer (CW/DVB)- tento typ vlákna je polárnější než typ PDMS/DVB. Nevýhodou tohoto vlákna je schopnost carbowaxu bobtnat ve vodě. 20

21 Carboxen/Polydimethylsiloxan (CAR/ PDMS) vrstva carboxenu v PDMS výrazně zvyšuje sorpční a desorpční aktivitu. Na rozdíl od ostatních vláken mají póry jednotný vzhled. Carbowax/pryskyřice (CW/TPR) na těchto vláknech probíhá extrakce na povrchu pórů, tyto vlákna jsou vhodné jen pro HPLC analýzu. Vlákna typu PDMS, PA, PDMS/DVB a CW/TPR se používají pro LC analýzu. Nepolární částice mají relativně vysokou afinitu pro nepolární PDMS vlákno. Pro polární částice se používají vlákna potažená polyakrylátem (PA). [10,15] DALŠÍ ÚPRAVY Dalším krokem optimalizování vzorků je úprava ph pro lepší účinnost extrakce. Pro plazmu, sérum a moč je méně náročná než z plné krve. Úprava ph zvyšuje extrakční účinnost částic, kyselé částice jsou účinněji extrahovány v kyselém prostředí, bazické v bazickém. Efekt vysolování- Přidání 25 30% chloridu sodného do vzorku před extrakcí, zvyšuje iontovou sílu roztoku a tím dochází ke snížení rozpustnosti analytů. Tímto krokem dochází ke zvýšení účinnosti extrakce především pro látky polární a těkavé. Míchání- Míchání vzorku optimalizuje a urychluje sorpci, především u molekul s vyšší molekulovou hmotností a vysokým difúzním koeficientem. [12] 21

22 2. 3. DALŠÍ MOŽNOSTI EXTRAKCE LÉČIV EXTRAKCE ORGANICKÝMI ROZPOUŠTĚDLY- LIQUID-LIQUID EXTRACTION (LLE) Princip extrakce spočívá v rozdělení distribuce analytů mezi dvěma navzájem nemísitelnými kapalinami v poměru, který je určen Nernstovým zákonem. Nernstův zákon K d - Distribuční konstanta c 0- Koncentrace analytu v organické fázi c aq - Koncentrace analytu ve vodné fázi Distribuční konstanta představuje rovnováhu mezi koncentracemi analytu v obou fázích. Čím bude větší rozdělovací poměr, tím lépe bude látka přecházet z vodné fáze do organické. Vybraná rozpouštědla se však nesmí navzájem mísit, musí mít odlišné specifické hmotnosti, přiměřenou viskozitu a netvořit emulzi. Volba organického rozpouštědla ovlivňuje selektivitu a účinnost reakce. Rozpouštědla jsou volena podle charakteru extrahované látky. Hydrofóbní látky se lépe rozpouští v nepolárních rozpouštědlech, hydrofilní látky v polárních rozpouštědlech. Na základě velikosti dielektrické konstanty jsou řazeny do mixotropní řady rozpouštědel. Hydrofóbní látky jsou snáze rozpouštěny v rozpouštědlech s nižší dielektrickou konstantou a látky hydrofilní s vyšší dielektrickou konstantou. [3] Vyšší selektivity extrakce se může docílit úpravou ph vodného prostředí, při které dochází k potlačení ionizace analyzované látky, která pak snáze přechází do organického rozpouštědla. Při nízkém ph (pod 5) kyselé látky méně disociují a při vyšším ph (nad 7) to platí pro látky bazické. [16] 22

23 LLE je technika, která je prováděna úpravou ph biologického vzorku a jeho následnou extrakcí do organického rozpouštědla nemísitelného s vodnou fází. Po centrifugaci a oddělení fází je organické rozpouštědlo se vzorkem zahuštěno do sucha. Nakonec je tento odparek analytu rozpuštěn v malém množství rozpouštědla, tím dojde k jeho zakoncentrování. Nevýhodou této metody je vysoká spotřeba organických rozpouštědel. [3] EXTRAKCE TUHOU FÁZÍ - SOLID PHASE EXTRACTION (SPE) Metoda extrakce tuhou fází byla představena během 70.let 20.století pro úpravu kapalných vzorků. [17] SPE je nejčastěji používána k přípravě kapalných vzorků, především pro extrakci středně těkavých a netěkavých látek. Používá se pro jejich zakoncentrování a odstranění nežádoucích látek, které ruší následná analytická stanovení. SPE využívá vyšší afinity látek v kapalině (mobilní fáze) pro stacionární fázi (sorbent). Při SPE jsou látky zachytávány na pevné fázi, která je umístěna ve formě sloupce nebo membrány v krátké kolonce. Sorbent je uložen v trubičkách z polypropylenu nebo ze skla. Sorbenty jsou vyráběny ve formách disků, kartridží a injekčních stříkaček. Před výběrem vhodného sorbentu je třeba znát vlastnosti matrice a analytu, a na základě těchto vlastnosti zvolit typ fáze a velikost kolonky. Sorbent má větší zrnění než mají kolony určené kapalinovou chromatografii, takže lze pracovat při nízkém podtlaku či přetlaku. [18] Mechanismus retence v SPE je srovnatelný jako v kapalinové chromatografii, proto i používané sorbenty jsou vlastně velice podobné. Užívají se reverzní fáze, normální fáze a iontově výměnné fáze, ale i celá řada dalších sorbentů. Pro reverzní fázi se používá silikagel, na kterém jsou navázány funkční skupiny C 18, C 8, C 2, cyklohexylu a fenylu, také sorbenty tvořené polymery karbonu a styren-divinylbenzenu. C 18 reverzní fáze patří k nejsilnějším hydrofobním fázím, využívá se pro izolaci nepolárních léčiv z krevní plazmy, séra, moči a dalších tělních tekutin. C 8 reverzní fáze má vzhledem ke kratšímu 23

24 uhlovodíkovému řetězci snadnější interakce mezi analytem a silikagelem. Pro normální fáze je na silikagel navázán cyanopropylová, aminopropylová a diolová funkční skupina. V případě iontově výměnné fáze jsou na silikagelu navázány slabé nebo silné kationtové nebo aniontové funkční skupiny. SPE je technika, která je provedena v následně uvedených krocích. V prvním je kolonka aktivována, nejčastěji metanolem a vodou. V druhém je vzorek nanesen na kolonku, přičemž dochází k zachycení analytu na sorbent kolonky. V průběhu tohoto procesu dochází k interakci mezi sorbentem a vzorkem. Jedná se o interakce typu van der Waalsových sil, vodíkových vazeb, interakce dipól-dipól a iontových sil. Poté je sorbent promýván, přičemž je odstraněna matrice vzorku. V posledním kroku je analyt eluován ze sorbentu vybraným rozpouštědlem, které poruší interakce mezi sorbentem a analyzovanou látkou. Rozpouštědlo s analytem je zahuštěno do sucha a analyt může být rozpuštěn v malém objemu mobilní fáze. Výhodou není jen v zakoncentrování vzorku ve vhodném rozpouštědle, ale i v dobré výtěžnosti extrakce a nižší spotřebě rozpouštědel. [17] DEPROTEINIZACE Tato jednoduchá a rychlá technika se používá k přípravě vzorků, ve které dochází k precipitaci proteinů z biologického materiálu, které by mohly poškodit chromatografickou kolonu. Při výběru vhodného typu techniky deproteinizace se zohledňuje chemická struktura, její stabilita, vazba na proteiny, filtrační membrány a výtěžnost po deproteinizaci. Používají se organické rozpouštědla (methanol, ethanol, aceton) mísitelné s vodou, také lze využít i kyseliny- trifluoroctová, trichloroctová a chloristou - anebo soli těžkých kovů (síran zinečnatý, síran měďnatý). K deproteinizaci se využívá i technika separace ultrafiltrací přes semipermeabilní membránu. Toto provedení je vhodné u látek, které nejsou 24

25 vázány na proteiny. Při použití tohoto způsobu deproteinizace nedochází ke změně koncentrace ředěním, což je výhodné. K nevýhodám patří přítomnost ostatních nebílkovinných endogenních látek ve vzorku po deproteinizaci. V některých případech se mohou tvořit mikropartikule, které se nedají odstranit centrifugací. [3] Při deproteinizaci dochází k odstranění bílkovin ze vzorku výše popsanými metodami. Určený objem supernantantu je před vlastní analýzou většinou zředěný vhodnými rozpouštědly. 25

26 2. 4. NESTEROIDNÍ ANTIFLOGISTIKA VLASTNOSTI NESTEROIDNÍCH ANTIFLOGISTIK Nesteroidní antiflogistika jsou obvykle syntetické sloučeniny, které mají kyselou povahu. Jejich mechanismus účinku je zprostředkován inhibici syntézy prostaglandinů. Při procesu vzniku zánětu dochází k metabolické přeměně arachidonové kyseliny dvěma cestami, jež jsou charakterizovány enzymy, které je katalyzují. Enzym cyklooxygenasa (prostaglandin-syntetasa) katalyzuje přeměnu arachidonové kyseliny na endoperoxidy, které se dále přeměňují na silné mediátory bolesti a zánětu- prostacyklin, prostaglandin a thromboxan. Druhou metabolickou cestu zprostředkovává enzym lipoxygenasa, která katalyzuje vznik leukotrienů z arachidonové kyseliny, které zvyšují cévní permeabilitu a jsou také označovány za mediátory zánětu. Mezi další mediátory zánětu se uvádějí bradikinin a lysozomální enzymy. V inhibici vzniku zánětu se uplatňují nesteroidní antiflogistika, která jsou rozděleny podle mechanismu účinku: Inhibitory cyklooxygenasy Inhibitory lipooxygenasy Inhibitory obou typů enzymů Inhibitory uvolňování bradikininů Inhibitory uvolňování lysozomálních enzymů Inhibitory vzniku volných kyslíkových radikálů V roce 1977 byly nalezeny společné prostorové rysy antiflogistik, který umožnil vypracování hypotetického modelu receptoru, který konformačně odpovídá arachidonové kyselině a objasňuje stereospecifickou konverzi na cyklické peroxidy. Receptor (vazebné místo enzymu) se skládá s kationtaktivního místa pro vazbu karboxylové skupiny arachidonové kyseliny a s hydrofobní roviny s dutinou pro navázání vodíku v poloze 13 arachidonové kyseliny. [19] 26

27 Mechanismus účinku nesteroidních antiflogistik spočívá v blokádě syntézy prostaglandinů inhibicí cyklooxygenasy. V organismu existuje více izoforem cyklooxygenasy- COX 1,2,3 COX 1- konstituční izoforma enzymu nacházející se ve většině buněk organismu,katalyzuje syntézu prostaglandinů a prostacyklinů, které ochraňují sliznici trávicího traktu COX 2- indukovatelná izoforma enzymu, je syntetizována prozánětlivými faktory např. IL-1, TNF- α, činností COX-2 dochází k syntéze prostaglandinů a prostacyklinů, které zvyšují citlivost nociceptorů na periférii vůči dalším mediátorům zánětu. Prostřednictvím inhibice COX-2 je zprostředkován protizánětlivý a analgetický účinek nesteroidních antiflogistik. COX 3- izoenzym, který byl identifikován v nervové soustavě a srdci. Protizánětlivý a analgetický účinek je zprostředkován inhibicí zejména COX- 2, tudíž snížením citlivosti periferních nociceptorů vůči působení bradykininu, histaminu a serotoninu. V důsledku inhibice COX-1, dochází k poškození sliznice trávicího traktu, zvýšení krvácivosti, zhoršení renálních funkcí, bronchokonstrikce a tromboembolických příhod. Dělení nesteroidních antiflogistik podle selektivity Neselektivní - kyselina acetylsalicylová v dávkách větších než 300 mg COX 1 selektivní kyselina acetylsalicylová v nízkých dávkách COX 2 preferenční - nimesulid COX 2 selektivní celekoxib, rofekoxib [20] 27

28 FYZIKÁLNĚ CHEMICKÉ VLASTNOSTI Na protizánětlivý účinek a pro metabolismus nesteroidních antiflogistik mají zásadní vliv jejich acidobazické vlastnosti a lipofilita. Acidobazické vlastnosti - vzhledem ke svému kyselému charakteru se v žaludku nacházejí v neionizované formě, což umožňuje jejich absorpci. V plasmě a ve tkáni mají vysokou vazebnou afinitu na bílkoviny, poněvadž jsou v tomto prostředí tato léčiva ionizována. Lipofilita- vyjádřená hodnotou log P, což je dělící koeficient pro neionizovanou kyselinu mezi oktanolem a vodou. Hodnota log P se v této skupině léčiv pohybuje v rozmezí 0,7 2,0, které je optimální pro průnik přes membrány. Současně ovlivňuje farmakokinetiku jednotlivých NSAID, především absorpci, vazbu na bílkoviny a jejich eliminaci PŘEHLED NESTEROIDNÍCH ANTIFLOGISTIK SALICYLÁTY kyselina salicylová, kyselina acetylsalicylová PYRAZOLIDINDIONY fenylbutazon, kebuzon, tribuzon FENAMÁTY flufenamová a niflumová kyselina DERIVÁTY ARYLALKANOVÝCH KYSELIN FENAKY- diklofenak, alklofenak, indometacin, tropesin. sulindak PROFENY- ibuprofen, naproxen, ketoprofen, tiaprofenová kyselina OXIKAMY- piroxikam, tenoxicam JINÉ STRUKTURY- nimesulid [19] 28

29 FENAKY Fenaky spolu s profeny patří do skupiny derivátů kyseliny arylalkanové. Profeny jsou látky odvozené od kyseliny arylpropionové a fenaky jsou odvozené od kyseliny aryloctové. Protizánětlivé účinky derivátů arylalkanových kyselin byly popsány počátkem 60. let. Prvním derivátem byl na počátku 60. let ibufenak, který se pro svou hepatotoxicitu neuplatnil v praxi. Z jeho blízkých analogů se v praxi uplatnily aklofenak a především diklofenak. Diklofenak lze odvodit od fenamátů vsunutím methylenové skupiny mezi aromatické jádro a karboxylovou skupinu. Roku 1963 byl syntetizován indolový analog fenaků indometacin, jehož struktura se od původních derivátů kyseliny octové vzdálila. Pro dnes používané deriváty kyseliny octové je charakteristické, že aryl nebo heteroaryl vázaný na α uhlík je substituován nejčastěji fenylem, který je připojen přímo nebo přes spojovací můstek různého charakteru. Roku 1971 byl popsán mechanismus účinku indometacinu a kyseliny acetylsalicylové. Mechanismus účinku indometacinu spočívá kompetitivní inhibice aktivního místa enzymu, což vedlo k různým obměnám struktur fenaků a profenů. [19] 29

30 2. 5. INDOMETACIN DEFINICE A VLASTNOSTI Indometacin je systematicky kyselina [1-(4-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2- methylindol-3-yl]octová. Byl syntetizován jako antagonista serotoninu, který patří mezi mediátory zánětu. Je to bílý nebo žlutý krystalický prášek prakticky nerozpustný ve vodě, mírně rozpustný v ethanolu 96%. [8,19] Strukturní vzorec indometacinu: FARMAKOLOGICKÉ ÚČINKY Indometacin je považován za velmi silný neselektivní inhibitor cyklooxygenasy in vitro a také patří mezi nesteroidní antiflogistika, které inhibují tvorbu leukotrienů (dále např. indometacin, nabumeton, diklofenak,nimesulid, ketoprofen) Má velmi dobré antiflogistické, analgetické, antipyretické a urikosurické účinky. [20] 30

31 Indometacin má vysokou frekvenci výskytu nežádoucích účinků, především trávicími obtížemi, bolestmi hlavy a psychickými poruchami. Nežádoucí účinky se podařilo omezit přípravou reverzibilních derivátů, které se v organismu uvolňují jako matečné léčivo. S tímto cílem byl vyvinut tropesin, ester indometacinu s kyselinou tropovou a také acemetacin, ester s kyselinou glykolovou. [19] POUŽITÍ INDOMETACINU Používá se v indikaci zánětlivě iritované degenerativní choroby kloubů a páteře, mimokloubní revmatismus a dnový záchvat a idiopatická dysmenorea. Indometacin má výrazné nežádoucí účinky jako například obtíže poškození sliznice trávicího ústrojí, bolesti hlavy a závratě, porucha jaterních funkcí, astmatické stavy, edémy renálního původu, poruchy vidění poškozením retiny. U dětí byla popsána úmrtí v důsledku aktivace infekce, proto se v dětství indometacin nemá užívat. [21] Indometacin se používá u nedošených novorozenců k léčbě perzistující ductus arteriosus otevřená tepenná dučej), což je nejčastější kardiovaskulární problém u nedonošených novorozenců, který může vést k levopravému zkratu a plicnímu edému. K farmakologické terapii se používají inhibitory prostaglandinů např. indometacin, k uzávěru ductu by mělo dojít během 7-10 dní novorozence. [22] Indometacin společně s diklofenakem se úspěšně používají při léčbě renální koliky, kdy se využívá jednak analgetického a antiedémového účinku. Indometacin se užívá maximálně po dobu 10 dnů. U pacientů s poklesem glomerulární filtrace, což je porucha ledvin, může vést k zhoršení stavu, v tomto případě je terapie léčiv ze skupiny NSAID kontraindikována. [23] 31

32 2. 6. ANALÝZA INDOMETACINU V LITERATUŘE SPME A INDOMETACIN Nesteroidní antiflogistika (NSAID; Non- steroidal anti- inflammatory drugs) jsou léčiva, která jsou používána ve vzrůstající tendenci. NSAID jsou v životním prostředí poměrně často detekovaná léčiva, vzhledem k tomu, že patří k léčivům slabě kyselého charakteru (pka 3-5), hydrofilitě a stabilitě ve vodném prostředí, jsou těžko eliminovány z rostlin. [24] Byla provedena studie k určení sedmi nesteroidních antiflogistik mezi nimi byl naproxen, ketoprofen, diklofenak, piroxicam, indometacin, sulindak a diflunisal a antiepileptika karbamazepin v řekách a odpadních vodách. Pro extrakci byla použita metoda mikroextrakce tuhou fází (SPME) a k analýze kapalinová chromatografie s diode array detektorem (DAD). V tomto experimentu bylo použito vlákno potažené PDMS/DVB. Extrakce z kapalného prostředí okyseleného na ph 3 kyselinou chloristou probíhala po dobu 44 minut. Poté bylo vlákno umístěno do desorpční komůrky s acetonitrilem s hydrogenfosforečnanem draselným v poměru 50:50 po dobu 5 minut. Po desorpci následoval přenos analytu na analytickou kolonu s použitím mobilní fáze s acetonitrilem s hydrogenfosforečnanem draselným (40:60) s průtokem 1ml/min. NSAID a karbamazepin byly analyzovány s použitím detektoru DAD při vlnových délkách mezi 200 a 350 nm. Výtěžnost 72% % pro všechny léčiva ve vzorcích vybraných řek. Výtěžnost % pro farmaceutika v odpadních vodách. [25] Dále byla vyvinuta jednoduchá a citlivá metoda pro určení 15 léčiv ze skupiny nesteroidních antiflogistik acetaminofen, ibuprofen, naproxen, fenoprofen, flurbiprofen, loxoprofen, ketoprofen, mefenamová kyselina, flufenamová kyselina, diklofenak, tolfenamová kyselina, oxaprozin,fenylbutazon, indometacin a acemetacin v odpadních vodách a řekách. Tato metoda zahrnuje in- tube solid phase mikroextrakci spojenou s kapalinovou chromatografii a MS. In-tube mikroextrakce zkracuje dobu analýzy, zlepšuje přesnost a senzitivitu techniky. V této studii je rozvíjena automatizace metody in-tube SPME/LC-MS- MS, při které je analyzováno 15 NSAID v přírodních vodách. Vzorky byly 32

33 získávány z okolí řek v Okayama City, zahrnující odpadní vody z nemocnic, vzorky z rostlin a vody z laboratoře. Použitím in-tube SPME/ LC-MS-MS metody byla získána dobrá linearity kalibrační křivky (r 0,9997) v koncentračním rozmezí 0,1-10 ng/ml pro všechny zkoušené složky. Detekční limity NSAID v rozmezí 5-65 pg/ml. Tato metoda může být použita pro povrchové a odpadní vody. Výtěžnosti NSAID v řekách byla nad 80 %. Mezi NSAID testovaných v této studii byl loxoprofen detekován v nemocničních odpadních vodách v koncentraci 458 pg/ml. [26] Metoda SPME v otevřené trubicové kapiláře (in-tube SPME) byla použita pro přípravu vzorku léčiv zahrnující indometacin, loratadin, ibuprofen a doxazosin. Byl zjišťován vliv podmínek jako například ph a teploty na účinnost mikroextrakce. Kapilára byla potažena (35 %-fenyl)-methylpolysiloxanem. Tato metoda je vhodná pro zjištění koncentrace loratadinu v králičí krvi. [27] Metoda SPME ve spojení s GC-MS byla použita zjištění kyselých částic z farmaceutických přípravků nebo jejich metabolitů ve vodách životního prostředí. Mezi zjišťovaná léčiva patří klofibrát, ibuprofen, gemfibrozil, fenoprofen, diklofenak, bezafibrat a indometacin. Proces zahrnuje derivatizaci na methylester použitím diazomethanu a trimetylsulfonium hydroxid (TMSH). Léčiva reagují přímo s diazomethanem na SPME vlákně, reakce s TMSH probíhá současně s termální desorpcí v GC injektoru. Obě metody byly vytvořeny ručně nebo plně automatizovány. Korelační koeficient (r) kalibrační křivky testovaných léčiv byl 0,995. Metoda byla použita pro detekci odpadních vod. [28] SPME a NSAID Sedm léčiv ze skupiny nesteroidních antiflogistik(ibuprofen, naproxen, ketoprofen, diklofenak, flufenamová kyselina, tolfenamová kyselina a meklofenamová kyselina) bylo extrahováno metodou SPME z kravského mléka a následně analyzováno plynovou chromatografii a hmotnostní spektrofotometrii. K mikroextrakci tuhou fází byly vyzkoušeny tři typy vlákenpolyakrylát (PA), polydimethylsiloxan/divinylbenzen (PDMS/DVB) a polydimethylsiloxan (PDSM). Nejoptimálnější výsledky byly získány při použití PDMS vlákna. [29] 33

34 Léčivo ze skupiny nesteroidních antiflogistik- naproxen bylo extrahováno z lidské moči použitím metody SPME a následnou analýzou kapalinovou chromatografii s detekcí UV. Kojugovaný naproxen s kyselinou glukuronovou byl podroben enzymatické a chemické hydrolýze, poté byl extrahován pomocí vlákna carbowax/ pryskyřice. [30] INDOMETACIN a LLE Kapalinová chromatografie ve spojení s MS byla zkoušena pro kvantitativní stanovení koncentrace indometacinu v plazmě a moči těhotných žen, které byly indometacinem léčeny. Vnitřním standardem byl zvolen derivát indometacinu. Mateřská plazma a moč byly okyseleny 1,0 M HCl. Poté byl indometacin extrahován do chloroformu s extrakční účinností %. Chromatografická separace probíhala na koloně C18 s použitím mobilní fáze kyseliny mravenčí a acetonitrilu (47:53). Tato metoda je založená na extrakci do organického rozpouštědla. Vzhledem k adekvátní citlivosti, selektivitě a přesnosti je tato metoda vyhovující pro stanovení farmakokinetických parametrů indometacinu během těhotenství. [31] 34

35 3. CÍL PRÁCE Cílem této diplomové práce bylo určení optimálních podmínek pro analýzu indometacinu vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii. Určení vhodných podmínek pro extrakci indometacinu z krevní plasmy. Extrakce byla prováděna metodou mikroextrakce tuhou fází (SPME) z králičí krevní plasmy. Dalším cílem bylo určení vhodného vnitřního standardu a sestrojení kalibrační křivky pro kvantitativní hodnocení indometacinu v krevní plasmě. Dalším cílem bylo určení detekčního a kvantitativního limitu pro indometacin. 35

36 4. PRAKTICKÉ PROVEDENÍ POUŽITÝ CHROMATOGRAFICKÝ MATERIÁL, PŘÍSTROJE, POMŮCKY, CHEMIKÁLIE, LÉČIVA A BIOLOGICKÝ MATERIÁL Chromatografický materiál: Analytická kolona Separon SGX 18, 150x4 mm I. D., 7 µm, Tessek Ltd., Praha, Česká republika Přístroje: HPLC: Čerpadlo P1000, Thermo Separation Products, USA Autosampler AS1000, Thermo Separation Products, USA Detektor UV3000HR, Thermo Separation Products, USA Počítačový program ChromQuest , Thermo Electron 2003, USA Spektrofotometr UV-2401 PC, Shimadzu, Columbia, USA Ultrazvuková lázeň K10, Krainek, Nové Zámky, Slovenská republika ph metr- acidimetr 333 Druopta, Praha, Česká republika Magnetická míchačka MM2A, Laboratorní přístroje, Praha, Česká republika Pomůcky: Držák vlákna pro SPME, Supelco, Bellefonte, USA Vlákno pro SPME, sorbent na vlákně 60 µm- polydimethylsiloxan/divinylbenzen (PDMS/DVB), Supelco, Bellefonte, USA 36

37 Biologický materiál: Králičí krevní plasma, Eldoret s.r.o., Praha, Česká republika Chemikálie a léčiva: Indometacin, Zentiva, Praha, Česká republika Diklofenak, Sigma, St.Louis, USA Ketoprofen, Sigma, St.Louis, USA Ibuprofen, Sigma, St.Louis, USA Fenylbutazon, Léčiva, Praha,Česká republika Tolmetin, Sigma, St.Louis, USA Naproxen, Sigma, St.Louis, USA Kyselina flufenamová, Sigma, St.Louis, USA Kyselina niflumová, Sigma, St.Louis, USA Kyselina tiaprofenová, Léčiva, Praha,Česká republika Methanol gradient grade, Merck, Darmstadt, NSR Kyselina fosforečná 85% p.a., Penta, Chrudim, Česká republika - zředěná vodou na 8,5% 37

38 4. 2. ANALÝZA INDOMETACINU VYSOKOÚČINNOU KAPALINOVOU CHROMATOGRAFII Vzorek indometacinu získaný mikroextrakcí tuhou fází z krevní plasmy byl analyzován kapalinovou chromatografii na reverzní fází C18 a byl detekován detektor UV/VIS. Mobilní fáze byla složena z methanolu a vody v poměru 75:25. Mobilní fáze byla upravena na ph3 pomocí kyseliny fosforečné (8,5%) a byla odvzdušněna ultrazvukem po dobu 20minut. Průtoková rychlost byla 0,7ml/min. Pro detekci byla zvolena vlnová délka 220nm. Vzorek indometacinu v mobilní fázi byl nastřikován na kolonu s reverzní fází C18 v objemu 20 µl. Za vnitřní standard byla zvolena kyselina flufenamová. Za takto zvolených podmínek byl retenční čas indometacinu 3,5 minuty a kyseliny flufenamové 5,0 minut. 38

39 4. 3. IZOLACE INDOMETACINU Z KREVNÍ PLASMY MIKROEXTRAKCÍ TUHOU FÁZÍ Indometacin byl izolován z králičí krevní plasmy a byl extrahován metodou mikroextrakce tuhou fází. Bylo použito vlákno pokryté vrstvou polymeru polydimethylsiloxan/divinylbenzenu (PDMS/DVB). Před procesem extrakce bylo vlákno ponořeno a vymýváno v methanolu po dobu 15 minut. Vzorek indometacinu byl připraven tak, že k 1ml plasmy bylo přidáno 50 µl methanolického roztoku indometacinu (1 mg/ml), protřepáno a zředěno vodou na 10 ml. Za stálého míchání bylo ph vzorku bylo upraveno na 2,7 pomocí kyseliny fosforečné (8,5%) Takto byl připraven vzorek indometacinu o koncentraci 0,005 mg/ml. Za takto upravených podmínek probíhala mikroextrakce na vlákně potažené polymerem PDMS/DVS za stálého míchání. Vlákno bylo ponořeno do 5 ml objemu tohoto vzorku, sorpce probíhala po dobu 30 minut. Desorpce probíhala 10 minut do 250 µl mobilní fáze bez míchání. Toto desorpční medium bylo nastřikováno dvakrát na kolonu C18 v objemu 20 µl. Po desorpci bylo vlákno vytaženo a ponořeno a vymýváno do methanolu po dobu 15 minut. 39

40 5. VÝSLEDKY A DISKUZE VÝBĚR CHROMATOGRAFICKÝCH PODMÍNEK PRO HPLC Mobilní fáze se skládala z methanolu a vody v poměru 75:25 a byla upravena na ph3 pomocí kyseliny fosforečné (8,5%). Při průtoku 0,7 ml/min byl retenční čas indometacinu 3,5 minuty. Při průtoku 1,0 byl retenční čas indometacinu téměř stejný jako při průtoku 0,7 ml/min a spotřeba mobilní fáze větší, proto byl zvolen průtok 0,7 ml/min. Byla vyzkoušena mobilní fáze z methanolu a vody v poměru 80:20, ale optimálnější byla zvolena mobilní fáze v poměru 75:25. Pro optimální zvolení vlnové délky byl methanolický roztok indometacinu v koncentraci 0,01 mg/ml změřen na spektrofotometru.(obr. 1) Tento roztok vykazoval tři absorpční maxima při 319 nm, 232 nm a 204 nm. Pro detekci roztoku indometacinu v methanolu byly vyzkoušeny vlnové délky 210 nm a 215 nm. Při hodnotě 210 nm vykazoval methanolický roztok indometacinu v koncentraci 0,001 mg/ml plochu , při hodnotě 215 nm byla plocha a proto pro průběh analýzy byla zvolena hodnota 210 nm. Indometacin byl rozpuštěn v methanolu, poté byl v koncentraci 0,001 mg/ml analyzován. Záznam chromatogramu měl negativní píky v retenčním čase 3,9 minut a 4,2 minuty, jejichž původcem byl methanol. (obr. 2) Tento methanolický roztok nebyl vhodný pro použití v dalším průběhu analýzy vzhledem k blízkosti píku indometacinu v retenčním čase 3,5 minut. Proto byla namísto methanolu jako rozpouštědla pro indometacin vyzkoušena mobilní fáze upravena na ph3 kyselinou fosforečnou (8,5%). Tento roztok indometacinu v mobilní fázi v koncentraci 0,001 mg/ml byl nastřikován v objemu 20 µl na kolonu s reverzní fází C18. V chromatogramu byl zaznamenán pík v retenčním čase 5,7 minut. Tento pík pocházel s kyseliny fosforečné.(obr. 3) Pík v retenčním čase 5,7 minut nezasahoval do analýzy indometacinu (obr. 4), tudíž bylo pro analýzu optimálnější použít roztok indometacinu v mobilní fází upravenou kyselinou fosforečnou na ph3 než jeho methanolický roztok. 40

41 Obr. 1 UV spektrum indometacinu v methanolu 41

42 Obr. 2 Chromatogram methanolu s negativními píky v retenčním čase 3,9 min a 4,2 min. 42

43 Obr. 3 Chromatogram mobilní fáze s píkem v retenčním čase 5,7 minut. 43

44 1 Obr. 4 Chromatogram indometacinu v mobilní fázi v koncetraci 0,001 mg/ml. 44

45 5. 2. OPTIMALIZACE PODMÍNEK PRO MIKROEXTRAKCI TUHOU FÁZÍ PRO EXTRAKCI INDOMETACINU Vzorky indometacinu byl připraveny tak, že k 1ml plasmy bylo přidáno 50 µl methanolického roztoku indometacinu (1 mg/ml), protřepáno a zředěno vodou na objem 10 ml. Při stálém míchání byla upravena hodnota ph kyselinou fosforečnou na rozdílné hodnoty ph 2,7; 3; 3,8 a 6,5. Z 10 ml bylo odebráno 5ml vzorku. Do 5 ml vzorku bylo ponořeno vlákno potažené polymerem PDMS/DVB a byly vyzkoušeny rozdílné hodnoty sorpce a desorpce. Optimální doba sorpce probíhala za stálého míchání 30 minut a desorpce probíhala 10 minut, po tuto dobu bylo vlákno ponořeno do 250 µl mobilní fáze okyselené kyselinou fosforečnou na ph3. Poté bylo toto desorpční medium nastřikováno na kolonu s reverzní fází C18 v objemu 20 µl. Vlákno bylo ponořeno a vymýváno do methanolu po dobu 15 minut. Z níže uvedené tabulky vyplývá, že nejoptimálnější procentuální výtěžnost extrakce indometacinu z králičí krevní plasmy byla při hodnotách ph 2,7. Při zvyšování hodnot ph docházelo ke snižování výtěžnosti extrakce indometacinu z králičí krevní plasmy. (obr 5, 6) Vzhledem k zanedbatelnému rozdílu výtěžnosti sorpce při 30 a 40 minutám byla zvolena doba sorpce 30 minut. Stejným způsobem byla zvolena doba desorpce 10 minut. (tab. 1) Za optimálních podmínek mikroextrakce indometacinu z plasmy byla provedena mikroextrakce vzorku plasmy bez přídavku indometacinu (obr. 7). Z chromatogramu je patrno, že endogenní látky neinterferují s píkem indometacinu od 3 min záznamu až do 5 min nejsou zaznamenány žádné píky. 45